Expressão e Purificação de uma Proteína Recombinante

Objectivos, Resultados, Discussão e Conclusões

Objectivos:
Este relatório pretende dar a conhecer os resultados e conclusões obtidos
da experiência feita nas duas últimas aulas da disciplina de Métodos e
Técnicas em Biologia Molecular. Para que o protocolo fosse cumprido de forma
eficaz seguimos algumas linhas orientadoras que nos permitiram atingir os
objectivos do trabalho. De modo a tornar este procedimento mais
pormenorizado foi dividido em duas aulas.
Na primeira aula, os nossos objectivos prendiam-se com a produção da
proteína de fusão recombinante e respectiva purificação por cromatografia de
afinidade. Na segunda aula pretendíamos analisar por electroforese em gel de
poliacrilamida em condições desnaturantes a proteína produzida para averiguar
o seu grau de purificação.

Resultados:
No que toca a cálculos temos no protocolo os seguintes dados:
A280nm =1  [GST] = 0,5 mg/ml
Através deste valor de absorvância apenas calculamos a concentração da
proteína de fusão diluída 1x. Recorrendo ao espectrofotómetro para analisar as
eluições obteremos os valores de absorvância necessários para calcular a
concentração de GST. A partir daqui teremos de calcular os valores quando as
soluções são diluídas 1x ou 50x. O valor da proteína recombinante purificada
será o correspondente aos da diluição a 50x.
Exemplo dos cálculos para a primeira eluição (E1):

1 ----- 0,5 mg/ml

0,047—x X = 0,047 x 0,5 = 0,0235 mg/ml

E1 = 0,047 = 0,0235 x 1 = 0,0235 mg/ml

E1 = 0,0235 x 50 = 1,175 mg/ml

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 Seguindo este modelo calculamos os valores para as seguintes eluições.
Os resultados estão expressos na seguinte tabela:
Proteína
A280nm [GST] [GST] x 1 [GST] x 50 recombinante
(mg/ml) (mg/ml) (mg/ml) purificada
(mg/ml)
Valor de
1 0,5 0,5 - -
Referência
E1 0,047 0,0235 0,0235 1,175 1,175
E2 0,048 0,024 0,024 1,2 1,2
E3 0,056 0,028 0,028 1,4 1,4
Figura 1 - Esta tabela expõe os dados e valores obtidos ao longo do processo até à obtenção da proteína
recombinante purificada.

Através dos dados que nos foram fornecidos no protocolo e dos valores
obtidos na purificação da proteína recombinante, visíveis nesta tabela, foi
possível quantificar a proteína. Podemos observar na última coluna que ao
longo das eluições a concentração de proteína recombinante purificada
aumenta, sendo que a última eluição é a que apresenta maior grau de pureza.
Os valores de absorvância vão aumentando ligeira e gradualmente como
podemos analisar melhor no seguinte gráfico.

Figura 2. Gráfico exemplificativo da concentração de proteína recombinante purificada em função da

absorvância.

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 Figura 3. Resultados obtidos na electroforese em gel de poliacrilamida em condições
desnaturantes.

Na primeira coluna as várias bandas são características de um padrão,

solução constituída por uma mistura de proteínas de diferentes pesos
moleculares que servirá como elemento de comparação de forma a
descobrirmos os pesos moleculares das nossas amostras.
Na coluna correspondente à fracção inicial, ou seja, a coluna constituída
pelo lisado celular, obtemos inúmeras bandas características de uma proteína
ainda não purificada.
No que toca às eluições, na primeira (E1) obtivemos várias bandas de cor
intensa, sendo que existe uma banda correspondente a proteínas de elevado
peso molecular na posição mais superior, que são contaminantes; abaixo desta
encontra-se uma banda que corresponde à CTGluR; e numa posição inferior,
outra referente à GST, resultante da clivagem de algumas proteínas
recombinantes por proteases. Na segunda eluição (E2) a cor torna-se mais
esbatida e a banda existente na zona correspondente aos contaminantes
torna-se mais clara, existindo também mais duas bandas inferiores que
correspondem à proteína recombinante e à GST, como na E1. Na terceira
eluição (E3) as bandas são muito claras devido à menor concentração de

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proteínas, existindo apenas duas bandas devido à inexistência da banda
correspondente a contaminantes.
Quanto à coluna correspondente ao GST era suposto obtermos uma
única banda o que efectivamente aconteceu, mostrando que o GST usado
estava puro. Não tem proteínas com peso molecular superior ou inferior.

Discussão e Conclusão:
Os resultados obtidos foram os esperados, mas existindo algumas
incorrecções. Estas podem ser devido a erros de medição durante a realização
do protocolo e erros de cálculos.
Os resultados obtidos na electroforese em gel de poliacrilamida,
apresentam, para além dos dados esperados, duas bandas que correspondem
a contaminantes e a GST em determinadas eluições. As bandas
correspondentes a contaminantes encontram-se nos resultados, pois podem
ter sido provocadas por uma cromatografia errada, tendo as eluições ficado
pouco purificadas. No caso das bandas referentes a GST, o seu aparecimento
deve-se à inexistência de inibidores de proteases, o que levou a que estas
clivassem algumas proteínas de fusão dividindo-as em GST e CTGluR.
A banda referente à proteína recombinante encontra-se na posição
esperada, visto que o peso molecular desta é de 30 kDa, e está posicionada
entre a banda de 25 e a de 37 kDa da solução padrão, no entanto não está
purificada como se pode deduzir pela existência de duas bandas em vez de
apenas uma.
Para corrigir alguns erros, podia-se ter efectuado o Western Blot. Neste
processo é utilizado um anticorpo anti-GST que se ligava a todas as proteínas
excepto aos contaminantes, por não possuírem GST. Com este processo
podia-se concluir se houve ou não falhas na purificação das proteínas.

Trabalho elaborado por: Grupo 1, P2

Ana Carina Maia
Ana Cláudia Pires
Ana Rita Graça
Daniela Oliveira
Métodos e Técnicas em Biologia Molecular
Coimbra, 27 de Junho de 2008