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UNIVERSIDAD NACIONAL MICAELA BASTIDAS DE APURIMAC

FACULTAD DE INGENIERIA
ESCUELA ACADEMICA PROFESIONAL DE
INGENIERIA AGROINDUSTRIAL

INFORME N003-SPE-CBD-SRK-VGJC-CCJ-2015-EAPIA-UNAMBA
PARA: Ing. Sal moreano carrasco
DE:

Sinc Peralta, Edith


Camacho Batllanos, Daniel
Saavedra Romn, Katherine
Vera Gutirrez, Juan Carlos
Chumbe Cahui, Judith

ASUNTO: CONTROL DE CALIDAD DEL MEDIO AMBIENTE


Fecha de ejecucin de la prctica: 10/06/15
Fecha de entrega de la prctica: 19/06/15
Grupo: mircoles de 4:00 a 6:00 pm

I.- RESUMEN
Temas nuevos o de importancia creciente, como son el control de calidad
del medio ambiente, las medidas de seguridad y salud de los personas y las
que aseguran una relacin armnica con el medio ambiente.se realiza con
el objetivo de cuantificar los microorganismos en el aire del medio ambiente
elegido, dado con el mtodo de sedimentacin por gravedad. Y los insumos
utilizados en esta prctica fue dos medios de cultivo como son el caso de
Agar plate count y Agar OGY respectivamente. Como resultado del proceso
de evaluacin y conteo de colonias, la mayor cantidad de poblacin

microbiana fue en el laboratorio de microbiologa mientras de menor


cantidad era en el laboratorio de qumica. Esto lleva a la necesidad de
disear acciones que tengan en cuenta esta realidad.

II.- INTRODUCCIN
El control ambiental es un proceso que permite determinar el grado de
asepsia que tiene un recinto o un laboratorio, el proceso evaluara la
limpieza e indicara si esta deber ser reforzada. En un laboratorio de
microbiologa es imprescindible mantener un ambiente asptico por las
actividades que all se realizan y para ello es necesario llevar un control de
calidad del medio ambiente. En esta prctica se observara los pasos
necesarios para mantener un control de calidad del medio ambiente tambin
se determina el grado asepsia del mismo.
Se puede defender el concepto calidad ambiental como el conjunto de
caractersticas del ambiente, en funcin a la disponibilidad y facilidad de
acceso a los recursos naturales y a la ausencia o presencia de agentes
nocivos. Todo esto necesario para el mantenimiento y crecimiento de la
calidad de vida de los seres humanos.

III.- MARCO TEORICO


CONTROL DE CALIDAD DEL MEDIO AMBIENTE

Control del medio ambiente


Un control adecuado de la temperatura, la humedad y el polvo es
importante para el bienestar del
personal, el funcionamiento de los
instrumentos y la seguridad en el trabajo (por ejemplo, con disolventes
inflamables). Los instrumentos pticos suelen requerir unas condiciones de
temperatura estables para funcionar debidamente. Es posible que el equipo
electrnico precise unos niveles determinados de temperatura y humedad
ambiental. Los ordenadores han de protegerse de campos magnticos
intensos provenientes de otros aparatos; los empleados o visitantes con
marcapasos debern evitar tales campos. Puede que sea necesario un
sistema de agua fra de la red de abastecimiento o de refrigeracin
localizada para que ciertos aparatos funcionen debidamente. Los materiales

de ensayo, reactivos y patrones habrn de almacenarse en condiciones


reguladas. Algunas sustancias deben protegerse de la luz del sol o de las
lmparas fluorescentes que las afectan. Las balanzas e instrumentos
pticos delicados necesitan proteccin contra las vibraciones (por ejemplo
de los mezcladores, tambores y centrfugas) o incluso un soporte
estabilizador. Todas estas necesidades han de identificarse y documentarse
de manera que en el sistema de garanta de la calidad puedan incluirse
procedimientos adecuados para regularlas y tomar las medidas oportunas.
(Weatherwax, J. y Martn, P.G. (1986))

Sern necesarios registros en los que conste que:


- las muestras se reciben, almacenan, manejan y analizada en condiciones
ambientales que no afectan negativamente a los anlisis;
- los controles de la temperatura, la humedad y la luz en las zonas sensibles
son adecuados para proteger las muestras, sus extractos, el personal y el
equipo;
- se lleva un registro de los resultados del muestreo ambiental en los locales
del laboratorio, en el que se anota tambin la velocidad de las corrientes de
aire que pasan a travs de las aberturas.
Es cada vez ms frecuente que dentro de las normativas de control de
calidad se incluya un control microbiolgico ambiental y de superficies y se
hace prcticamente imprescindible en actividades relacionadas con
productos destinados a sanidad o alimentacin. Para llevar a cabo este
anlisis debemos establecer previamente:
El mtodo de muestreo que se va a utilizar
Los microorganismos que se desean aislar y cuantificar
Los lugares de muestreo
La posicin del muestreador
Nmero de muestras en cada punto
Frecuencia de los muestreos
Todos estos puntos dependen de las caractersticas especficas del ambiente que
se pretende

Asociados a este concepto, se encuentran los trminos estndar de calidad


ambiental y lmite mximo permisible, instrumentos de gestin ambiental
que buscan regular y proteger la salud pblica y la calidad ambiental,
permitindole a la autoridad ambiental desarrollar acciones de control,
seguimiento y fiscalizacin de los efectos causados por las actividades
humanas.
Un Estndar de Calidad Ambiental (ECA) es la medida que establece el
nivel de contraccin o del grado de elementos, sustancias o parmetros
fsicos, qumicos o biolgicos, presentes en el aire, agua o suelo, en su
condicin de cuerpo receptor, que no representa significativo para la salud
de las personas ni al ambiente(Copyright Ministerio del Ambiente
MINAM)
Control de la limpieza
Como en lo que concierne a cualquier otro aspecto de las actividades del
laboratorio, la responsabilidad de las operaciones de limpieza deber
definirse claramente. Tanto el personal de la limpieza como el del laboratorio
debern tener instrucciones precisas sobre sus obligaciones respectivas en
relacin con:( Weatherwax, J. y Martn, P.G. (1986))
- la limpieza de los suelos, superficies verticales (por ejemplo, armarios,
paredes, ventanas y puertas), superficies horizontales (por ejemplo
superficies de trabajo, estanteras), equipo, interior de refrigeradores,
congeladores, almacenes de temperatura regulada;

- control del contenido de refrigeradores, congeladores, almacenes de


temperatura regulada;
- comprobacin del funcionamiento del equipo de acondicionamiento de aire
y extraccin de polvo.

TCNICAS DE MUESTREO AMBIENTE:


A) SEDIMENTACIN:
Es el mtodo ms rudimentario de medicin de microorganismos en el
ambiente. Consiste en la exposicin de placas de Petri al ambiente
durante un cierto tiempo.

Este mtodo tiene la ventaja de que se puede realizar en todas las


condiciones habituales de trabajo y en tiempo real, es el ms econmico
y requiere muy poco tiempo de dedicacin.
El resultado ha de expresarse como: u.f.c (unidades formadoras de
colonias) /cm2/hora (no puede referirse a un volumen de aire, por lo que
los resultados no pueden ser cuantitativos/volumen de aire, pero si
comparativos).
Los tiempos de exposicin no deben ser extremadamente largos para
evitar que se reseque la superficie de la placa.
Se utilizan placas de Petri estndares de 90 mm de dimetro y los
medios ms utilizados son:
Agar de Triptona y Soja (T.S.A) para el recuento de aerobios (ref. 064PA0031, para placas preparadas y ref. 1-200 para el medio
deshidratado).
Agar Rosa de Bengala o Agar de Sabouraud cloranfenicol para el
recuento de hongos (Ref. 064-PA0038 o 064-PA0026, para placas
preparadas y ref. 1-301 o 1-166 para el medio deshidratado).
En el caso de control de salas blancas recomendamos utilizar placas
preparadas e irradiadas, de esta forma evitamos introducir
contaminacin en la sala y los recuentos son fi ables. Ref.
064PA0031I, placas de 90 mm de dimetro de T.S.A irradiadas.
Ref. 064PA0026I, placas de 90 mm de dimetro de Agar Sabouraud
Cloranfenicol irradiadas.
El Agar Rosa de Bengala es un medio selectivo para la deteccin de
hongos que, adems de los requerimientos nutritivos para el desarrollo
de los mismos, incorpora el indicador de Rosa de Bengala que, adems
de teir las levaduras de color rosado, facilitando su contaje, impide el
crecimiento masivo de mohos tales como Rhizopus y Neurospora
permitiendo as detectar otros.

Cul es el fundamento del agar OGY?


El agar OGY (Agar-Oxitetraciclina-glucosa-extracto de levadura) Es un agar
selectivo para la demostracin y numeracin de mohos y levaduras en de
material de investigacin (alimentos, material clnico, etc.) El agar-

oxitetraciclina-glucosa-extracto de levadura ha sido recomendado comomed


io
de
rutina
para
la
investigacin
de
mantequilla.Esta compuesto por extracto de levadura, D-glucosa, Agaragar,Oxitetraciclina 0,1 o Gentamicina 0,05.

III.- OBJETIVOS

Cuantificar los microorganismos presentes en el aire ,determinar la


diversidad microbiana del ambiente elegido

IV.- MATERIALES Y INSUMOS:


MATERIALES:

Placas Petri esterilizadas.


Probeta.
Matraz Erlen Meyer.
Esptula.
Balanza analtica.
Equipo cuenta colonias.
Incubadora regulada 20C.
Plumn indeleble.

INSUMOS:

Agua destilada.
Agar pate count
Agar OGY

V.- PROCEDIMIENTO:
Elegir 3 o ms puntos de la muestra en el ambiente de microbiologa.
Abrir las placas de agar Plate Count y OGY y exponer durante 15
minutos
Las placas con agar Plate Count incubar a 35C / 3 das y las placas con
agar OGY 35C / 4 das.
Obtener resultados entre 3 das y 4 das de incubacin y contar las
colonias y expresar como Ufc/ 15 minutos.

CALCULOS REALIZADOS EN LA PRCTICA:

Clculos para el Agar Plate Count (para 2 placas)


17,5 gr
X

1000 ml
40 ml

X = 0,7 gr de agar plate count


Clculos para el Agar OGY (para 2 placas)
18,5 gr
X

500 ml
40 ml

X = 1,48 gr de agar OGY

Diagrama: protocolo de procesamiento del control de calidad del medio


ambiente

Elegir 3 puntos en el
laboratorio de

Colocar en las zonas de


muestra 3 placas de agar
Plate Count y Agar OGY

Exponer las placas abiertas


durante 15 minutos

Incubar Plate Count a


35C/ 3 das y OGY a 2024C a 4 das

Contar las colonias y


expresar como ufc/ 15
minutos de exposicin

VI.- RESULTADO:
Cuadro N01 Resultados que se obtuvo en el control de calidad del
medio ambiente

Incubar Plate Count a


35C/ 3 das y OGY a 20-

Medio de zona de
muestreo
cultivo
Agar
plate
count

Agar
plate
count

Laboratorio
microbiologa

Laboratorio
qumica.

Agar
OGY

Laboratorio
microbiologa

Agar
OGY

Laboratorio
qumica.

placas

4. 1
2
1

color

periodo de # total de
incubacin colonias

Blanco
cremoso y
blanco
amarillento

3 DIAS

100 ufc/15min

Blanco
cremoso

4 DIAS

81ufc/15min

Blanco
cremoso y
blanco
amarillento

3 DIAS

222 ufc/15min

Blanco
cremoso y
verde
oscuro

4 DIAS

14 ufc/15min

FORMULA UTILIZADO PARA CONTAR LOS MICROORGANISMOS:

X
1: N = FdVm

= 100 ufc/15min laboratorio de microbiologa (Agar Plate

Count)

X
2: N = FdVm
X

= 81 ufc/15min laboratorio de qumica (Agar Plate Count)

3: N = FdVm

= 222 ufc/15min laboratorio de microbiologa (Agar OGY)

X
4: N = FdVm

= 14 ufc/15min laboratorio de qumica (Agar OGY)

VII.- DISCUSIONES.
Se sabe que la mayor cantidad de colonias presentes en el aire,
est en laboratorio de microbiologa, esto nos indica que estamos
expuestos a contaminarnos. Por tal motivo se requiere el ingreso al
laboratorio con todo el implemento necesario en un laboratorio de
microbiologa, o en otros laboratorios.
En la prctica realiza solo tomo dos puntos de muestreo por motivos
de materiales no estriles ,segn el procedimiento debera tomarse
ms de dos puntos respectivamente,
Entre stas, son las normas previas y simultneas con los procesos
de certificacin de calidad (ISO 9000), medioambiental (ISO 14000) y
con la introduccin de medidas de seguridad y salud laboral, ocupan
un lugar imprescindible.

VIII.- CONCLUSIONES:
Se logr la cuantificacin de microorganismos en el aire, con los
diferentes medios cultivos especialmente para microorganismos
presentes en medio ambiente, para esto se tom dos puntos el
laboratorio de qumica y microbiologa. Llegamos a un resultado de
recuento de colonias y de cada zona de muestra. La ms poblada
de microorganismos fue de laboratorio de microbiologa con un
nmero de 222 ufc/15min y en el otro punto fue de 81 ufc/15min, son
de los medios cultivos con mayor cantidad de colonias que los otros
medios, como se muestra en cuadro N01. En conclusin si se logr
los objetivos de cuantificacin de microorganismos presentes en el
aire.

UNIVERSIDAD NACIONAL MICAELA BASTIDAS DE APURIMAC


FACULTAD DE INGENIERIA
ESCUELA ACADEMICO PROFESIONAL DE
INGENIERIA AGROINDUSTRIAL

INFORME N003-IA 504-SPE-CBD-SRK-VGJC-CCY-2015-EAPIA-UNAMBA


PARA: Ing. Sal Moreano carrasco
DE: Edith Sinc Peralta

Daniel Camacho Batllanos


Katherine Saavedra Romn
Juan Carlos Vera Gutirrez
Yudy Chumbe Cahui
ASUNTO: EVALUACION MICROBIOLOGICA DE SUPERFICIES VIVAS E INERTES:

Fecha de ejecucin de la prctica: 26/06/15


Fecha de entrega de la prctica: 22/07/15
Grupo: mircoles 4:00 a 6:00 pm
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

I.- RESUMEN
Los microorganismos de superficies vivas e inertes relacionado con la funcin de los
riesgos sanitarios, con diferentes etapas de cadena alimentaria, siendo con el
objetivo de Evaluar la cantidad microbiolgica de superficies inertes (tabla de picar).
Y la calidad microbiolgica de manos de manipuladores de alimentos. Sea por
mtodos rpidos o convencionales, se realiza utilizando mtodos normalizados por
organismos internacionales para la estandarizacin ISO ,dado el ms utilizado es el
incorporacin ,utilizando el medio cultivo de Agar Plate Count y peptona, obteniendo
4
un resultado en manos de manipulador de 3.4x 10

104

2
ufc/ 100 cm Respectivamente.

ufc/ml y en superficies de1.4x

I.- INTRODUCCION
Un alimento puede estar contaminado en su origen o bien puede ser por el
manipulador quien lo contamine durante el procesado. La persona que va a
manipular un alimento tiene una gran carga microbiana en la piel, pero nunca
debern deslizarse de ellas bacterias patgenas. Por lo tanto resulta evidente la
necesidad de que el manipulador mantenga una perfecta condicin de higiene
durante el procesado de los alimentos.
La tcnica de carga microbiana depende de la naturaleza del sitio, grado de
concentracin y de informacin microbiolgica que se pretende obtener.
Existen dos categoras de muestreo que habitualmente se toman del entorno donde
se fabrican alimentos en superficies y ambientes.
Los microorganismos se encuentran presentes en todos los ambientes: en el aire, en
el suelo, superficies de los objetos e incluso sobre muestro piel.

II.- OBJETIVOS

Evaluar la cantidad microbiolgica de superficies inertes (tabla de picar).


Evaluar la calidad microbiolgica de manos de manipuladores de alimentos.
III.- MARCO TEORICO
Evaluacin de riesgo microbiolgico en superficies inertes y vivas de
Manipuladores en reas de produccin
Uno de los factores que en mayor medida afectan a la Salud Pblica es la higiene de
los alimentos, especialmente en los grandes centros de venta, ya que cada vez es
mayor el porcentaje de personas que adquieren o consumen alimentos fuera del
hogar.
La higiene de las superficies, equipos y utensilios, es uno de los pilares donde se
asientan las buenas prcticas de manufactura y si se considera que entre el 6 y 15 %
de los alimentos producidos poseen algn tipo de contaminacin, cifra que podra
dispararse de manera imprevisible en un mercado de produccin a escala macro
como lo hacen las industrias alimenticias en la actualidad, la respuesta a estos
grados de contaminacin son varias, pero una de ellas se basa en la comprobacin

de que existen microorganismos capaces de resistir los tratamientos habituales de


limpieza (Forte, L.M.y Rebagliati, J.E.,2000).
Los microorganismos patgenos pueden pasar de un alimento a otro por contacto
directo o bien a travs de quienes los manipulan, de las superficies de contacto o del
aire (CAC/RCP 1, 1997).
Una correcta higiene de los alimentos est determinada por una multitud de factores:
condiciones de obtencin de los mismos, caractersticas de los medios empleados
para su transporte, temperaturas y condiciones de conservacin,
Estructura de los locales donde se manipulan, destacando entre todos ellos la
higiene de las prcticas de los manipuladores de alimentos. (Prez Silva Garca, M.;
Belmonte Corts, S. y Martnez Corral, J.; 1998).
Entre los agentes etiolgicos productores de enfermedades transmitidas por
alimentos (ETA) predominan los biolgicos.(Gomez, D.; Cotella, O.; Fernandez
Pascua, C. y Ameztoy, A.M., 1997); entre los cuales se destaca el gnero
Salmonella. En la industria de los alimentos Escherichia coli es un organismo de
particular importancia por su impacto en salud, y se considera que, conocindose el
papel de los reservorios, la prevalencia del organismo en las plantas procesadoras y
en los alimentos producidos, (Rodrguez; H.R. 1995),Tambin se deberan conocer
cules seran las operaciones o procedimientos en las etapas de produccin y en las
posteriores de procesamiento que facilitan o producen contaminacin microbiana, la
investigacin sobre estos organismos aportara la informacin cientfica necesaria
para sustentar programas de control de estos emergentes. Asimismo, la intoxicacin
estafilocccica es una de las ETA ms frecuentes, con especial preponderancia en la
regin latinoamericana, y su presentacin ocurre por las enterotoxinas producidas
por numerosas cepas de Staphylococus aureus que proliferan en los alimentos, los
estafilococos abundan en el medio y el origen de la contaminacin por lo regular est
relacionada con heridas de la piel, la nariz, la boca o la garganta de los
manipuladores, cuando se procesan aun estando ya cocidos y calientes (INPPAZ /
OPS / OMS, 1997).
La contaminacin cruzada entre materias primas crudas o entre productos crudos y
los ya cocidos a travs de manos, equipos o utensilios, es otra forma frecuente de
contaminacin que origina toxiinfecciones.
Al no existir en nuestra regin un estudio microbiolgico con las caractersticas
planteadas, nos ha llevado a trazar esta lnea de investigacin.

Muestreo de superficies
Debe estar en funcin de los riesgos sanitarios relacionados a las etapas de la
cadena alimentaria.
a) superficies inertes.
Se seleccionan aquellas que estn o tendrn contacto directo con los
alimentos, que no sern sometidos a un proceso trmico y que estn
destinados al consumo directo como: utensilios, vajillas, superficies de corte,
menaje, equipos, etc.
b) Superficies vivas
Se selecciona a los manipuladores de alimentos, con o sin guantes, que estn
en el contacto directo con los alimentos que no sern sometidos a un proceso
trmico o pasterizacin u otro tratamiento que disminuya la carga microbiana.
Cuadro N01 seleccin del mtodo del muestreo
MTODO DE MUESTREO

MTODO DEL HISOPO

SUPERFICIES A MUESTREAR
Se utiliza superficies inertes e
irregulares tales como: tabla de picar,
bandejas, mesas de trabajo, utencillos,
cuchillas de equipo, cortadora de
embutidos, cortadora de pan de molde,
fajas transportadoras, mezcladoras,
pisos, paredes y otros.

MTODO DE LA ESPONJA

El mtodo de la esponja se utiliza


preferentemente
para
muestrear
superficies de mayor rea.

MTODO DEL ENJUAGUE

Se utiliza para superficies vivas


(manos) y para objetos pequeos o
para el muestreo de superficies
interiores de envases, botellas, bolsas
de plstico, etc.

Fuente: elaboracin propia.

PARAMETROS PERMISIBLEAS:
Cuadro N02 limites microbiolgicos permisibles
SUPERFICIES
MWETODO DE
ENJUAGUE
ensayo
Coliformes
totales

SUPERFICIES VIVAS
Lmite de
Limite
deteccin
permisible
mtodo
<100
<100
ufc/manos
ufc/manos

Staphylococcu
s aureus
patgenos

SUPERFICIES INERTES
Lmite de
Limite
deteccin
permisible
mtodo
<25 ufc/
<25 ufc/
super.muestra
super.muestr
a
------------

<100
<100
ufc/manos
ufc/manos
Ausencia de
Ausencia de
ausencia
manos
manos
Fuente: direccin general de salud ambiental-DIGESA

ausencia

VI.- MATERIALES E INSUMOS

Hisopo de algodn u otro material equivalente de largo aproximada 12 cm.


Plantilla estril con un rea abierta en el centro de 10 cm x 10 cm.
Frasco con tapa rosca de 250 ml con 100 ml de solucin diluyente.
Pinzas estriles
Bolsas de polietileno de primer uso.
Tubo de ensayo con tapa hermtica de 10 ml.
Guantes descartables de primer uso.
Tabla de picar.
Pipetas.
Mechero bunsen.

INSUMOS
Agar Plate Count
Agar agua peptona

V.- METODOLOGIA
a.- para mtodo de hisopo
Colocar la plantilla de 10x10 cm sobre la superficie a muestrear.
Humedecer el hisopo, en la solucin diluyente y presionar ligeramente en la
pared del tubo con un movimiento de rotacin para quitar el exceso de
soluciones.
Con el hisopo inclinado en un ngulo de 30 frotar 4 veces la superficie
determinada por la plantilla.
Para superficies irregulares en el caso de utensilios, se repetir la operacin 3
utensilios ms, en total 4 como mximo.
b.- para mtodo de enjuague para manos de manipuladores.
el mtodo consiste en realizar un enjuague (botellas, frascos, utensilios) o
inmersin (manos, objetos pequeos) en una solucin diluyente.
Vaciar el diluyente del frasco 100 ml en una bolsa plstica de primer uso.
Introducir las manos a muestrear hasta la altura de la mueca.
Solicitar al manipulador que realice un frotado de los dedos y particularmente
alrededor de los uas y la palma de los manos.
Luego retirar las manos se regresa el lquido al frasco o se anuda la bolsa y
este se coloca en otra bolsa para que quede segura.

Clculos realizados:
Para Agar Plate Count (para 6 placas)
17,5 gr-------------------1000 ml
X -------------------- 100 ml
X = 175 gr de Plate Count
Para agua peptonada (para 2 frascos de 90 ml y 4 tubos de 9ml)
1 gr -----------------1000 ml
X------------------ 220 ml
X = 0,22 gr de peptona

DIAGRAMA DE FLUJO DEL PROCEDIMIENTO (muestra liquida)


PARA EVALUACION MICROBIOLOGICA DE SUPERFICIES VIVAS E INERTES
(Para los dos mtodos realizados)

1 ml
Diluyente

1 ml

90 ml

H2Op

9 ml

9ml

102

103

101
1 ml

1 ml

1 ml

Inocular 1ml de
Cada dilucin en

1 ml

1ml

1 ml

Placas Petri por


Duplicado.

Siembra por incorporacin


Invertir las placas e incubar a 37C y reporte de resultado
Fuente: protocolo de DIGESA

VI.- RESULTADOS
Cuadro N03 evaluacin microbiolgica de superficies vivas e inertes:
Dilucin

Cuadrantes

Manos de
manipuladores

13

Amarrillo lechoso

4
3.4x 10

10

Superficies (tabla
de picar)
Dilucin

Colonias en
ufc/ml

Dilucin

Color

Sin determinar
1.4x 10

102

Para manos del manipulador

x
fdv

13+ 7+6+8
1020.1

= 34000=3.4x 10

Para superficies (tabla de picar)


2
Ufc/ 100 cm

100 cm2

Fuente: elaboracin propia.

Ufc/ml =

x
fdv

ufc/ml

7 +1+ 2+ 4
1020.1

4
= 14000=1.4x 10

ufc/

VII.- DISCUSIONES

Segn en cuadro N02 de limites microbiolgicos permisibles, lo que se


encontr en la mano y en superficies supera a la norma dada. Esto nos indica
que la mano del estudia est contaminada de microorganismos patgenos y
4
de igual manera en la tabla de picar encontrando de 1.4x 10

4
y de 3.4x 10

2
Ufc/ 100 cm

ufc/ml.y se hall gran cantidad de S.aureus.

Para obtener o garantizar de que un producto no este contaminado por estos


microorganismos mencionados tenemos que tener ms higiene asptica en
todos los procesos de manipulacin de alimentos de consumo directo.

VIII.- CONCLUCIONES

Se concluye que en la mano del estudiante se determin 3.4x 10


4

formadoras de colonia /ml, mientras en la tabla de picar 1.4x 10


formadoras de colonias/

100 cm2

unidades
unidades

, en el medio agar plate count, esto indica

que no puede manipular un alimento por tener la alta carga microbiana.


por lo general encontramos S.aureus, salmonella basillus cereus y oros que
pueden ser patgenos como coliformes totales que estas nos pueden causar
la muerte.

UNIVERSIDAD NACIONAL MICAELA BASTIDAS DE APURIMAC


FACULTAD DE INGENIERIA
ESCUELA ACADEMICO PROFESIONAL DE
INGENIERIA AGROINDUSTRIAL

INFORME N004-IA 504-SPE-CBD-SRK-VGJC-CCY-2015-EAPIA-UNAMBA


PARA: Ing. Sal Moreano carrasco
DE: Edith Sinc Peralta

Daniel Camacho Batllanos


Katherine Saavedra Romn
Juan Carlos Vera Gutirrez
Yudy Chumbe Cahui
ASUNTO: NUMERACION DE MICROORGANISMO MESOFILOS AEROBIOS VIABLES EN
ALIMENTOS NO FERMENTABLES.

Fecha de ejecucin de la prctica: 24/06/15


Fecha de entrega de la prctica: 08 /07/15
Grupo: mircoles 4:00 a 6:00 pm
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

I.- RESUMEN

Se trata de conocer el nmero total de microorganismos viables, que se encuentran


en los alimentos, no fermentables. Con el objetivo de alcanzar el flujo de
operaciones para el numeracin de microrganismos mesofilos aerobios viables, que
pretendemos encontrar en el alimento utilizando (HotDog). Aislando con el mtodo de
la tcnica de siembra por incorporacin y utilizando solo el medio cultivo del Agar
Plate Count para mesofilos aerobios viables no fermentativos. Obteniendo un
2

resultado de colonias encontrados en un dilucin sucesiva de 5,238x x 10

ufc/ml.

I.- INTRODUCCION
El anlisis de los alimentos est catalogado por diversas tcnicas y mtodos para
determinar microorganismos que se encuentran viables en los alimentos ya sean
slidos como las carnes, verduras y frutas, o lquidos ya sea leche y jugos de frutas;
entre estos mtodos tenemos la numeracin de microorganismos aerobios mesofilos,
la cual nos permite determinar cuntos microorganismos contaminantes presenta un
alimento sobre su superficie o en su interior. Segn La presente norma sanitaria se
establece en el marco del Reglamento sobre Vigilancia y Control Sanitario de
Alimentos y Bebidas (NTS N 071-MINSA/DIGESA-V-01), aprobado por Decreto
Supremo N 007.98 SA, establecen que el nmero de microorganismos aerobios
5
mesofilos y facultativos deben ser hasta un mximo de 500000 = 5x 10

ufc/ml,

para que puedan ser consumidos por la poblacin. Por otro lado las tcnicas para
poder encontrar la numeracin de aerobios mesofilos viables son: el recuento de
colonias en placa por profundidad, superficie o por goteo; otro el Mtodo del nmero
ms probable (MPN) de grmenes como clculo estadstico del nmero de clulas
viables. El recuento total de bacterias en placa es un mtodo til para obtener una
idea del grado de frescura o pronta alteracin de los alimentos, dependiendo dela
cantidad de bacterias presentes. La mayora de los alimentos deben ser
considerados como inadecuados para el consumo cuando contienen un gran nmero
de microorganismos, aun cuando estos microorganismos no sean conocidos como
patgenos y no hayan alterado de forma apreciable los caracteres organolpticos del
alimento. (Thatcher y Clark, 1973)
La presencia de microorganismos aerobios mesofilos en los alimentos puede ser
relacionada directamente con la manipulacin, el estado de frescura o de
descomposicin del producto y la temperatura de conservacin del producto. Un
nmero relativamente bajo de estas bacterias no es sinnimo de buena calidad
bacteriolgica del alimento, ya que puede contener microorganismos que producen
entero toxinas o son patgenos. (Venegas y col., 1990).

II.- OBJETIVOS
Realice el flujo de operaciones para la numeracin de microorganismos
mesofilos aerobios viables.
Realice la tcnica de siembra por incorporacin en el medio Plate Count en la
muestra de alimento.
Realice los clculos y reporte de resultado para rechazar o aceptar el
Producto.
III.- MARCO TEORICO
Los recuentos de microorganismos viables se basan en el nmero de colonias que
se desarrollan en placas previamente inoculadas con una cantidad conocida de
alimento e incubadas en condiciones ambientales determinadas.
Estos recuentos nos pueden considerarse como totales ya que solo se pueden
contar aquellos microorganismos que crecen en condiciones establecidas.
En nuestro caso se incluyen microorganismos mesofilos, que son aquellos que
crecen entre 20 30C, con una temperatura de crecimientos optima entre los 30
40C. Aqu se encuentran todas las bacterias, mohos y levaduras capaces de
desarrollarse a 30C en las condiciones establecidas. En este recuento se estima la
microflora total sin especificar tipos de microorganismos.
Refleja la calidad sanitaria de un alimento, las condiciones de manipulacin, las
condiciones higinicas de la materia prima.
Existen 2 requisitos principales que deben tener los alimentos para ser considerados
de buena calidad:
1. Que estn libres de microorganismos patgenos, o sea que posean buena
calidad sanitaria.
2. Que posean un bajo nmero de microorganismos alterantes, o sea que sean
frescos.
Esterilidad Comercial: Condicin de un alimento procesado trmicamente obtenida
por: (i) Aplicacin de calor que hace que el alimento est libre de: (a)
Microorganismos capaces de reproducirse en el alimento bajo condiciones normales
de almacenamiento y distribucin no refrigeradas; y (b) Microorganismos viables
(incluyendo esporas) de importancia para la salud pblica; o (ii) Control de la
actividad de agua y la aplicacin de calor, que hace que el alimento est libre de
microorganismos capaces de reproducirse en el mismo, bajo condiciones normales
(no refrigeradas) de almacenamiento y distribucin. (Norma sanitaria que establece
los criterios microbiolgicos RM N 615-2003 SA/DM)

Numeracin de microorganismos aerobios mesofilos viables:


Mtodo: recuento estndar en placa o pour plate o recuento en placa por siembra en
profundidad.
Este mtodo se recomienda para productos lcteos (standard methods for the
examination of dairy products, 1972) y para alimentos congelados, enfriados, pre
cocidos o preparados (ADAC .1975).
Realizar los recuentos:
- Seleccionar para hacer el recuento aquella dilucin donde haya crecimiento
bacteriano que contenga entre 30 y 300 colonias, Utilice l cuenta colonias
- Cuente las colonias y el numero encontrado deber multiplicarlo por el reciproco de
la dilucin que utilizo para hacerlo
- Pueden presentarse ciertas variaciones en los cultivos realizados. En la hoja
siguiente usted encontrara las diferentes posibilidades y que hacer en cada caso. Lo
importante es saber que cuando se puedan encontrar diluciones que contengan entre
30 y 300 colonias si el recuento es preciso, se informa como recuento Estndar.
Recuento estimado del standard.
Este clculo se realiza cuando no es posible encontrar ninguna dilucin que
contenga menos de 300 colonias. Para hacer recuentos se puede dividir la caja en 2,
4 o aun 8 porciones y contar las colonias. Este nmero de colonias se multiplica por
el factor apropiado (2,4 u 8) y adems por el reciproco de la dilucin, que en este
caso sera la ms alta.
Cuando hay ms de 200 colonias por 1/8 se asume que en toda la caja hay ms de
1600 (200x8). El recuento total deber ser mayor de 1600 multiplicado por el
reciproco de la dilucin ms alta. Si no hubiese colonias en la caja de dilucin menor
1
( 10 ) se reporta como menos de 10 colonias puesto que el mnimo nmero de

colonias puesto que el mnimo nmero de colonias que se puede obtener es de 1 y al


multiplicarlo por el reciproco de la dilucin dar 10.
Expresin de los resultados.
El recuento bacteriano se debe expresar con 2 dgitos y el resto en potencias de 10.
Como no siempre el conteo de colonias produce valores como por ejemplo 10-2050-80-300 etc., es necesario aplicar algunas correcciones con la finalidad de
convertir el nmero hallado en uno con 2 dgitos.

Si el recuentos se realiz en la dilucin

10

y fue de 138 colonias, el tercer digito

por ser mayor que 5 permite adicionar 1 unidad al 2 o sea que el recuento seria
4
140.000 = 14x 10 .

Si el recuento fue de 124 por ser el 3er. Digito menor que 5 se anula y se expresa
4
120.000 = 12x 10 .

Cuando el recuento de mesofilos aerobios se utiliza para determinar la aceptacin o


rechazo de un alimento, nicamente se considerara el recuento standard y nunca el
estimado.
VI.-MATERIALES E INSUMOS

Placas Petri 250 ml


Pipetas 10 ml
Tubos de ensayo
Matraz

INSUMOS
Agar Plate Count
Agar peptona

V.- METODOLOGIA
Preparar el medio de cultivo segn las indicaciones del frasco.
Prepara la muestra de 10 gr en 90 ml de agua peptonada y tubos de 9 ml cada
uno.
Siembra por duplicado 1 ml de volumen del inoculo de cada dilucin en el
medio Plate Count
Siembra por incorporacin
Invertir las placas e incubar a 37C por 48 h
Recuento en placas
N=

C
V ( n1 +0,1 n2 ) d

Donde:

=es la suma de colonias contadas de todas las placas, de dos diluciones

sucesivas.
V =es el volumen de inoculo aplicado en cada uno de las placas, en mililitros.
n1 = es el nmero de placas ledas de la primera dilucin.
n2

= es el nmero de placas ledas de la segunda dilucin.

d = es el factor de dilucin correspondiente de la primera dilucin leda.

DIGRAMA DE OPERACIONES: numeracin de microorganismo mesofilos aerobios


viables en alimentos no fermentables.

Tomar 10 gr de hot
dog
Diluir en 90 ml de agua
peptonada estril

Por otro lado


tenemos placas

Seguidamente despus de ser


diluido el hot dog, seguir las
diluciones

101

hasta

103

Hacer una siembra por


incorporacin por
duplicado de cada una de
las diluciones

Finalmente incubar las


placas con estas
diluciones a 37C durante
24 48 horas

DIAGRAMA DE FUJO DEL PROCEDIMIENTO (muestra solida)

10 gr de muestra de Hot dog


1 ml

1 ml

90 ml
H2Op

9 ml

9ml

102

103

10

1 ml

1 ml

1 ml

Inocular 1 ml
De cada dilucin

1 ml

1ml

1 ml

Incorporar 15 ml de medio Agar Plate Count homogenizar y que solidifique.

Invertir las placas e incubar a 37C por 48 h y reportar los resultados

Siembra por incorporacin


Fuente: ver apndice de operaciones, ISO 4833:2003-DIGESA

CALCULOS REALIZADOS
Para agar Plate Count (para 6 placas)
17,5 gr -------------------1000 ml
X --------------------- 100 ml
X = 1,75 gr de Plate Count

Para agar peptona (para 2 tubos)


110 ml ------------------ 100 ml
X ---------------------- 1 %
X = 1,1 gr de peptona

VI.- RESULTADOS

Cuadro N01: resultados de numeracin de microorganismo mesofilos aerobios


viables en la muestra (hot dog)
Factor de
dilucin

10

10

Agar

Colonias
contadas

Plate Count

ml

Plate Count

ml

Total

17

13

14

16

13

14

14

53

57

110 colonias

= 11x10 ufc/ml

Fuente: elaboracin propia

Cuadro N02: expresin de resultado segn el ISO 7218:1996


formula

N=

Calculo

C
V ( n1 +0,1 n2 ) d

Fuente: elaboracin propia

VII.-DISCUSIONES

1
2+ 0,1 10

1
53+57
N=

Total de colonias en
UFC/g o ml
2
5,238x 10 ufc/ml

Segn La presente norma sanitaria se establece en el marco del Reglamento


sobre Vigilancia y Control Sanitario de Alimentos y Bebidas (NTS N 071MINSA/DIGESA-V-01), aprobado por Decreto Supremo N 007.98 SA,
establecen que el nmero de microorganismos aerobios mesofilos y
5

facultativos deben ser hasta un mximo de 500000 = 5x 10

ufc/ g o ml,

para que puedan ser consumidos por la poblacin.


Segn el cuadro N01 nos indica que el nmero de colonias contadas de las
dilucin (

101 ) fue de un total de 110 colonias dando un equivalencia de

11x10 ufc. Sin embargo en los de ms diluciones sucesivas, se encontr


bacterias que presentaban menores a 30 colonias.
Segn el cuadro N02 muestra que la cantidad calculada (de la muestra Hot
2

dog) es de 5,238x 10

ufc/ ml, esto nos indica grado de importancia en

relacin con la utilidad y riesgo sanitario. Patgenos de riesgo moderado


directo, de diseminacin limitada. Sin cambio de peligrosidad.

VIII.- CONCLUSIONES

Logramos un flujo de operaciones para la numeracin de microorganismos


mesofilos aerobios viables, y para as hacer el procedimiento que requiere
este practica realizada. Que nos indica los parmetros de utilizacin
respectivamente.

Se utiliz la tcnica de siembra por incorporacin para el medio Plate Count,


siendo uno de los medio indicado para su desarrollo de los microorganismos

mesofilos aerobios, dando en conclusin si se logr el crecimiento de


mesofilos aerobios no fermentativos de un total de 110 colonias.
Dando los clculos y reporte de resultado de numeracin de microorganismos
mesofilos aerobios. de colonias contadas (cuadro N01) y total de colonias en
2
ufc/ml (cuadro N02) en conclusin se determin 5,238x 10 ufc/ml
5
menos a 5x 10

y es

ufc/ml que esta dado en la norma (DIGESA/MINSA) y es el


5

mximo permisible de (5x 10

) ,para alimentos con tratamiento trmico y

refrigeracin como el caso de hot dog. Este nos indica que si es aceptable su
2
5
consumo del alimento, en un rango permisible 5,238x 10 < 5x 10 ufc/ml

UNIVERSIDAD NACIONAL MICAELA BASTIDAS DE APURIMAC


FACULTAD DE INGENIERIA
ESCUELA ACADEMICO PROFESIONAL DE
INGENIERIA AGROINDUSTRIAL

INFORME N005-IA 504-SPE-CBD-SRK-VGJC-CCY-2015-EAPIA-UNAMBA

PARA: Ing. Sal Moreano carrasco


DE: Edith Sinc Peralta

Daniel Camacho Batllanos


Katherine Saavedra Romn
Juan Carlos Vera Gutirrez (no aporto en el informe)
Yudy Chumbe Cahui
ASUNTO: INVESTIGACIN Y NUMERACIN DE Bacillus cereus

Fecha de ejecucin de la prctica: 24/06/15


Fecha de entrega de la prctica: 11 /07/15
Grupo: mircoles 4:00 a 6:00 pm
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

I.- RESUMEN
Bacillus cereus es una bacteria Gram positiva, habitante frecuente de un amplio
nmero de ambientes. Esta bacteria es la responsable del sndrome emtico y del
diarreico, y adems se ha identificado vinculada a otras enfermedades. Identificacin
realizndose la bsqueda e investigacin en aquellos alimentos que por su
naturaleza y por los datos clnicos ante una contaminacin de arroz cocido pudieran
guiar a la posible presencia de este microorganismo. Aislando con un mtodo
practico de diseminacin en placas, con los medios de agar Bacillus cereus +yema
de huevo y las pruebas de coloracin Gram, as dando unos resultados de Bacillus
cereus Gram positivo. Con un crecimientos de colonias de

4.9 x 10 4

ufc/g

encontrados en el arroz cocido y contaminado.


I.- INTRODUCCION
Bacillus cereus es una bacteria ubicua formadora de esporas que ha sido vinculada
con algunos aspectos beneficiosos y nocivos para la actividad econmica de la
sociedad. Esta bacteria es frecuentemente encontrada como saprofita en el suelo,
agua, vegetacin y aire, desde los cuales se transfiere muy fcilmente a los
alimentos. La colonizacin de diferentes nichos ecolgicos es posible debido a su
buena adaptabilidad y resistencia a variadas influencias. B. cereus produce
endosporas que sobreviven a la pasteurizacin y son resistentes a varios
desinfectantes. Adems produce enzimas como lipasas, proteasas, xilanasas y otras.

En la leche y productos lcteos descompone la casena a pptidos y aminocidos y


la grasa de la leche a cidos grasos libres, los cuales descomponen la leche y
acortan su vida til. Es propsito de este artculo, revisar informacin sobre las
toxinas producidas por B. cereus y cules y cmo estn relacionadas con las
intoxicaciones alimentarias, as como abordar otros factores responsables de la
virulencia de esta bacteria.

II.- OBJETIVOS
Realizar la identificacin y numeracin de Bacillus cereus a partir de alimentos
de panadera.
Conocer los medios de cultivo y la tcnica de aislamiento de Bacillus cereus.
II.- MARCO TEORICO
Bacillus cereus:
Es un bacilo formador de esporas responsable de intoxicaciones alimentarias,
siendo su hbitat natural el suelo, contamina con frecuencia cereales, leche,
budines, cremas pasteurizadas y especias, entre otros alimentos.
La Organizacin Mundial de la Salud (OMS) estima que las enfermedades causadas
por alimentos contaminados constituyen uno de los problemas sanitarios ms
difundidos en la actualidad
Los casos de intoxicaciones o enfermedades por alimentos mal preparados o
contaminados por este microorganismo suelen ser frecuentes a pesar de que son
perfectamente evitables; la primera descripcin de un brote de gastroenteritis data de
principios de 1900
En nuestro pas casos de brotes de ETA denunciados y confirmados, por este tipo
de microorganismos han sido espordicos, 3 brotes en los ltimos 9 aos.
B. cereus puede producir dos enterotoxinas: la toxina diarreica y la toxina emtica.
Los sntomas de la toxiinfeccin tienen dos formas de presentacin con presencia
de diarrea, dolores abdominales y vmitos.
Su perodo de incubacin vara de 4 a 16 horas luego de la ingesta del alimento
contaminado.
Los Laboratorios de Microbiologa Alimentaria de los Municipios con infraestructura
y capacidad analtica han realizado un seguimiento preventivo de este tipo de
microorganismos en los alimentos que por su naturaleza pueden representar un

vehculo de contaminacin. La resistencia trmica de esporas de B. cereus en un


medio con elevado contenido de agua vuelve a este microorganismo un potencial
peligro para el desarrollo de una intoxicacin, si las medidas higinico sanitarias y
de elaboracin no son las adecuadas.
Taxonoma.
La familia Bacillaceae contiene una diversidad de bacterias formadoras de esporas
incluyendo desde aerobios estrictos hasta anaerobios obligados, cocos y bacilos,
tanto psicrfilos como termfilos
Es un microorganismo Gram positivo en los cultivos jvenes y a medida que
envejece puede verse como Gram variable o Gram negativo. Las esporas aparecen
claras en la tincin de Gram y verdes con la tincin de esporas estas pueden estar
dentro de la pared bacteriana o puede deformar la pared.
Las temperaturas de crecimiento: mnima estn entre 15C a 20C y la mxima es
entre 40C a 45C con un ptimo de 37C.
Tiene una morfologa celular similar a la del B.anthracis pero a diferencia de ste, en
general es mvil y no es susceptible a la penicilina o al fago gamma. La produccin
de esporas en presencia de oxgeno es un rasgo que define el gnero, as como su
morfologa. Son saprofitos ampliamente distribuidos en el ambiente natural en
suelos de todo tipo, y puede ser encontrado en el polvo y en el aire, por lo tanto
tiene considerable oportunidad para estar presente en o sobre los alimentos. Las
esporas fcilmente sobreviven la distribucin en polvos y aerosoles siendo
vehiculizadas desde estos lugares a otros habitas. Los alimentos secos como
condimentos, leche en polvo y harinas pueden estar contaminadas con esporas.

Intoxicacin alimentaria:
Nos referiremos esencialmente al papel del Bacillus cereus en la intoxicacin
alimentaria dejando de lado las actividades purulenta y necrotizante cutneas que
pueden verse. Bacillus cereus causa intoxicaciones alimentarias a travs de la
ingesta de alimentos contaminados. En general se admite que, debido a la levedad
del cuadro y a que la deteccin microbiolgica de esta bacteria no se realiza
rutinariamente en pacientes diarreicos, la incidencia real puede ser superior a la
estimada. Mas si tenemos en cuenta, que el cuadro clnico se confunde a menudo

con los producidos por Staphylococcus aureus


dependiendo de qu toxina est involucrada.

y Clostridium perfringens,

La intoxicacin alimentaria puede ocurrir cuando los alimentos son preparados y


mantenidos sin la adecuada refrigeracin durante horas antes de ser servidos. El
consumo de alimentos que contienen 105 B.cereus/g o ms puede provocarla. Los
alimentos vinculados a brotes han sido carne y verduras cocidas, arroz frito o
hervido, crema de vainilla, sopas, leche y brotes de vegetales crudos.
Bacillus cereus produce dos enterotoxinas durante su crecimiento exponencial: la
toxina diarreica y la toxina emtica que dan lugar a dos formas clnicas distintas de
intoxicacin alimentaria.
El sndrome emtico est producido por una toxina preformada y termoestable, al
igual que la de S.aureus. Se asocia frecuentemente con arroz frito contaminado,
tiene un perodo de incubacin corto, habitualmente de 1 a 6 horas y predominan los
sntomas gastrointestinales altos manifestados por nuseas y vmitos. Este hecho ha
llevado a confundir la intoxicacin por B.cereus y atribuirla a S.aureus.
El sndrome diarreico por el contrario, est producido por la ingestin de alimentos
inadecuadamente refrigerados. Resulta de la esporulacin del organismo in vivo y de
la produccin de una enterotoxina diferente de la anterior, preformada y termolbil
tiene un perodo de incubacin ms largo que promedia entre 10 y 12 horas y las
manifestaciones se relacionan con la afectacin gastrointestinal baja similar a la
intoxicacin por Clostridiun perfringens . Los sntomas son dolor abdominal, diarrea
acuosa profusa, tenesmo y nauseas que generalmente duran 12-24 hrs. y en
algunos pacientes pueden durar ms tiempo, de 2 a 10 das.
El aislamiento de Bacillus cereus de las heces de los pacientes no es
documentacin suficiente del brote, a menos que se obtengan cultivos negativos de
materia fecal de un adecuado grupo control. Se puede realizar tipificacin serolgica
para estudios epidemiolgicos de disponer de los antisueros.
La intoxicacin alimentaria por Bacillus cereus es auto limitada y no requiere
tratamiento antimicrobiano, el tratamiento es sintomtico y ocasionalmente es
necesario rehidratacin.
VI.-MATERIALES E INSUMOS

Placas Petri
Pipetas
Tubos de ensayo
Matraz
Microscopio a 10x a 100x

Microscopio
Mechero bunsen
INSUMOS
Agar peptona
Agar Bacillus cereus

V.- METODOLOGIA
Procedimiento:
Se prepara el medio cultivo segn la indicaciones del frasco
Preparar las diluciones con 10 g de muestra en 90 ml de agua peptonada y
tubos de 9 ml cada uno. Diluir el alimento hasta 10-3
Sembrar por duplicado 0.1 ml de volumen el inoculo de cada dilucin en el
medio MYP y sembrar por diseminacin con una esptula de drigalsky
Dejar incubar a 48 h por 30C
Seleccionar las colonias sospechosas grandes ,irregulares, rosadas lisas
Escoger de cada placa 5 colonias y realice la prueba bioqumica
Realizar la confirmacin bioqumica, pre calculo y reporte en ufc/g de alimento.

Diagrama de coloracin Gram


Extendido y fijacin

Lavar por 1min

Cristal violeta

Lavar por 1min

Lugol

Alcohol acetona

Lavar por 1min

Safranina

lavar por 1 min

Observar a 10x y 100x


*color azul indica (+) y rosada y rojizo (-)
CALCULOS REALIZADOS
Para agar Bacillus cereus (para 6 placas)
20,5gr -------------------475 ml
X --------------------- 100 ml
X = 4.3 gr
Para agar peptona (para 2 tubos y 90ml de frasco)
10 gr------------------ 100 ml
X ---------------- 120 ml
X = 1,2 gr de peptona

DIAGRAMA DE FUJO DEL PROCEDIMIENTO (muestra solida)

10 gr de muestra de arroz cocido


1 ml

1 ml

90 ml
H2Op

9 ml

9ml

10

10

101
Inocular 0.1 ml
De cada dilucin

Siembra por desimanacin 15 ml de medio Agar Bacillus cereus + yema de huevo y


homogenizar con esptula de drigalski

Incubar por 48 ha 30C

Hacer la coloracin Gram

VI.- RESULTADOS
Cuadro N01 resultados obtenidos de Bacillus cereus en muestra de arroz
cocido
medios

Diluciones recuento

Tincin Gram

102

4 .9 x 104

Agar Bacillus
cereus
2 x 103
3

10

ufc/g

ufc/g

Gram positivo

Caractersticas
2

10

No hubo cambio

LIA
3

10

10

Cambio a color
amarillo: hay
degradacin de
glucosa
Cambio a amarillo
claro

TSI
10

Cambio a amarillo
claro

102

No cambio nada

103

No cambio nada

Simons

De color
violeta
(caracterstico
de Bacillus
cereus)

VII.-DISCUSIONES

Para obtener buenos resultados debemos homogenizar bien el alimento, por


otro lado tenemos que trabajar en condiciones aspticas para no contaminar
con otros microorganismos.
Una mal dilucin o diseminacin

no nos saldr bien buenos resultados

perjudicndonos en el conteo de los microorganismos en ufc/ml o gr de


alimento analizado.

VIII.- CONCLUSIONES
en la primera practica no se logr realizar una buena siembra ,dando a esto,
a hacer otro practica y obteniendo buenos resultados y de una carga
microbiana en el arroz cocido o cocinado,
logrando una carga microbiana de

4.9 x 10 4

ufc/g en una dilucin de

102

superando los lmites permisibles de la norma establecida.


Los causa que causan este microorganismo son la emtica y diarreica
produciendo dolores abdominales y del estmago cuando es ingerido ests
microorganismos por alimentos contaminados.

UNIVERSIDAD NACIONAL MICAELA BASTIDAS DE APURIMAC

FACULTAD DE INGENIERIA
ESCUELA ACADEMICO PROFESIONAL DE
INGENIERIA AGROINDUSTRIAL

INFORME N006-IA 504-SPE-CBD-SRK-VGJC-CCY-2015-EAPIA-UNAMBA


PARA: Ing. Sal Moreano Carrasco
DE: Edith Sinc Peralta

Daniel Camacho Batllanos


Katherine Saavedra Romn
Juan Carlos Vera Gutirrez (no aporto nada en el informe)
Yudy Chumbe Cahui
ASUNTO: INVESTIGACION YNUMERACION DE Staphylococcus aureus COAGULASA
POSITIVA

Fecha de ejecucin de la prctica: 29/07/15


Fecha de entrega de la prctica: 11 /07/15
Grupo: mircoles 4:00 a 6:00 pm
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

I.- RESUMEN
Staphylococcus aureus es un especie bacteriana integrada por formas cocaceas .es
una especie muy sensibles a la accin del calor y de los desinfectante. En esta
prctica se realiz con una finalidad de determinar la numeracin de S.aureus en
alimentos y las caractersticas de colonias representativas. Aisladas en un medio de
cultivo agar Baird Parker ms yema de huevo como emulsionante, efectuando con un
mtodo de diseminacin en placas. Dando que en las pruebas de confirm se dio
negativo en el acidez del manitol, mientras en las otras pruebas no se logr la
confirmacin, por motivos de inoperatividad del microscopio ptico o falta de un
mantenimiento de limpieza en su lente ptico respectivamente.
I.

INTRODUCCIN

Staphylococcus aureus es una especie bacteriana integrada por formas cocceas de


0,8-1,0 mm de dimetro, que se dividen en ms de un plano, por lo que se agrupan
irregularmente en racimos. Son inmviles y no forman esporas. Son Gram positivas.
Es una especie muy sensible a la accin del calor y de los desinfectantes.
Ms del 50 % de las personas son portadoras de S.aureus en fosas nasales,
garganta, fornculos, manos o pelo. Por eso su presencia en determinados niveles
en los alimentos es un signo evidente de falta de higiene en la manipulacin.
Adems algunas cepas de S.aureus son patgenas para el hombre porque producen
enterotoxinas que dan lugar a la intoxicacin estafiloccica. La dosis infectiva es alta
ya que es necesario un nmero de al menos 10 6 ufc/g para producir cantidad
suficiente de enterotoxinas para producir la enfermedad en el consumidor.
Puede ocurrir que no se detecte S. aureus en un alimento, que el nmero detectado
sea pequeo y que, sin embargo, exista cantidad detectable suficiente de
enterotoxinas estafiloccica. En este caso, los microorganismos que originaron la
toxina han ido descendiendo en nmero e, incluso, desapareciendo, mientras que la
toxina,
por
su
mayor
resistencia,
permanece
en
el
alimento.
El mtodo de recuento en placa se utiliza cuando se sospecha que el alimento por
analizar contiene ms de 100 S. aureus por gramo.

II.

OBJETIVOS:
Determinar la numeracin de staphylococcus aureus en alimentos.
Evala las caractersticas de las colonias y las clulas bacterianas al
microscopio ptico.

III.

MARCO TEORICO

DESCRIPCIN DE LA BACTERIA:
Staphylococcus es un gnero de bacterias anaerobias Gram-positivas productoras de
enterotoxinas termoestables ampliamente distribuida en el medio ambiente y presente en
las mucosas de los animales y personas, transmitindose al ser humano a travs de
alimentos contaminados, generndole una toxiinfeccin alimentaria.
LAS TRES CONDICIONES NECESARIAS PARA SU PTIMO DESARROLLO SON:
o PH cercano a la neutralidad
o Temperatura alrededor de 30C
o Ausencia de microorganismos competitivos.
Este ltimo punto es importante, ya que Staphylococcus aureus no es competitivo en
presencia de otros microorganismos.
Condiciones de crecimiento de las toxinas producidas por Staphylococcus aureus
Mnimo

ptimo

Temperatura

10

40-45

48

pH

7-8

9,6

0,85

0,98

0,99

Actividad
agua

del

Mximo

Staphylococcus se puede encontrar


a) medio ambiente como puede ser: aire, polvo, superficies en donde se manejan
alimentos, agua, agua residual
b) en alimentos: por ejemplo los que presentan un alto contenido proteico, como puede
ser la leche y derivados lcteos, tambin se desarrolla en aquellos alimentos que
presentan altas concentraciones de sal, uno de ellos sera el jamn; otro factor importante
en los alimentos es el pH, as tenemos en el caso de la mayonesa, sta tiene un pH lo
suficientemente bajo para inhibir el desarrollo de S. aureus, sin embargo, al diluirse y
neutralizarse en una ensalada por ejemplo, el pH asciende lo suficiente como para
permitir el desarrollo de este microorganismo enterotoxignico.
c) tambin se puede localizar en personas y animales.

Estos ltimos, los animales y las personas son los principales reservorios de estos
microorganismos.
En los humanos, las cepas de Staphylococcus habitan en forma especfica en el tracto
nasofarngeo, cabello y piel del 50% o ms de los individuos, sin causar dao aparente
(portadores asintomticos), pudiendo transferirse de los dedos y manos a los alimentos y
desarrollarse con rapidez en ellos. La especie aureus, es la considerada patgena dentro
del gnero Staphylococcus y est comnmente asociado a casos de artritis, osteomielitis,
meningitis, neumona y en algunos casos puede llegar a ocasionar prdida del
conocimiento. Las cepas de este microorganismo que producen enzimas extracelulares y
toxinas, son las ms importantes por ser causante de intoxicaciones alimentarias.
COMO SE PRODUCE LA CONTAMINACION EN LOS ALIMENTOS:
o los alimentos son susceptibles a una contaminacin post proceso con tipos
enterotoxignicos de Staphylococcus aureus, por ejemplo, si son sometidos a un
inadecuado manejo o bien a temperaturas de conservacin inapropiadas; este
problema se acenta por la ausencia de flora competitiva, que normalmente
restringe el desarrollo de este microorganismo
o El crecimiento de Staphylococcus aureus en alimentos, tiene gran importancia por
tratarse de un microorganismo capaz de producir una poderosa enterotoxina, que
al ingerirse causa intoxicaciones severas al hombre.
Como se mencion con anterioridad son 5 enterotoxinas: A, B, C, D y E, siendo la A la
ms nociva La cantidad de Staphylococcus aureus necesaria para producir suficiente
toxina (1.0 microgramo), para causar intoxicacin, es de 100 UFC/g de alimento, de
acuerdo con la Norma
o perceptible en cuanto a su apariencia, sabor y olor, por lo que no se distinguen de
los alimentos que no estn contaminados con este microorganismo, por esta razn
el peligro de ingerir alimentos contaminados con Staphylococcus aureus sin darse
cuenta es alto.
o Los alimentos sometidos a intensa manipulacin durante su preparacin y que se
mantienen a temperaturas de riesgo (por encima de 7.2 C y por debajo de 60

Enterotoxinas de S. aureus
Enterotoxina
Concepto
Enterotoxina A Asociada a la mayora de las intoxicaciones alimentarias.
Enterotoxina B Produce colitis pseudo-membranosa y se encuentra con

Regularidad en infecciones intra-hospitalarias.


Enterotoxina C Se atribuye a productos lcteos contaminados.
Enterotoxina D Tambin se asocia a un gran nmero de intoxicaciones
Y se atribuye a productos lcteos contaminados.
ALIMENTOS MS INVOLUCRADOS EN LA INTOXICACIN ESTAFILOCCCICA.
Los alimentos perecederos tales como:
o carnes crudas y procesadas, ensaladas, productos de pastelera, como pasteles
rellenos con crema, pies de crema, coberturas de chocolate, leche y sus derivados,
rellenos para sndwiches y papas, son los ms comnmente asociados con
intoxicaciones estafilocccicas.
SINTOMAS DE UNA INTOXICACION ALIMENTARIA:
El establecimiento de los sntomas de la intoxicacin, por lo general se presentan
rpidamente y en muchos casos de forma aguda, aunque depende de:
o la susceptibilidad de la persona hacia la toxina, la cantidad consumida del alimento
contaminado, la cantidad de toxina en el mismo y en general la salud del individuo.
Los sntomas ms comunes de intoxicacin consisten en:
o nusea, vmito, dolor o espasmos abdominales y postracin. Sin embargo, existen
algunos individuos que pueden no manifestar todos estos sntomas asociados a la
enfermedad.
o En casos ms severos, se puede presentar dolor de cabeza, calambres
musculares as como cambios intermitentes en la presin sangunea y pulso. La
recuperacin parcial se alcanza a los 2 das, sin embargo la recuperacin completa
puede durar ms das en casos muy severos.

COAGULASA-POSITIVO:
El trmino Staphylococcus coagulasa-positivo se utiliza para describir aquellas cepas que
secretan una enzima que provoca coagulacin del fibringeno sanguneo, utilizando el
microorganismo esta capacidad contra la fagocitosis y otros mecanismos de defensa del
husped.

Esta reaccin se utiliza in vitro para la identificacin de cepas de Staphylococcus


productoras de toxinas, mediante el uso de plasma. Algunas razones para determinar
Staphylococcus aureus son: Confirmar la presencia de este microorganismo como agente
causal de intoxicaciones.
Determinar si un alimento o ingrediente de los mismos, es fuente potencial de este
microorganismo enterotoxignico. Demostrar la contaminacin pos proceso, la cual es
usualmente debida a contacto humano o con superficies inadecuadamente sanitadas.

Cultivo
Los estafilococos crecen rpidamente en casi todos los medios bacteriolgicos bajo
condiciones aerobias o microaeroflicas.
Tiempo de cultivo en Sal-manitol

24 h

Recomendado para los cultivos de muestras no contaminadas

24-48 h

Usado en cultivos mixtos/contaminados.


Recomendado para conseguir colonias de tamao adecuado para
microscopio y pruebas.

72 h

Puede ser necesaria para aumentar la sensibilidad de las pruebas.

Los Medios diferenciales para S.aureus son el medio:


manitol-salino o Chapman y el medio Baird-Parker.
Estos medios comerciales verifican la presencia de -glucosidasa durante
el desarrollo (las colonias de S.aureus coagulasa negativos crecen en color
azul, blanco o beige).
Su temperatura ptima de crecimiento va de 35 a 40 C y el pH ptimo
oscila entre 7,0 y 7,5 aunque soportan pH mucho ms extremos. Soportan
tasas elevadas de cloruro sdico, hasta un 15%.
Medidas de control y prevencin
En la cadena alimentaria

o En las explotaciones y durante el sacrificio es importante aplicar las buenas


prcticas agrcolas (BPA) y las buenas prcticas higinicas (BPH) que contribuyen a reducir el nmero de Staphylococcus.
o Durante la transformacin de los alimentos, hay que evitar el uso de materias
primas que puedan ser contaminadas con S. aureus (aunque se elimine la
bacteria por tratamiento trmico, las enterotoxinas pueden estar presentes y
su eliminacin es muy difcil).
Por tanto, es importante cumplir con los criterios microbiolgicos de las materias primas y
los sistemas de autocontrol basados en el Anlisis de Peli-gros y Puntos de Control Crtico
(APPCC).
Tratamientos de inactivacin
Los fabricantes de alimentos envasados deben someter a sus productos a una
temperatura elevada durante un periodo de tiempo determinado para garantizar que
no se formen las enterotoxinas estafiloccicas.
o El tratamiento principal de inactivacin de Staphylococcus aureus consiste en
aplicar calor por encima de 45C, pero si las toxinas ya se han formado
previa-mente, la destruccin de las clulas viables de la bacteria no inactiva la
actividad biolgica de las enterotoxinas estafiloccicas formadas. Asimismo,
es necesario mantener la cadena de fro durante el transporte,
almacenamiento y distribucin de los alimentos crudos susceptibles de ser
contaminados con Staphylococcus.
En usos diarios
Muchos de los brotes de intoxicacin de enterotoxinas estafiloccicas se producen
en el hogar por un inadecuado cocinado (<45C) y mala conservacin de los
alimentos (>10C), por lo que es recomendable seguir ciertas buenas prcticas de
higiene y manipulacin en la preparacin de los alimentos, especialmente en
alimentos que vayan a consumirse crudos o con tratamientos leves de conservacin.
Limpieza de las manos antes de manipular cualquier alimento.
Desinfeccin de los utensilios, tablas, superficies.
No consumir embutidos de procedencia no garantizada.
Cocinar bien los huevos, las carnes (vacuno, ternera, cordero, aves), los pescados,
y los productos elaborados con ellas y mantenerlos calientes hasta su consumo. Tras
su consumo, refrigerar los excedentes lo antes posible (5C).
No descongelar los alimentos a temperatura ambiente, sino en la parte baja del
frigorfico.
Evitar la contaminacin cruzada de alimentos crudos con cocinados.

Lavar bien las frutas y hortalizas con agua corriente cuando vayan a ser
consumidos en crudo.
Mantener la cadena de fro durante el transporte de los alimentos crudos
susceptibles de ser contaminados con S. aureus.
Mantener los alimentos elaborados con huevo crudo como mayonesa, salsas,
helados, cremas, masas de pastelera a temperaturas seguras (calientes por encima
de 60C o refrigerados en la nevera) hasta su consumo.
Cuadro N01 lmites permisibles
Alimento

Quesos a base de
leche cruda

Lmite microbiolgico mximo


permitido

104 105 ufc/g

Quesos hechos a base de leche


sometida a un tratamiento trmico
inferior a la pasteurizacin (7) y quesos
madurados a base de leche o suero
sometidos a pasteurizacin o tratamiento
trmico ms fuerte (7)
Quesos blandos no
madurados
(quesos frescos) a
base de leche o
suero sometido a
pasteurizacin o un 10 100 ufc/g
tratamiento trmico
ms fuerte (7)

Leche en polvo y

Fase en la que se
aplica el criterio

Accin en caso
de resultados
insatisfactorios

En el momento del
proceso de
fabricacin en el
que se prevea que
el nmero de
estafilococos ser
el mximo

Mejoras en la
higiene de la
produccin y
seleccin de las
materias primas. Si
se detectan valores
> 105ufc/g, el lote
de queso deber
ser sometido a
pruebas para
enterotoxinas
estafiloccicas

100 1000 ufc/g

Final del proceso


de fabricacin

Final del proceso

Mejoras en la
higiene de la
produccin. Si se
detectan valores >
105ufc/g, el lote de
queso deber ser
sometido a
pruebas para
enterotoxinas
estafiloccicas
Mejoras en la
higiene de la
produccin. Si se
detectan valores >

suero en polvo (4)

10 100 ufc/g

de fabricacin

105ufc/g, el lote de
queso deber ser
sometido a
pruebas para
enterotoxinas
estafiloccicas

(4) El criterio no se aplica a los productos destinados a una transformacin posterior


en la industria alimentaria.
(7) Excluidos los quesos en los que el fabricante pueda demostrar, a satisfaccin de las
autoridades competentes, que el producto no plantea un riesgo de enterotoxina
estafiloccica.
IV.

MATERIALES E INSUMOS
Queso fresco
Balanza digital
Placas preti
Pipetas
Frasco tapa rosca
Contador de colonias
Esptula de drigalski
Varilla de vidrio
INSUMOS
Agar Baird Parker
Agar manitol sado
Emulsin de yema de huevo
REACTIVOS Y COLORANTES
Reactivo para la catalasa (perxido de hidrogeno)
Kit para la coloracin Gram
Cepas o patrones de referencia}

V.

PROCESDIMIENTO

PARA EL DA 1 Y 2

Pesar 10 gr de muestra colocar en un recipiente que contiene 90 ml de agua


peptona al 0.1% mezclar y homogenizar por 1 min y proceder a preparar las
diluciones.
Preparar las diluciones hasta 10-3 e inocular 1 ml de cada dilucin en placas
preti de 15 mm de agar Baird Parker por duplicado para cada dilucin.

Incubar a 35Co 37C/24 horas.


Seleccionar para la numeracin 0.1 ml de homogenizado de sus diluciones
respectivamente a la superficie del medio Baird Parker.

DIA 3

Elegir las placas que contienen colonias negras y brillantes de margen


estrecho y blanco rodeadas reas claras .para hacer un recuento elegir
las placas entre 20 a 200 colonias aisladas y contar.
Seguidamente repicar no menos de 5 colonias sospechosas de S.aureus
en agar manitol, realza la prueba de la catalasa, coloracin Gram.

CALCULOS REALIZADOS:
Para agar Baird Parker

Para agar manitol

63 gr-------------------950ml

111gr------------------1000 ml

X-------------------92ml

X--------------------35 ml

X= 6.10 gr de Baird Parker

X= 3.9 gr

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Para agua peptona


120 ml-----------------100%
X----------------1%
X= 1.2 gr

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DIAGRAMA DE FLUJO DE PROCEDIMIENTO (muestra solida)

DIAGRAMA DE COLORACION GRAM


Extendido y fijacin

Lavar por 1min

Cristal violeta

Lavar por 1min

Lugol

Lavar por 1min

Alcohol acetona

Safranina

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Observar a 10x y 100x


VI.

RESULTADOS

Cuadro N02 de investigacin y numeracin de Staphylococcus aureus


coagulasa positiva.
Medio de
cultivo

Factor de
dilucin (ml)

Agar Baird
Parker +
yema de
huevo

Color de
colonias

101

Amarillento
cremoso

102

Amarillento
cremoso

Por
cuadrantes
49

37

26

25

13

10

24

Ufc/ml

1.37 x 104

5.1 x 10

103

translucidos
cremosos

Volumen de dilucin = 0.1ml / Ufc/ml=

1
5

0
3

9 x 10

N
VxFd

Cuadro N03 prueba de confirmacin de coagulosa positiva.


Coloracin
Gram

Acidez del
manitol

Prueba de catalasa

Se realiz la
coloracin Gram
respectivamente
con dos
portaobjetos. No
se logr divisar

En el agar
manitol dio un
viraje de color
rojo, esto nos
indica que es
negativo (-).

En esta prueba no tenamos el reactivo


(perxido de hidrogeno al 3%), se intent
hacer con el 0,025% de H2O2. sin
embargo este concentrado no era lo
adecuado para descomponer la enzima
de catalasa.

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cocos en
racimos en el
microscopio
ptico.

VII.

Por lo tanto no se logr observar la


efervescencia.

DISCUSIONES
Este microrganismo Staphylococcus aureus es reconocido como
patgeno humano siendo el agente de un amplio aspecto de intoxicacin
de origen comunitario y hospitalario.

En el momento del proceso de fabricacin en el que se prevea que el


nmero de estafilococos ser el mximo 104105 ufc/g o

1.04105 x 10

ufc/g de colonias, pero sin embargo el nmero de colonias encontradas


en queso fresco era de la prctica era de

1.37 x 104

ufc/g dando en un

parmetro permisible de consumo humano.

Haciendo las pruebas respectivas de Staphylococcus aureus

de
coagulasa positiva, encontrando una prueba negativa en la prueba
confirmativa de acidez del manitol, mientras en la coloracin y de la
catalasa no se observ bien las caractersticas de S.aureus. Por factores
de problema del microscopio ptico y un reactivo que no se encontr en
laboratorio de microbiologa.

VIII.

CONCLUSIONES
Pudimos ver: cmo podemos mostrar en los resultados con una carga
microbiana fue de

1.37 x 10

ufc/g, la especie calculada corresponde a

S.aureus coagulasa positiva, esto nos representa que el alimento es en


lmites permisibles de consumo segn las nomas dadas.

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Siendo

productoras de enfermedades que puede causar


este
microorganismo son los vmitos violentos y hasta puede ser
incontrolables. Los alimentos implicados y ms frecuentes son: pollo,
crema productos de panadera y quesos elaborados.

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