WESTERN BLOT

La tcnica del Western Blot (tambin llamado inmunoblotting debido a que se utilizan
anticuerpos para detectar el antgeno o los antgenos especficos de inters) fue
descrita por primera vez por Towbin et al. en 1979. La especificidad de la unin
antgeno anticuerpo permite la deteccin de una nica protena dentro de una
mezcla compleja de otras protenas. En la actualidad se utiliza como criterio de
identificacin positivo de una protena especifica en una mezcla compleja y para
obtener datos cualitativos y semicuantitativos sobre la misma.

PASOS
Preparacin de la muestra

Obtener extracto de protenas a partir de cultivos celulares o tejidos:

Una pequea cantidad del tejido se introduce en un buffer de extraccin. Despus se

procede a homogeneizarlos. Por ltimo se centrifuga para obtener las protenas en el
sobrenadante, la fraccin no precipitada.

Electroforesis
Las protenas de la muestra sern separadas mediante una electroforesis en gel en
funcin de uno o varios de estos criterios: punto isoelctrico, peso molecular y carga
elctrica. La naturaleza de la separacin depende del tratamiento de la muestra y de la
naturaleza del gel.

Transferencia de las protenas a una menbrana

Para que las protenas sean accesibles a la deteccin por anticuerpos, se las
transfiere desde el gel de poliacrilamida a una membrana de nitrocelulosa o de PVDF.
Esta transferencia puede realizarse por difusin, capilaridad, por vaco o por
electroelucin (o transferencia electrofortica), aunque ste ultimo es el ms
ampliamente utilizado en la mayora de las ocasiones por su rapidez y alta eficacia de
transferencia.
Este mtodo se basa en la movilidad electrofortica de las protenas para transferirlas
desde el gel hasta la membrana e implica poner en contacto directo el gel de
poliacrilamida con las protenas con la membrana de nitrocelulosa o de cualquier otro
material adecuado para la unin de las mismas, formando un sndwich entre dos
electrodos sumergidos en una solucin conductora.

Bloqueo de los sitios de unin inespecficos

Es muy importante en un Western Blot bloquear los sitios de unin de la membrana sin
reaccionar con el antgeno, para reducir la unin inespecfica de las protenas durante
los siguientes pasos del ensayo. En la actualidad se utilizan una amplia variedad de
tampones de bloqueo (desde la simple leche o suero normal y corriente hasta
protenas altamente purificadas) para bloquear los sitios sin reaccionar de la
membrana. Estos tampones de bloqueo, lo que hacen es incrementar la sensibilidad
del ensayo reduciendo la interferencia por el ruido de fondo (background).

Lavado de la membrana
Como otros Inmunoensayos, el Western Blot consiste en una serie de pasos de
incubacin con diferentes reactivos (tampones de bloqueo, anticuerpos, etc.)
separados por pasos de lavado. Estos lavados son necesarios para eliminar los
excesos de reactivos no unidos y para reducir el ruido de fondo, ayudando a
incrementar la relacin seal:ruido. Un lavado insuficiente de la membrana ocasionara
un elevado ruido de fondo, mientras que un exceso del mismo puede ocasionar una
disminucin de la sensibilidad debido al lavado del antgeno y/o anticuerpo de la
membrana.
Para realizar estos lavados, se pueden utilizar una gran variedad de tampones:
tampones fisiolgicos como el TBS o el PBS sin ms conservantes, aunque en la
mayora de las ocasiones se aade a los mismos un detergente como el Tween-20
(0,05%) para ayudar a eliminar el material unido inespecficamente.

Anticuerpos primarios y secundarios

La eleccin del anticuerpo primario para un Western Blot depender del antgeno que
se desee detectar y de los anticuerpos disponibles para ese antgeno en concreto. Se
pueden utilizar tanto anticuerpos monoclonales como policlonales para realizar un
Western Blot; los policlonales son bastante ms baratos, se tardan menos en producir
y normalmente tienen una elevada afinidad por su antgeno; los monoclonales son
muy valorados por su gran especificidad, pureza y consistencia que originan un menor
ruido de fondo.
De la misma manera, hay una gran variedad de anticuerpos secundarios marcados de
diferentes maneras para la deteccin del Western Blot. Su eleccin depende de la
especie en la que se haya obtenido el anticuerpo primario (la hospedadora); por
ejemplo, si el anticuerpo primario es un anticuerpo monoclonal de ratn, entonces el
secundario debe ser un anticuerpo anti-ratn obtenido en un hospedador diferente del
ratn.
Marcaje de anticuerpos
La eleccin del anticuerpo secundario tambin depende del tipo de marcaje que se
desee. Hace algunos aos se utilizaban mayoritariamente los radioistopos, pero eran
muy caros y no ofrecen ninguna mejora de la relacin seal:ruido. Como marcajes
alternativos, en los ltimos aos se han desarrollado los marcajes con biotina,
fluorforos o enzimas:
El uso de fluorforos requiere de menos pasos durante el proceso pero necesita de
equipamiento especial para visualizar la fluorescencia, sobre todo si se desea tener un
registro permanente de los resultados.
El marcaje con enzimas se utiliza ms ampliamente y, aunque necesita algunos
pasos extra, suelen ser bastante sensibles.Las dos enzimas que ms se utilizan son la
fosfatasa alcalina (AP) y la peroxidasa de rbano (HRP) y hay una amplia variedad de
sustratos
cromognicos,
fluorognicos
y
quimioluminiscentes
disponibles
comercialmente para cada enzima.
Tabla I. Comparacin de las enzimas HRP y AP

Tamao:
Precio:
Estabilidad:
Sustratos
disponibles:
Cintica:
pH ptimo:

Peroxidasa de rbano
(HRP)
40 kDa
Relativamente barata
Estable a <0C
Muchos
Rpida
57

Fosfatasa alcalina (AP)

140 kDa
Relativamente cara
Inestable a <0C
Pocos
Lenta
8 10

Sustratos cromognicos
Hay un gran nmero de sustratos disponibles comercialmente y su eleccin depende,
entre otros factores, de la enzima utilizada (AP o HRP), la sensibilidad deseada y el
mtodo de deteccin o tipo de seal que se busque (colorimetra, fluorescencia,
quimioluminiscencia, etc.).
Los sustratos cromognicos son los ms ampliamente utilizados y proporcionan el
mtodo de deteccin ms barato y sencillo; cuando estos sustratos entran en contacto
con la enzima correspondiente, se transforman en productos insolubles coloreados
que precipitan sobre la membrana, por lo que no necesitan ninguna instrumentacin
especial para realizar la visualizacin de los resultados. Para la HRP los sustratos ms
utilizados son el TMB (3,3,5,5-tetrametil-benzidina), el 4-CN (4-cloro-1-naftol) y el
DAB (tetrahidrocloruro de 3,3-diaminobenzidina).
Sustratos quimioluminiscentes
El proceso de la quimioluminiscencia se define como la emisin de energa en forma
de luz a partir de una sustancia, como consecuencia de una reaccin qumica. El
luminol es uno de los sustratos ms ampliamente utilizados y su oxidacin en
presencia de perxido, origina la formacin de un producto en estado excitado llamado
3-aminoftalato, que al pasar a un estado de energa menor, emite fotones de luz.
En una reaccin quimioluminiscente, el sustrato es el reactivo limitante de la reaccin y
en cuanto que ste se acaba, termina la emisin de luz por ello es critico la
optimizacin de la aplicacin utilizando las concentraciones ms adecuadas de
anticuerpos primario y secundario; si hay mucho anticuerpo presente, el sustrato es
utilizado muy rpidamente, por lo que la seal durara muy poco tiempo y adems
obtendremos mucho ruido de fondo y una baja sensibilidad del ensayo.

Captura de los datos

Los ms utilizados son las pelculas de autoradiografa o las cmaras CCD
refrigeradas, que tienen la ventaja de permitir la manipulacin en tiempo real de las
imgenes, eliminar la necesidad de tener una cmara oscura y el equipamiento
necesario para el procesamiento de las pelculas de autoradiografa, poseer una
mayor sensibilidad y resolucin y, sobre todo, tener un mayor rango dinmico que las
pelculas de autoradiografa; no obstante, tienen la desventaja de que necesitan la
utilizacin de sustratos quimioluminiscentes que produzcan una seal intensa y de
duracin suficiente para ser capturada por la cmara.

Marcadores de peso molecular

Para la deteccin en cualquier Western Blot, es muy aconsejable la utilizacin de
marcadores de peso molecular preteidos que se transfieren a la membrana
conjuntamente con las protenas de la muestra y permiten estimar del peso molecular
de las bandas de las protenas que se detecten al final del Western Blot.

Como ya se ha mencionado anteriormente, cuando se utilizan sustratos

quimioluminiscentes en un Western Blot, las bandas de las protenas se detectan en
una pelcula de autoradiografa o con equipos de imagen digitales, por lo que surge el
inconveniente de que los marcadores de peso molecular no se pueden observar ya
que no producen emisin de luz. Para solucionar este punto, en los ltimos aos se
han desarrollado marcadores de peso molecular que poseen dominios de unin
de la protena A o G, los cuales capturan los anticuerpos utilizados como reactivos de
deteccin en la posicin de cada banda del marcador, por lo que permiten ser
visualizados junto con los datos experimentales a la hora de hacer el revelado
fotogrfico.

Lavado y redeteccin de una membrana

Una membrana puede ser lavada y vuelta a detectar muchas veces para visualizar
otras protenas o para optimizar la deteccin de la misma protena variando las
concentraciones de los anticuerpos primario y secundario sin necesidad de correr
numerosos geles y realizar mltiples transferencias. La clave de este procedimiento es
utilizar condiciones que provoquen la ruptura de la unin entre los anticuerpos y los
antgenos sin que esto ocasiones una significativa liberacin de dichos antgenos
(protenas de la muestra) de la membrana.
Despus del proceso de lavado de la membrana, se debera comprobar que todos los
reactivos de deteccin han sido eliminados; para ello, debe lavarse varias veces la
membrana con agente bloqueante e incubada solamente con el anticuerpo secundario
y el sustrato quimioluminiscente. Si el anticuerpo primario ha sido efectivamente
eliminado de la membrana por el proceso de lavado, el anticuerpo secundario no
debera unirse a la membrana por lo que no debera observarse seal alguna; si
todava se observan bandas en la membrana, debe repetirse el proceso de lavado en
condiciones ms intensas. Normalmente basta con incrementar el tiempo de la
reaccin de lavado o la temperatura, aunque a veces es necesario cambiar la
composicin del tampn de lavado o cambiar el protocolo completamente.

(A)Mtodo
directo
de
deteccin:
el
anticuerpo primario marcado se une al antgeno
de la membrana y reacciona con el sustrato
originando una seal detectable.
(B)Mtodo indirecto de deteccin: el
anticuerpo primario sin marcar reacciona con el
antgeno. Luego, un anticuerpo secundario
marcado se une al primario y reacciona con el
sustrato.