RESOLUCIN OIV/OENO 340/2010

DETERMINACIN DE LA ACTIVIDAD -GLUCANASA ( 1-3, 1-6)EN LAS PREPARACIONES

ENZIMTICAS
LA ASAMBLEA GENERAL
Visto el artculo 2, apartado 2 iv, del Acuerdo del 3 de abril de 2001 por el cual se cre de la
Organizacin Internacional de la Via y el Vino
Tras conocer los trabajos del grupo de expertos Especificidad de los productos enolgicos,
DECIDE, a propuesta la Comisin II Enologa, completar el captulo II del Cdigo
Internacional de las Prcticas Enolgicas con las tcnicas de anlisis y de control siguientes:
DETERMINACIN DE LA ACTIVIDAD -GLUCANASA ( 1-3, 1-6)
EN LAS PREPARACIONES ENZIMTICAS
1. MBITO DE APLICACIN
Materias primas
comerciales.

que

contengan

enzimas

con

actividad

-glucanasa

preparaciones

2. FUNDAMENTO
El mtodo de anlisis se basa en la determinacin cuantitativa de la glucosa liberada por la
enzima, cuya actividad se quiere medir, a partir de una solucin patrn de glucano
Schizophyllum sp. comn.
2.1 Definicin de las unidades:
La unidad -glucanasa (-Glu-U) se define como la cantidad de azcares reductores (en forma
de glucosa) que se liberan en condiciones de laboratorio con 1 gramo (o 1 mililitro) de enzima
por minuto.
2.2 Papel de la enzima
Durante el desarrollo de Botrytis cinerea sobre las uvas infectadas, lo que se conoce como
podredumbre gris o noble, el hongo excreta un -1,3-glucano en el que cada tres unidades de
glucosa hay una glucosilada en -1,6. (Fig. 1). Este glucano es muy similar al glucano
sintetizado por Schizophyllum sp. comn.
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2.3 Fundamento de la medida

La actividad enzimtica libera glucosa que, en medio bsico, produce la reduccin del cido
3,5-dinitrosaliclico a cido 3-amino-5-nitrosaliclico. El fenol aumenta la sensibilidad de la
reaccin. El hidrogenosulfito de sodio fija la coloracin.

3. MATERIAL
3.1 Espectrofotmetro y cubetas de 1 cm de paso ptico
3.2 Bao Mara 40C, 100C
3.3 Agitador magntico estndar
3.4 Agitador magntico mltiple, a 300 rpm
3.5 Recipientes de medida (matraces aforados, vasos de precipitados, matraces de
Erlenmeyer, etc.)
3.6 Becher
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3.7 Micropipetas
3.8 Cronmetro
3.9 Homogeneizador ultrasnico
3.10 Pehachmetro
4. REACTIVOS Y SUSTANCIAS
4.1 Sustrato
Disolucin madre de glucano facilitada por la Universidad de Braunschweig1 y cuya
concentracin de glucano ha sido determinada por dicha institucin.
4.2 Sustancias puras
4.2.1
4.2.2
4.2.3
4.2.4
4.2.5
4.2.6
4.2.7
4.2.8

cido ctrico (monohidrato) (CAS N 5949-29-1)

Hidrxido de sodio (CAS N 1310-73-2)
Tartrato de sodio y de potasio (CAS N 304-59-6)
Metabisulfito de sodio Na2O5S2 (CAS N 7681-57-4)
Fenol (CAS N 108-95-2)
Glucosa anhidra
cido 3,5-dinitro-2-hidroxibenzoico (3,5-dinitrosaliclico) (CAS N 609-99-4)
Agua destilada

4.3 Disoluciones
4.3.1 Disolucin de hidrxido de sodio 1 M
En un matraz aforado, disolver 4,0 g de hidrxido de sodio (4.2.2) con agua destilada (4.2.8) y
enrasar.
4.3.2 Disolucin tampn de citrato (pH 4,0), 0,2 mol/l
En un matraz aforado de 500 ml, disolver 21,0 g de cido ctrico monohidratado (4.2.1) con
400 ml de agua destilada. Ajustar el pH a 4,0 con una solucin molar de hidrxido de sodio
(4.3.1) y enrasar con agua destilada (4.2.8).
4.3.3 Disolucin tampn de citrato (pH 4,0), 0,1 mol/l
En un matraz aforado de 1000 ml, disolver 21,0 g de cido ctrico monohidratado (4.2.1) con
900 ml de agua destilada (4.2.8). Ajustar el pH a 4,0 con una solucin molar de hidrxido de
sodio (4.3.1) y enrasar con agua destilada (4.2.8).
4.3.4 Disolucin valorante: reactivo de color cido dinitrosaliclico (DNS) con fenol
Se prepara a partir de las disoluciones A, B y C siguientes:
4.3.4.1 Disolucin A
Pesar 154,2 g de tartrato de sodio y de potasio (4.2.3) en un vaso de precipitados de 800 ml y
disolver totalmente en 500 ml de agua destilada (4.2.8). Aadir 9,7 g de hidrxido de sodio
(4.2.2).
4.3.4.2 Disolucin B
En un vaso de precipitados de 2000 ml, disolver totalmente 5,3 g de cido 3,5-dinitrosaliclico
(4.2.7) en 500 ml de agua destilada (4.2.8). Los mejores resultados se obtienen con el
homogeneizador
ultrasnico.
4.3.4.3 Disolucin C

Prof. Dr. Udo Rau, Technical University Braunschweig, Department of Biochemistry and Biotechnology
Spielmannstr. 7, 38106 Braunschweig - Germany

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En un vaso de precipitados de 100 ml, disolver 4,2 g de fenol (4.2.5) en 50 ml de agua

destilada (4.2.8). Aadir 1 g de hidrxido de sodio (4.2.2) y, una vez disuelto totalmente,
4,2 g de bisulfito de sodio (4.2.4) y volver a mezclar.
4.3.4.4 Disolucin de glucosa al 0,3 %
Poner 300 mg de glucosa (4.2.6) en un matraz aforado de 100 ml, disolver en agua destilada
(4.2.8) y enrasar.
4.3.4.5 Reactivo DNS con fenol
Mezclar las disoluciones A y C con la B en un vaso de precipitados de 2000 ml y tapar con
papel de aluminio.
Antes de utilizar, conservar al resguardo de la luz durante al menos 3 das.
Trasvasar el reactivo a un frasco de vidrio ambar.
Puede conservarse durante un mes en un lugar oscuro y a una temperatura de entre 15 C y
20 C.
Cada vez que se vuelve a preparar un reactivo y antes de cada medicin, deber realizarse
hay que realizar un calibrado antes de proceder al anlisis de la enzima.
Antes de cada uso, se han de aadir 3 ml de glucosa al 0,3 % (4.3.3.4) a 200 ml del reactivo
DNS con fenol.
4.3.5 Glucano en disolucin al 0,1 %, pH 4,0
Pesar la cantidad exacta de disolucin madre de glucano (4.1) necesaria para obtener una
concentracin final de 1 g/l.
La disolucin final de sustrato debe contener un 50 % de solucin tampn de citrato (pH 4,0),
0,2 mol/l (4.3.2).
Para obtener 100 ml de disolucin a partir de una disolucin madre de glucano (4.1) que
contenga 5,2 g/l, se toman 19,2 g y se pesan en un vaso de precipitados de 100 ml. Se
aaden 50 ml de la solucin tampn de citrato (pH 4,0), 0,2 mol/l. Para obtener una mezcla
homognea, se remueve durante al menos 15 minutos. Una vez la disolucin est bien
homogeneizada, se ajusta el pH a 4,0 con una solucin molar de hidrxido de sodio (4.3.1).
Posteriormente, se transfiere la disolucin a un matraz aforado de 100 ml y se enrasar con
agua destilada (4.2.8).
Las disoluciones madres de glucano se almacenan a temperatura ambiente. Si se utiliza una
nueva disolucin madre de glucano, se ha de determinar el factor de sustrato (Gf o factor de
glucano) mediante la enzima estndar. El factor Gf resulta indispensable para comparar los
resultados obtenidos con disoluciones madres distintas. El factor Gf se calcula a partir de una
frmula con los valores medidos teniendo en cuenta que la actividad enzimtica estndar es de
10000 -Glu U/g (vase el apartado correspondiente al clculo de la actividad enzimtica).
4.4 Preparaciones enzimticas
4.4.1 Disolucin enzimtica estndar de glucanasa:
Se disuelven 0,5 g de la preparacin enximtica estandar de glucanasa en 25 ml de la
disolucin tampn de citrato (pH 4,0; 0,1 mol/l) (4.3.3) y se enrasa a 100 ml con agua
destilada (4.2.8).
4.4.2 Para el resto de preparaciones enzimticas:
Se toma 1 ml de la preparacin enzimtica, o 0,5 g si se trata de una preparacin slida en
polvo o granulado. Se disuelve en 25 ml de la disolucin tampn de citrato (pH 4,0; 0,1 mol/l)
(4.3.3) y se enrasa a 100 ml con agua destilada (4.2.8). Si los valores de absorcin son
demasiado altos o demasiado bajos (intervalo de absorbancia 0.1-0.6), deber realizarse una
dilucin adecuada. La disolucin de enzimas deber contener un 25 % de disolucin tampn de
citrato (4.3.3).
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5. PROCEDIMIENTO
5.1 Blanco de reactivo
En un matraz aforado de 50 ml, aadir 7 ml de reactivo DNS con fenol (4.3.4) a 3 ml de agua
destilada (4.2.8) y calentar durante 10 minutos en un bao Mara en ebullicin. Enfriar el
matraz durante 5 minutos en hielo. Introducirlo despus en el bao Mara a 20 C y aadir
agua destilada (4.2.8) por debajo de la lnea de enrase. Enrasar una vez transcurridos 10
minutos a 20 C.
5.2 Curva de calibrado de la glucosa (con reactivo DNS con fenol)
Disolver 2,00 g de glucosa (4.2.6) en un matraz aforado de 200 ml y enrasar con agua
destilada (4.2.8). A partir de esta disolucin, preparar la serie de disoluciones siguiente:

N.
1
2
3
4
5
6
7

V solucin patrn /
100 ml
2 ml
5 ml
10 ml
15 ml
20 ml
30 ml
40 ml

glucosa/100 ml
20 mg
50 mg
100 mg
150 mg
200 mg
300 mg
400 mg

glucosa (g) en la muestra

(0,5 ml)
100 g
250 g
500 g
750 g
1000 g
1500 g
2000 g

Pipetear 0,5 ml de cada disolucin de la serie y ponerlos en matraces aforados de 50 ml.

Aadir 7 ml del reactivo DNS con fenol (4.3.4) y 2,5 ml de agua destilada (4.2.8). Calentar los
matraces durante 10 minutos exactos en un bao Mara en ebullicin. Enfriar durante 5
minutos en un bao de hielo. Introducir los matraces en un bao Mara a 20 C y aadir agua
destilada (4.2.8) por debajo de la lnea de enrase. Enrasar una vez transcurridos 10 minutos a
20 C. Con un espectrofotmetro, medir la absorbancia de las disoluciones 515 nm de
longitud de onda respecto al blanco (que contiene slo reactivo).
Representar en una grfica la cantidad de glucosa en cada disolucin de la serie frente a los
valores de absorcin a 515 nm (Fig. 2).
La curva de calibrado se debe elaborar el mismo da, antes de cada anlisis de la enzima.

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Figura 2
5.3 Determinacin del blanco de las enzimas
Pipetear 0,5 ml de las disoluciones enzimticas (4.4.1 o 4.4.2) y ponerlos en matraces
aforados de 50 ml. Aadir 7 ml del reactivo DNS con fenol (4.3.4). Mezclar con esmero y
aadir 2,5 ml de la disolucin de sustrato (4.3.5). Mezclar bien agitando los matraces con la
mano. Calentarlos en un bao Mara en ebullicin durante 10 minutos exactos. Enfriar los
matraces durante 5 minutos en hielo e introducirlos en un bao Mara a 20 C. Aadir agua
destilada (4.2.8) por debajo de la lnea de enrase. Enrasar una vez transcurridos 10 minutos a
20 C. Con un espectrofotmetro, medir la absorbancia de las disoluciones 515 nm de
longitud de onda respecto al blanco (que contiene slo reactivo).
5.4 Medida de la actividad de las preparaciones enzimticas
Para cada muestra, disponer 10 ml de sustrato (4.3.5) en un matraz de Erlenmeyer y calentar
durante 5 minutos en un bao Mara a 40 C. Para homogeneizar las muestras se ha de utilizar
un agitador magntico mltiple a 300 rpm.
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Transcurridos 5 minutos, se aaden 2 ml de las disoluciones enzimticas (4.4.1 o 4.4.2) al

primer matraz e inmediatamente despus se pone en marcha un cronmetro.
A continuacin, aadir las disoluciones enzimticas restantes a los dems matraces espaciando
las adiciones 30 segundos.
Agitar las muestras a 300 rpm a lo largo de toda la reaccin.
Tras exactamente 15 minutos, se pipetean 3 ml de la primera mezcla y se transfieren a un
matraz aforado de 50 ml con 7 ml de reactivo DNS con fenol (4.3.4). Repetir la operacin con
todas las mezclas, dejando transcurrir 30 segundos entre cada transferencia.
Calentar en un bao Mara en ebullicin durante 10 minutos exactos, respetando los 30
segundos de diferencia entre muestra y muestra.
Enfriar los matraces durante 5 minutos en hielo e introducirlos en un bao Mara a 20 C.
Aadir agua destilada (4.2.8) por debajo de la lnea de enrase.
Enrasar una vez transcurridos 10 minutos a 20 C. Con un espectrofotmetro, medir la
absorbancia de las disoluciones 515 nm de longitud de onda respecto al blanco (que contiene
slo reactivo).
La diferencia de absorbancia entre el blanco de las enzimas y el valor obtenido tras la reaccin
debe estar entre 0,1 y 0,6 unidades.
Si los valores quedan por encima del intervalo de la curva de calibrado, repetir el experimento
realizando diluciones que se adapten a las enzimas.
Para cada muestra, proporcionar la medida del blanco de la enzima y los dos valores obtenidos
al medir por duplicado la absorbancia tras la reaccin. Estos dos valores han de ser cercanos.
6. Clculos
Para calcular la actividad se utiliza la media. La actividad enzimtica de una preparacin
enzimtica se calcula con la frmula siguiente:
Actividad -Glu-U por gramo o mililitro = (G 200)/(15 E) 1/Gf
Nkat/g o ml = (Activit -Glu-Unit/g o ml) X (1000/60)
G es la cantidad de azcares reductores liberados, es decir, la media de los azcares
reductores liberados (que se calcula a partir de los dos valores de absorbancia obtenidos tras
la reaccin) menos el blanco (expresado en microgramos de glucosa a partir de la curva de
calibrado).
E es la cantidad (en gramos o mililitros) de enzima diluida en 100 ml
200 corresponde al factor de dilucin
15 corresponde al tiempo de reaccin
Gf es el factor de glucano ( a calcular)
Ejemplo:
Enzima
Enzima estndar
-glucanasa
de
Penicillium
funiculosum

Valor
medido
1
2
0,621 0,618
0,417

0,416

Blanco
(enzima)

Glucosa
(g)

0,415

0,503

662

-Glu-U por
gramo
o
miligramo
10325

0,023

1249

9799

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Clculo del Gf :
1 realizar la medicin con el primer sustrato y la enzima estndar (Valor 1)
2 realizar la medicin con el nuevo sustrato y la enzima estndar (Valor 2)
Clculo : Valor 1 / Valor 2

7. Bibliografa
Bertrand A. Determination de l'activite -glucanase de Botrytis des preparations enzymatiques
OIV FV 1263

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