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Memoria del proyecto desarrollado durante el perodo de investigacin del

Master en Estudios Avanzados en Qumica

Composicin qumica de diversos materiales


lignocelulsicos de inters industrial y
anlisis estructural de sus ligninas
Pepijn Prinsen

Supervisores:

Dra. A. Gutirrez y Dr. J. C. del Ro


Departamento de Biotecnologa Vegetal,
INSTITUTO DE RECURSOS NATURALES Y AGROBIOLOGIA DE SEVILLA (IRNAS)
CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES CIENTIFICAS (CSIC)

Sevilla, a 20 de Septiembre 2010

AGRADECIMIENTOS
Este proyecto se realiz en el Instituto de Recursos Naturales y Agrobiologa de Sevilla (IRNAS
CSIC). Ha sido financiado por una beca de FPI (Formacin Personal Investigadora) del Ministerio
de Educacin y Ciencia y por el proyecto europeo LIGNODECO.
En primer lugar quiero expresar mis agradecimientos a Dra. Gutirrez Ana (INRAS), a mi director
de este proyecto Dr. Ro Jos Carlos (IRNAS) y a Prof. Angel T Martnez (Centro de
Investigaciones Biolgicas, CSIC, Madrid), por darme esta oportunidad para trabajar en un campo
interesante y dinmico, por su paciencia con mi expresin de la lengua castellana, por sus consejos
y ayuda en todos los campos y en general por sus esfuerzos y gran motivacin elevando el nivel de
investigacin.
A mi tutor Prof. Jos Mara Fernandez-Bolaos, por su atencin amable, ayuda, consejo y charlas
interesantes.
A mis compaeros Esteban Daniel, Alejandro Rico, Edith Cadena y mis ex compaeros Dra.
Gisela Marques, Setefilla Molina y Dr. Rencoret Jorge, por su compaa, ayuda y detalles.
A Lidia Nieto, por sus esfuerzos para medir todas mis muestras de NMR, su aportacin de
conocimientos valiosos sobre NMR y sobretodo por su atencin amable.
A Dr. Craig Faulds, por compartir sus conocimientos y a sus compaeros del CIB, por recibirme en
su grupo.
A mis compaeros del Master, Ana, Azucena, Yesica, Carmen, Teresa, Cristina, Eva, Renato, Paco,
Fernando, Jos Ignacio, Jos Blas, Jonathan y Sorel.
A mi novia, Susana, que siempre est all para mi a pesar de situaciones difciles.
Y a mi madre Kathy y padre Herman.

INDICE
CAPTULO I: INTRODUCCIN...1
1. Materiales lignocelulsicos ...2
1.1. Materiales lignocelulsicos de inters industrial...2
1.2. Composicin.......................................3
1.2.1. Celulosa.......................................3
1.2.2. Hemicelulosas..............................3
1.2.3. Lignina........................................8
1.2.3.1. Biosntesis.......................................9
1.2.3.2. Biodegradabilidad.......................11
1.2.3.3. Anlisis.........................................13
1.2.4. Compuestos minoritarios19
1.3. Entrecruzamiento de celulosa, hemicelulosa y lignina: organizacin
estructural y funcional en la pared celular ..19
1.3.1. Complejos de lignina-carbohidratos (LCC) .22
1.3.2. LCC de plantas herbceas .23
2. Lignina como factor limitante en procesos industriales...25
2.1. Produccin de papel........................25
2.1.1. Pasta de papel..........................25
2.1.2. Blanqueo de pasta de papel....26
2.1.3. Degradacin enzimtica de lignina26
2.2. Biorrefinera27
2.2.1. Pretratamiento.........................28
2.2.2. Hidrlisis..................................30
2.2.3. Conversin a productos..........30
2.2.4. Ingeniera gentica ..................30
CAPTULO II: OBJETIVOS.32
CAPTULO III: MATERIALES Y MTODOS..34
1. Materiales.35
1.1. Reactivos..35
1.2. Materiales lignocelulsicos.35
1.2.1. Sisal...35
1.2.2. Abac36
1.2.3. Hierba elefante.37
1.2.4. Paja de trigo.........38
1.2.5. Salvado de trigo39
1.2.6. BSG...40
2. Mtodos analticos para materiales lignocelulsicos.40
2.1. Anlisis de metales y otros elementos41
2.2. Determinacin del contenido en cenizas41
2.3. Determinacin del contenido en extrables lipoflicos..............................41
2.4. Determinacin del contenido en compuestos hidrosolubles41
2.5. Anlisis de lignina............41

2.5.1. Lignina Klason..41


2.5.2. Lignina cido-soluble...42
2.5.3. Aislamiento de lignina: preparacin de MWL..42
2.5.4. Anlisis de MWL mediante pirlisis (Py-GC/MS)43
2.5.5. Anlisis de MWL mediante 2D-NMR43
2.5.6. Anlisis de MWL mediante DFRC.44
2.6. Determinacin del contenido en celulosa...46
CAPTULO IV: RESULTADOS Y DISCUSSIN...47
1. Composicin qumica.48

2. Anlisis de MWL....51
2.1. Pirlisis (Py-GC/MS)...51
2.2. 2D-NMR...53
2.3. DFRC61
3. Conclusiones ..71
3.1. Investigacin prxima.72
CAPTULO V: REFERENCIAS....73

ABREVIATURAS
- AFM: atomic force micrscopy
- CAD: cinnamyl alcohol dehydrogenase
- CCoAOMT: caffeoyl CoA 3-O-methyltransferase
- CCR: cinnamoyl-CoA reductase
- COMT: caffeic acid 3-O-methyltransferase
- C3H: coumaroyl shikimate 3-hydroxylase
- C4H: cinnamate 4-hidroxylase
- 4CL: 4-coumarate- CoA ligase
- DMSO: dimetilsulfxido
- ECF: elementary chlorine free
- EDTA: cido etilendiaminotetraactico
- Fer: cido ferulico
- F5H: ferulate 5-hydroxylase
- Glcp: unidad de glucopiranosa en cadena de polisacrido
- HBT: (1-hidroxibenzotriazol)
- HCT: hydroxycinnamoyl CoA : shikimate hydroxycinnqmoyl transferase
- HMBC: heteronuclear multiple bond coherence
- HSQC: heteronuclear single quantum correlation
- LCC: lignin-carbohydrate complex (complejo de lignina-carbohidrato)
- MWL: milled wood lignin
- NMI: N-metilimidazola
- NMR: nuclear magnetic resonance (resonancia magntica nuclear)
- PCA: grupo de p-cumarco
- PAL: phenylalanine ammonia-lyase
- Rpm: rates per minute (revoluciones por minuto)
- SEM: scanning electron microscopy
- TBAF: tetrabutilammonium fluoruro
- TMAH: tetrametil ammonio hidrxido
- TCF: totally chlorine free

RESUMEN
Las plantas son materiales lignocelulsicos. Constituyen principalmente en celulosa, hemicelulosas
y lignina. La composicin qumica y la morfologa de la pared celular estn relativamente bien
conocidos. Sin embargo las caractersticas estructurales de sus biopolmeros, sobretodo de lignina
en relacin con su biosntesis y con la funcionalidad en la pared celular no han sido investigado tan
extensivamente (sobretodo de especies herbceas). La estructura de celulosa es universal y bien
conocido, sin embargo se desconoce en gran parte los mecanismos de su organizacin estructural y
plegamiento en las paredes celulares (lminas de microfibrillas). Estos conocimientos podran
cambiar drsticamente las estrategias para aumentar el aprovechamiento lignocelulsico mediante
tcnicas de biorrefinera. Actualmente el contenido y la estructura de lignina y su entrecruzamiento
con polisacridos son factores limitantes en el aprovechamiento lignocelulsico. En procesos con
biomasa se requieren pretratamientos optimizados para aumentar la accesibilidad de enzimas
hidrolticas a los polisacridos, por ejemplo para aumentar el rendimiento de sacarificacin con el
fin de producir biocombustibles o para conversin en otros productos (por ejemplo por
fermentacin). Por ello se debe conocer los cambios estructurales de la lignina durante el proceso.
Pueden servir muy bien los conocimientos de las tcnicas analticas usadas para estudiar la lignina
durante la fabricacin de papel. Un pretratamiento idneo sera el fraccionamiento completo de
celulosa, hemicelulosa y lignina y su conversin en productos puros aumentando la viabilidad
econmica de plantas de biomasa y la descarbonizacin del suministro de materias primas y
energa.
La lignina representa aproximadamente entre 20 y 35 % de la materia seca en fibras madereras y
entre 10-25 % en fibras no-madereras. Presente una estructura polimrica macromolecular. Sus
unidades repetitivas son fenoles sustituidos con respectivamente 0, 1 y 2 grupos de metoxilo en la
subunidad fenlica de respectivamente unidades H, G y S. Estas unidades derivan de los
monolignoles, respectivamente los alcoholes p-cumarlico, coniferlico y sinaplico. Estudios
recientes demostraron que unidades acetiladas en el carbono de sobretodo S tambin se comportan
como monolignoles y demuestran la flexibilidad en la biosntesis de lignina a partir de sus
precursores en cultivos naturales, pero sobretodo en cultivos transgnicos que pueden aportan ms
informacin sobre la regulacin de su biosntesis. Los monolignoles se unen entre si mediante
diversos tipos de enlaces aumentando la complejidad de su estructura. Se distinguen principalmente
enlaces carbono-carbono formando estructuras ms condensadas y ramificadas y enlaces ter
(principalmente enlaces -O-4) formando estructuras ms lineales. La proporcin de cada enlace
depende principalmente de la proporcin de unidades H, G y S y es el principal factor que
determina su biodegradabilidad.
En este proyecto se analiz la composicin qumica de diferentes materiales de inters industrial
(fibras de sisal, abac, hierba elefante, paja de trigo, material de salvado de trigo y brewers spent
grain (BSG)), poniendo especial nfasis en el aislamiento de lignina (preparacin de MWL
(milled wood lignin)) y su caracterizacin estructural. La hierba elefante se separ manualmente
en una fraccin de corteza y una de mdula. Se analiz los MWL por Py-GC/MS, 2D-NMR y
DFRC. El rendimiento de extraccin para preparar MWL es bajo comparado con el contenido total
presente en las fibras. Sin embargo las condiciones de preparacin hacen que la estructura de MWL
es representativa para la estructura nativa. Las tcnicas de anlisis tambin se aplicaron en situ
(directamente sobre la fibra) obteniendo espectros y cromatogramas ms complejos debido a las

seales de los carbohidratos. Sin embargo son anlisis rpidos (sin aislar lignina) y est garantizada
la representatividad de la estructura.
El contenido de lignina de hierba elefante es 20.5 %, aproximadamente 3 % ms que paja de trigo y
6 % ms que sisal y abac. Los contenidos de lignina Klason (no cido-soluble) de hierba elefante y
paja de trigo son aproximadamente los dobles de los contenidos de sisal y abac y los contenidos en
lignina cido-soluble de ambos son ms bajo que los de abac y sisal. Consecuentemente sisal y
abac contienen 30 % ms holocelulosa que hierba elefante y paja de trigo. Sin embargo la
diferencia entre ambos grupos en el contenido de -celulosa es ms pequeo. Sisal por ejemplo
contiene 11 y 19 % ms -celulosa que respectivamente hierba elefante y paja de trigo.
Los contenidos lipoflicos de hierba elefante y paja de trigo se sitan entre 3 y 6 veces mayores que
abac y sisal. Son compuestos minoritarios de cuales algunos pueden causar problemas graves en la
industria de papel. Hierba elefante y paja de trigo contienen 10 % de compuestos hidrosolubles y
6 % de cenizas, ambos aproximadamente 6 veces mayor que en abac y sisal.
En cuanto a la estructura de las ligninas aisladas, se observ que ambas fracciones de la hierba
elefante (mdula y corteza) se parecen mucho. Respectivamente 32 y 48 % de sus MWL estn
acilados en el carbono , estimado a partir de la integracin de las intensidades de los seales
cruzados en el espectro 1H-13C HSQC del carbono acilado y hidroxilado. Los grupos de acilacin
son sobretodo p-cumaratos y pocos acetatos, ambos identificados por Py-GC/MS (pirlisis), DFRC
(Derivatization Followed by Reductive Cleavage) y HMBC (2D-NMR). En el espectro HSQC se
observaron seales intensas de p-cido cumrico (PCA) y en baja proporcin cido ferulico (Fer).
Ambos tambin se detectaron en proporciones parecidas por Py-TMAH-GC y DFRC, tanto en la
MWL como en la fibra. Mientras Py-GC/MS es un mtodo semicuantitativo, el mtodo de DFRC
permite estimar la proporcin de las diferentes unidades de la lignina. Se estim que slo 3 y 4 % de
unidades respectivamente G y S estn acetilados en la MWL de la corteza. En la mdula el grado de
acetilacin es 10 y 3 % de unidades G y S. Sin embargo los grupos de p-cumarato slo se
encontraron en baja proporcin (7 %) acilados sobre la posicin , conforme a los anlisis de
(HMBC) 2D-NMR y DFRC de la corteza. El resto del acoplamiento con PCA est correlacionado
con un seal desconocido a 4,9/66 ppm. No queda claro si el seal corresponde a una estructura que
pertenece a la lignina. Sin embargo el espectro HSQC indica un alto grado de acilacin en (48 %).
En el anlisis de DFRC se encontraron pocas unidades G y S p-cumarilados. Sin embargo se
produjeron seales muy intensas de p-cido cumrico y en mucho menos proporcin cido ferulico.
En abac y sisal se observ un alto grado de acetilacin y un alto contenido en unidades S,
favoreciendo la formacin de enlaces -O-4. Sus ligninas presentan una estructura ms lineal que
por ejemplo la de hierba elefante. La lignina de abac tambin contiene p-cido cumrico, pero en
mucho menos proporcin que la de hierba elefante. Sisal no contiene cido p-cumrico y cido
ferulico. La lignina de paja de trigo tambin contiene cido p-cumrico y niveles de cido ferulico
ms altos que la hierba elefante. La presencia de cido p-cumrico en la lignina de hierba elefante,
abac y paja de trigo se demostr por Py-TMAH-GC/MS, 2D-NMR y DFRC. Sin embargo no
queda claro en que posicin est unida a la lignina. Una fraccin est esterificada a C de
sobretodo unidades S y otra fraccin est eterificada a C y/o C a base de los resultados obtenidos
por DFRC (seales intensas de p-cido cumrico libre). Tambin se observ cido ferulico,
identificado por Py-TMAH-GC/MS, DFRC y 2D-NMR en el caso la fibra de hierba elefante. La
posicin de unin de cido ferulico no queda clara.

Salvado de trigo y BSG son residuos agro-industriales. No son materiales puramente


lignocelulsicos; tambin contienen una fraccin considerable de protenas, vitaminas, etc. Adems
sus componentes de polisacridos se diferencian estructuralmente de fibras puramente
lignocelulsicas. Existe la posibilidad que hubo interferencia en los anlisis usados para materiales
lignocelulsicos. De BSG no se pudo aislar MWL segn el procedimiento de (Bjrkman, 1956) y
de salvado de trigo justamente suficiente para un anlisis de 2D-NMR. No se encontraron unidades
S y G, ni en las fibras en situ. Sin embargo hay seales en la zona aromtica del espectro HSQC,
identificado por unidades H en el BSG. Las unidades G y S se detectaron en poca cantidad por PyGC/MS y por DFRC. Curiosamente BSG y salvado de trigo contiene respectivamente 12 y 9 % de
lignina Klason. Puede resultar interesante estudiar la interferencia de protenas y de cidos
hidrxinmicos presentes en los polisacridos para explicar esta diferencia en resultados.
Actualmente se est investigando la estructura qumica de los compuestos lipoflicos y se est
analizando la lignina presente en las fracciones de celulosa y hemicelulosas segn un mtodo recin
publicado y universal. En investigaciones prximas se cuantificarn las proporciones de las
diferentes enlaces y unidades H, G y S de las ligninas aisladas medido por 2D-NMR y DFRC. Ms
adelante se podra intentar optimizar tcnicas analticas (sobretodo en situ en la fibra) durante
tratamientos qumicos y enzimticos.

I. Introduccin

CAPTULO I:

INTRODUCCIN

I. Introduccin

1.

Materialeslignocelulsicos

En general las paredes celulares de plantas consisten en polisacridos, compuestos fenlicos y


compuestos minoritarios (minerales, lpidos, protenas, etc.). Los polisacridos se clasifican en
celulosa, hemicelulosas y pectinas. Gran parte de los compuestos fenlicos estn presentes en la
estructura de lignina. La pared celular primaria envuelva la clula que durante la fase de expansin
celular crece hasta un tamao 100 veces ms larga que su tamao justo despus de dividirse.
Despus ciertas clulas empiezan a desarrollar una pared secundara. Los compuestos fenlicos
pueden alcanzar hasta 30 % en peso seco de las paredes celulares secundarias (Scheller, 2010).
Relativamente poco se conoce sobre la organizacin y coordinacin de celulosa, hemicelulosa y
lignina durante y despus la biosntesis que determinan la morfologa y funcionalidad de la pared
celular

1.1. Materialeslignocelulsicosdeintersindustrial
Fibras de plantas conocen multitud de aplicaciones industriales, principalmente en el sector de papel
y textil. En la ltima dcada ha crecido mucho el inters en estos materiales lignocelulsicos como
fuente de energa. Actualmente se producen biocombustibles a partir de cultivos que son materias
primas para productos comestibles y mientras se est investigando cultivos que no compiten en el
mercado de materias primas comestibles. Sobretodo las plantas herbceas han recibido mucho
inters en el sector de biomasa y cultivos energticos por su renovabilidad y su disposicin de
stocks de biomasa que alcanz 1549 millones de toneladas/ao a nivel mundial (Kim y Dale, 2004).
Plantas herbceas se caracterizan por su bajo contenido leoso. En general suelen tener tallos
verdes, finos y blandos, aunque existen especies herbceas con tallo ancho como el pltano y
papaya. Las plantas herbceas estn clasificadas dentro de la divisin Spermatophyta y subdivisin
Angiospermae, dentro de las clases Dicotyledoneae y Monocotyledoneae (Liliopsida). La mayora
pertenece a la familia de Poaceae (Gramineae (las gramneas)), la familia de mayor importancia
econmica. Crecen rpidamente y producen flores y semillas en relativamente poco tiempo. La
mayora de ellos es anual; mueren despus de perder sus semillas. Las bienales y perennes viven
respectivamente dos y ms hasta 25 aos. Tambin pierden sus tallos y hojas, pero al ao sobrevive
la parte de la planta bajo tierra. En general las plantas perennes pueden ser una mejor opcin que
plantas anuales, porque no generan los costes anuales de sembra, cosecha, combustibles, etc.
Adems suelen desarrollar races ms profundas que fijan ms carbono de la atmsfera. Sin
embargo no se garantiza la continuidad de la disponibilidad de stocks.
La informacin de lignina en cultivos herbceos es relativamente escasa y poco uniforme en
comparacin con la de especies madereros (Buranov, 2008). Tabla 1 muestra la composicin de
varios cultivos lignocelulsicos de inters industrial (Carroll, 2009).

I. Introduccin
Tabla 1: Composicin de algunos cultivos lignocelulsicos de inters industrial
Cultivo

Extrables

Cenizas

Lignina

Arabinano

Xilano

Manano

Galactano

Celulosa

23.09

Acido
urnico
2.16

Bagazo de caa de azcar


(Saccharum officinarum)
Rastrojo de maz
Paja de trigo
Pinus radiata
Alamo hbrido
Eucalyptus
Switchgrass (alamo)
(Panicum virgatumis)
Sorgo dulce
(Sorghum bicolor)

3.78

3.66

2.06

22.05

0.35

0.46

39.01

5.61
12.95
2.7
6.89
4.15
16.99

10.06
10.22
0.3
2.03
1.22
5.76

18.59
16.85
25.9
25.18
26.91
17.56

2.99
2.24
2.5
4.31
4.07
1.17

2.42
2.35
1.6
0.89
0.3
2.75

21.61
19.22
5.9
13.07
10.42
20.42

0.38
0.31
10.7
1.81
1.23
0.29

0.87
075
2.4
0.88
0.74
0.92

37.69
32.64
41.7
39.23
48.07
30.97

22.03

5.04

16.09

1.07

1.65

14.14

0.2

0.52

34.01

1.2. Composicin
Evidentemente celulosa, hemicelulosas y lignina son los principales constituyentes de la pared
celular de fibras de plantas. La morfologa de fibras depende principalmente de la composicin y la
organizacin estructural de estos constituyentes. Sin embargo contiene compuestos minoritarios no
polimricos que pueden ser de vital importancia para los procesos fisiolgicos de la clula. La
cantidad y el tipo de estos compuestos pueden influir mucho en procesos industriales.
A continuacin se describen cada uno de los compuestos de una fibra o un material lignocelulsico.
1.2.1. Celulosa
Celulosa es el biopolmero ms abundante en la Tierra. Consiste en cadenas lineales de celobiosa
(D-glucopiranosil--1,4-D-glucopiranosa) de aproximadamente 10.000 unidades glicosdicas en
celulosa nativa de fibras madereras donde representan ms de 50 % del peso. En la clula vegetal
gran parte de la celulosa est presente como microfibrillas empaquetadas muy densamente. Poco se
conoce sobre la regulacin de este plegamiento. Contiene zonas amorfas y cristalinas. Las cadenas
en la zona amorfa son susceptibles a bioconversin (celulasas).
Estudios recientes investigan derivados de celulosa como por ejemplo la esterificacin con cloruros
de cidos grasos para su uso en materiales compuestos de construccin para fortalecer (Freire et al.,
2006). La superficie de las microfibrillas de celulosa es altamente polar debido a los grupos
hidroxlicos que se asocian entre si por puentes de hidrgeno (Sjstrom, 1993). Eso dificulta la
compatibilidad con materiales no polares y afecta a la agregacin entre fibras y a la absorcin de
humedad que hacen disminuir respectivamente su dispersin en materiales compuestos y su rigidez.
Con tcnicas analticas como XPS y TOF-SIMS (Freire et al., 2006) caracterizaron las
modificaciones qumicas y fsicas en superficies menos polares de derivados de celulosa con cidos
grasos. Celulosa contiene regiones cristalinas y amorfas.
1.2.2. Hemicelulosas
Hemicelulosas son ms difciles de clasificar, es decir, son polisacridos con grupos heterogneos.
Tienen un grado de polimerizacin entre 100 y 200 en fibras madereras. Son insolubles en agua,
pero en medio alcalino se disuelven. Plantas herbceas suelen contener ms hemicelulosas y menos
ramificados. Las pajas de cereales (trigo, arroz, centeno, cebada, etc.) suelen contener entre 30 y 40
% de hemicelulosas con algunas excepciones (Fang et al., 2000b; Xiao et al., 2001; Sun et al.,
3

I. Introduccin
2000a; Sun et al., 2000b; Klinke et al., 2002; Sun y Tomkinson, 2003). Residuos agrcolas de stas
(principalmente salvado) contienen entre 40-50% (Claye et al., 1993; Saulnier et al., 1995;
Chanliaud, 1995).
Los autores no siempre clasifican las hemicelulosas de la misma forma. Se pueden clasificar segn
la cadena principal en xilanos (Xyl), xiloglucanos (XyG), mananos y glucomananos (Scheller,
2010). Son ramificados con una cadena principal de glucosa, xilosa y/o manosa con enlaces -(1
4) entre si, todos en posicin ecuatorial en el C1 y C4 (Figura 1). Otros autores lo clasifican en
xilanos, glucuronoxilanos, arabinoxilanos, mananos, glucomananos y galactoglucomananos.
ecuatorial

5
3

-(1- 4 ) glucano

-(1-4) xilano

-(1-4) glucomanano

-(1- 4) manano

Figura 1: En hemicelulosas los enlaces -(1 4) unen los tomos C1, O y C4 en posicin
ecuatorial, entre unidades de glucosa, xilosa y manosa.

Las hemicelulosas de la pared celular de las gramneas normalmente contienen una cadena principal
de -(1,4) xilopiranosil con -L-arabinofuranosa en las ramificaciones (Izydorczyk, 1995; Sun et
al., 2002a; Xiao et al., 2001). En algunos casos como en plantas del orden de los Poales
(principalmente cereales) se alternan los enlaces -(1 4) con -(1 3). Las ramificaciones de
hemicelulosas consisten en oligosacridos, una cadena pequea tpicamente entre 1 y 4 unidades de
D-galactosa, D-manosa, L-arabinosa, D-xilosa, L-fucosa, L-ramnosa y/o D-cido glucurnico.
Figura 2 demuestra todos los posibles monosacridos presentes en las cadenas de hemicelulosas
(Fengel y Wegener, 1984). Sin embargo las unidades constituyentes, la estructura y el contenido
total de la hemicelulosa varian entre los tipos de especies, dentro de la misma especie y incluso
segn el tejido anatmico y fisiolgico del organismo vegetal. Figura 3 ilustra la estructura tpica de
la cadena principal y las ramificaciones observados en las hemicelulosas de dicotelidones,
monocotelidones y conferas y Tabla 2 compara el contenido tpico en hemicelulosas.
La funcin principal es su interaccin con la celulosa y lignina para proporcionar rigidez a la pared
celular. Las cadenas de hemicelulosas se asocian con las microfibrillas de celulosa tras su carcter
polar (puentes de hidrgeno). Su comportamiento fsico-qumico, principalmente su capacidad de
enlace y su comportamiento visco-elstico, es de gran importancia para proporcionar propiedades
deseadas como grado de hinchamiento, (re)hidratacin, plasticidad, flexibilidad, rigidez, dureza,
etc. durante el proceso de fabricacin de papel. Sin embargo en procesos de biorrefinera tratan de

I. Introduccin
convertir hemicelulosa con mezclas de enzimas que actan sobre celulosas y hemicelulosas
simultneamente, frecuentemente en la segunda fase de hidrlisis

Figura 2: Diferentes posibles mnomeros presentes en cadena principal y cadena lateral de


hemicelulosas (adaptado de Fengel y Wegener, 1984).
Tabla 2: Contenido en polisacridos de hemicelulosas (%) de la pared primaria y secundaria de
dicotiledones, monocotiledones y conferas (ausente: -, presente sin dato cuantitativo: +).
Pared de
Pared de
Pared de
Polisacrido
dicotiledones
monocotiledones
conferas
Primaria Secundaria Primaria Secundaria Primaria Secundaria
Xiloglucanos
20-25
Menor
2-5
Menor
10
Glucuronoxilanos
20-30
Glucorono-arabinoxilanos
5
20-40
40-50
2
5-15
(Gluco)mananos
3-5
2-5
2
0-5
Galactoglucomananos
0-3
+
10-30
-(13,14)-glucanos
2-15
Menor
-

I. Introduccin

Figura 3: Estructura de la cadena central y de las ramificaciones de glucurono-arabinoxilano


(Gax), glucuronoxilano y galactoglucomanano tpico en respectivamente monocotiledones,
dicotelidones y conferas. (Fer = ferulato) (adaptado de (Scheller, 2010)).

Xilanos
Los xilanos forman un grupo de polisacridos muy diversos, pero todas disponen de una cadena
principal de unidades de xilosa con enlaces -(1,4) entre si. Se encontraron sustituciones muy
diversos, frecuentemente arabinofuranosa que se sita principalmente sobre tomo O-3 en xilosa en
plantas herbceas y sobre tomo O-2 en dicotelidones. Frecuentemente en plantas herbceas se
encuentran sustituyentes de feruloilarabinofuranosil (Wende, 1997). Los glucuronoxilanos y los
glucuronoarabinoxilanos abundan respectivamente en dicotiledones y monocotiledones (Figura 3).
Los galactoglucamananos son tpicos en conferas. En dicotelidones y monocotelidones no
perteneciendo a las gramneas, xiloglucanos representan la mayor fraccin de la hemicelulosa. Los
dicotiledones contienen ms sustituciones sobre las unidades de xiloglucanos. Otra diferencia es
que contienen ms xiloglucanos que monocotiledones (Tabla 2).

I. Introduccin
Xiloglucanos
Consisten en una cadena principal de (1,4)-D-Glcp. Hasta 75 % de las unidades de Glcp pueden
estar ramificados con un monosacrido u oligosacrido (con -L-fucosa en muchas especies como
ilustrado en Figura 4).

Figura 4: Ilustracin de la cadena central y cadenas laterales en xiloglucanos (Scheller, 2010).

El grado de ramificacin divide los xiloglucanos en 2 tipos: XXXG y XXGG. Las cadenas
principales contienen respectivamente 3 unidades ramificadas con Xylp (X) + 1 unidad no
ramificada (G) y 2 unidades ramificadas + 2 no ramificadas. G y X representan respectivamente (1,4)-D-Glcp y -D-Xylp-(1,6)--4-D-Glcp--(1,4). El grado de ramificacin determina el grado de
bioconversion por -(1,4)-glucanasas. Estos endoglucanos rompen el enlace glicosdico entre
unidades no ramificadas (G). De xiloglucanos tipo XXXG generan una mezcla tpica de
oligosacridos (tetrasacridos) mientras con tipo XXGG el patron de oligosacridos generado
depende de la especifidad enzimtica y el grado de acetilacin de grupos hidroxlicos de las
unidades no ramificadas.
Xiloglucanos forman un red con celulosa que es el principal fuente de rigidez de la pared primaria.
Cubren la celulosa y reducen la agregacin entre microfibrillas de celulosa. La fijacin de
xilanoglucanos a celulosa es un proceso complejo y puede mostrar varias conformaciones. La
formacin y rotura de los enlaces glicosdicos de xiloglucanos por transglucosil hidrolasas podran
estar involucrados en garantizar la rigidez mecnica de la pared cellular de clulas en crecimiento.
Glucuronoxilanos
Los glucuronoxilanos juegan un papel importante durante la formacin de la pared secundaria.
Mutantes IRX8 y IRX9 (Persson et al., 2007) desarrollaron un xilema irregular y contienen menos
glucuronoxilanos indicando su importancia en el enlazamiento entre xilanos y la pared secundaria.
Estudios de NMR (Pena et al., 2007) descubrieron la secuencia de 4--D-Xylp-(1,4)--D-Xylp(1,3)--L-Rhap-(1,2)--D-GalpA-(1,4)-D-Xylp en los grupos terminales reductores de
glucuronoxilanos de Arabidopsis thaliana. Encontraron una relacin directa entre la cantidad de
esta secuencia, la cantidad de cadenas de glucuronoxilanos y la longitud de la cadena (dispersidad).
IRX9 contiene ms cadenas de glucuronoxilanos y ms cortas, IRX8 al revs (dispersidad ms alta).
Esta secuencia tambin est presente en glucuronoxilanos de Betula verrucosa (birch) y Picea
7

I. Introduccin
abies (spruce), indicando la conservacin de ste grupo terminal durante la evolucin hasta
especies conferas y herbceas. Resulta interesante encontrar genes comunes que han sido
conservado durante la evolucin. (Pena et al., 2007) indica que los genes IRX8 regulan la biosntesis
de la secuencia encontrada en el grupo terminal reductor de glucuronoxilanos y la terminacin de la
elongacin en ste grupo terminal reductora . Los genes IRX9 regulan la elongacin de las cadenas
por adicin de xilosa en el grupo terminal no reductor. Esta secuencia podra servir como primer
en la biosntesis de glucuronoxilanos.
Pectinas
Pectinas son polisacridos heterogneos y contienen un alto porcentaje de cidos galacturnicos. Se
caracterizan normalmente por extraccin con cidos a temperatura elevada o con reactivos
quelantes. Son polisacridos con estructuras y propiedades fsico-qumicos altamente variados y la
caracterizacin por su solubilidad (extraccin) no es lo ms apropiado (Scheller, 2010).
1.2.3. Lignina
La lignina representa entre 25 y 33 % de la biomasa en madera de especies conferas y entre 18 y 34
% de frondosas (Aitken et al., 1988). Detrs de celulosa y hemicelulosa, es el tercer biopolmero
ms abundante en la Tierra. Este polmero se encuentra principalmente en la lmina media de la
pared celular y en las capas de la pared celular. Con las hemicelulosas forman un matriz alrededor
de las microfibrillas de celulosa.
Lignina es de vital importancia para el organismo vegetal. Desempea funciones en el transporte de
agua, nutrientes y metabolitos en el sistema vascular facilitado por sus propiedades como estructura
macromolecular. Su hidrofobicidad junto con el nivel de entrecruzamiento con los polisacridos
(ver apartado 2) es importante para la permeabilidad de los poros entre las clulas vegetales. Se
encuentra sobretodo en el xilema. Juega un papel importante en el sistema de defensa de la planta
frente a patgenos y protegen los polisacridos de la pared celular frente a despolimerizacin
(Sarkanen y Ludwig, 1971; Hckelhoven, 2007). Lignina tiene una estructura pticamente inactiva
(Ralph et al., 1999b). Sin embargo los dmeros de monolignoles, los denominados lignanes, tienen
actividad ptica y biolgica (antibacterial y antioxidante). Cultivos herbceos y legumbres
contienen hasta 5 % lignanes (Ralph, 1999). Lignanes han sido identificados en extractos de varias
especies incluido en cereales como salvado de trigo (Smeds et al., 2007). Tambin se detectaron en
el extracto lipoflico de paja de trigo (Sun y Sun, 2001).
La composicin qumica de lignina (biopolmero) consiste principalmente en tres tipos de unidades
repetitivas: cumaril (H), guaiacil (G) y siringil (S). Estn derivadas de los denominados
monolignoles, los alcoholes p-cumrico (4-hidroxicinamlico), coniferlico (4-hidroxi-3metoxicinamlico) y sinaplico (4-hidroxi-3,5-dimetoxicinamlico). Son los precursores en la
biosntesis de lignina. Se diferencian en la sustitucin con un grupo metoxilo (-OMe) en las
posiciones 3 y 5 de la unidad aromtica (Figura 5).

I. Introduccin

Figura 5: Estructura de los precursores alcohol p-cumarlico (1), alcohol coniferlico (2), alcohol
sinaplico (3), sinapil acetato (4) y sinapil p-cumarato que se incorporan en la biosntesis de lignina.

En general se distingue entre lignina de gimnosperma (softwoods o conferas), angiosperma


(hardwoods o frondosas) y herbceas (non-woody). Sus ligninas constituyen respectivamente
principalmente en unidades G, unidades G y S, mientras lignina de fibras herbceas contienen los
tres unidades G, S y H en proporciones muy variables (Lapierre et al., 1995; Billa et al., 1998). Paja
de trigo por ejemplo contiene respectivamente 5, 49 y 46 % de unidades H, G y S (Lapierre et al.,
1995).
Las proporciones relativas con que se incorporan los monolignoles durante la lignificacin pueden
alterarse en los diferentes estadios de la vida de una planta. Adems la estructura de lignina depende
en que tipo de tejido se encuentra. Por ejemplo lignina del xilema es de tipo hardwood (slo
unidades S y G y < 1 % de unidades H). El contenido y la composicin de lignina entre varias
especies se deben comparar en el mismo estado vegetativo y en el mismo tejido.
1.2.3.1.

Biosntesis

Lignina es un biopolmero sintetizado a partir de fenilalanina. La lignina presenta una estructura


macromolecular con unidades unidas por varios tipos de enlaces que no se repiten con cierta
frecuencia, es decir, tiene una estructura tridimensional irregular. El estudio de la biosntesis de
ligninas de varias plantas naturales y transgnicas permite explicar la alta variedad de enlaces
encontrada y controlar en cierto modo la estructura y composicin a nivel de expresin de los genes
que intervienen en la biosntesis. La biosntesis de monolignoles a partir de fenilalanina est
regulada por genes. Figura 6 muestra la ruta de la biosntesis de dichos precursores de las de
unidades G, H y S en lignina (Vanholme et al., 2008). Su expresin regula la actividad de las
enzimas PAL (phenylalanine ammonia-lyase), C4H (cinnamate 4-hidroxylase), CCR
(cinnamoyl-CoA reductase), 4CL (4-coumarate- CoA ligase), HCT (hydroxycinnamoyl CoA :
shikimate hydroxycinnamoyl transferase) , C3H (coumaroyl shikimate 3-hydroxylase),
CCoAOMT (caffeoyl CoA 3-O-methyltransferase), CCR (), F5H (ferulate 5-hydroxylase),
COMT (caffeic acid 3-O-methyltransferase) y en menos grado CAD (cinnamyl alcohol
dehydrogenase).

I. Introduccin

Figura 6: Biosntesis de los precursores (alcoholes p-cumarlico, coniferlico y sinaplico) a


partir de fenilalanina dando lugar a su polimerizacin en lignina (Vanholme et al., 2008)

La alteracin gentica de la regulacin (downregulation) de HCT y C3H resulta en lignina


enriquecida en unidades H y de F5H en lignina enriquecida en unidades G mientras la sobreexpresin resulta en lignina casi nicamente con unidades S. Cultivos con downregulation de
COMT sintetizan lignina con menos unidades S y incorpora alcohol 5-hidroxiconiferlico. Estudios
recientes demuestran que la biosntesis de los monolignoles dispone de una cierta flexibilidad, tanto
en plantas naturales como en transgnicas (Boerjan et al., 2003: Ralph et al., 2004: 2007). En
general los tres precursores ms abundantes son los alcoholes p-cumarlico, coniferlico y
sinaplico, los denominados monolignoles (respectivamente compuesto 1, 2 y 3 en Figura 5).
Demostraron (del Ro et al., 2004; 2007; 2008; Martinez et al., 2008) que no slo estos 3
monolignoles se incorporan en la lignina durante la biosntesis. Tambin los alcoholes p-cumarlico,
coniferlico y sinaplico con una acilacin en el carbono (compuestos 4 y 5 en Figura 5) se
comportan como monolignoles. Las acilaciones consisten en la formacin de enlaces ster que se
producen enzimticamente (Vanholme et al., 2008). Los monolignoles acilados se encuentran
sobretodo en lignina de angiospermas madereras y no-madereras (Lu y Ralph, 2002; Lu et al., 2004;
Lu y Ralph, 1999; Ralph et al., 1994; del Ro et al., 2007b) como en la de kenaf (Hibiscus
cannabinus L.), Carpinus betulus L., maz (Zea mays L.) y abac (Musa textilis N.). De esta ltima
ms que 80 % de las unidades S estn acetiladas (del Ro et al., 2007). Tambin se reportaron
unidades p-hidroxibenzoilados en varias especies (Landucci et al., 1992; Sun et al., 1999). La
acilacin no ocurre a nivel de polmero; los monmeros respectivos estn acilados antes de
10

I. Introduccin
acoplarse por lo cual se le consideran cmo otro monolignol ms . Poco est conocido sobre la
funcionalidad de estas acetilaciones. Tambin se observaron que cidos dihidroxicinamlicos (5hidroxiconiferlico) y aldehdos derivados de los monolignoles se incorporaron en la estructura de
lignina en plantas transgnicas (Ralph et al., 1997; 1998; Sederoff et al., 1999). (Morreel et al.,
2004) encontraron nuevas estructuras de coniferil benzodioxano en la lignina de lamos
transgnicos deficientes en COMT. Incluso derivados cidos - y steres hidroxicinmicos, arilpropano-1,3-dioles, arilgliceroles y tiramina hidroxicinamatos a veces se encuentran en lignina
(Ralph, 2007; Vanholme et al., 2008). En general de origen natural suelen abundar en baja
proporcin, pero pueden contribuir significativamente en la lignina de organismos transgnicos
porque son intermedios de la biosntesis que no terminan de convertirse en monolignoles. El estudio
de la alteracin de la biosntesis en plantas transgnicas puede revelar ms informacin sobre los
mecanismos bioqumicos y genticos.
Los monolignoles biosintetizados se polimerizan en la lignina tras acoplamiento oxidativo por la
accin de peroxidasas y lacasas (Vanholme et al., 2008). No queda claro si existe una selectividad
regulada por protenas de los sitios de incorporacin y la preferencia por un tipo de monolignol o si
est sujeta a las condiciones fsico-qumicos.
1.2.3.2.

Biodegradabilidad

La biodegradabilidad de lignina es de gran importancia en la produccin de pasta de papel para


separar la celulosa. Ligninas ms recalcitrantes resulta en ms lignina residual, lo que baja el
rendimiento de la separacin de celulosa y consecuentemente la calidad del papel. Esto a su vez
hace aumentar el tiempo de residencia con el riesgo de degradar la celulosa. Se compara la
composicin (G/H/S) y los diferentes tipos de enlaces presentes en la lignina inicial y la lignina
residual. Figura 7 resuma todos los tipos de enlaces encontrados en varios tipos de especies. La
biodegradabilidad depende de las proporciones de estos enlaces que a su vez dependen
principalmente de las proporciones de unidades G, H y S incorporados durante la biosntesis. No
est claro si es un proceso regulado genticamente por protenas.
Los enlaces ster y ter son enlaces ms fciles de degradar que los enlaces carbono-carbono, tanto
qumicamente como enzimticamente. Estructuras de lignina con menos enlaces carbono-carbono
son ms abiertas (menos condensadas). A los enlaces ter pertenecen -O-4 (A, A), -O-4 (E),
-O- (B), -O- (B), -O-4 (C y G), -O-4 (E) y 4-O-5(H). Los enlaces carbono-carbono
encontrados incluyen - (B, B), -5 (C), -1 (D y F) y 5-5 (E).
En la produccin de pasta de papel existe una correlacin directa entre la biodegradabilidad y la
relacin de unidades S y G presente en la lignina (S/G). Relaciones de S/G mayores resulta en
rendimientos mayores y menos gastos de reactivo (Gonzlez-Vila et al. 1999; del Ro et al. 2005).
Las unidades S tienen 2 sustituciones aromticas con un grupo metoxilo. Las unidades G tienen un
grupo metoxilo en posicin C-3 mientras la posicin C-5 no est sustituida y queda disponible para
la formacin de enlaces carbono-carbono. Lignina con mayor cantidad de unidades G suelen tener
una estructura ms condensada y es ms recalcitrante. Tras anlisis de varias fibras herbceas (del
Ro et al., 2007; del Ro et al., 2008a) encontraron una relacin entre la relacin S/G, la proporcin

11

I. Introduccin
de enlaces -/-O-4 y el grado de acetilacin. La proporcin -/-O-4 es una indicacin para
la proporcin de enlaces condensados/menos condensadas, porque estos enlaces suelen ser los ms
frecuentes de los enlaces carbono-carbono/carbono-oxgeno-carbono (teres). Por tanto ligninas con
un alto grado de acetilacin muestran una estructura ms lineal, porque la sustitucin en la posicin
5 con un grupo metoxilo de unidades S hace que se forman ms estructuras -O-4 y por tanto
menos estructuras como -5 (enlaces que aumentan grado de ramificacin). Anlisis por DFRC y
DFRC de MWL de diferentes fibras revelaron que el alcohol sinaplico acetilado tiende menos a
formar enlaces -. Tras muchos estudios de la composicin (G/H/S) y de los diferentes tipos de
enlaces encontrados en diferentes tipos de especies, se han propuestos modelos de estructuras de
lignina de especies conferas, frondosas y herbceas (Figura 8).

Figura 7: Resumen de todas las subestructuras observadas en especies naturales y transgnicas (A: O-4, A: -O-4 con acilacin en posicin , B: -/-O- (resinol), B: -/-O- (resinol a partir
de alcohol sinaplico acetato), C: -5/-O-4 (fenilcumarano), D: -O-/ -1/-O-4(espirodienona),
E: 5-5/-O-4/-O-4(dibenzodioxocina), F: -1, G: -O-4, H: 4-O-5, I: p-cumarato y J: ferulato

12

I. Introduccin
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OMe

Figura 8: Estructura de modelos de lignina de especies conferas, frondosas y herbceas.

1.2.3.3.

Anlisis

No existe un mtodo general para el anlisis cuantitativo de lignina (Hatfield, 2005). Se distingue
entre mtodos gravimtricos invasivos y mtodos no-invasivos manteniendo la estructura de la
lignina intacta. La aptitud del mtodo depende principalmente del tipo de material lignocelulsico.
Para el anlisis de lignina en plantas herbceas se usan las mismas tcnicas analticas como usadas
para lignina de plantas madereras con posibles adaptaciones debido a la presencia de compuestos
que interfieren durante el anlisis como protenas, ciertos carbohidratos y en menor proporcin
ceras que provienen de hojas (Hatfield, 2005). En general el contenido de protenas en plantas
herbceas es mayor que en especies madereras.
Contenido de lignina
Los mtodos ms empleados son los de detergente cido, Klason, permanganato y ms
recientemente con acetil bromuro. En la lignina Klason puede que interfieren las protenas, en los
13

I. Introduccin
otros anlisis no. Se determin la lignina de tallos de una especie de alfalfa y de Zea mays L. con
diferentes mtodos (Hatfield, 2005). Los resultados variaron bastante entre los diferentes mtodos
(respectivamente 132.7 28.1 y 59.7 30.3 g lignina/kg pared celular), sobretodo en Zea mays L.
dnde se prev ms interferencia (herbceas).
Lignina cido-soluble
La determinacin de lignina cido-soluble se basa en la determinacin de la absorcin del extracto
soluble en la regin UV despus la extraccin con cido sulfrico diluido usado en la determinacin
de lignina no cido-soluble (lignina Klason). En esa regin los compuestos fenlicos de la lignina
absorben mucho ms que los carbohidratos. La exactitud del mtodo depende principalmente del
uso de un coeficiente de extincin apropiado. Adems (Fergus, 1970) encontr una mxima de
absorcin a 280 y 270 nm para compuestos modelos basados en respectivamente guaiacilo y
siringilo. Especies herbceas en general tienen un contenido ms alto en lignina cido-soluble que
especies madereras. En la pared celular de plantas herbceas pueden haber compuestos fenlicos
que no pertenecen a la lignina y pueden interferir en la determinacin. Sin embargo en plantas
herbceas puede existir una subestimacin del contenido total de lignina debido a una
subestimacin del contenido en lignina cido-soluble, sobretodo posteriormente a una extraccin en
medio alcalino (Hatfield, 2005).
Anlisis no-invasivo de lignina nativa
- 2D-NMR
2D-NMR es la tcnica ms potente para anlisis de lignina nativa en general. En 2D-NMR se miden
correlaciones 1H-13C que resuelvan seales que aparecan solapadas en los espectros
unidimensionales. En HSQC se mide correlaciones de acoplamientos a corta distancia (a 1-2
enlaces de distancia entre protn y heteroncleo). Figura 9 muestra las seales cruzadas en el
espectro HSQC de diferentes enlaces que se puede encontrar en lignina y de las unidades S y G
presentes en la lignina de sisal (del Ro et al., 2008a). Los espectros se dividen en una zona
aliftica, aliftica oxigenada y aromtica. Durante la lignificacin se forman varios tipos de enlaces
entre las unidades de lignina. Con 2D-NMR se puede identificar estos enlaces, principalmente en la
regin aliftica oxigenada, y estimar sus proporciones presentes en la lignina.
Durante el anlisis HMBC el protn puede acoplar con un heteroncleo a distancia ms larga (1-4
enlaces). Por ejemplo el protn H puede acoplar con C y con C1 de la unidad aromtica (2 enlaces
de distancia), pero tambin con C, C2 y C6 (3 enlaces de distancia). Adems en una unidad S
(simtrica) C2 y C6 resuenan al mismo desplazamiento, en una unidad G (no simtrica) resuenan a
desplazamientos distintos. En la zona aromtica del espectro HSQC se observan seales a tres
desplazamientos distintos en ambas dimensiones de los ncleos en posicin 2, 5 y 6 de unidades G,
mientras solapan en unidades S. Al contrario de HSQC, el anlisis HMBC da informacin sobre
carbonos cuaternarios (carbonilos y carbonos aromticos en lignina). Sin embargo el espectro
HSQC basta para estimar la relacin S/G. En algunos casos el espectro HMBC da ms informacin
sobre enlaces con otras unidades y permite diferenciar y cuantificar los diferentes grupos de
acilacin (acetato, p-cumarato, etc.).

14

I. Introduccin

Figura 9: Espectros expandidos de HSQC de la regin aliftica oxigenada (posiciones , , y ) y de la


regin aromtica (posiciones 1-6 de unidades S y G) de lignina de sisal

Resultan atractivas tcnicas que estudian la lignina nativa en situ en la fibra. En NMR se usan
disolventes como DMSO o mezclas de disolventes como DMSO/piridina, DMSO/TBAF,
DMSO/NMI, etc. La interaccin de DMSO con los polisacridos hace que se forma un estado de
gel. La piridina ayuda a disolver, facilita la preparacin de geles homogneos y puede aumentar la
resolucin (Kim y Ralph, 2010). De tal forma se puede analizar la lignina en cuestin de das sin
aislarla previamente. La preparacin de MWL es un proceso con un rendimiento bajo (hasta
mximo 15 % de extracto del contenido total de lignina). Adems se analiza la fraccin completa de
la lignina al contrario de MWL (solo fraccin de la lignina nativa).
(Lu y Ralph, 2003) analizaron la pared celular molida en CD3Cl despus de acetilarla en situ. En
muestras de geles resulta difcil obtener un espectro de HMBC til, porque no se llega a registrar
suficientes adquisiciones debido a la atenuacin rpida de la relajacin en un medio de tal
viscosidad (polisacridos).
15

I. Introduccin
La presencia de metales acelera la atenuacin de la relajacin. Su presencia en la pared celular se
puede reducir por acetilacin, precipitacin y posterior lavado con EDTA, mejorando el
comportamiento de relajacin (Ralph et al., 1994; 1999a). Se obtienen espectros complejos pero el
uso de imanes de NMR cada vez ms potentes y de criosondas acopladas a ello, permite obtener una
resolucin y sensibilidad cada vez mejor (detalles que no se observa en NMR de estado slido).
Un aspecto a optimizar es el tiempo de molienda con bolas (ball-milling) para minimizar la
alteracin de enlaces y grados de polimerizacin. Durante la molienda de bolas se puede
transformar la celulosa del estado cristalino parcialmente en estado amorfo, pero no se oxida. Se
aconseja la molienda de fibras dispersadas en tolueno. Prximamente se registraran espectros de
3D-NMR con que se puede resolver las diferentes cadenas alifticas de cada estructura presenten la
lignina, porque se resuelven cada uno en una dimensin (Ralph et al., 1999; Marita et al., 2001).
- Espectroscopa de infrarrojo
Debido a la deteccin de los diferentes modos de vibracin de los enlaces C-O, C=O, y O-H, se
puede obtener informacin estructural valiosa de una pequea muestra de lignina. Para determinar
la lignina en situ (en la pared celular) es ms complicado, porque gran parte de las bandas de
absorcin de lignina est solapada con bandas de otros compuestos de la pared celular. Sin embargo
quedan algunas bandas caractersticas no solapadas para la cuantificacin de lignina (Hatfield,
2005). Permite comparar diferencias estructurales y de composicin entre varias especies, pero no
se puede correlacionar al contenido total en lignina.
Anlisis invasivo de lignina nativa
Los 3 mtodos destructivos ms usados son tioacidlisis, DFRC y pirlisis (Py-GC/MS). Se les
pueden aplicar a MWL y en situ directamente con la fibra.
- DFRC
En el mtodo de DFRC (Figura 10) se producen derivados acetilados y bromurados en posicin o
. El bromo se elimina posteriormente con Zn, rompiendo selectivamente los enlaces ter y
formando un doble enlace -. Los productos son monmeros y oligmeros. La identificacin y
cuantificacin de monmeros y dmeros puede dar informacin muy valiosa, por ejemplo para
cuantificar la relacin H:G:S. En las condiciones de la reaccin se mantiene intacto el grupo de
sustitucin sobre C. En el mtodo modificado (DFRC) se usa un reactivo propionilado en vez de
acetilado, lo que hace posible diferenciar entre productos acetilados (sobre C) de forma sinttica y
de forma natural por el anlisis de los principales iones registrados en el anlisis de los productos
por GC/MS.

16

I. Introduccin

Figura 10: Rotura selectiva de enlaces ter de unidades S por sustitucin nucleoflica con acetil y
prioponil bromuro (AcBr (DFRC) y PropBr (DFRC)) y posterior eliminacin reductiva produciendo
monmeros de unidades acetilados (1+2) de cual una fraccin est acetilado de forma sinttica (3) y
una fraccin de forma natural (4)

- Pirlisis (Py-GC/MS)
El pirlisis tambin es un mtodo destructivo que ofrezca varias ventajas frente a otros mtodos
destructivos. Slo se requiere entre 0.5 y 1 mg de MWL. Adems es posible analizar la lignina in
situ en la fibra (1-2 mg de fibra). El anlisis es relativamente rpido ( 0,5 horas) y sencillo.
Tambin se pueden metilar los grupos de hidroxilo antes de analizarlo. Para ello se usa el reactivo
TMAH en una solucin de 25 %. De este modo se puede identificar cido ferulico y cido pcumrico que estn esterificados al carbono de unidades de la lignina (Figura 11). Py-GC/MS
ofrece un anlisis cualitativo y semicuantitativo.
Durante la pirlisis se fragmenta la muestra en compuestos voltiles por descomposicin trmica
(normalmente entre 400 y 800 C) en ausencia de oxgeno (Meier y Faix, 1992; Fullerton y Franich,
1983). Cuando la energa trmica supera la energa de ciertos enlaces como enlaces ter incluso
algunos enlaces C-C, se produce la disociacin de estos enlaces produciendo una mezcla de
compuestos fenlicos voltiles. El tipo y la proporcin de la sustitucin aromtica en la lignina se
pueden deducir del espectro mediante separacin (GC) e identificacin (MS) de estos compuestos
voltiles con la ayuda de libreras de espectros. La identificacin de la sustitucin aromtica de
estos compuestos voltiles hace posible deducir su origen (proveniente de una unidad G, H y/o S).
17

I. Introduccin
La suma de los cuantificaciones de cada compuesto da una estimacin del contenido (%) en
unidades G,H y/o S de la lignina analizada.

Figura 11: Productos de pirlisis en ausencia (Py-GC/MS) y presencia de TMAH (Py-TMAH) de cido
p-cumrico y cido ferulico

- Tioacidolisis
Tioacidolisis (Figura12) es un mtodo destructivo basado en la solvlisis de MWL o la fibra en una
mezcla de dioxano, etanotiol (EtSH) y eterato de trifluoruro de boro (Et2O-BF3) en atmsfera libre
de oxgeno (Lapierre et al., 1985; Rolando et al., 1992; Grabber et al., 1996). La reaccin se basa
en la actuacin de Et2O-BF3 como cido de Lewis fuerte y en EtSH como nuclefilo suave. Se
rompen selectivamente los enlaces ter aril-alquil (-O-4 y -O-4). La cuantificacin de los
monmeros permite estimar la proporcin de estos enlaces en la estructura de lignina. A parte de
monmeros, tambin se obtienen oligmeros unidos por enlaces ms difciles de degradar (-5,, -1, 5-5 y 4-O-5) que pueden dar informacin valiosa sobre la estructura de la lignina.

Figura 12: Mecanismo de tioacidolisis de lignina (adaptado de (Lin y Dence, 1992)).

18

I. Introduccin
1.2.4. Compuestosminoritarios
Los compuestos minoritarios representan poco del peso total del material lignocelulsico. En
general se clasifican en compuestos extrables, protenas y cenizas (principalmente metales).
Aunque presente en baja concentracin, desempean funciones fisiolgicas de vital importancia.
Los compuestos extrables se clasifican segn su solubilidad (Hillis W.E., 1962; Fengel y Wegener,
1984; Rowe 1989.; Sjstrm, 1981) en compuestos lipoflicos (lpidos y derivados) y compuestos
hidroflicos (hidrosolubles). Son compuestos de bajo peso molecular en comparacin con los otros
constituyentes de la pared celular (biopolmeros). En muchas plantas el olor, color y gusto les
determinan casi nicamente los lpidos. Adems son importante en la defensa contra patgenos. Los
extrables hidrosolubles son compuestos ms polares. Son compuestos fenlicos libres como
estilbeno, lignanes (oligolignoles y derivados), tanines, flavonoides, etc. Los extrables lipoflicos
consisten principalmente en cidos y alcoholes grasos libres, cidos resnicos, hidrocarburos,
terpenoides, esteroides (sitosteroles libres y esterificados con cidos grasos y compuestos
glicosdicos), glicridos libres y esterificados y ceras).
El contenido en metales es importante en para evaluacin de fibras para procesos industriales como
combustin, pero tambin para la produccin de pasta de papel y procesos de biorefinera (Samson
y Mehdi, 1998). El contenido alto en K+ no crea problemas debido a su alto solubilidad en agua,
pero el contenido en silicio crea problemas. De plantas herbceas cabe esperar un alto relativamente
contenido, sobretodo de plantas perennes C3 y en menos proporcin C4 como la hierba elefante.
Tambin influye mucho el tipo de suelo y la parte de la planta.

1.3. Entrecruzamientodecelulosa,hemicelulosaylignina:organizacin
estructuralyfuncionalenlaparedcelular
El descubrimiento de entrecruzamientos entre polisacridos por enlaces covalentes (por diferuloil
disteres) en hidrolizados enzimticos de clulas en crecimiento dio lugar a muchas investigaciones
sobre el contenido y la funcin de cidos hidroxicinmicos (cido p-cumrico, cido ferulico) y pcumaratos, ferulatos y dehidrodiferulatos) en la pared celular de numerosas especies de plantas.
Juegan un papel importante en la investigacin fundamental de las funciones y morfologa de la
pared celular. Se sugiri que el nivel de entrecruzamiento juega un papel en la regulacin del
tamao de poros. Figura 13 muestra un esquema citado frecuentemente para representar la
organizacin estructural de los diferentes polmeros en la pared celular. Relativamente poco est
conocido sobre su organizacin funcional y su actividad biolgica. El estudio del perfil de
expresin de cultivos transgnicos puede relevar informacin valiosa. Por ejemplo un estudio
imaginario de evolucin dirigida con cultivos transgnicos, que selecciona cultivos con un
contenido reducido de cido ferulico, podra proporcionar ms informacin sobre la actividad
biolgica de ferulatos. Estn investigando la posibilidad de producir cultivos transgnicos con una
pared celular ms digerible o ms fcil de desintegrar y aprovechar. Sin embargo es importante
conocer la funcionalidad de los compuestos en cuestin para garantizar el xito de dichos cultivos
transgnicos. Por ejemplo est conocido que oligosacridos feruloilados tienen actividad biolgica
(Ishii y Nishijima, 1995) y anti-oxidativa (Ohta et al., 1994). Desempean funciones en la
regulacin del crecimiento celular y en la transduccin de seales entre organismos vegetales y
19

I. Introduccin
microbiolgicas, pero sus mecanismos de accin no estn conocidos. Estudios con istopos tambin
pueden generar informacin valiosa.

Figura 13: Representacin esquemtica de la organizacin estructural de los diferentes biopolmeros


de la pared celular de una angiosperma no leosa (adaptado de Bidlack et al., 1992).

Dehidrodiferulatos y ferulatos en el entrecruzamiento entre polisacridos


En los entrecruzamientos entre polisacridos se encuentran sobretodo puentes de dehidrodiferulatos.
Se observ que la acilacin de residuos de arabinofuranosil ocurre frecuentemente en la posicin C5 (Figura 14a) y que la formacin de un dehidrodiferulato (Figura 14b) se establece en la posicin
C-5 de la unidad aromtica de cido ferulico (enlace 5-5) (Ishii, 1997; Quideau y Ralph, 1997).
(Ishii, 1997) da un resumen de todas las diferentes ferulatos y p-cumaratos de oligosacridos
encontrados en los hidrolizados de la pared celular de diferentes fibras de especies mono- y
dicotelidonas de inters agro-industrial. En dicotelidones (espinaca, remolacha, etc.) los
(di)ferulatos estn presentes en pectinas, tambin sobre unidades de arabinosa. Puede implicar una
diferencia importante en la capacidad de entre-cruzamiento en la pared celular entre dicotelidones y
plantas herbceas que contienen respectivamente 25 % y 5 % de xiloglucanos. Numerosas
investigaciones indican que la formacin de estos dehidrodiferulatos ocurre por acoplamiento
oxidativo de radicales generados por H2O2 y peroxidasas (Ralph et al., 1994; Wallace y Fry, 1995;
Hatfield et al., 1995; Sanchez et al., 1996; Ralph et al., 1998) y/o por ciclo-adicin foto-qumica de
radicales (Ford y Hatfield, 1989; Hatfield et al., 1999).
20

I. Introduccin

Figura 14a (izquierda): Acoplamiento por un enlace ster entre el grupo carboxilo de cido ferulico y
el tomo C-5 de -L-arabinofuranosil de la cadena lateral de arabinoxilanos de plantas herbceas
(Hatfield et al., 1999). Figura 14b (derecha): Formacin de enlace 5-5 en la unidad aromtica de
dehidrodiferulatos (Ishii, 1997).

Ningn mtodo de extraccin convencional es capaz de separar los ferulatos por completo (Ishii,
1997, Hatfield et al., 1999 y Ralph et al., 1995) debido al comportamiento de los ferulatos como
monolignoles en la biosntesis de lignina. Es decir, (di)ferulatos que se han incorporado en la
lignina slo se pueden liberar parcialmente. Por eso mucho de los contenidos de cido ferulico
publicados estn infravalorados. Adems en muchas publicaciones consideraron slo el diferulato
5-5. Sin embargo en plantas herbceas el contenido total de dehidrodiferulatos es ms grande, hasta
20 veces ms que el contenido de estructuras 5-5 (tambin dehidrodiferulatos 8-5, 8-8, 8-O-4)
(Hatfield et al., 1999).
P-cumaratos, ferulatos y cido ferulico en el entrecruzamientos entre lignina y polisacridos
Los ferulatos y p-cumaratos pueden acoplar polisacridos con lignina (Scalbert et al., 1985; Iiyama
et al., 1990; Ralph et al., 1992; Quideau y Ralph, 1997). Un estudio con istopos (Ralph et al., 1995)
fue capaz demostrar la existencia de enlaces covalentes entre ferulatos y sinapil- y coniferil
alcoholes de lignina de ballico (Lolium perenne) cultivado en un atmsfero con 15 % del CO2
marcado con 13C. Los enlaces ter entre lignina y ferulatos se pueden formar por ataque
nucleoflico al carbono C de un intermedio de metiluro de quinona de lignina en crecimiento dando
lugar a estructuras de 8-O-4 (mecanismo pasivo). Sin embargo estudios de 13C NMR (Ralph et al.,
1995) demostr que ferulatos se incorporan en la estructura de lignina en crecimiento
preferiblemente por acoplamiento radicalario (mecanismo activo). Eso explica la variedad de
enlaces encontradas (8-O-4, 8-8, 8-5 y 8-) de cido ferulico y ferulatos por 2D-NMR y por
tioacidolisis (Ralph et al., 2008). Las posiciones 7, 8 y 9 se refieren a las posiciones alifticas ,
y de cidos hidroxicinmicos, que se consideran aromticas en el caso de hidroxicinamatos y
hidroxicinamaldehidas. Detectaron el compuesto 1,2,2-tritioetil etilguiacol (Figura 15), un producto
de tioacidolisis tpicamente en fibras herbceas donde cido ferulico est incoporado en la lignina
via el acoplamiento 8-O-4. (Ralph et al., 1995) y (Ralph et al., 2008) indican fuertemente que
cido ferulico y ferulatos se comportan como otros monolignoles. Adems sugirieron que el
compuesto podra servir como indicador de deficiencia en actividad de CCR en cultivos
transgnicos. Esto es el caso sobretodo en frondosas como lamo, pero en herbceas es menos
evidente porque el compuesto puede existir de forma natural (no transgnicas).
21

I. Introduccin
Se sugiri que los ferulatos son puntos de nucleacin para la biosntesis de lignina (Hatfield et al.,
1999). Los niveles de dehidrodiferulatos y su organizacin espacial determinan el grado de
entrecruzamiento entre polisacridos de la pared celular. La fraccin de lignina presentes en
complejos de lignina-carbohidratos y el nivel de entrecruzamiento dependen de los niveles y
organizacin espacial de cido ferulico, ferulatos y dehidrodiferulatos.

Figura 15: Incorporacin en lignina de monolignoles (a), ferulatos (b) y cido ferulico (c) por
acoplamiento radicalario 8-O-4, la aromatizacin posterior del intermedio de quinona por ataque
nucleoflico de agua (a), eliminacin de un protn cido en posicin 8 (b) y decarboxilacin (c), y sus
productos de tioacidolisis correspondientes. Se produce 1,2,2-tritioetil etilguiacol (c) a partir de una
unidad de cido ferulico (Ralph et al., 2008)

1.3.1. Complejosdeligninacarbohidratos(LCC)
El entrecruzamiento hace que no se puede tratar las fibras lignocelulsicas como fracciones
separadas de celulosa, hemicelulosa y lignina. Ests fracciones se encuentran en complejos
presentes en la pared primaria y secundaria (Ishii, 1997). Parte de la lignina est presente en
complejos con carbohidratos, los denominados LCC (lignin-carbohydrate complexes). Ligninas
extradas, por ejemplo con dioxano:agua segn (Bjrkman, 1956), no son puras. Contienen
inevitablemente una fraccin residual de carbohidratos. La presencia de los biopolmeros de la
pared celular en dichos complejos limita el aprovechamiento de celulosa como en la produccin de
papel y en hidrlisis (enzimtica) y fermentaciones para convertir la celulosa. El fraccionamiento
22

I. Introduccin
eficiente es un reto en los procesos de refinera, no slo en cuanto a rendimiento de producto pero
tambin en cuanto a pureza para optimizar la conversin en productos.
Para fraccionar estos complejos se usan tcnicas especficas dependiendo de la estructura de la
lignina segn el tipo de especie, la parte anatmica y la madurez de la planta (Himmelsbach, 1993).
Entre ellos se usan en general mtodos de solvolisis. Son extracciones con agua caliente y alcali
seguido por precipitacin en etanol, extracciones con disolventes como dioxano:agua (80:20),
DMSO y DMSO con compuestos N alcali (por ejemplo tetrabutilamoniumhidrxido) y con vapor
de agua a presin seguido por digestin alcalina.
Los enlaces que se encuentran en los complejos de conferas y frondosas son de tipo (Watanabe,
2003) ter- y ster benclico, ter glicosdico y acetal (Figura 16). Las proporciones de estos enlaces
se puede estimar con 2,3-dicloro-5,6-diciano-1,4-benzoquineno (Koshijima et al., 1984; Watanabe
et al., 1986).

Figura 16: Enlaces encontrados en complejos de lignina-carbohidratos: ter-benclico (1), ter


glicosdico entre el grupo p-hidroxilo aromtico y el carbono anomrico (2), ster-benclico (3) y acetal

El rendimiento del fraccionamiento industrial es importante para obtener lignina comercial con un
bajo contenido en carbohidratos residuales, porque influye en la reactividad y las propiedades del
polmero (Singh et al., 2005).
1.3.2. LCCdeplantasherbceas
Los complejos LCC de plantas herbceas diferencian estructuralmente de plantas madereras. A
parte del contenido de unidades H, la lignina de especies herbceas tambin se caracterizan por su
nivel de acilacin de la lignina de forma natural en la posicin de cadenas laterales de unidades S
(Crestini, 1997, Ralph et al., 1999; del Ro et al., 2008). Los grupos de acilacin encontrados son
23

I. Introduccin
acetato, cido p-cumarlico y/o derivados p-hidroxibenzoilados. Adems las plantas herbceas se
caracterizan por su contenido en cido ferulico y cido p-cumrico que forman puentes entre
carbohidratos-carbohidratos y lignina-carbohidratos (Buranov, 2008). Los enlaces de estos puentes
con lignina y con carbohidrato (sobretodo arabinoxilanos) consisten en steres y teres
(Himmelsbach, 1993; Lapierre y Monties, 1989) que se pueden caracterizar cuantitativamente
respectivamente por rotura en medio alcalino o por metilacin (Wallace et al., 1995). (Higuchi et
al., 1967b) estim que 3-10 % de la masa de lignina de especies herbceas est representado por
cido p-cumarico unido por enlaces de steres. Los enlaces ster se encuentran sobre el carbono C
de sobretodo unidades S. Tambin est presente cido ferulico en proporciones ms pequeas, que
est unido por enlaces ster y/o ter. Los enlaces ter consiste sobretodo en el acoplamiento 8-O-4
(ver apartado 1.3.).
El tratamiento alcalino (Figura 17) libera parcialmente cido ferulico y cido p-cumrico de los
carbohidratos. La fraccin de estos cidos hidroxinmicos que est unida a la lignina por enlaces
ster se separan, mientras las que estn enlazados por enlaces ter se mantienen en la lignina.
Despus el tratamiento con alcali, una fraccin residual de lignina permanece unida a los
carbohidratos. En las gramneas los enlaces ster con arabinosa predominan sobre enlaces ter
benclico y - fenil glicosdicos. Por eso ms o menos la mitad de los compuestos fenlicos se
pueden eliminar con alcali a temperatura ambiente (Chesson, 1981; Hartley y Morrison, 1991).

Figura 17: Separacin parcial de lignina, cido ferulico, cido p-cumrico y arabinoxilanos en maz
despus tratamiento en medio alcalino (adaptado de (Kato y Nevins, 1985)).

Las pajas suelen contener hasta 5 % de cido ferulico (Buranov, 2008). La fraccin de cido
ferulico separada suele variar entre 1 y 4.3 % en plantas herbceas segn (Sun et al., 2002). Se
liberaron respectivamente 20 % de p-cido cumarico y 60 % de cido ferulico de 2,13 mg/g y 1,35
mg/g presentes en la fibra de paja de trigo (Benoit et al., 2006). Los enlaces ter entre cido
ferulico y lignina se pueden romper por cidos como cido oxlico. Simultneamente se rompe
24

I. Introduccin
parcialmente el enlace entre la cadena lateral con arabinosa y xilano manteniendo intacto el enlace
ster entre arabinosa y cido ferulico, es decir, se producen oligosacridos feruloilados y en menos
proporcin p-cumarilados (Figura 18).

Figura 18: Estructura de feruloil arabinobiosa (1) y de tetrasacridos de arabinoxilano feruloilado (8 y


9) y p-cumarilado (10) isolada en el hidrolizado con Driselase de respectivamente espinaca (1) y ,
bamb (8 , 9 y 10), caa de azcar (8) y paja de cebada (10)

2. Ligninacomofactorlimitanteenprocesosindustriales
A continuacin se describe brevemente la produccin de pasta de papel y la problemtica en el
sector asociado a la lignina. El estudio exhaustivo del comportamiento de lignina y carbohidratos
durante la produccin de papel sirve como base de conocimientos para desarrollar tcnicas
analticas optimizadas en procesos de biorrefinera de materiales lignocelulsicos.

2.1. Produccindepapel
Previo a la produccin misma de papel est la produccin de pasta de papel (pasteado) y su
posterior blanqueo. El pasteado se basa en la separacin de celulosa de los otros componentes de
fibras madereras y no-madereras. El blanqueo trata de disolver y/o degradar lignina residual
despus el pasteado y mejorar ciertas propiedades. Segn datos de FAO de 2004 sigue aumentando
la produccin de pasta de papel. La Unin Europea es el segundo productor mundial de pasta de
papel. La industria de papel, incluyendo la produccin hasta producto final (impreso), representa
aproximadamente 10 % de la actividad industrial europea (Confederation of European Paper
Industries, 2001).
2.1.1. Pastadepapel
El pasteado trata de maximizar rendimiento, mejorar calidad de la pasta de papel y dar ciertas
propiedades al papel. Se emplean procesos mecnicos y qumicos. Procesos mecnicos dan un alto
rendimiento y son adecuados para ciertos tipos de papel. Sin embargo el alto contenido en lignina se

25

I. Introduccin
mantiene produciendo fibras rgidas, poco flexibles, con poca rehidratacin y agregacin entre si
resultando en papel con baja resistencia y sensibles al envejecimiento ptico. En el proceso qumico
se elimina lignina tras coccin con cidos o alcali en digestores de temperatura y presin elevadas
dejando pasta de celulosa con lignina residual y la denominada leja negra. Su rendimiento es ms
bajo (entre 35-65 % (Sjstrom, 1993)) que con procesos mecnicos, pero da papel ms resistente y
ms fcil de blanquear. Se dividen principalmente tratamientos alcalinos como el proceso kraft y en
tratamientos con cidos como el pasteado al sulfito. Otro proceso emplea solventes orgnicos
(organsolv) (Gilarranz et al., 1999). El proceso de organsolv tambin ha sido usado para desarrollar
pretratamientos de biomasa.
El proceso a la sosa (con alcali) es el ms convencional. Se elimina la lignina con un alto
rendimiento, frecuentemente asistido por antraquinona como catalizador y estabilizador de los
carbohidratos. El proceso kraft emplea a parte de NaOH tambin H2SO4, a elevada presin y
temperatura (150-170 C). El proceso kraft requiere periodos cortos de coccin debido a una
deslignificacin catalizada por H2SO4 disminuyendo la despolimerizacin y degradacin de la
celulosa. El rendimiento de pasta varia entre 40 y 60 % parcialmente debido a la eliminacin de ms
lignina. El proceso al sulfito separa la celulosa eficazmente. Est restricto a fibras no conferas,
porque se presentan manchas coloradas en el papel debido a la formacin de complejos entre
lignina y cidos resnicos a baja pH. Los reactivos empleados son H2SO3 y Ca(HSO3)2 producidos a
partir de SO2 y CaCO3. Da rendimientos similares al proceso kraft dependiendo de la temperatura
(125-180 C). Se obtiene una pasta de celulosa con menos grado de polimerizacin y menos
resistente, pero ms facil de blanquear. El proceso de organsolv emplea disolventes orgnicos como
metanol, etanol, butanol, alcohol benclico, glicero, glicol y derivados, fenol, acetona, cido frmico
y actico, dioxanos, DMSO, hexametilendiamina, etc. El proceso admite usar todas tipas de fibras
y ofrece un alto rendimiento con un bajo contenido de lignina residual. Sin embargo est sujeto al
coste del disolvente, de su recuperacin y de su impacto medioambiental. Por eso metanol y etanol
resultan los ms atractivos.
2.1.2. Blanqueodepastadepapel
El blanqueo trata de eliminar la lignina residual que se mantiene unido a la celulosa despus el
pasteado. La cantidad de secuencias determina el grado de blancura deseado en funcin del tipo y
aplicacin del papel producido. Para ello se emplean reactivos como Cl2, NaOCl, H2O2, ClO2 y
NaOH. Frecuentemente se usan xilanasas en el blanqueo para hidrolizar xilanos con lignina
acoplada teniendo en cuenta que xilanos se asocian con la celulosa. As se logra reducir el gasto de
reactivos clorados. Actualmente la legislacin europea est evolucionando y los niveles de
productos clorados en efluentes estarn cada vez ms restrictos. En la ltima dcada se introdujeron
secuencias de blanqueo parcialmente (ECF) y completamente libres de cloro (TCF). Procesos de
ECF no usan Cl2 y procesos de TCF emplean H2O2, O2 y/o O3. Sin embargo para obtener pasta de
una calidad parecida, surgieron problemas debido a la lignina y los lpidos.
2.1.3. Degradacinenzimticadelignina
La problemtica de la presencia de lignina en la produccin de papel est relacionada con el
rendimiento, la calidad y propiedades del papel (color, resistencia, etc.) y costes (reactivos, energa,
etc.). Para reducir el contenido de lignina se usaron varios tipos de hongos como por ejemplo
26

I. Introduccin
especies de Aspergillus y Neurospora, Pycnoporus cinnabarinus , Myceliophthora thermophila,
pero tambin enzimas ligninolticas aisladas hongos. Estas enzimas pertenecen al amplio grupo de
lacasas, peroxidadas lignolticas (LiP), peroxidasas de manganesio (MnP) y perxidasas verstiles
(VP). La actuacin de las enzimas aisladas es ms directa y selectiva que la de los hongos. Con los
hongos existe el riesgo de hidrolizar la celulosa demasiado debido a la presencia de celulasas y
tiempos de residencia ms largos. La efectividad de muchas lacasas aumenta (en presencia de
mediadores sintticos como HBT y mediadores naturales como cido sinaplico y metilsiringato
presentes en las lejas negras del pasteado. En hongos como Clostridium termocellum y Aspergillus
niger (Faulds et al., 2010) que producen lacasas, tambin se encontraron feruloil esterasas que
hidrolizan cido ferulico esterificado sobre unidades de lignina. Se observ que cido ferulico y pcumrico se hidrolizaron antes de que lignina degradad. Su actuacin sinergtica puede acelerar la
biodegradacin de lignina. Estos compuestos actan como mediadores para la oxidacin de lignina.
En muchos estudios sobre produccin de pasta de papel se compara la estructura de lignina nativa y
de la lignina residual, por ejemplo en el proceso kraft. (Ibarra et al., 2007a) lograron aislar las
ligninas residuales de pastas de madera de eucalipto tratados con el proceso kraft. Tenan una
estructura bastante similar a la de la lignina nativa (MWL) con un predominio de unidades S y
enlaces -O-4 ( 80 %) y un predominio ( 15 %) de subestructuras tipo siringaresinol
(compuesto B en Figura ). La lignina kraft que termina en la fraccin de leja negra tiene un alto
contenido fenlico y est enriquecida en estructuras tipo resinol. Despus el blanqueo con perxido
en medio alcalino el contenido de subestructuras tipo resinol baj hasta 6%. Sin embargo segn
(Sipila, 2002) la lignina residual est enriquecida en subestructuras condensadas como estructuras
tipo bifenil como 5-5y tipo -5. Subestructuras tipo bifenil pueden representar hasta 30 % de la
lignina residual de pasta no blanqueadas. Gran parte de compuestos modelos de la lignina residual
del proceso kraft se degradaron con varios tipos de lacasas (C. subvermispora, T. hirsuta, etc.) en
presencia de ABTS o HBT (Elegir et al., 2005) en medio acuoso. Subestructuras que no tienen
grupos de hidroxilo libre (solo grupos de metxido ) como -5-dehidrodiferulato no degradaron.
En presencia de surfactantes como Tween 80, ciertos lpidos y Mn2+ se degradaron ms de 50 % de
los compuestos modelos indicando la accin de MnP y lacasas. Sin embargo con otras lacasas solo
se observ la rotura de enlaces -O-4 y -5 (la accin de lpidos como n-dodecil--maltosida y
.
cido linoleico se basa en la formacin de peroxiradicales (ROO ) que podra abstraer el hidrgeno
benclico (en la posicin C ) para romper el enlace -O-4 en presencia de MnP (Kapich et al.,
1999).

2.2. Biorrefinera
CO2 representa una gran parte de las emisiones de los gases greenhouse que aportan al cambio
global climtico. Gran parte de las emisiones de CO2 vienen de combustibles fsiles que
suministran el 85 % de la energa que se consuma globalmente (Lewis, 2006). Un sistema
sostenible y eficaz para afrontar las problemas del cambio global climtico es una combinacin de
varias tecnologas que convierten la energa de los fotones emitidos por el sol en energa final a
consumir de forma eficaz (energa elica, energa solar, biomasa y produccin fotoelctrica de H2).
Tecnologas que usan biomasa lignocelulsica resultan atractivas, porque pueden ayudar a la
decarbonizacin de nuestro suministro energtico, incluso a la disminucin de emisiones de otros
gases de efecto invernadero (NOx, SOx, CH4, etc.). Actualmente los biocombustibles lquidos
27

I. Introduccin
provienen de azcares, almidn, aceites y grasas principalmente de los granos de cereales. Sin
embargo compiten en el mercado con el suministro de materias primas comestibles. Por este motivo
se investigan sobretodo plantas lignocelulsicas no comestibles (de segunda generacin), pero
tambin lpidos de algas y terpenos para la produccin de biocombustibles lquidos.
Actualmente se emplean cada vez ms tecnologas que convierten biomasa en biocombustibles y
bio-energa por conversin trmica como en plantas para la generacin de electricidad a travs de
combustin controlada de carbn con sustitucin parcial por biomasa, en la conversin a syngas, en
la conversin gas water shift, pirlisis y variantes, etc. Syngas es una mezcla de CO2, CO, CH4,
N2 y H2 que se genera a partir de biomasa a 800-900 C. El syngas se puede convertir con
catalizadores especficos a metanol, etanol, dimetileter, hidrocarburos y otros productos
relacionados que se pueden usar para la produccin de diesel y gasolina y otros combustibles. Estas
tecnologas son ms sensibles al coste de transporte, porque estas plantas requieren operar a gran
escala para garantizar la viabilidad econmica debido a costes de inversin ms altos. Tecnologas
de bioconversin para la produccin de biocombustibles necesitan menos escala y por eso son
menos sensibles al coste de transporte de biomasa. Sin embargo la presencia de lignina limita el
aprovechamiento celulsico mientras que lignina no influye en la conversin trmica.
En la bioconversin de materias lignocelulsicas se diferencian 4 pasos principales: reduccin de
tamao de la biomasa, pretratamiento, hidrlisis y conversin a productos finales como
biocombustibles (Carroll, 2009).
2.2.1. Pretratamiento
El pretratamiento se divide en procesos mecnicos (reduccin de tamao de fibras y partculas) y en
procesos (bio)qumicos. La reduccin del tamao de las fibras es un proceso esencial para reducir
los gastos energticos y aumentar la accesibilidad de reactivos y enzimas. El objetivo principal de
pretratamientos para la produccin de biocombustibles es aumentar la porosidad de los partculas de
biomasa y facilitar la accesibilidad de enzimas hidrolticas a la celulosa tras desacoplamiento de
lignina y hemicelulosa de las microfibras de celulsa. (Carroll, 2009) indica que el tamao
molecular de muchas enzimas hidroliticas que se sita alrededor 20 kDa (2,5 nm radius stokes), es
crtico en comparacin con el radius del espacio entre las paredes celulares, p.e. 3 nm en clulas del
entrenudo de trigo (Chesson, 1997). Se conoce sobretodo el mecanismo de conversin de
oligosacridos con celulasas, pero estructuras ms grandes de celulosa presentes en lminas son ms
recalcitrantes (Arantes y Saddler, 2010). Se conoce relativamente poco sobre los mecanismos de
delaminacin, dispersin y hinchamiento de celulosa que est empaquetado muy densamente. Gran
parte est presente como microfibrillas, subestructuras de 30-36 cadenas lineales de glucanos con
regiones cristalinas agregadas por puentes de hidrgeno y fuerzas van der Waal. Emplearon ciertas
protenas con determinados grupos enlazantes de carbohidratos para hinchar las lminas de
celulosa. Result en una accesibilidad mayor de celulsas, aunque su mecanismo de accin todava
se desconoce. Tambin se describieron expansinas que pueden aumentar la accin de celulasas
(Cosgrove et al., 1998). Son enzimas de alrededor 27 kDa que actan sobre celulosa sin
hidrolizarla, aunque gran parte de su centro cataltico es comn con endoglucanasas.
El tipo y las condiciones de pretratamiento dependen principalmente del tipo del material
lignocelulsico. Para ello se debe identificar y cuantificar los constituyentes de la pared celular.

28

I. Introduccin
Resulta interesante cuantificar la proporcin de enlaces ster y ter que unen cido p-cumrico y
cido ferulico a la lignina. Por ejemplo ligninas de maz y paja de trigo contienen respectivamente
(Sun et al., 2002):
- 6.7 y 3.8 % de cido p-cumrico unidos por enlaces ster y 1.3 y 1.7 % por enlaces ter
- 1.4 y 1.0 % de cido ferulico unidos por enlaces ster y 2.4 y 2.2 % por enlaces ter
Un pretratamiento tpico consiste en aadir 0,9 % H2SO4 (cido diluido) a 180 C durante
alrededor de 1 minuto (Carroll, 2009). Se hidroliza gran parte de los xilanos presentes. Los xilanos
se disuelven en oligosacridos y azcares libres. Los que estn asociados con lignina y con otros
xilanos por enlaces steres dificulta este proceso. Lignina se asocia indirectamente a celulosa a
travs de xilano. Otro pretratamiento con resultados parecidos es la expansin de fibras por amonio
(Wyman et al., 2005; Lau et al., 2009). Figura 19 muestra imgenes de alta definicin que ilustran
los cambios superficiales de la pared celular de paja de trigo durante variantes de pretratamientos.

Figura 19: Imgenes de SEM y AFM de paja de trigo, sin pretratamiento (A-C), con pretratamiento
hidrotrmico sin (D-F) y con delignificacin (G-I) y con pretratamiento por steam explosion (J-L).
(Kristensen et al., 2008).

29

I. Introduccin
Imagen C ilustra las microfibrillas de celulosa presente en un matriz de lignina y hemicelulosas. El
tratamiento hidrotrmico separa las fibras (D) y hace que la lignina vuelve a depositar en la pared
celular en forma globular (E). Las microfibrillas de celulosa ya no estn visibles. Con un
pretratamiento adicional de delignificacin de la pared celular, desaparecen los depsitos de lignina
y aparecen visibles las lmelas de microfibrillas de celulosa (H y I). El tratamiento por vapor tiene
efectos similares dejando depsitos globulares de lignina (J-L).
2.2.2. Hidrlisis
Enzimas hidrolticas depolimerizan celulosa en glucosa y xilosa (sacarificacin). Una vez reducido
el tamao de la materia lignocelulsica, parte de la celulosa se mantiene recalcitrante frente a las
enzimas hidrolticas (Himmel et al., 2007). Los slidos recuperados tras filtracin se someten a una
segunda hidrlisis. Se puede llevar a cabo con levaduras que metabolizan hexosas y pentosas
simulatneamente (respectivamente en mayor proporcin glucosa y xilosa) a la vez o con mezclas
de enzimas. La digestibilidad de la pared celular depende principalmente del contenido total de
lignina (Adler, 1977; Liu y Wyman, 2003). Diferencias pequeas en el contenido de lignina influye
mucho en la velocidad de la hidrlisis a azcares solubles (Chen F., 2007).
Tras modificacin gentica y nuevas mezclas de enzimas se intenta aumentar el aprovechamiento
celulsico. Segn (Carroll, 2009) se requieren alrededor de 25 kg de enzima por tonelada de
celulosa para alcanzar una velocidad de conversin a nivel industrial. El coste de las enzimas
hidrolticas representa el mayor coste y por eso crece tambin inters en catalizadores qumicos. Sin
embargo con catalizadores qumicos surgen problemas de desactivacin por ciertas sustancias en la
biomasa. Importante es un pretratamiento adecuado para aumentar la accesibilidad de las enzimas a
la celulosa y hemicelulosa (Chen y Dixon, 2007). Ciertos compuestos como furfural producido por
pretratamiento con cido diluido de hemicelulosas, pueden inhibir a las levaduras usadas debido a la
alta concentracin de slidos usada para no diluir el producto (Haemelinck et al., 2005).
2.2.3. Conversinaproductos
La conversin a productos es de vital importancia para la rentabilidad y viabilidad de una
biorrefinera. Cuanto ms integrado la refinera del material lignocelulsico, es decir, cuanto ms
biomasa se convierte en producto final y cuanto ms alto su pureza, ms rentable y viable sea una
planta de biomasa. En en futuro la extraccin industrial de lignina puede dar lugar a productos
como vanilina, cido ferulico, vinilo guaiacol y lignanos. Resulta interesante un estudio sobre la
adsorcin de cido p-cumrico sobre las paredes de levaduras de Brettanomyces sp. y
Saccharomyces sp. y sobre polivinilpolipirrolidona (Salameh et al., 2008) para evitar la formacin
de 4-vinilfen ol que se transforma en 4-etilfenol por levaduras que da un mal gusto y olor a vinos.
En vino cido p-cumrico forma un complejo con cido tartrico y glucosa. La enzima cinamato
descarboxilasa convierte cido p-cumrico en 4-vinilfenol. Para transformar cido p-cumrico en
productos, conviene primero separarlo del medio. La adsorcin sobre superficies de levaduras
resulta interesante para ms investigacin, aunque sus enzimas lo convertirn en 4-vinilfenol.
2.2.4. Ingenieragentica
Durante los ltimos aos ha crecido mucho el inters en cultivos transgnicos como lamo (Hu et
al., 1999; Morreel et al., 2004; Vanholme et al., 2008) y alfalfa (Chen F. et al., 2006) con un
contenido reducido de lignina. La ingeniera gentica pretende estudiar el efecto sobre el contenido
30

I. Introduccin
total de lignina y la proporcin de unidades G/H/S tras alterar la expresin de estos genes. El
control de la biosntesis en ciertos cultivos permite obtener fibras con lignina de mayor
digestibilidad con fines de producir biomasas ms aptas para la produccin de papel y para
biorefinera. (Chen y Dixon, 2007) compararon el contenido de lignina y el rendimiento de
sacarificacin de cultivos transgnicos de alfalfa. Alteraron la regulacin de los genes C4H, HCT,
C3H, CCoAOMT, F5H y COMT que intervienen en la biosntesis de lignina. Produjeron menos
lignina y ms carbohidratos y se aument el rendimiento de sacarificacin, sobretodo en C3H y
HCT transgnicos. En los hidrolizados de los cultivos transgnicos se aument la proporcin de
xilosa frente a glucosa, indicando que la alteracin en contenido y composicin de la lignina puede
aumentar la accesibilidad de enzimas a las hemicelulosas. En la lignina de los cultivos transgnicos
de C3H y HCT no se observ una correlacin directa entre la proporcin S/G y el rendimiento de
sacarificacin. Puede ser una consecuencia del enriquecimiento en unidades H en la lignina. Para la
produccin de papel se lograron aumentar genticamente el contenido en unidades S en la lignina
de lamos para aumentar la degradabilidad de la lignina (Huntley et al., 2003) resultando en un
tiempo de residencia ms corto en los reactores de pasta de papel, un gasto energtico reducido y
menos compuestos potencialmente txicos para el medioambiente. Tambin se podra reducir el
grado de entrecruzamiento por cidos ferulicos entre arabinoxilanos y lignina y entre si mismo.
La ingeniera gentica tambin tiene como objetivo encontrar rutas de biosntesis de otros
monolignoles ms fciles de degradar una vez polimerizados. Tambin se busca reducir el nivel de
acetilacin de los polisacridos genticamente y tambin de lignina, porque durante el
pretratamiento cido se hidrolizan los enlaces ster con acetato. cido actico puede inhibir a los
micro-organismos en el paso de la fermentacin a azcares libres. No se conoce por completo la
funcin de la acetilacin, probablemente reduce la solubilidad de la pared celular (Carroll, 2009).

31

II. OBJETIVOS

CAPTULO II:

OBJETIVOS

32

II. OBJETIVOS
Este proyecto tiene 2 objetivos principales:
- Determinacin y anlisis de la composicin qumica de diferentes fibras de inters
industrial: sisal, abac, paja y salvado de trigo, brewers spent grain (BSG) y hierba
elefante
- Aislamiento y purificacin de lignina nativa de las diferentes fibras estudiadas
(preparacin de MWL). Anlisis de MWL mediante diferentes tcnicas analticas.
Este proyecto fin de master pretende establecer los fundamentos de mi investigacin doctoral sobre
diferentes tcnicas analticas usadas para caracterizar qumicamente y estructuralmente los
constituyentes de diferentes fibras y sus cambios durante la produccin de pasta de papel y de
varios tipos de pretratamientos usados en biorrefinera. Como fibra de inters industrial recibe
mucho inters en particular la hierba elefante, porque es una fibra de inters industrial que el
proyecto europeo LIGNODECO (Seventh Framework Programme) trata de analizar y evaluar
como como material lignocelulsico. LIGNODECO, Optimised pre-treatment of fast growing
woody and nonwoody Brazilian crops by detailed characterization of chemical changes produced in
the lignin-carbohydrate matrix, tiene los siguentes objetivos:
- Evaluacin del rendimiento de biomasa de la cultivacin (Eucalyptus y Pennisetum)
- Composicin y estructura qumica de la materia lignocelulsica
- Evaluacin de mtodos analticos de para constituyentes de biomasa lignocelulsica
- Desarrollo de nuevos pretratamientos basado en (bio)tecnologas de la industria
papelera
Un objetivo importante es analizar y evaluar un pretratamiento adecuado (mcanico, qumico y
enzimtico) para aumentar el rendimiento de sacarificacin y fermentacin para la produccin de
bioetanol. Se pretende adquirir una mejor comprensin de la funcin y comportamiento durante los
tratamientos de las constituyentes de la pared celular (lignina, hemicelulosa y celulosa).

33

III. MATERIALES Y MTODOS

CAPTULO III:

MATERIALES
Y MTODOS

34

III. MATERIALES Y MTODOS

1 Materiales
1.1. Reactivos
Acetona: (CH3)2CO, 99.5 % pureza (GC), Panreac, (RFE, USP, BP, Ph. Eur.) PRS-CODEX.
Acido actico (glacial 100 %): CH3COOH, 99.8-100.5 % (acidimtrico), Merck.
Acido propinico: C3H6O2, 99.0 % (GC), purum, Fluka.
Acido sulfrico: H2SO4, 96 % ( 95 % acidimtrico), PA-ISO.
Amonio cloruro: NH4Cl, 99.5 %, Panreac (PA-ACS-ISO).
Anhidrido actico: (CH3CO)2O, > 99.0 %, Panreac (Reag.Ph.Eur, PA-ACS-ISO).
Anhidrido propinico: C6H10O3, 96 % (NT), purum, Fluka.
Bromuro de acetilo: C2H3BrO, 97 % (mtodo morfolina), para sntesis, Merck
Cloroformo: CHCl3, 99.8 % (GC), SupraSolv, Merck.
Clorito sdico: NaClO2, 25 % (m/m) en agua para sntesis.
Diclorometano: CH2Cl2 estabilizado con amileno, 99.5 % (GC), Panreac (PA-ACS-ISO).
1,2-dicloro-etano: C2H4Cl2, 99.5 % (GC), puris., Merck.
Dimetilsulfxido: C2H6O, 99.9 % (GC), H2O 0.1 %, puriss., Fluka.
Dimetilsulfxido-d6: (CD3)2SO, 99.8 % grado de deuterizacin (RMN), Panreac.
1,4-dioxano: C4H8O2, 99.0 % (GC), puriss., Merck.
Etanol: C2H5OH, Merck (Reag.Ph.Eur, ACS-ISO).
Eter de petrleo: 3560 C, Pestipur, Carlo Erba Reactifs-SDS.
iridina: C5H5N, 99.5 % (GC), SeccoSolv, Merck.
Piridina-d5: C5D5N, 99.95 % grado de deuteracin, Panreac.
Propionil bromida: C3H5BrO, 98 %, Sigma Aldrich.
Sodio sulfato anhidro: Na2SO4, 99.0 %, Panreac (PA-ACS-ISO).
Tetrabutilamoniohidrxido: C16H37NO, 40 % (m/m) in H2O ( 1.5 M). Halides (Br) < 0.1 % y
sulfatos 3000 mg/kg.
Tetrametilamoniohidrxido: (CH3)4NOH, 25 % (m/m) en metanol, Sigma Aldrich.
Tolueno: C6H5CH3, 99.5 % (GC), Panreac (Reag.Ph.Eur,PA-ACS-ISO).
Zinc: Zn,en polvo, 99 %, Riedel-de Han.

1.2. Materialeslignocelulsicos
1.2.1.Sisal
El sisal (Agave sisalana) es una planta que pertenece a la familia de las Agavceas, orden
Asparagales, clase Liliopsida dentro de la divisin Magnoliophyta. Son plantas monocotelidones.
Las plantas de sisal son originalmente de Mxico y suelen crecer en climas tropicales, pero se
adaptan bien a diferentes condiciones medioambientales y climatolgicas. Estn siendo cultivados
principalmente en Brasil (> 50 % de la produccin mundial en 2005). Otros pases productores (310 %) son Mxico, Colombia, Cuba, Kenia, Tanzania, Madagascar y China.

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III. MATERIALES Y MTODOS

Figura 20: Ilustracin de cultivos de sisal (Agave sisalana) y procesado de sus fibras

Tienen una vida productiva entre 18 y 20 aos y producen aproximadamente 30 hojas al ao (Figura
20). Crecen hasta 2 m de altura y hasta 15-23 cm dimetro del tronco que es relativamente corto. En
las plantas de descorticacin se separan las fibras que posteriormente pasan por secado, cepillado,
embalado y distribucin. Caractersticas de la fibra como longitud, espesor y resistencia dependen
principalmente de la madurez de la hoja y de su orientacin en la hoja. Las hojas maduras contienen
fibras ms largas y bastas. En los extremos de las hojas se encuentran fibras ms gruesas. Una hoja
madura de sisal suele medir entre 1-2 m de longitud, 10-15 cm de anchura y 6 mm de espesor (en el
centro). Los haces de fibras suelen crece hasta 60-150 cm y la fibra elemental entre 1-8 mm de
longitud y 8-40 m de anchura (McDougall et al., 1993; Garca Hortal, 2007).
Gracias a su rigidez actualmente todava se usan las fibras en la industria de textil y la fabricacin
de cuerdas. Tambin se usa como materia prima para la produccin de pasta de papel, sobretodo
para papel con propiedades especficas como su porosidad (papel de filtro, bolsas de t, etc.) y
papeles dielctricos. Tambin se usan para reforzar papeles delgados.
1.2.2.Abac
El abac (Musa textilis) es una planta perenne que pertenece a la familia de las Musceas (bananas),
orden Zingiberales. Son plantas monocotiledones. Tiene su origen nativo en las Filipinas y
actualmente se cultiva en Indonesia y en muchos pases tropicales de Amrica Central (Figura 21).
Se implantan trozos de races maduros al inicio de la temporada lluviosa. Despus 18-25 meses, se
recogen las hojas cada 3-8 meses durante una vida productiva de 10 aos. Suelen crecer hasta 25
tallos que pueden alcanzar una altura entre 3 y 7.5 m y un dimetro entre 12-30 cm. Contiene un
corazn central envuelto por vainas foliares que forman un pseudo-tronco de 30-40 cm. Las vainas
externas del tallo se separan de forma mecnica para uso comercial. La longitud de los haces
fibrosos pueden llegar a medir entre 1.5 y 3.5 m y la fibra elemental entre 2.5 y 12 mm segn el
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III. MATERIALES Y MTODOS


espesor y la posicin en el tallo de la vaina madre. Las fibras de las vainas externas son ms cortas
y gruesas. Suelen tener un color ms oscuro y una calidad inferior.

Figura 21: Ilustracin de la planta de abac y sus fibras

La fibra de abac est clasificada como dura. Se caracteriza por una alta porosidad y son aptos para
papel de filtro, envolturas de embutidos, bolsitas de t, papel de moneda, servilletas, paales, etc.
Tambin tiene aplicaciones en textil, bolsas, muebles, etc. Las fibras de alta calidad se pueden
mezclar con fibras de algodn y maderas para la produccin de papeles ultrafinos, papel de
imprimir de bajo gramaje, papel de registro, etc. La fibra de abac es una fibra duradera, flexible y
resistente a agua salada (uso en redes de pesca, cuerdas de barcos, etc.).
1.2.3.Hierbaelefante
A veces se confunde la hierba elefante (Micanthus) con el pasto africano (Pennisetum purpureum)
a lo que tambin se llama pasto elefante. En este proyecto se analizaron las fibras de Pennisetum
spp. Pennisetum tambin es una planta herbcea perenne de la misma taxonoma como Miscanthus
hasta la subfamilia (Panicoideae) que tiene su orgen en Africa. Se encuentran en todas las regiones
templadas de ambos hemisferios, sobretodo en Africa, Australia y Sur-America. El gnero consta de
80 especies con una amplia diversidad de alturas (entre 15-800 cm, tpicamente 250-300 cm) y
hojas de 30-120 cm de longitud y anchuras de 1-5 cm (max. 35 cm). Entre ellos se cultivan
sobretodo Pennisetum purpureum (Schumacher), P. setaceum, P. spp., P. alepocroides, etc. (Figura
22). Sin embargo existen muchas otras especies salvajes y cultivadas para fines ornamentales.
Los especies de Pennisetum son veraniegos. En algunas zonas realmente forma infestaciones. Su
alto contenido calorfico hace que zonas densas de Pennisetum son zonas de riesgo para incendios.
Su corteza se hace ms dura y rgida con los aos y sus races crecen profundamente ayudando a la
conservacin de suelo. Resiste muy bien en zonas secas, aunque necesita un suelo hmedo para
crecer bien. Frecuentemente se usa fertilizantes (necesita entre 150 y 300 kg N/ha/ao). Su
37

III. MATERIALES Y MTODOS


rendimiento suele variar entre 2-10 toneladas /ha/ao de materia seca en suelos no fertilizados y
hasta 85 toneladas /ha/ao de materia seca en suelos fertilizados. En este tesis los trozos de
Pennisetum spp. se separaron mecnicamente en 2 fracciones, una de la corteza y otra de la mdula.
Adems se separaron 500 g de trozos de hierba elefante cuantitivamente. La fraccin obtenida de
corteza represent 84 % del peso inicial (mdula 16 %).

Figura 22: Ilustracin de cultivacin de varias especies de Pennisetum

1.2.4.Pajadetrigo

El trigo (Figura 23) ha formado parte del desarrollo econmico y cultural del hombre, siendo el
cereal ms cultivado. El trigo pertenece a las familias de las gramneas, orden Poales, clase
Monocotyledoneae dentro de la divisin de Angiospermae.Actualmente se producen
aproximadamente 530 millones de toneladas/ao a nivel mundial (Buranov, 2008). Tiene una
disponibilidad continua y podra resultar ms interesante para la produccin de biocombustibles que
maz debido a su contenido ms bajo en lignina. Las especies que ms estn siendo cultivadas son
Triticum aestivum, T.durum y T. compactum. Existen muchas variedades como trigos con paja corta
y de alto rendimiento. Entre ellos principalmente se diferencian variedades de otoo/verano (de
ciclo largo), variedades de primavera/invierno (de ciclo corto) y variedades alternativas. La
duracin del periodo vegetativo marca su diferencia. Las variedades de invierno suelen cultivarse en
zonas templadas, y las de verano predominan en zonas con inviernos fros (a altas latitudes) o
demasiado suaves (latitudes bajas).
Es una materia prima importante para el alimento de consumo humano, aunque gran parte se destina
a la alimentacin animal, as como a subproductos de la transformacin industrial destinado para
piensos. La propiedad ms importante del trigo es la capacidad de coccin de la harina debida a la

38

III. MATERIALES Y MTODOS


elasticidad del gluten que contiene. Esta caracterstica permite la panificacin, constituyendo un
alimento bsico para el hombre.

Figura 23: Ilustracin de cultivos de trig

1.2.4.Salvadodetrigo

El salvado de trigo (wheat bran) es la membrana exterior que envuelve el endosperma del trigo
(Figura 24). El salvado se diferencia en aleuron y pericarp. Es dura y protege la semilla
(endosperma y brote), de ah el nombre de salvado. Es un material lignocelulsico rico en
minerales, vitaminas B, protenas, fcula y lpidos. Es un subproducto de la produccin de trigo
refinado (molienda). En principio el salvado se puede separar de cualquier cereal (arroz, maz,
avena, cebada, mijo, etc.).

Figura 24: Ilustracin de salvado de trigo (residuo agro-industrial)

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III. MATERIALES Y MTODOS


1.2.5.BSG
Brewers spent grain (BSG) es un residuo agro-industrial de la industria cervecera. Es el material
que queda despes el machacar de los granos (restos de cascabillo, pericarpo y endosperma),
normalmente de cebada (Figura 25). Su composicin consiste en aproximadamente 50 %
carbohidratos (celulosa, fcula, arabinoxilanos y -glucanos) y el resto en principalmente protenas
y lignina. Es una buena fuente de protenas no degradables y vitaminas solubles en agua. Se
aprovecha sobretodo en comida para animales, pero tambin como fertilizante y en la produccin de
biogas. En particular sirve bien como medio para cultivar championes.

Figura 25: Brewers spent grain (BSG), residuo lignocelulsico en la prepracin de malta en la
elaboracin de cerveza

2 Mtodosanalticosparamaterialeslignocelulsicos
Inicialmente se molieron las diferentes fibras dos veces con un molino de cuchillas (Ika, modelo
MF10), primero por un tamiz de 2 mm y posteriormente por uno de 1 mm. Estas fibras se usaron
para los anlisis de la composicin qumica. Para los anlisis de la estructura de lignina en situ, se
usaron las fibras cortadas por el molino de cuchillas que posteriormente se molieron con un molino
de bolas (Retsch, modelo S100) en seco durante 6-12 horas efectivas. Las horas de molienda en
total se calculan por multiplicacin con 1.8, debido a un programa de molienda con intervalos de
reposo para enfriar (ciclos de 25 minutos de molienda y 20 de reposo). Despus se someti la fibra
molida a las extracciones de compuestos lipoflicos y hidrosolubles. Para el aislamiento de la
lignina, se les extrajeron de fibras molidas por el molino de cuchillas y posteriormente se molieron
en el molino de bolas en dispersin con tolueno (ver apartado 2.5.3.).

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III. MATERIALES Y MTODOS

2.1.Anlisisdemetalesyotroselementos
Una vez molidas y secadas, se sometieron 0.5 g de fibra a una hidrlisis cida con 4 ml de cido
ntrico concentrado (HNO3) durante 15 min. en un aparto de microondas (Jones y Case, 1990). Se
filtraron los hidrolizados con un filtro de Whatman n 2 y se diluyeron hasta 50 ml de volumen
final. Se determinaron las concentraciones de metales por ICP-OES por un espectrmetro (Termo
Jarrel Ash, modelo IRIS Advantages).

2.2.Determinacindelcontenidoencenizas
El contenido en cenizas se determin segn la norma Tappi 211 om-85. Para ello, se tararon
cresoles de porcelana previamente limpiados con HCl concentrado y calentados durante 1 h a
575 C en una mufla. Se pesaron 200 mg de fibra seca en cresoles que se calentaron durante 6 h a
575 C en la mufla. Se determinaron las cenizas restantes por gravimetra y se calcul el contenido
en % sobre fibra seca.

2.3.Determinacindelcontenidoenextrableslipoflicos
Se someti aproximadamente 2 gramos de fibra a una extraccin continua durante 8 horas con
acetona en extractores de tipo Soxhlet. Seguido se elimin el disolvente por rotavaporacin y
posteriormente por un flujo de N2 hasta peso constante. El extracto lipoflico se redisolvi en
cloroformo. La fraccin soluble se sec otra vez con un flujo de N2 para su determinacin
gravimtrica. La fraccin insoluble tambin se determin por gravimetra. El extracto seco se
resuspendi en cloroformo en una concentracin apta para su anlisis por cromatografa de gases
(GC). El extracto se diluy o se concentr apropiadamente para su posterior anlisis por
cromatografa de gases/espectrometra de masas (GC/MS). Dado que este proyecto se centra en el
anlisis de lignina, no se describe la composicin de los lpidos.

2.4.Determinacindelcontenidoencompuestoshidrosolubles
Para determinar el contenido en compuestos hidrosolubles, se sometieron las fibras libres de
compuestos lipoflicos a una extraccin con agua destilada a 100 C (conforme la norma Tappi T
207 om-88) durante 3 horas. El extracto se rotavapor y se sec en cresoles de porcelana hasta peso
constante para determinacin gravimtrica. Durante estas 3 horas se extrajeron la mayor parte de los
hidrosolubles y permite comparar entre varias fibras de forma bastante exacta. Se expresa el
contenido en % sobre fibra seca inicial, por lo cual se recalcula el peso de la fibra extrada con agua
al peso inicial una vez conocido con exactitud el contenido de extrables lipoflicos.

2.5.Anlisisdelignina
El contenido de lignina de una fibra es la suma de los contenidos cido-solubles y no cido-soluble
(lignina Klason), expresados en % (m/m) de lignina sobre fibra seca inicial.
2.5.1.LigninaKlason
La lignina Klason se determin conforme la norma Tappi T222 om-88 (Tappi, 2004) con algunas
modificaciones. Para ello se eliminaron los extrables de la fibra y se determin la humedad residual
41

III. MATERIALES Y MTODOS


de la fibra que se someti a un hidrlisis cido con 3 ml de 72 % H2SO4 (m/m) por cada 300 mg de
fibra a 30 C durante 1 hora. Despus se diluy la suspensin con agua destilada hasta obtener una
concentracin de 4 % H2SO4 y se autoclav durante 1 hora a 110 C. Tras enfriar y dejar reposar se
filtr la suspensin en un filtro de kitasato n 3 previamente tarado. El hidrolizado se guard para su
posterior anlisis de la lignina cido-soluble. Se lav el filtro que contiene la lignina no cidosoluble con agua destilada hasta pH neutro y se sec durante 4 horas a 100 C para su
determinacin gravimtrica. Se recalcul el peso de la fibra al peso de fibra inicial con los datos de
la humedad y el contenido en extrables previamente determinado.
Puede que durante el hidrlisis cido algunos metales y otras sustancias de las cenizas de la fibra no
llegan a disolverse y terminan con la lignina no cido-soluble en el filtro de kitasato. Incluso
protenas y polipptidos pueden mantenerse enlazados a la lignina no cido-soluble. Para ello, se
puede introducir un factor de correccin para estas cenizas y protenas aplicando el protocolo de
cenizas a la lignina Klason seca. El contenido peptdico se estim por el contenido en nitrgeno
segn la aproximacin: contenido peptdico ~ 6,25 contenido NKjehldal.
2.5.2.Ligninacidosoluble
Para la determinacin del contenido en lignina cido-soluble se midi la absorbancia en cuvetas de
cuarzo a 205 nm del hidrolizado (filtrado) obtenido despus la hidrlisis durante el anlisis de la
lignina Klason. Para la disolucin del blanco se prepar una solucin de 4 % (m/m) H2SO4. En caso
de absorbancias mayor que 1.2 AU, se diluyeron los hidrolizados apropiadamente. La disolucin del
blanco se diluy de forma idntica. Se determino la media de varias mediciones de la absorbancia y
se calcul la lignina cido-soluble (LAS) segn:
LAS (% sobre fibra seca) = (A V) / ( m)
A = absorbancia a 205 nn (AU)
V = volumen final del filtrado (hidrolizado) (ml)
= coeficiente de extincin (1100 ml.AU/g)
m = peso de la fibra seca inicial (g)
2.5.3.Aislamientodelignina:preparacindeMWL
Con este mtodo se puede aislar una fraccin de lignina poco alterada en estructura y representativa
para el contenido total de lignina. Para aislar la lignina de fibra molida (MWL) segn el protocolo
de (Bjrkman, 1956), previamente las fibras se extrajeron con acetona durante 9 horas para eliminar
los extrables lipoflicos. Se secaron las fibras y se eliminaron los extrables hidrosolubles en agua
hirviendo. Se extrajeron en varios pasos consecutivos cambiando el agua hasta que se elimin el
color de los hidrosolubles. Se secaron y se molieron las fibras en un molino de bolas. Se emple un
molino de bolas centrfugo de marca Retsch, modelo S100 y de material gato con un programa de
25 min. de molienda y 20 min. de reposo para evitar temperaturas altas que provocan alteraciones
en la estructura nativa de la lignina. Adems la molienda no se llev a cabo en seco; se aadi
tolueno para reducir estas alteraciones. Entre 25 y 30 g de fibra, libre de extrables, se moli con 2025 bolas durante 84 horas que corresponde con 47 horas efectivas de molienda. El rendimiento de
la lignina extrada depende del grado de molienda. Las fibras molidas se secaron inicialmente
debajo un flujo de aire y despus durante mnimo 3 das al aire libre para eliminar el tolueno. La
lignina se extrajo con 250 ml de una mezcla dioxanos:agua (9:1) por cada 10 g de fibra molida
durante 15 horas. La fibras se recuperaron por centrifugacin (25 min., 4 C, 11000 rpm) que se
42

III. MATERIALES Y MTODOS


sometieron a dos extracciones consecutivas durante 13 horas. La lignina extrada se concentr y se
sec por rotavaporacin a 40 C. El residuo (lignina cruda) se resuspendi en 20 ml de una mezcla
de cido actico:agua (9:1) por cada gramo de lignina cruda seca obtenido. La disolucin de lignina
se precipit, gota a gota, en 225 ml de agua destilada fra por cada gramo de lignina cruda en
agitacin continua. Se recogi la lignina precipitada tras centrifugacin. Una vez seco (facilitado
por el uso de silica), se tritur en un mortero de gata para facilitar su disolucin en 20-25 ml de
una mezcla de 1,2-dicloroetano:etanol (2:1). El sobrenadante se recuper tras centrifugacin (5
min., 4 C, 5000 rpm). La lignina en disolucin se precipito, gota a gota, en 225 ml de ter dietlico
por cada gramo de lignina cruda, se recuper por centrifugacin y se resuspendi en 25 ml de ter
dietlico fresco. Despus 12 horas la lignina se recuper por centrifugacin y se resuspendi en
ter de petrleo durante 12 horas. La lignina se aisl por centrifugacin y se sec con un flujo de
N2. Una vez seco, se conserv en ausencia de luz y tapado del aire para evitar su oxidacin.
2.5.4.AnlisisdeMWLmediantepirlisis(PyGC/MS)
Slo se requiere entre 0.1 y 0.5 mg de MWL y entre 0.5 y 1 mg de fibra (con o sin extrables).
Las MWL y fibras se introdujeron manualmente en la cmara del pirolizador (micro-furnace
pyrolyzer de Frontier Laboratories Ltd.) que oper a 500 C durante 10 s. El programa de
temperatura del horno del GC empez a 50 C y aument hasta 100 C (30 C/min) y luego hasta
290 C (6 C:min.). Un GC (Agilent 6890) con una columna capilar de silicio (fused silica DB1701, 30 m 0.25 mm dimetro interno 0.25 m de espesor de pelcula) est acoplado al
pirolizador. La columna capilar est conectado con un MS (Agilent 5973 N). El flujo del gas
portador (He) fue 1 ml/min. La energa de ionizacin del detector fue programado a 70 eV.
Tambin se prepararon muestras derivadas (metiladas). Para ello basta con aadir 1 gota de 25 %
TMAH por mg de lignina (2-3 gotas por mg de fibra) para esterificar los grupos hidroxilos con un
grupo de metilo tras aadir TMAH.
2.5.5.AnlisisdeMWLmediante2DNMR
En general est tcnica espectroscpica es la tcnica ms poderosa para el anlisis de materia
lignocelulsica y en particular para lignina. Con el anlisis mediante 2D-NMR se puede estimar la
relacin entre las unidades S y G de la lignina. Adems se puede observar y estimar la proporcin
de los diferentes enlaces alifticos y aromticos presentes en cierta proporcin de la lignina. Con
2D-NMR se descubrieron nuevos tipos de enlaces en subestructuras menos abundantes como
dibenzodioxocinas (Karhunen et al., 1995) y las espirodienonas (Zhang y Gellerstedt, 2001; Zhang
et al., 2006).
Los espectros de NMR de ligninas se registraron en un espectrmetro Bruker Avance II 600-MHz
equipado con una criosonda TXI 1H-13C/15N/2H con gradientes en el eje z, a una temperatura de
298K. Se disolvieron 40 mg de MWL en 0.750 mL de disolvente deuterado (DMSO-d6 o DMSOd6 : piridina-d5 (4:1)) en tubos de NMR. Los geles se preparon con 100/120 mg de fibra molida sin
extrables en 0.720/0.900 ml de disolvente. Importante en la preparacin de geles es el grado de
homogenizacin para medir en un campo homogneo. Eso depende principalmente del tamao del
43

III. MATERIALES Y MTODOS


slido, el tipo de disolvente y la agitacin. Las muestras de geles se agitaron manualmente en los
tubos facilitado por ultrasonidos. No se trataron con ultrasonidos durante ms de 2 horas, en un
bao a 30 C.
Se llevaron a cabo los experimentos 1H-13C HSQC y HMBC con secuencias de pulsos estndar de
BRUKER. En el espectro de protn el nmero de puntos adquiridos fue 16k. Los experimentos 1H13
C HSQC se realizaron empleando una matriz de datos de 256 incrementos en la dimensin
indirecta, y adquiriendo 1024 puntos en la dimensin de adquisicin (respectivamente 512 y 2048
en el caso de HMBC). Las ventanas espectrales en el HSQC fueron 8000 y 21800 Hz para las
dimensiones de 1H y 13C respectivamente. En el caso de HMBC, la dimensin del 13C se increment
hasta 33000 Hz. El nmero de acumulaciones para el espectro de HSQC fue 8 (96 para HMBC). La
constante de acoplamiento 1JCH utilizada fue 140 Hz. En el HMBC, se us una constante de
acoplamiento a larga distancia de 7.5 Hz. La seal residual de DMSO-d6 se us como referencia
interna. La intensidad de las seales en los espectros HSQC depende del valor de esta constante as
como del tiempo de relajacin T2 (Zhang y Gellerstedt, 2007). Por ello, la integracin de las reas
de las seales se realiz por separado en cada una de las regiones del espectro, utilizando las seales
correspondientes a correlaciones de C-H qumicamente anlogas, con constantes de acoplamiento
1
JCH similares. En la regin aliftica oxigenada, las abundancias relativas de las diferentes
subestructuras de la lignina se estimaron mediante la integracin de las correlaciones C-H. En la
regin aromtica, las correlaciones 1H-13C de las unidades S y G se usaron para estimar las
relaciones S/G.
2.5.6.AnlisisdeMWLmedianteDFRC
El mtodo de DFRC (Derivatization Followed by Reductive Cleavage), desarrollado por el Dairy
Forage Research Center en los EEUU, es un mtodo degradativo que rompe selectivamente los
enlaces ter -O-4 y -O-4 (eliminacin reductiva) con un alto rendimiento produciendo
monmeros y dmeros (Figura 10). El anlisis por GC/MS de estos productos puede dar
informacin cualitativo y cuantitativo de las subunidades eterificadas y sobre los enlaces C-C
presentes en los dmeros formados (Lu y Ralph, 1997a; 1997b). Durante la reaccin el sustituyente
sobre el carbono C de la cadena aliftica permanece intacto (Ralph y Lu, 1998). Eso hace posible
estudiar las acilaciones presentes en esta posicin (con acetatos, p-cumaratos o p-hidroxibenzoatos).
Con el mtodo no es posible detectar y cuantificar las acetilaciones presentes de forma natural en la
lignina, porque no se puede distinguir si el grupo acetilo tiene un origen natural o si se form
durante el paso de la acetilacin en el anlisis. Por eso se desarroll un mtodo modificado
(DFRC). El mtodo DFRC es idntico al DFRC, salvo que se emplean reactivos propionilados en
vez de acetilados.
Primero se disuelve la lignina (10 mg) y se rompe los enlaces ter en una mezcla de bromuro de
acetilo y cido actico (8:92 v/v) durante 2 horas a 50 C. Se elimin el disolvente tras
rotavaporacin debajo de 50 C. Se resuspendi el residuo en una mezcla de dioxano: cido actico
: agua (5:4:1) con polvo de zinc. La suspensin se agit adecuadamente durante 40 min. a
temperatura ambiente para reducir los enlaces Br-C-C-O- (en caso de enlace ter -O-4). Tras
dejar depositar el zinc, se traspas la muestra cuantitativamente a un embudo de extraccin
aadiendo 10 ml de una solucin saturada de NH4Cl. Se agit la mezcla y se ajust el pH de la fase
44

III. MATERIALES Y MTODOS


acuosa a pH < 3 con HCl al 3%. Se aadi 10 ml de diclorometano para la extraccin de los
compuestos de la fase acuosa a la fase orgnica de diclorometano. Se agit adecuadamente y se
extrajo 2 veces ms con 5 ml de diclorometano. La adicin de sulfato de sodio anhidro a la fase
orgnica asegur la ausencia de humedad. Se decant la disolucin a un matraz para su posterior
rotavaporacin hasta obtener un residuo seco. Los grupos hidroxilo de los monmeros y dmeros se
acetilaron con 0.2 ml de anhdrido actico y 0.2 ml de piridina en 1.1 ml de diclorometano durante 1
hora a temperatura ambiente. Se elimin el disolvente y la piridina tras co-evaporacin con 10 ml
etanol (4 veces consecutivas). El residuo seco se redisolvi en diclorometano y se sec por un flujo
de N2. Se prepar una concentracin adecuada del residuo seco en diclorometano para su anlisis
con un GC/MS de Varian Star 3400 acoplado a un detector de trampa de iones (ITD, Varian Saturn
2000). La columna capilar es de slice fundida (DB-5HT, J&W, 12 m de longitud 0,25 mm de
dimetro interno 0,1 m de espesor de pelcula). El programa de temperatura empez a 50 c
incrementado con 30 C/min. hasta 100 C y despus se elev hasta 300 C a 5 C/min. El gas
portador fue He. Los monmeros se pudieron cuantificar usando tetracosano como patrn interno.
En el calcul con las reas de los picos cromatogrficos se asumaron factores de respuesta similares
a los obtenidos en (Lu y Ralph, 1997).
Los mtodos DFRC y DFRC tambin se pueden aplicar a fibras para estudiar la lignina en situ.
Para ello se suele usar fibras molidas sin extrables. Los espectros son menos limpios que los de
lignina, debido a los productos de los carbohidratos y sus complejos con lignina. Sin embargo
comparando el mtodo entre lignina aislada y lignina in situ se puede obtener informacin valiosa.
A continuacin Tabla 3 muestra los variables experimentales de los dos pasos principales en el
mtodo DFRC y DFRC. Para estimar la relacin S/G y el grado de acetilacin en la posicin , no
hace falta recuperar los productos de forma cuantitativa y usar un patrn interno para cuantificar los
monmeros de forma absoluta. Se calculan proporciones relativas de los superficies integrados de
los picos en el espectro de GC/MS de las unidades S y G del anlisis DFRC y se multiplican por un
factor de respuesta especfico para cada producto de DFRC deducido experimentalmente
(bibliografa). Los picos correspondiente a unidades S y G representan ambos tanto unidades
acetilados como no-acetilados (S+Sac y G+Gac). Para estimar el grado de acetilacin se calcula
Sac/(S+Sac) y Gac/(G+Gac) con los superficies integrados de los picos del anlisis modificado
(DFRC).
Tabla 3: Variables experimentales en los mtodos de DFRC y DFRC
Mtodo
Ruptura reductiva enlaces ter
Formacin de -bromo esteres
-O-4/-O-4
Muestra
Reactivo
Vol. Condiciones
Disolvente
Vol. Zn
(mg)
(ml)
(ml)
(mg)
DFRC MWL

10

DFRC fibra
DFRC MWL

50
5

DFRC fibra

30

CH3COBr :
CH3COOH
(8:92 v/v)
CH3CH2COBr :
CH3CH2COOH
(1:2 v/v)

2.5
5
3

2 horas 50 C /
16 horas Tamb
3 horas 50 C
12 h

16 horas 50 C

Dioxano :
cido actico : agua
(5 : 4 : 1)
Dioxano :
cido propinico : agua
(1:1:0.1)

2.5

50

5
8

100
100

100

45

III. MATERIALES Y MTODOS

2.6.Determinacindelcontenidoencelulosa
Primero se determin el contenido en holocelulosa. Para ello se aadi 1.5 g de clorito sdico
(NaClO2) y 10 gotas de cido actico glacial a 5 g de fibra (sin extrables con humedad conocida)
en suspensin en 160 ml de agua destilada en un bao de 75-80 C en constante agitacin. Cada
hora se aadi otra dosis de clorito sdico y cido actico. Se aadieron 3 dosis para fibras
madereras (hardwoods) y 4 dosis para fibras no madereras (mtodo segn (Wise et al., 1946). Se
filtr la suspensin y se lav la holocelulosa con acetona y con agua. Se determin el contenido en
holocelulosa por gravimetra y se expres en % sobre fibra seca inicial una vez conocido los
contenidos en extracto lipoflico y hidrosolubles.
Para determinar la fraccin de -celulosa en la holocelulosa, se aadi 75 ml de solucin alcali
(17.5 % m/m NaOH) a 3 g de holocelulosa con humedad previamente conocida en un bao a 20 C
en agitacin. El mtodo se basa en la norma Tappi T 203 OS-61 para determinar -, - y -celulosa
de pulpas. La -celulosa es la fraccin insoluble en las condiciones de alcali del ensayo. En general
indica la fraccin de celulosa no degrada, es decir, de alto peso molecular. La -celulosa indica
celulosa hidrolizada (con NaOH) y -celulosa representa hemicelulosas. Se aadi el NaOH en
varios pasos: 15 ml 1 minuto de agitacin + 10 ml 0,75 minutos de agitacin + 10 ml 0,25 minutos
de agitacin. Despus aadir estos primeros 35 ml se dej reposar la suspensin durante 1 min.
Enseguida se aadieron 10 ml con 2.5 minutos de agitacin y se repiti la misma dosis 3 veces ms.
Se cubrieron las suspensiones al aire y se dejaron reposar durante 30 minutos. Se aadieron 100 ml
de agua destilada a las suspensiones y se agit vigorosamente. Se dej reposar de nuevo las
suspensiones durante 30 min. para filtrarlas posteriormente sobre filtro de poro n 2. Se lavaron los
filtros con 25 ml de 8,3 % NaOH y enseguida se lavaron 5 veces con 50 ml agua destilada. El
material insoluble se lav ms con unos 400 ml de agua destilada y despus con 2 N cido actico
durante 5 min. antes de emplear el filtrado por vaco. Se lavaron los filtros con agua destilada hasta
pH neutro. Se secaron los filtros y se determin la fraccin de -celulosa por gravimetra. Se
expresaron en % de holocelulosa y en % de -celulosa de la fibra seca inicial.

46

IV. RESULTADOS Y DISCUSSIN

CAPTULO IV:

RESULTADOS Y
DISCUSIN

47

IV. RESULTADOS Y DISCUSSIN

1 Composicinqumica
Tabla 4 muestra el anlisis de los metales y algunos elementos calculados a partir de su
concentracin en el extracto cido con HNO3 determinado por ICP-OES de sisal, abac, paja y
salvado de trigo, corteza y mdula de hierba elefante y BSG.
Tabla 4: Contenido en metales y otros elementos expresadas en mg/kg (A) y % (B) de fibra seca

As
Ba
Cd
Co
Cu
Cr

A
(mg/kg
fibra seca) Fe
Li
Mn
Ni
Pb
Zn
S
Ca
B
P
(% de
fibra seca) Mg
K
Na

Hierba elefante Salvado


Mdula Corteza de trigo
< 0,01
< 0,01
< 0,01
5,692 1,532
8,253
0,973
<0.5
<0.5
<1
<1
<1
7,78
3,44
13,296
1,041
<1
<1

< 0,01
8,162
0,603
<1
5,42
<1

112,907
<1
23,8
1,02
<1
5,51
0,2458
0,211
0,022

41,507
<1
23,6
<1
<1
36,8
0,1458
0,072
0,18

10,807
<1
11,6
<1
<1
12,4
0,0623
0,011
0,292

100,7
<1
52,932
<1
<1
70,2
0,1068
0,063
0,091

75,607
<1
36,3
<1
<1
55,9
0,2226
0,785
0,631

0,074
1,2
0,182

0,071
3,5
0,012

0,025
1,82
0,01

0,076
<0.05
0,075

0,06
<0.05
0,023

Sisal

Abac

Paja de trigo

< 0,01
36,163
<0.5
<1
<1
<1

< 0,01
2,373
0,559
<1
<1
<1

< 0,01
5,552
<0.5
<1
1,91
1,851

50,1
<1
1,782
1,004
<1
4,59
0,0135
0,177
<0.01

14
<1
8,242
<1
<1
<1
0,0066
0,093
<0.01

0,032
0,056
0,021

0,013
0,214
0,001

Bsg

Resta por analizar el contenido en silicio que no se puede analizar por este mtodo. De los
resultados cabe sacar las siguientes conclusiones:
- La mdula de la hierba elefante contiene aproximadamente entre 2 y 4 veces
ms metales y otros elementos que la corteza en todos los tipos de metales y elementos,
excepto en el caso de fsforo. La hierba elefante contiene bastante ms K+ que las otras
fibras. En general el contenido de metales de la corteza de la hierba elefante es ms parecido
a lo de sisal y abac. Paja de trigo, salvado de trigo, BSG y sobretodo la mdula de la hierba
elefante tienen contenidos relativamente altos.
- BSG contiene en todos los casos menos metales que salvado de trigo excepto Ca, pero contiene
ms S y P (elementos vitales).
- Paja de trigo tiene un contenido relativamente muy alto en Fe, Ca y S.
- Abac y sisal contienen poco metales, excepto para Ba y Ca (sisal). Sisal contiene
ms metales que abac.

48

IV. RESULTADOS Y DISCUSSIN


A continuacin se muestran los resultados de diferentes anlisis qumicos de diferentes materiales
lignocelulsicos de inters industrial (Tabla 5). De cada anlisis se hizo un triplicado, salvo en el
caso de la lignina Klason (4 replicados) y solo una muestra en el caso de las correcciones de la
lignina Klason. Se observ que existe un cierto margen de error experimental en el anlisis de la
lignina Klason. En el caso de algunas fibras (sobretodo con BSG) se observ restos insolubles
depositados despus de dejar reposar el hidrolizado durante varios das. La cantidad de esta
fraccin depende principalmente del tamao de poros de los filtrados usados en el anlisis de la
lignina Klason. Se realizaron experimentos que demuestran que usando filtros de n 4 en vez de
n 3, el contenido de la lignina Klason no vara mucho (< 2 %). Tambin se encontr que estos
restos de la lignina Klason en el hidrolizado no influyen mucho en el valor de la lignina cido
soluble (< 0,5 %).
Tabla 5: Composicin qumica de sisal, abac, paja y salvado de trigo, corteza y mdula de hierba
elefante y BSG (expresados en % sobre fibra seca inicial)
Sisal

Abac

Paja de
trigo

Hierba elefante
Mdula
Corteza

Salvado
de trigo

BSG

Cenizas

1.1 0.1

1.1 0.0

6.6 0.1

11.3 0.1

5.6 0.2

1.1 0.2

4.9 0.0

Extracto lipoflico
en acetona

0.7 0.1

0.4 0.0

2.7 0.2

2.5 0.2

1.9 0.5

1.9 0.0

9,2 0.2

Extracto lipoflico
en cloroformo

0.5 0.1

0.3 0.0

2.0 0.2

1.3 0.4

0.9 0.3

1.9 0.0

9.1 0.2

Compuestos
hidrosolubles
Lignina Klason
(con correccin de
cenizas y protenas)
Lignina
cido-soluble

1.6 0.6

1.2 0.2

9.6 1.3

11.1 1.5

9.1 0.4

2.4 0.1

8.3 1.0

8.5 0.7

9.4 1.4

16.2 2.1

16.5 1.0

19.3 0.6

12.1 0.8

8.8 0.9

6.0 0.9

5.4 0.9

1.5 0.0

1.7 0.1

1.6 0.1

8.6 3.0

4.9 0.3

Holocelulosa

89.2 0.3

87.6 0.4

67.2 0.4

63.6 0.5

66.9 1.7

64.0 0.4

49.4

-celulosa

55.6 0.6

65.5 0.3

36.5 0.4

49.7 3.4

41.8 1.4

31.4 9.1

16.7

Total

107.1 1.3

105.1 1.7

103.8 2.5

106.7 1.9

104.4 1.9

90.1 3.1

85.5 1.4

En primer lugar se observa que el total de los contenidos estn un poco de encima de 100 %. No son
anlisis independientes. Ciertos componentes interfieren en los anlisis. Los totales de los
contenidos de salvado de trigo y BSG son respectivamente 90 y 85 %, debido al contenido
proteoltico elevado de ambos. No son realmente fibras, son residuos industriales no puramente
lignocelulsicos. Las protenas pueden influir significativamente en los diferentes tipos de anlisis
(Hatfield, 2005).
Se puede observar que hierba elefante y paja de trigo contienen entre 5 y 6 veces ms cenizas que
sisal, abac y salvado de trigo. La mdula de la hierba elefante contiene el doble de cenizas que la
corteza.

49

IV. RESULTADOS Y DISCUSSIN


En cuanto a los compuestos lipoflicos se puede distinguir 3 grupos segn el contenido:
- Abac y sisal (bajo)
- Hierba elefante, paja y salado de trigo (moderado)
- BSG (elevado)
BSG tiene un contenido lipoflico 10 veces mayor que baca y sisal. La composicin de los
lpidos se est investigando actualmente, pero este proyecto se centra en lignina y no enfocar en la
estructura qumica de los lpidos.
En cuanto a los compuestos hidrosolubles se diferencian en:
- Abac, sisal y salvado de trigo (bajo contenido)
- Paja de trigo, hierba elefante y BSG tienen (contenido bastante elevado)
Paja de trigo y hierba elefante contienen dos veces ms lignina no cido-soluble (lignina Klason)
que abac, sisal y BSG. El salvado de trigo tiene un contenido entremedio. Los valores de lignina
Klason con sus respectivos rangos de incertidumbre de abac, sisal, paja de trigo y hierba elefante
estn conformes con los pocos datos encontrados en la literatura (datos no mostrados). Sin embargo
los valores de salvado de trigo y BSG estn bastante por debajo de los valores publicados, por
ejemplo % para salvado de trigo () y % para BSG (). Se podra comparar los contenidos con el
mtodo de extraccin con detergente cido segn (Goering y Van Soest, 1975). El mtodo minimiza
restos de xilanos y pectinas dejando solo celulosa y lignina. La interferencia de cutina y suberina se
puede eliminar por oxidacin con permanganato, pero no tienen un alto contenido (1 %).
Curiosamente en el anlisis de la lignina en situ en la fibra por pirlisis, 2D-NMR y DFRC (ver
apartado 2.) se observan pocas unidades G, H y S. Adems no se pudo aislar lignina segn el
procedimiento de (Bjrkman, 1956), por falta de cristalizacin durante la precipitacin. Estas
observaciones se discutirn ms adelante en apartado 2.
En cuanto a la lignina cido soluble, abac y sisal dieron valores altos de lignina cido-soluble en
comparacin con paja de trigo y hierba elefante. Podra resultar interesante investigar la
composicin (unidades G/H/S) de lignina cido- y no cido-soluble. Tambin falta por investigar la
aptitud del coeficiente de extincin usada en el calculo, porque en realidad depende de la
composicin de la lignina. Normalmente se suele usar un valor de 110 L/(g.cm) en la ecuacin de
Beer (Dence, 1992), pero en realidad se debera determinar para cada fibra. Las mximas de
absorcin de las unidades de lignina se sitan alrededor de 280 nm, pero no se usan debido a la
interferencia con furfural y hidroximetilfurfural, productos de carbohidratos (xilanos) formados
despus el hidrlisis cido. Segn (Fergus y Goering, 1970) las mximas de absorcin de unidades
G y S son respectivamente 280 y 270 nm. La interferencia no es significante a 205 nm, pero pueden
absorber en cierta proporcin monosacridos de los carbohidratos (Hatfield, 2005). Por ejemplo el
contenido relativamente alto en salvado de trigo y BSG podra explicarse por el contenido ms alto
en unidades H segn el anlisis por 2D-NMR (ver apartado 2.2.), pero tambin puede estar influido
por sus carbohidratos que son estructuralmente distintas de las otras fibras. Sin embargo contiene
menos carbohidratos que las otras fibras, pero influyen ms en muestras con poca lignina. Tambin
hay que considerar su contenido peptdico que podra interferir en la absorbancia. Para eliminar la
interferencia, antes de someter la fibra al hidrlisis cido para medir la lignina Klason se podra
50

IV. RESULTADOS Y DISCUSSIN


extraer con una mezcla de etanol-benceno seguido por un tratamiento proteoltico enzimtico (Ellis,
1949).
Un contenido ms bajo en lignina implica un contenido ms alto en holocelulosa como se puede observar en

sisal y el abac. Contienen 20 % ms holocelulosa que las otras fibras analizadas. La holocelulosa
de la mdula y corteza contienen respectivamente 78 y 62 % -celulosa, muy parecido a la de sisal
(62 %) y abac (75 %). La holocelulosa de la paja y salvado de trigo contiene menos -celulosa
(respectivamente 54 y 49 %). El valor bajo de BSG falta por confirmar (se perdieron 2 muestras en
el triplicado).

2 AnlisisdeMWL
Durante la extraccin de lignina a partir de fibras vegetales se puede alterar la estructura nativa de
la lignina en la materia. Sobretodo existe riesgo de alteracin durante la molienda debido a las
condiciones de estrs mecnico y trmico. Por eso la molienda no se lleva a cabo en seco pero con
tolueno, un disolvente que dispersa bien la fibra y disipa bien el calor. Adems los intervalos en la
molienda evitan sobrecalentamiento. MWL (milled wood lignin), la lignina aislada conforme al
protocolo de (Bjrkmann, 1956)), est considerada como representativa para la lignina nativa. Sin
embargo el rendimiento de extraccin es bajo en comparacin con el contenido total de lignina. Eso
hacen atractivas las tcnicas en situ, es decir, tcnicas que se aplican directamente sobre la fibra sin
extraer la lignina. Cuando se obtenga una resolucin y sensibilidad satisfactoria, realmente se puede
estudiar los compuestos de forma muy directa en la pared celular todava integra.

2.1.Pirlisis(PyGC/MS)
Se analizaron los productos de pirlisis tanto de MWL como de fibra para identificar de que
unidades se derivan (G/H/S). Falta por cuantificar las proporciones relativas de las unidades para
estimar la relacin S/G y H/G. A continuacin se muestra los espectros obtenido con la fibra de la
mdula y corteza de hierba elefante (Figura 26). Los otros espectros no estn mostrados, pero se
implicarn ms adelante en la discusin. Se observan productos de pirlisis de las diferentes
unidades de lignina partir de 5.5 minutos de elucin. Los compuestos que eluyen antes son
productos de pirlisis de carbohidratos. Cuando se piroliza la lignina o la fibra en presencia de
TMAH, se puede diferenciar cido ferulico y cido p-cumrico debido a la metilacin de sus grupos
hidroxilos. Hierba elefante contiene niveles de p-cido cumrico bastante mayores que cido
ferulico. Comparando los espectros de MWL y de la fibra en situ, se puede deducir que el cido pcumrico est presente sobretodo en la lignina mientras la distribucin de cido ferulico en lignina y
carbohidratos no queda claro. Se observan seales de intensidad parecidas de cido ferulico en
MWL y fibra, mientras la intensidad de acido p-cumrico aument mucho en la MWL. Slo una
fraccin del cido ferulico se encuentra en la lignina. En MWL y fibra de abac se detectaron
niveles mucho ms moderados de p-cido cumrico y de cido ferulico en compararacin con la
hierba elefante.

51

IV. RESULTADOS Y DISCUSSIN

Figura 26: Cromatograma de la fibra de corteza (arriba) y mdula (abajo) de hierba elefante obtenido con
Py-GC/MS (izquierda) y Py-TMAH-GC/MS (derecha)

52

IV. RESULTADOS Y DISCUSSIN


En la fibra de paja de trigo ambos cidos p-hidroxicinmicos estn presentes en niveles muy
parecidos mientras en la MWL baja mucho el seal de cido ferulico en comparacin con el seal
de cido p-cumrico. Ambos no se detectaron en sisal. En BSG y salvado de trigo hay poco p-cido
cumrico presente y mucho ms cido ferulico. Tambin se observaron seales intensas de cidos
grasos en los espectros de Py-TMAH-GC/MS, incluso en la MWL aislada de salvado de trigo. Se
observ que el precipitado obtenido con el extracto en dioxano:agua (9:1) segn el procedimiento
de (Bjrkman, 1956) no se cristaliz. Se mantuvo liquido con una alta viscosidad, quizs debido a
la presencia de estos cidos grasos en el extracto (aunque se sometieron a las extracciones de
extrables).

2.2.2DNMR
Se prepararon de cada tipo de fibra muestras para su anlisis de HSQC y de algunas para un anlisis
HMBC. Las muestras de MWL se disolvieron en DMSO-d6, cuyo seal residual se usa como
referencia interna. Las muestras de fibra (sin extrables) se encuentran en un estado de gel facilitado
por la interaccin de los polisacridos con el DMSO. Se prepararon en DMSO-d6 y en DMSO-d6:
piridina-d5 (4:1). Tabla 6 da un resumen de las seales cruzadas observadas por (del Ro et al.,
2008) en el espectro de HSQC de sisal, kenaf, abac y curaua en DMSO-d6. Sirve como base para
asignar la mayora de los acoplamientos observados en lignina. Sin embargo en DMSO-d6 :
piridina-d5 (4:1) los seales se desplazan muy ligeramente.
Tabla 6: Desplazamientos qumicos de las seales cruzadas de diferentes acoplamientos observadas en
sisal, kenaf, abac y curaua segn (del Ro, 2008).

En general los seales en la mezcla de DMSO y piridina no ganaron en resolucin, probablemente


debido al uso de parmetros de shimming del gradiente de campo usados para muestras en DMSO
slo (guardado en mtodo del equipo de NMR) o optimizados en el momento y debido a la falta de
homogenizacin de los dos disolventes en el tubo (se debe mezclar antes). Sin embarg la piridina
facilit mucho la movilidad de las muestras para homogenizar ms fcilmente.

53

IV. RESULTADOS Y DISCUSSIN


Espectros 1H-13C HSQC
A continuacin se ilustran los espectros de 2D-NMR de MWL de la mdula y corteza de hierba
elefante en DMSO-d6 (Figura 27) y de MWL y gel de fibra de paja de trigo, abac y de la corteza de
hierba elefante en DMSO-d6 : piridina-d5 (4:1) (Figura 28a). Figura 28b ilustra las subestructuras
identificadas en los espectros de Figura 28a. Las seales estn marcadas con letras (A, B, C, etc.)
que refieren a diferentes tipos de subestructuras encontradas en la lignina. Las letras , y se
refieren al tomo de carbono o hidrgeno de la cadena aliftica. G, H y S son los seales aromticas
de las respectivas unidades de la lignina. Se analizaron ambas fracciones de hierba elefante, pero se
muestran sobretodo los anlisis de la corteza teniendo en cuenta que es la mayor fraccin (84 %).
Las seales cruzadas principales (C/H) estn asignadas a grupos metoxilos (MeO) y a la estructura
ms abundante (A) con enlaces -O-4 y sus respectivos derivados acilados A (acetilado) y A (pcumarilado). En la zona aromtica de todos los espectros estn los seales de unidades G y S,
menos en salvado de trigo y BSG. En los geles de fibra faltan a veces seales. En la MWL de paja
de trigo y en el gel de salvado de trigo y BSG se encontraron unidades H, y quizs tambin en
MWL de abac y hierba elefante (baja intensidad). Se identificaron seales de estructuras menos
abundantes como resinoles en abac, paja de trigo y hierba elefante (C/C en Figura 27 y B/B/B
en Figura 28a) formando enlaces -/-O-/-O-, fenilcumaranos en paja de trigo y hierba
elefante (B/B/B en Figura 27 y C/C en Figura 28a) formando enlaces -5/-O-4 y
espirodienonas en abac (D/D/D/D2/D6 en Figura 28a) formando enlaces -1/-O-. En general
estas estructuras no se llegan a detectar en espectros de geles de fibra. En el espectro de los geles se
observan casi todos los seales de lignina en el caso de la corteza (Figura 28b). En la mdula faltan
seales tanto en la zona aliftica como aromtica (no mostrado), sobretodo de PCA. En la corteza
se observan seales de xilanos (X1) y xilanos acetilados (X1, X2 y X3). Estos seales no se
observaron en la mdula.
Las seales cruzadas del acoplamiento entre H y C de las MWL estn suficientemente resueltos
(Figura 27) para diferenciar los seales entre 63.5/3.83 - 63.5/4.30 ppm y 60.2/3.30 - 60.2/3.70
ppm, correspondiendo respectivamente a C con un grupo de acilacin y sin acilacin (grupo
hidroxilo). El grado de acilacin en la MWL de la corteza y mdula se estim respectivamente 32 y
48 % a partir de los reas integrados. El grado de acetilacin y p-cumarilacin no se puede estimar
en el espectro HSQC. Seales de p-cumarato (PCA) se observaron en la regin aromtica. Otro
mtodo apto para cuantificar los diferentes grupos de acilacin es DFRC y DFRC (ver apartado
2.3.). cido ferulico (Fer) slo se identific en el gel de la corteza de hierba elefante (Figura 28a),
en la MWL de la mdula (Figura 29) y corteza (no mostrado) y en el gel de salvado de trigo (no
mostrado). En las fibras que contienen PCA, los seales de Fer y Fer5 (C y C5 de cido ferulico)
no se pueden observar debido al solapamiento con el seal de PCA3,5 (C3 y C5 de p-cido
cumrico) igual que Fer con PCA. Las seales de cido ferulico son menos abundantes y mucho
menos intensas que los de p-cido cumrico.
En el gel de paja de trigo faltan algunos seales de lignina. Se encuentra poco seal de PCA. En el
espectro de MWL estn casi todas las seales de lignina. Se detecta poco acoplamiento con el
carbono anomrico de carbohidratos presentes en los complejos con lignina indicando una pureza
alta de la MWL. Se debe tener en cuenta que en la preparacin de MWL parte de lignina se extrae
como complejos con carbohidratos. En el gel de fibra de corteza de hierba elefante estn presentes
54

IV. RESULTADOS Y DISCUSSIN


C

OMe

MWL bark

B
A

A'

A/A'/A'' B

A(G)/A'(S)
A(S)
B

pC3,5

A(G)/A'(S)
A(S)
B

S2,6
G2

B
A

A'

A/A'/A'' B

OMe

MWL pith

S2,6

100

G2

pC

G5/G6

100

pC3,5

pC

G5/G6

pC2,6

pC2,6

pC

pC
ppm (t1
7.0

6.0

5.0

ppm (t2)
O
HO
HO
6
5

MeO

4.0
HO

1
4

MeO

5
4

6
3

O
1
2

HO

OMe

2
3

OMe

6
5

MeO

1
4

MeO
5
4

1
2

3.0

2
3

OMe

7.0

6.0

5.0

4
3

5
2

6
1

O
HO
6
5

MeO

1
4

MeO
5'
4'

6'
3'

1'
2'

HO

OMe

2
3

OMe

6
5

6
5

MeO

1
4

A'

3.0

OMe

2
3

OMe

2
3

MeO
OMe
O

5
4

6
3

3
6

4
5

A''

OMe

OMe

MeO

6''
5''

2
1

1
2

2
1

HO
MeO

MeO
O

6
5

1
4

1''
4''

2''
3''

OMe

2
3

OH

OMe

OMe

4.0

ppm (t2)

OMe

ppm (t1

Figura 27: Espectro de HSQC de MWL de mdula (izquierda) y corteza (derecha) de hierba elefante en DMSO-d6 con

ilustracin de los seales cruzadas de las diferentes subestructuras presentes


55

IV. RESULTADOS Y DISCUSSIN


Me-COO-

MeO
A'
A/A'
A''

B ?
D
A

MeO
A'
A/A'

B ?

D B?

100625-Elephant grass-bark-MWL-HSQC

Me-COO-

MeO

B
A

A'
A/A'

A'

S2,6

S'2,6 S2,6

S'2,6
G2 PCA3,5 D2
PCA
G5
D6
G6
PCA2,6
H2,6

S'2,6

B
A

B
A'

A'

Me-COO-

S2,6

G2 PCA3,5 PCA

G5
G
PCA2,6 6

G2
PCA3,5
G5
G
PCA2,6 6
H 2,6

PCA'

PCA'

Me-COO-

A/A'
X'3 X'2
S2,6
PCA3,5
PCA2,6

A'

A/A'

X'3 X'2

A'
X'1
X1/X'1

MeO

MeO

MeO
A'

Me-COO-

Me-COO-

A
S'2,6 S2,6
G2
G5

PCA3,5
G6

X1/X'1
Gl1

G2

S2,6

PCA3,5 PCA

G6
PCA2,6 Fer6 ?

Fer2?

PCA'

X'3 X'2 A'

(R)
A
(R)
X'1
X1/X'1
Gl1

G5

Fer ?

Figura 28a: Espectro de HSQC de MWL (arriba) y gel de fibra (abajo) de abac (izquierda), paja de trigo (medio) y la corteza de hierba elefante (derecha) de
hierba elefante en DMSO-d6 : piridina-d5 (4:1)

56

IV. RESULTADOS Y DISCUSSIN

Figura 28b: Subestructuras asignadas a las seales cruzadas identificadas en los espectros HSQC de
abac, paja de trigo y corteza de hierba elefante en Figura 28a. Subestructuras de unidades de lignina
unidas por enlaces -O-4 (A y A), -/ -O-/-O- (resinoles B y B), -5/-O-4 (fenilcumarano
C y C) y -1/-O- (espirodienona D y D) (PCA: p-cido cumrico y Fer: cido ferulico)

Figura 29: Expansin de la zona aromtica del espectro HSQC de MWL de la mdula de hierba
elefante en DMSO-d6

57

IV. RESULTADOS Y DISCUSSIN


seales cruzadas del acoplamiento entre C/C y un tomo de un carbohidrato unido por un enlace
ter ((R) y (R) en Figura 28a). La estructura principal de la lignina de paja de trigo es -O-4 de
cual tambin una proporcin est acilada en el carbono . El seal de acetato (MeCOO) es
moderado, igual que en el gel. El seal a 7.3/130 ppm corresponde a unidades H. En plantas
herbceas el contenido de unidades H es ms elevado y es muy variable entre las especies, pero en
general suele variar debajo de 20 %. Por eso es difcil detectarlas y cuantificarlas. Los seales a
6.2/92 y 6.7/97 ppm estn desconocidos.
En los espectros de los geles de salvado de trigo y BSG (no mostrados) se observan seales de H.
No se llegaron a detectar unidades de S y G, slo se observ seales de H3,5 (6.9/115 ppm) y H2,6
(7.4/125 ppm), ambos ms intensas en BSG que en salvado de trigo. Tambin cido oleico y
linoleico han sido identificados (respectivamente a 5.38/125 y 5.4/128 ppm). Ambas materiales se
trataran ms profundamente en apartado 3.3.
Espectros 1H-13C HMBC
De las muestras de MWL se pueden comparar los espectros de HSQC con los de HMBC. Sin
embargo el acoplamiento a larga distancia en muestras de geles de fibra se atena demasiado rpido
para registrar suficiente acoplamiento y obtener un seal intenso y bien resuelto. Con geles de fibra
slo se registran espectros HSQC. Los grupos de acilacin en la posicin , acetato y p-cumarato,
en el espectro HMBC s se pueden cuantificar. Con el equipo de NMR usado se llega a registrar
suficientes acoplamientos a larga distancia; las acumulaciones registradas durante 15 horas son
suficientes para establecer una buena correlacin con los carbonilos de acetato y p-cumarato
(carbonilos carboxlicos de steres). Figura 30 muestra los espectros HMBC de abac y hierba
elefante con el espectro de HSQC de sus respectivos MWL superpuestos (en color). Figura 31
ilustra las cuantificaciones de los acoplamientos con los grupos carbonilo observados en sisal, abaca
y la corteza de hierba elefante.
- En sisal slo se encontraron unidades acetilados. La correlacin con el protn a 2 ppm confirma el
acetato. El acoplamiento del carbonilo actico a 170.5 ppm con H fue estimado en 81 %.
- En abac predominaron las acilaciones con acetato (MeCOO, 85%). Mucho menos
acoplamiento se observ con el carbonilo de p-cido cumrico (PCA, 13 %) a 166.7 ppm
(correlacin con H a 7.5 ppm y con H a 6.3 ppm). La acilacin fue principalmente con el H (78
%) entre 3.9 y 4.6 ppm. El resto del acoplamiento se cuantific entre el carbonilo actico y el
protn no identificado a 4.8 ppm (11 %) y entre el carbonilo de PCA y el protn no identificado a
4.9 ppm (11%). Slo 2 % del carbono en posicin est acilado con cumaratos. El resto del
cumarato (11 % de los carbonilos) est acilado en otra posicin. Un pequeo seal de acilacin en
C es observable, pero no es suficiente intenso para diferenciar de que grupo se trata en el HMBC.
- Pocas unidades de MWL de la corteza de hierba elefante estn acetilados. El mayor grupo de
acilacin es PCA. Sorprendetemente de los 32 % de acilacin en posicin (calculado en HSQC),
slo 7 % fue estimado estar acilado en con PCA. El seal con que correlaciona el acoplamiento
est desconocido actualmente (a 4.9 ppm). Igual que observada en abac hay un seal debil de
acilacin en la posicin . Las correlaciones con los seales a 4.8 ppm y 4.9 ppm tambin se
encontraron en poca intensidad en sisal y kenaf (del Ro et al., 2008). En sisal analizado en (del
Ro et al., 2008) no se detect, en este proyecto s. La cuestin es la naturaleza de la estructura no
identificado (lignina?).
58

IV. RESULTADOS Y DISCUSSIN


Me-COO-

MeO

A'
A/A'

B?

A''
C

A'
D'

S2,6

S' 2,6

PCA3,5

G2
G5
G6

PCA2,6

B ?
D
A

D2
D6

PCA

PCA'

-Acetylation

-p-Coumaroylation

Unknown Coumaroylation

Me-COO-

MeO C
A'
A/A'
C
S'2,6
G2
PCA 2,6

G5
G6

B
A

A'
B

S2,6
PCA 3,5

PCA

PCA'

-p-Coumaroylation

Unknown Coumaroylation

Low lignin acetylation

Figura 30: Espectros de HMBC de MWL de abac (arriba) y la corteza de hierba elefante
(abajo) en DMSO-d6 : piridina-d5 (4:1) con los respectivos espectros superpuestos (en color)

59

IV. RESULTADOS Y DISCUSSIN

6% 14% 31%

11%

166.7

50%

170.5

2%
8%

17%

170.5

49%

11%

C ?
?

93%

166.7

7%

Fi
gura 31: Espectros de HMBC y HSQC en DMSO-d6 : piridina-d5 (4:1) de sisal (arriba, en DMSO-d6),
abac (medio) y corteza de hierba elefante (abajo) y cuantificacin de la correlacin del acoplamiento
del carbonilo de PCA (azl) y MeCOO (acetato, rojo) con la cadena aliftica de sus MWL

60

IV. RESULTADOS Y DISCUSSIN


La diferencia en la estructura de lignina se pudo observar de forma macroscpica. La lignina aislada
(MWL) de hierba elefante y abac, al tener una estructura respectivamente ms condensada y ms
lineal, es respectivamente menos soluble y ms soluble en cido actico:agua. Respectivamente
100 % y 40 % de sus ligninas extrados se recuperaron despus precipitacin en agua fra y
centrifugacin durante respectivamente 25 y 200 minutos. La solubilidad en cido actico:agua de
lignina de paja de trigo y sisal fueron entremedios de abac y hierba elefante. Los ltimos
experimentos con lignina de abac indican que la lignina en cido actico:agua se puede recuperar
por rotavaporacin a 40 C en vez de por centrifugacin, recuperando 100 % de la lignina aislada.
Los anlisis de Py-GC/MS (datos no mostrados) no indican ninguna diferencia entre ambas
fracciones preparadas de forma distinta. Falta por comparar sus espectros de NMR y anlisis de
DFRC para controlar efectos secundarios y nivel de contaminacin.

2.3.DFRC
En este mtodo de derivatizacin los enlaces ter en la posicin y de la cadena aliftica se
rompen por eliminacin reductiva de los derivados bromurados separando monmeros. As se
puede estimar la relacin entre unidades G y S y el grado de acetilacin tras comparar las
intensidades de unidades G, Gac, S y Sac. En algunos casos se puede detectar di- y trimeros que
puede dar informacin adicional sobre las enlaces entre unidades. En los anlisis de lignina en situ
se obtienen cromatogramas ms complejas debido a las seales de los productos de carbohidratos.
Eluyen principalmente al principio de la columna, pero pueden bajar mucho la sensibilidad para
detectar los seales correspondiendo a los fragmentos de GC/MS producidos de unidades de
lignina. De las unidades G y S el confrmero cis se produce en menos proporcin que el trans y
suele eluir antes. Las intensidades de las diferentes unidades identificadas se deben adaptar con un
factor de sensibilidad obtenido experimentalmente (bibliografa) para cuantificar las proporciones
relativas presentes en la muestra. En este proyecto las proporciones no estn calculadas todava por
motivos que se discutirn a continuacin. Sin embargo las intensidades relativas de los picos
observados permiten un anlisis semi-cuantitativo.
Se realiz el anlisis de DFRC y de DFRC de las diferentes fibras y sus respectivas MWL. Figuras
32a, 32b, 32c, 32d, 32e y 32f muestran las cromatogramas de los productos obtenidos por DFRC y
DFRC y identificados por GC/MS de MWL y de lignina en situ (directamente sobre la fibra) y
Figura 32g ensea la estructura de estos mismos.
En las MWL de todas las fibras se identificaron las unidades G y S, incluso en la mayora de los
anlisis de lignina en situ. Sin embargo en algunos casos en el tiempo de elucin correspondiente a
una cierta unidad slo se observ el seal del valor de m/z principal debido a su intensidad baja con
respecto a seales de carbohidratos. Por tanto no se pudo identificar con seguridad aquellas seales
cuales sus valores de m/z secundarios no se detectaron. La presencia de carbohidratos tambin hace
dificultar identificar el tiempo de elucin correcto, mientras en las muestras de MWL los tiempos de
elucin mostraron muy poca desviacin.

61

IV. RESULTADOS Y DISCUSSIN


tG

tG
tS

DFRC, MWL, Mdula

DFRC, MWL, Corteza

tS

Fer?
cG
PCA
cS

cG
PCA
GpcSpc

Fer

cS
Spc

Mdula, fibra, DFRC (Tamb, 16h)

Corteza, fibra, DFRC

carbohidratos

tG

tG
tS

Spc

tS
cS

Spc

Spc

cG ?

Figura 32a: Productos de DFRC de MWL (arriba) y fibra (abajo) de la mdula (izquierda) y corteza (derecha) de hierba elefante

62

IV. RESULTADOS Y DISCUSSIN


PCA

tG
DFRC, MWL, Mdula

tG

DFRC, MWL, Corteza

PCA

Gac

tS

tS
Fer?

Sac

cS

cG

Sac

Sac?

Gac + cG
Fer?

cS

Sac

Mdula, fibra, DFRC

tG + Sac?

Corteza, fibra, DFRC

tS

PCA

Gac

cG?

tS
Gac

Fer cS

Fer
Sac

Figura 32b: Productos de DFRC de MWL (arriba) y fibra (abajo) de la mdula (izquierda) y corteza (derecha) de hierba elefante

63

IV. RESULTADOS Y DISCUSSIN


tS

PCA

Abaca, MWL, DFRC

Abaca, MWL, DFRC

tG

Sac

Fer

cG + PCA ?tG
Fer?

tS

Spc

cS

cG
Gac
cS

Fer?

PCA + cG
cS

Abaca, fibra, DFRC

Abaca,
fibra,
Abaca,
fibra,
DFRC DFRC

tS

PCA
tG

Sac
Spc
Gac

Figura 32c: Productos de DFRC (izquierda) y DFRC (derecha) de MWL (arriba) y fibra (abajo) de abac

64

IV. RESULTADOS Y DISCUSSIN


tG

tG

Paja de trigo, MWL, DFRC

Paja de trigo, MWL, DFRC

tS
tS
cG + Gac
cG

cS

Spc ?

Spc

cS

PCA Fer

PCA

Sac

Sf ?

Paja de trigo, fibra, DFRC

Paja de trigo, fibra, DFRC

cG

tG

Gac

Fer
cS
tS

Gac
Fer

Figura 32d: Productos de DFRC (izquierda) y DFRC (derecha) de MWL (arriba) y fibra (abajo) de paja de trigo

65

IV. RESULTADOS Y DISCUSSIN


Sac
tS

Sisal, MWL, DFRC

Sisal, MWL, DFRC

tG

Gac
tG

tS

cS

cSac?
cS

cG

Sisal, fibra, DFRC

Sisal, fibra, DFRC

tS
tG cS
Sac
Gac
cG

Figura 32e: Productos de DFRC (izquierda) y DFRC (derecha) de MWL (arriba) y fibra (abajo) de sisal

66

IV. RESULTADOS Y DISCUSSIN

Salvado de trigo, fibra, DFRC


BSG, fibra, DFRC

Fer
tG

tS
tG
Fer
tS

cS

BSG, fibra, DFRC

cS

Salvado de trigo, fibra, DFRC

tS

Fer

Figura 32f: Productos de DFRC (arriba) y DFRC (abajo) de MWL de BSG (izquierda) y salvado de trigo (derecha)

67

IV. RESULTADOS Y DISCUSSIN

Figura 32g: Estructura de los productos G, Gac, Gpc, Gf, S, Sac, Spc, Sf, PCA (cido p-cumarlico) y Fer
(cido ferulico) de DFRC y DFRC. G y S indican el tipo de unidad mientras ac, pc y f se refiere
respectivamente a la acetilacin, p-cumarilacin y feruloilacin de las unidades. C y t se refiere a los
confrmeros cis y trans (cS, tS, etc.).

Para identificar unidades acetiladas (Gac y Sac) se considera las cromatogramas de DFRC. En abac
y sisal (Figura 32c y 32e) se observa una presencia elevada de unidades acetiladas, sobretodo de
unidades S (Sac), muy parecido a los resultados en (del Ro et al., 2007). Hierba elefante y paja de
trigo tambin contienen unidades acetiladas, pero mucho menos que abac y sisal. Tabla 7 muestras
los grados de acetilacin de sisal, abac y hierba elefante estimados a partir de las reas integradas
de los picos.
Tabla 7: Grados de acetilacin en MWL de sisal, abac y en medla y corteza de hierba elefante
estimado a partir de las intensidades relativas de S, Sac, G y Gac por DFRC.

MWL

% Gac/G

% Sac/S

Sisal
Abac

45
4
3
10

80
82
4
3

Hierba
elefante

Corteza
Mdula

68

IV. RESULTADOS Y DISCUSSIN


En la hierba elefante, abac y paja de trigo se observaron unidades de sinapil p-cumarato (cido pcumarlico esterificado sobre el C del alcohol sinaplico (Spc)). En algunos casos tambin se les
encontraron en el anlisis en situ, sobretodo en hierba elefante donde se espera un nivel de pcumarilacin ms elevado segn los resultados de Py-TMAH-GC/MS. En MWL de la mdula de
hierba elefante tambin se detect unidades de coniferil p-cumarato (Gpc). No fue posible evaluar el
grado de p-cumarilacin, porque en abac se detectaron intensidades mucho ms bajas que
obtenidas anteriormente (del Ro et al., 2007). Tras analizar de nuevo dos muestras obtenidas por
(del Ro et al., 2007), se obtuvieron los mismos resultados con excepcin de los picos que
pertenecen a unidades Spc (tambin eluyeron con baja intensidad). Eso indica que las condiciones de
la columna o de otros parmetros del equipo GC/MS posiblemente no fueron idnticos como en (del
Ro et al., 2007). Por tanto es posible que las proporciones relativas de las intensidades observadas
de las diferentes unidades no son representativas para las proporciones presentes en las muestras.
Habr que investigar los parmetros actuales del equipo GC/MS (condicin y longitud de la
columna, inyector, detector, programa de temperatura, etc.) para cuantificar las proporciones
relativas exactas. Sin embargo los anlisis por HMBC de MWL de corteza de hierba elefante y
abac indican slo 7 y 11 % de p-cumarilacin en la posicin . Eso explica las bajas intensidades
de Gpc y Spc en el anlisis de DFRC. Tambin se nota el aumento de la relacin de las seales del
acoplamiento de H en las estructuras -O-4 con un grupo de hidroxilo y con un grupo de acilacin
en posicin (A/A en Figura 28a) segn abac < paja de trigo < hierba elefante. Inevitablemente
surgen las siguientes preguntas, por ejemplo para la corteza de la hierba elefante:
- Qu grupos estn acilados sobre la posicin de la corteza de hierba elefante, aparte de acetato y
p-cido cumrico (PCA) ---> 32 % de acilacin de cuales 7 % de PCA y 4 % de acetato
---> grupo de acilacin de los 21 % restantes ?
- Abundancia de estructuras de fenilcumarano con acilacin en ?
- Otras unidades que G y S con acilacin? (seal a 4,9/66 ppm)
- Otra posicin de unin de PCA a la lignina, y ? (DFRC)
En los anlisis DFRC de MWL y de hierba elefante (mdula y corteza) y de abac se observaron
seales relativamente muy intensas de PCA y en menos proporcin tambin en paja de trigo.
Curiosamente en los anlisis DFRC los correspondientes seales de PCA se detectaron en
intensidad ms baja. Puede que tenga que ver con una diferencia de reactividad entre los reactivos
respectivamente acetilados y propionilados o en el factor de sensibilidad usando en el clculo
cuantitativo. Segn (del Ro et al., 2007) el seal corresponde a PCA eterificado en la posicin o
. En el HSQC los seales de acilacin en son relativamente bajas. La diferencia de PCA con
unidades H en la lignina est en la posicin (COOH de p-cido cumrico y OH en el caso de
unidades H). En general pocas veces se detectan unidades H, debido a su bajo contenido comparado
con G y S.
En algunos casos de las fibras de hierba elefante, paja de trigo, BSG y salvado de trigo se
observaron cido ferulico libre en una proporcin mucha ms baja que p-cido cumrico. La
identificacin de cido ferulico no es tan obvia como p-cido cumrico, porque sus seales de m/z
secundarios son de intensidad ms baja (comparacin espectros en librera de NIST).

69

IV. RESULTADOS Y DISCUSSIN

En los anlisis en situ de salvado de trigo y BSG no se detectaron unidades acetiladas. Tampoco se
observaron unidades G y S en el anlisis DFRC mientras ambas unidades se observaron en el
anlisis DFRC. Por eso no queda claro si BSG y salvado de trigo contiene unidades acetilados, ni si
quiera si tiene unidades G y S. Las intensidades de los seales de unidades S y G en el DFRC son
parecidas a las observadas por Py-GC/MS. Sin embargo en el espectro de 2D-NMR no se
detectaron seales de ambas unidades.
Teniendo en cuenta el contenido en lignina Klason (alrededor de 10 %), se puede concluir que BSG
y salvado de trigo tiene un contenido moderado de lignina en contraste con los datos encontrados en
la bibliografa. Su elevado contenido de protenas, minerales y otros compuestos orgnicos no
presentes en materiales puramente lignocelulsicos disminuye la exactitud de los anlisis. Existen
adaptaciones y otros mtodos para reducir las interferencias en el anlisis. Tambin podra influir el
grado de polimerizacin de la lignina. Los procesos industriales de cuales provienen (coccin
(BSG) y proceso mecnico (salvado de trigo)) podran contribuir a la degradacin de lignina. Los
extractos en dioxano:agua obtenidos en la preparacin de MWL de BSG y salvado de trigo tuvieron
un color oscuro, tpico para materiales con alto contenido de lignina. Sin embargo no se precipit en
la mezcla de cido actico:agua. Se recuper una materia de alta viscosidad parecida a un sirope. De
salvado de trigo se consigui 30 mg de MWL. Los resultados de Py-GC/MS muestran un alto
contenido en los cidos grasos palmtico, oleico y linoleico igual que observados en situ. Eso podra
explicar el carcter de sirope del extracto en dioxano:agua. Surge la cuestin si se debe a una
extraccin incompleta de lpidos o a la presencia de enlaces covalente entre estos cidos grasos y la
lignina. En los espectros de 2D-NMR de los geles de BSG se observ cido oleico y linoleico,
aunque ambos se extrajeron con acetona para eliminar lpidos. Incluso se extrajeron despus la
molienda y durante 1.5 hora ms que previsto en el protocolo para asegurar su eliminacin. Esto
indica ms a la presencia de enlaces covalentes con el material lignocelulsico. Al otro lado hay que
tener en cuenta que durante la preparacin de MWL se molieron los materiales despus la
extraccin y que BSG tiene un contenido lipoflico muy elevado. Por eso el seal de cido linoleico
fue mucho ms intenso en el gel (2D-NMR) de BSG (9.2 % lpidos) que en salvado de trigo (1.9
%). Las tcnicas analticas usadas para caracterizacin de materiales lignocelulsicos usados para la
fabricacin de papel ofrecen una alta sensitividad, resolucin y exactitud. Existen mtodos
adaptados y posibilidades de adaptacin de los mtodos existentes para caracterizar materiales no
puramente lignocelulsicos como los de residuos agrcolas, industriales y urbanos.

70

IV. RESULTADOS Y DISCUSSIN

3 Conclusiones
Composicin qumica
En general se puede dividir los materiales lignocelulsicos analizados en 3 grupos segn el
contenido de compuestos en que constituye :
- abac y sisal
- paja de trigo y hierba elefante
- salvado de trigo y BSG (en realidad no consiste en fibras).
---> clasificacin:
- Cenizas: hierba elefante / paja de trigo > BSG > abac / sisal / salvado de trigo
- Lpidos: BSG >> salvado de trigo / paja de trigo > hierba elefante > abac / sisal
- Hidrosolubles: hierba elefante / paja de trigo > BSG >> salvado de trigo > abac / sisal
- Lignina: salvado de trigo / hierba elefante > paja de trigo > abac / sisal / BSG
---> Lignina Klason:
hierba elefante > paja de trigo > salvado de trigo > abac / sisal / BSG
---> Lignina cido-soluble:
salvado de trigo > abac / sisal / BSG > paja de trigo / hierba elefante
- Holocelulosa: abac / sisal > paja de trigo / hierba elefante / salvado de trigo > BSG
- - celulosa: abac > sisal > hierba elefante > paja de trigo > salvado de trigo > BSG
En cuanto a los metales, en general estn muy ricos en minerales la mdula de hierba elefante,
salvado de trigo, BSG y paja de trigo. Contienen relativamente pocos minerales sisal y abac y la
corteza de hierba elefante. Falta por determinar el contenido en slice.
Caractersticas estructurales de lignina
Todas las fibras contienen unidades S y G. Sus contenidos en salvado de trigo y BSG no quedan
claros. Slo en paja y salvado de trigo se identificaron unidades H (seales en abac y hierba
elefante?). Falta por cuantificar la relacin S/G y la proporcin de diferentes enlaces de todas las
ligninas y el grado de acilacin en la posicin de algunas.
Las caractersticas estructurales de sisal son parecidas a los resultados en la bibliografa. Tiene un
alto de grado de acetilacin, mayoritariamente en la posicin . Abac, hierba elefante y paja de
trigo contiene enlaces de fenilcumarano y resinoles. Enlaces de espirodienonas slo se detectaron en
abac. El nivel de acetilacin en abac es mucho mayor que en hierba elefante y paja de trigo. En
abac la acetilacin se produce sobretodo en unidades S, menos en sisal y parecido en unidades G
en hierba elefante. El grado de p-cumarilacin aumenta segn abac < paja de trigo < hierba
elefante. La p-cumarilacin en abac y hierba elefante se produce mucho menos en la posicin
que esperado. La posicin de unin est desconocido (seal a 4.9/66 ppm). La cuestin es si est
acilado sobre unidades G y S o sobre otras estructuras. Los seales muy intensas de p-cido
cumrico libre en el anlisis de DFRC indican acilacin en posicin y , pero no fue observado
en HSQC en tal proporcin. Tambin se observ acido ferulico libre en el anlisis de DFRC en
abac, paja de trigo y hierba elefante, tanto en MWL como en la fibra. Ambos cidos phidroxicinmicos tambin se encontraron en alta proporcin en el anlisis de Py-TMAH-GC/MS de
paja de trigo y hierba elefante. Abac contiene menos cido ferulico.
71

IV. RESULTADOS Y DISCUSSIN


Acido ferulico tambin se observ en salvado de trigo y BSG por DFRC y Py-GC/MS. Ambas
tcnicas detectaron unidades G y S, pero en baja proporcin. Por 2D-NMR no se encontraron
unidades G y S en ambos materiales. Estos resultados contrastan con el contenido de lignina de los
anlisis de lignina Klason y cido-soluble. No se sabe la influencia de su contenido de protenas
sobre los diferentes anlisis.
La combinacin de las tcnicas analticas Py-(TMAH)-GC/MS, 2D-NMR y DFRC/DFRC resulta
ser muy til para resolver la estructura de ligninas. En principio espectros intensos y bien resueltos
de HSQC y HMBC (2D-NMR) dan suficiente informacin. Sin embargo es preferiblemente con
MWL, porque por ejemplo con geles de fibra (anlisis en situ) no se puede obtener un buen espectro
de HMBC. La presencia de los carbohidratos disminuyen la sensibilidad en las 3 tcnicas.
El anlisis de Py-(TMAH)-GC/MS ofrece ms ventajas en el aspecto que es rpido y ms apto para
anlisis en situ, pero es un mtodo semi-cuantitativo. Los anlisis de DFRC y DFRC se aplica
preferiblemente con MWL.

3.1.Investigacinprxima
Actualmente se sta analizando las ligninas (tipo de unidades, enlaces y grado de acilacin)
presentes en fracciones de hemicelulosas y celulosa de las diferentes fibras con un mtodo universal
recin desarrollado. El fraccionamiento se hace mediante solvlisis en una mezcla de disolventes
orgnicos. Tambin se est analizando la composicin qumica de los lpidos.
Habr que identificar los restantes seales desconocidos y cuantificar todos los seales de DFRC y
2D-NMR para estimar la relacin G/H/S, el grado de acetilacin y p-cumarilacin y las
proporciones relativas de enlaces en la MWL de los materiales lignocelulsicos. Tambin se
investigar ms para resolver la duda si el cido p-cumrico est acilado slo en la posicin gama o
tambin en otra posicin.
El anlisis por tiocidolisis puede dar informacin valiosa sobre la presencia de enlaces
condensados entre las unidadesen y probablemente se aplicar con todos los materiales analizados.
Se aplicarn ms tcnicas dependiendo de los objetivos finales de la investigacin, pero a largo
plazo se intentar optimizar mtodos y evaluar su aptitud en diferentes procesos fundamentales y
industriales. Las muestras de los buenos resultados obtenidos por (Faulds, 2010) por tratamiento
enzimtico con feruloil esterasas podran servir para analizar con que tipo de residuos de
carbohidratos se forma uniones con la lignina.

72

IV. RESULTADOS Y DISCUSSIN

74

V. Referencias

CAPTULO V:

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