PRCTICA # 9

CROMATOGRAFA DE AMINOCIDOS
INTRODUCCION
A menudo es necesario identificar y cuantificar los aminocidos individuales de
una mezcla, tanto en estudios metablicos como en las investigaciones de la
estructura de las protenas.
El uso de la cromatografa en capa fina o de la electroforesis son adecuados para
averiguar el nmero y la cantidad relativa de los diferentes aminocidos presentes
en una muestra (anlisis cualitativo), aunque para los anlisis cuantitativos es
necesaria la cromatografa de gases o un analizador de aminocidos.
Cromatografa en capa fina:
Una importante aplicacin de la cromatografa en capa fina es la de servir como
gua para el desarrollo de las condiciones ptimas para realizar separaciones por
cromatografa de lquidos de alta resolucin. Proporciona una idea rpida de los
aminocidos mayoritarios existentes en la muestra. Las ventajas de este
procedimiento son la rapidez y el bajo coste de los ensayos experimentales. De
hecho, se recomiendan que los ensayos en capa fina debern preceder siempre al
uso de la columna.
En la cromatografa de papel se pueden aplicar grandes volmenes de muestra, lo
que permite la elucin posterior de un aminocido en particular para su posterior
purificacin y anlisis, factor que tiene gran importancia en la identificacin de un
constituyente desconocido de la muestra.
Antes de la realizar la cromatografa, es necesario eliminar las sustancias que
interfieren, tales como protenas, carbohidratos y sales, lo que puede hacerse con
una resina de intercambio inico. Los aminocidos retenidos pueden eluirse a
continuacin aadiendo a la columna un pequeo volumen de amoniaco y lavando
despus con agua destilada.
La separacin de los aminocidos se basa en que stos se reparten de modo
diferencial entre la fase mvil y la fase estacionaria. Generalmente se realizan por
el procedimiento ascendente: introduciendo el borde inferior de la placa
cromatogrfica en el eluyente que ser succionado por accin de las fuerzas
capilares del recubrimiento de la superficie del la placa.
La identificacin de un aminocido se realiza comparando los valores de R f (factor
de retraso: cociente entre la distancia recorrida por el compuesto desde el origen y
la distancia recorrida por el solvente desde el origen), con otros tomados como
referencia, debindose utilizar al menos tres sistemas de disolventes distintos para
establecer su identidad con un cierto grado de seguridad.
La naturaleza de los aminocidos es un factor importante a la hora de elegir un
disolvente, ya que los diferentes solventes pueden permitir una mejor resolucin
de los componentes cidos, bsicos o neutros. En general, aumentando la

proporcin de agua en el disolvente se incrementan todos los valores de R f e

introduciendo pequeas cantidades de amoniaco aumentan los valores del factor
de retraso de los aminocidos bsicos. Algunos disolventes contienen compuestos
nocivos, por ejemplo el fenol, lo que restringe su uso rutinario. La composicin
qumica del disolvente puede tambin limitar el rango de reactivos de localizacin
que pueden aplicarse satisfactoriamente. Por ejemplo, el cido sulfanlico no
puede utilizarse con disolventes fenlicos.
El poder de resolucin de la cromatografa de capa fina puede aumentarse
empleando tcnicas bidimensionales, o sea, utilizando dos disolventes distintos.
Se aplica una cantidad de muestra mayor que la utilizada generalmente para la
separacin cromatogrfica de una dimensin (aproximadamente el triple) en una
esquina del papel o placa y se hace correr en una dimensin. Entonces el
cromatograma se seca completamente al aire, se gira un ngulo de 90 y se
desarrolla con el segundo solvente. Tras un nuevo secado, se sumerge en el
reactivo de localizacin elegido. En la cromatografa de dos dimensiones, la
composicin de los dos disolventes es la que determina el orden en que debe
utilizarse.
Las separaciones bidimensionales permiten la resolucin de un gran nmero de
aminocidos presentes en una muestra, ya que los que tienen una movilidad
similar en la primera dimensin se separan en la segunda. Esto es muy til en la
deteccin de los componentes que estn en muy baja concentracin y pueden
quedar enmascarados por otros compuestos que tengan una concentracin alta
cuando se utiliza la cromatografa en una dimensin.
Cromatografa de gases:
Se han hecho muchos ensayos para aprovechar la velocidad y sensibilidad que
ofrece la cromatografa de gases, pero aunque se han realizado considerables
progresos en el desarrollo de tales mtodos, an no se utiliza de forma rutinaria
para el anlisis de aminocidos en muestras biolgicas. La razn de esto radica
en el hecho de que los aminocidos, aunque similares, son compuestos
qumicamente heterogneos y adems no son suficientemente voltiles a menos
que se conviertan en algn derivado apropiado. Aparecen dificultades no slo a la
hora de elegir el mtodo de obtencin de tales derivados, sino tambin en la
seleccin de una fase estacionaria que sea capaz de resolver los derivados de
todos los elementos de un grupo tan diverso de compuestos. A lo hora de elegir el
detector aparecen tambin problemas similares.
Cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC):
Existen dos tcnicas para la determinacin de aminocidos a travs de
cromatografa lquida: cromatografa de reparto en fase reversa y cromatografa de
intercambio inico.
La cromatografa de lquidos de alta resolucin es la tcnica de separacin ms
ampliamente utilizada. Las razones ms importantes son su sensibilidad, su fcil
adaptacin a las determinaciones cuantitativas exactas, su idoneidad para la
separacin de especies no voltiles o termolbiles y, sobre todo, su gran
aplicabilidad a sustancias que son de primordial inters en la industria, en muchos

campos de la ciencia y para la sociedad en general. Algunos ejemplos de estos

materiales incluyen los aminocidos, protenas, cidos nucleicos y otros.
Cromatografa en fase reversa:
La cromatografa en fase reversa consiste en un disolvente fundamentalmente
polar como fase mvil y una cadena hidrocarbonada ligada como fase
estacionaria. Algunas de las ventajas ms sustanciales de esta alternativa son su
gran reproducibilidad, tiempos de retencin cortos, velocidad de muestreo alta,
sistema cromatogrfico simple y amplio campo de aplicacin. Por todo ello, las
aplicaciones son cada vez ms numerosas.
La selectividad se basa en las interacciones especficas entre el soluto y la fase
mvil, ya sea de tipo polar, de formacin de puentes de hidrgeno o mediante
equilibrios secundarios provocados al variar la composicin de la fase mvil
(cido-base, formacin de complejos o pares inicos, adicin de complejos metalligando o reactivos quirales para separar los ismeros pticos, etc.).
Cromatografa de intercambio inico:
La cromatografa inica est relacionada con los mtodos modernos y eficaces
para la determinacin de iones que se basan en el uso de resinas de intercambio
inico.
Existen mtodos automatizados para la separacin y deteccin de aminocidos y
otras especies inicas en mezclas complejas. El desarrollo de la HPLC moderna
empez a finales de los aos sesenta, pero su aplicacin a la separacin por
intercambio inico se retraso debido a la inexistencia de un mtodo general y
sensible para la deteccin de especies como los cationes alcalinos y
alcalinotrreos, y aniones como los haluros, acetato y nitrato. Esta situacin se
remedi en 1975 al desarrollarse por tcnicos de Dow Chemical Company la
tcnica de supresin del efluente, la cual hace posible la deteccin
conductimtrica de los iones eludos. El analizador de aminocidos, con el que se
lleva a cabo la cuantizacin de los aminocidos se basa en esta tcnica.
OBJETIVOS
1. Identificar a los aminocidos por cromatografa en capa fina.
2. Revelar los aminocidos por medio de la reaccin de ninhidrina.
MATERIALES Y REACTIVOS
Material:
Cmara de cromatografa
Estufa
Pipeta automtica
Placa silica-gel de cromatografa

Reactivos:
Silica-gel
n-butanol
cido actico
Ninhidrina al 0.5 % en acetona
Aminocidos: glicina, glutamina, serina, valina, L-alanina, metionina.
METODOLOGIA
1. Depositar en la cmara de cromatografa una mezcla de n-butanol, cido
actico y agua (12:3:15) de tal forma que el solvente quede a una altura de
1 cm.
2. A dos cm del borde inferior de la placa, sealar los puntos de aplicacin,
colocar un punto de cada aminocido en cada punto de la placa.
3. Cuando la muestra este seca, colocarla en la cmara y permitir el
corrimiento mas all de la mitad de la placa (1 hora aproximadamente).
4. Una vez terminado el corrimiento sacar las placas y permitir que se sequen.
5. Rociar con ninhidrina y revelar en la estufa.

OBSERVACIONES:
RESULTADOS:
CONCLUCIONES:
CUESTIONARIO:
BIBLIOGRAFIA