La inhibicin de Bacillus cereus y Bacillus weihenstephanensis en verduras

crudas
mediante la aplicacin de soluciones de lavado que contienen enterocina AS- 48
solo y en combinacin con otros antimicrobianos
Antonio Cobo Molinos a , Hikmate Abriouel a , Rosario Lucas Lopez a , Nabil Ben Omar a , Eva Valdivia b,c, Antonio Galvez a,
a Area de Microbiologa, Departamento de Ciencias de la Salud, Facultad de Ciencias Experimentales, Universidad de Jaen, 23071 Jaen, Spain b
Departamento de Microbiologa, Facultad de Ciencias, Universidad de Granada, 18071 Granada, Spain c Instituto de Biotecnologa, Facultad de Ciencias,
Universidad de Granada, 18071 Granada, Spain

resumen
Enterocina AS-48 es un pptido antimicrobiano de amplio espectro cclico producido por Enterococcus faecalis. En el
presente estudio, la bacteriocina se ensay solo y en combinacin con otros antimicrobianos para la descontaminacin
de Bacillus inoculado en la alfalfa, brotes de soja y esprragos verdes. El lavado con enterocina AS-48 soluciones
reduce el recuento de clulas viables de Bacillus cereus y Bacillus weihenstephanensis por 1.0-1.5 y 1.5-2.38 unidades
de registro de derecho despus de la aplicacin del tratamiento, respectivamente. En ambos casos, el bacteriocina fue
eficaz en la reduccin de la poblacin viable que queda por debajo de niveles de deteccin durante su posterior
almacenamiento de las muestras a los 6 C, pero no pudo evitar que rebrote en las muestras almacenadas a 15 o 22
C.
La aplicacin de tratamientos de lavado que contienen enterocina AS-48 en combinacin con varios otros
antimicrobianos y desinfectantes (cinmico y los cidos, carvacrol, cido polifosfrico hidrocinmico,cido peractico,
cloruro de hexadecilpiridinio y el hipoclorito de sodio) aumentar considerablemente la efectos bactericidas. Las
combinaciones de AS-48 y el hipoclorito de sodio, cido peractico o cloruro de hexadecilpiridinio proporciona los
mejores resultados. Despus de la aplicacin de los tratamientos combinados en los brotes de alfalfa contaminados
con B. cereus o B. weihenstephanensis, bacilos viables no fueron detectado o mantenido en concentraciones muy
bajas en las muestras tratadas durante un periodo de almacenamiento de 1 semana en 15 C. Inhibicin de B. cereus
por in situ bacteriocina producida fue probado por cocultivo con el AS-48 cepa productora E. faecalis A-48-32 inocula
en brotes de soja. Strain A-48-32 fue capaz de crecer y producir bacteriocinas sobre brotes tanto en 15 y 22 C. En 15
C, el crecimiento de B. cereus era completamente inhibido en los cocultivos, mientras que un efecto mucho ms
limitado se observ a 22 C. Los resultados obtenido para tratamientos de lavado son muy alentadores para la
aplicacin de enterocina AS-48 en el descontaminacin de las coles. Aplicacin de tratamientos de lavado que contiene
AS-48 el nico que puede servir para reducir el recuento de clulas viables de bacilos en las muestras almacenadas en
refrigeracin, mientras que la aplicacin de combinar tratamientos deben ser recomendados para evitar la proliferacin
de
los
bacilos
supervivientes
bajo
temperatura
abuse
condiciones.

Y 2008 Elsevier Ltd. Todos los derechos reservados.

abstract
Enterocin AS-48 is a broad-spectrum cyclic antimicrobial peptide produced by Enterococcus faecalis. In the present
study, the bacteriocin was tested alone and in combination with other antimicrobials for decontamination of Bacillus
inoculated on alfalfa, soybean sprouts and green asparagus. Washing with enterocin AS-48 solutions reduced viable
cell counts of Bacillus cereus and Bacillus weihenstephanensis by 1.01.5 and by 1.52.38 log units right after
application of treatment, respectively. In both cases, the bacteriocin was effective in reducing the remaining viable
population below detection levels during further storage of the samples at 6 1C, but failed to prevent regrowth in
samples stored at 15 or 22 1C. Application of washing treatments containing enterocin AS-48 in combination with
several other antimicrobials and sanitizers (cinnamic and hydrocinnamic acids, carvacrol, polyphosphoric acid, peracetic
acid, hexadecylpyridinium chloride and sodium hypochlorite) greatly enhanced the bactericidal effects. The
combinations of AS-48 and sodium hypochlorite, peracetic acid or hexadecylpyridinium chloride provided the best
results. After application of the combined treatments on alfalfa sprouts contaminated with B. cereus or with B.
weihenstephanensis, viable bacilli were not detected or remained at very low concentrations in the treated samples
during a 1-week storage period at 15 1C. Inhibition of B. cereus by in situ produced bacteriocin was tested by
cocultivation with the AS-48 producer strain E. faecalis A-48-32 inoculated on soybean sprouts. Strain A-48-32 was able
to grow and produce bacteriocin on sprouts both at 15 and 22 1C. At 15 1C, growth of B. cereus was completely
inhibited in the cocultures, while a much more limited effect was observed at 22 1C. The results obtained for washing
treatments are very encouraging for the application of enterocin AS-48 in the decontamination of sprouts. Application of
washing treatments containing AS-48 alone can serve to reduce viable cell counts of bacilli in samples stored under
refrigeration, while application of combined treatments should be recommended to avoid proliferation of the surviving
bacilli under temperatureabuse conditions. & 2008 Elsevier Ltd. All rights reserved.
1. Introduction
Bacterias Endospore formadores del grupo Bacillus cereus a menudo se consideran peligrosos para la seguridad de los
alimentos debido a su capacidad de producir enterotoxinas, junto con su amplia distribucin en la naturaleza y la
contaminacin frecuente de materias primas utilizadas en la produccin de alimentos. B. cereus es un habitante comn
del suelo que a menudo est presente en una variedad de alimentos, como el arroz, especias, leche y productos
lcteos, verduras, carne, pasteles y otros postres (Granum, 2001). B. cereus produce varias toxinas (Schoeni y Wong,
2005), incluyendo la toxina emtico y al menos otros cuatro enterotoxinas (Agata et al., 1995): BL hemolisina o Hbl
(Beecher y Wong, 1997), la enterotoxina no hemoltica o Nhe (Lindba CK et al., 2004) y K citotoxina o CYTK (Lund et
al., 2000). Bacillus weihenstephanensis es una bacteria psicrotolerantes perteneciente al grupo B. cereus (Lechner et
al., 1998). Algunas cepas pueden ser altamente citotxico, y se ha demostrado para llevar al menos algunos de los
determinantes genticos de las enterotoxinas, as como la toxina emtico se describe en B. cereus (Pruss et al., 1999;
Stenfors et al., 2002 ; Thorsen et al, 2006;.. Baron et al, 2007). B. cereus se ha aislado de brotes y sproutin semillas
(Kim et al, 2004;.. Pao et al, 2005). En los brotes de soja,endospora de formacin de bacterias se encuentran en el
orden de 2 logunits / g,y 53 de los 55 aislamientos de B. cereus se encontraron para producir diarreico enterotoxinas
(Kim et al., 2004). B. cereus tambin se ha aislado a partir de vegetales crudos utilizados para preparar refrigerados
mnimamente procesados alimentos (Valero et al., 2002). El uso de desinfectantes para reducir el B. cereus niveles en

las frutas y verduras se ha propuesto como un medida de seguridad (Beuchat et al., 2004).Las bacteriocinas de
bacterias de cido lctico (LAB) han sido rara vez utilizado para la descontaminacin de productos frescos (revisado
por Ga'lvez et al., 2008). La nisina y pediocina individualmente o en combinacin con agentes antimicrobianos (lactato
de sodio, sorbato de potasio, cido ftico y cido ctrico) se probaron como sea posible desinfectante tratamientos para
la reduccin de la poblacin de Listeria monocytogenes el repollo, el brcoli y las coles de frijol mungo (Bari et al.,
2005).
Soluciones de lavado que consta de bacteriocinas LAB producen en un extracto de lechuga (nisina Z, coagulina y
nisina: cctel coagulina) reduccin de los recuentos de clulas viables de L. monocytogenes en recin cortada lechuga
iceberg almacena en bolsas de plstico microperforados, pero lo hizo no impide un mayor crecimiento de los
sobrevivientes durante la refrigeracin almacenamiento (Allende et al., 2007). Enterocina AS-48 es un pptido cclico
con un amplio espectro antibacteriano (Ga'lvez et al, 1986., 1989;Maqueda et al., 2004). Esta bacteriocina ha sido
purificado en una escala semi-preparativa (Abriouel et al., 2003), y ahora est siendo probado como conservante
natural
en
diferentes
sistemas
alimentarios
(Mun~oz
et al, 2004., 2007; . Ananou et al, 2005a, b; Grande et al., 2005,2006, 2007a, b; Lucas et al., 2006). Enterocina AS-48
puede ser una bacteriocina interesante para la descontaminacin de verduras crudas. En jugo de lechuga, aadido
enterocina AS-48 provoc una fuerte inhibicin de la Staphylococcus aureus y completamente inactivadas L.
monocytogenes y B. cereus (Grande et al., 2005). Enterocina AS-48 era probado previamente en tratamientos de
lavado para la descontaminacin de semilla brota contra L. monocytogenes (Cobo Molinos et al., 2005).La actividad
antilisterial de AS-48 se mejor en gran medida por varios compuestos antimicrobianos, la reduccin de la poblacin de
viabilidad listeria debajo de los lmites de deteccin de los brotes tratados despus el tratamiento y la prevencin de
rebrote de las listeria durante el almacenamiento de las muestras tratadas (Cobo Molinos et al., 2005).Resultados de
nuestros
estudios
anteriores
indican
que
la
eficacia
de
AS48
tratamientos depende en gran medida de las bacterias diana y la comida sistema. Mientras aadido bacteriocina
completamente inactivados B. cereus en los alimentos a base de arroz ( Grande et al. , 2006 ) , bacteriocina superior
Se requieren concentraciones para controlar poblaciones mixtas de bacilos en pure'es ( Grande et al. , 2007b ) . En los
tratamientos de lavado, la concentracin de bacteriocina en muestras disminuir despus del tratamiento, limitar la
proteccin de las muestras durante el almacenamiento. los objetivo del presente estudio fue determinar la eficacia de
AS- 48 aplicado en tratamientos de lavado contra dos toxicgeno especies del grupo B. cereus solo y en combinacin
con otra antimicrobianos en bsqueda de efectos sinrgicos contra los bacilos .
2. Materiales y mtodos
2.1. Cepas y condiciones de cultivo bacteriano
Enterococcus faecalis A-48-32 (Martnez Bueno et al., 1990) era faecalis usadas para la produccin de enterocina AS48, y E. S-47 de nuestra coleccin se utiliz para la determinacin de la norma actividad bacteriocina. B. cereus LWL1
es un psicotrpico y cepa enterotoxignica (Dufrenne et al., 1995), suministrado amablemente por Dr. F.M. van
Leusden (Laboratorio Microbiolgico para la Salud Proteccin, Natl. Inst. Publ. Salud y Environ., Pases Bajos).B.
CECT weihenstephanensis 5894 se obtuvo del espaol coleccin de cultivos tipo (CECT). Todas las cepas se
cultivaron rutinariamente en infusin de cerebro-corazn (BHI, Scharlab, Barcelona, Espaa) caldo a 37 1C, y se
almacen a 4 1C en tubos inclinados de agar BHI-.
2.2. Preparacin de bacteriocina y qumicas conservantes
Enterocina AS-48 se recuper a partir de caldos de cultivo de la cepa productora E. faecalis A-48-32 en CMG-medio
por cationes cromatografa de intercambio como se describe en otro lugar (Abriouel et al.,2,003). Concentrados de
bacteriocina se filtraron a travs 0,22 mm
filtros de baja unin a protenas de tamao de poro (Millex GV; Millipore Corporation, Belford, MA, EE.UU.) bajo
condiciones estriles y probado para la actividad bacteriocina contra la cepa indicadora E. faecalis S-47por el mtodo
de difusin en agar bien (Abriouel et al., 2003).
Soluciones de inmersin se prepararon por dilucin de bacteriocina concentrados (500 mg / ml) en agua destilada
estril o en acuosa soluciones de los conservantes qumicos a ensayar en el caso de tratamientos combinados.
El cido lctico, lactato sdico, trimetafosfato trisdico,cido polifosfrico, cloruro de hexadecilpiridinio, n-propilo phidroxibenzoato de metilo y p-hydoxybenzoic esther metlico del cido fueron adquiridos de Sigma (Madrid, Espaa). El
cido cinmico, cido hidrocinmico, carvacrol y cido peractico eran de Fluka(Madrid). El hipoclorito de sodio se
concentr un comercial leja (ConejoTM, Henkel Ibe' rica, Barcelona, Espaa). El comercial
soluciones o soluciones madre concentradas preparadas por disolviendo los compuestos slidos en agua destilada
estril o en etanol se diluyeron al menos 20 veces en agua destilada estril en Para preparar las soluciones de
inmersin que se utilizar para la tratamientos de lavado. Todas las soluciones se prepararon fresca antes de su uso.
2.3.
Ensayo
de
enterocina
AS-48
en
los
vegetales
contaminados
artificialmente
con
bacilos
El efecto de la inmersin en soluciones que contienen enterocina AS-48 (25 mg / ml, concentracin final) en la
supervivencia y el crecimiento de B. cereus LWL1 inocul en la alfalfa fresca, brotes de soja y esprragos verdes, as
como B. weihenstephanensis CECT 5894 en brotes de soja se investig a temperaturas de almacenamiento de 6, 15 y
22 1C. Los cultivos de bacilos crecer durante la noche en caldo BHI a 37 1C se diluyeron 1: 100 en solucin salina
estril a una densidad final de clulas de aprox. 5.5 log CFU / ml. Esta suspensin de clulas de Bacillus se utiliz para
contaminan artificialmente las verduras estn probando. Verde fresco esprragos (variedad Mary Washington, 5-10 mm
de dimetro), soja coles (Alleuras Industrias, Madrid) y brotes de alfalfa (Productos Fanya, Madrid) fueron adquiridos de
los supermercados locales. El esprrago se cortaron en piezas de 2 cm antes del tratamiento solicitud. Las muestras
de los vegetales estn probando (2,5 g cada uno) fueron depositados en el interior de tubos de 50 ml de polipropileno
tapados estriles (Sterilin, Piedra, Reino Unido) y se sumergi durante 5 minutos en 5 ml destilada estril de agua
(controles
negativos)
o
en
5
ml
de
suspensin
de
clulas
de
Bacillus
en
6,
15 y 22 1C. A continuacin, se depositan sobre un papel de filtro estril para drenar el exceso de agua. Las muestras
contaminadas artificialmente eran Despus de los tratamientos de inmersin, el exceso de solucin de inmersin era
quitan que el anterior, y las muestras fueron almacenadas en estril coron 50 ml tubos de ensayo de polipropileno
colocados en almacenamiento refrigerado o cmaras de incubacin (Memmert, Schwabach, Alemania) a deseada
temperaturas de incubacin (6, 15, 22 1C) para diferentes perodos de tiempo. En cada paso, las muestras (2,5 g) se
mezclaron
con
5
ml
de
solucin
salina
estril

solucin (0,85% de NaCl) y golpeado durante 3 min en un Stomacher 80 (Biomaster) antes de que se diluyeron en
serie en solucin salina estril solucin y se extendi por triplicado en placas de agar B. cereus (Scharlab, Barcelona)
suplementado con yema de huevo y polimixina B (Panreac, Barcelona). Las placas se incubaron a 37 1C durante 48 h,
y el nmero de colonias que muestra las caractersticas tpicas de B. cereus eran determinado con el fin de calcular el
recuento de clulas viables. Tratamientos combinados de enterocina AS-48 y conservantes qumicos se llevaron a cabo
en
Bacillus
contaminada
artificialmente
muestras de alimentos a temperatura ambiente esencialmente como se describe anteriormente, mediante el uso de
soluciones de inmersin que contienen enterocina AS-48 (25 mg / ml concentracin final) y / o los compuestos
qumicos
correspondientes
(a las concentraciones finales indicadas en el epgrafe anterior). Viable recuentos de clulas de bacilos se determinaron
como se ha descrito anteriormente siguiente tratamiento de inmersin (tiempo cero) y despus de 24 h de incubacin a
22 1C. Confirmacin de B. cereus se realiz mediante amplificacin por PCR de la SSPE gen con cebadores
especficos sspE1-F (50-GAGAAAGATGAGTAAAAAACAACAA-30) Y sspE1-R (50-CATTTGTGCTTTGAATGCTAG)
Como se describepor Kim et al. (2004), seguido por la deteccin de la 71-bp amplicn mediante electroforesis en gel
de agarosa.
2.4.
Experimentos
de
cocultivo
Las clulas de un cultivo de una noche (cultivaron a 37 1C en caldo BHI) de la cepa enterocina AS-48 productor E.
faecalis A-48-32 eran recuperado por centrifugacin (5000 g durante 10 min a temperatura ambiente) y se
resuspendieron en solucin salina estril a la inicial volumen de cultivo. Esta suspensin se aadi a la bacilos
suspensiones de contaminacin para obtener una suspensin de co-cultivo con una proporcin aproximadaenterococos a los bacilos de 100: 1. Vegetal muestras (2,5 g cada una) se sumergieron en el co-cultivo suspensin
durante
5
min
a
temperatura
ambiente
como
anteriormente
y
el
exceso
la
suspensin
se
elimin
como
arriba.
A
intervalos
deseados
de
de incubacin a la temperatura de ensayo (15 o 22 1C), las muestras se chapado para los recuentos de clulas viables
de bacilos y enterococos. porlos bacilos, B. cereus agar fue suplementado con ampicilina (80 mg / ml, concentracin
final) con el fin de inhibir el crecimiento de enterococos. Los bacilos se confirm mediante amplificacin por PCR como
se
descrito arriba. Recuentos de clulas viables de enterococos eran tambin llevado a cabo, mediante la difusin de las
muestras por triplicado en kanamicina esculina azida de agar (KAA, Scharlab), seguido de 48 h de incubacin a 37 1C.
La confirmacin de la AS-48 cepas productoras de placas KAA hecho por colonias de prueba aislados al azar para
bacteriocina
la produccin por el lugar en un mtodo csped con E. faecalis S-47 como la cepa indicador sensible y A-48-32 cepa
como el AS-48- cepa indicadora resistentes. Las colonias que mostraban inhibicin frente cepa S-47, pero no lograron
inhibir
la
cepa
A-48
a
32
se
consideraron
ser
AS-48
productores.
La actividad bacteriocina en las muestras se determin mediante la prueba 100 ml de la suspensin vegetal golpeado
por
el
agar
pocillosmtodo
de
difusin.
2.5.
Anlisis
estadstico
Los datos promedio de las desviaciones trials7standard duplicados se determinaron con el programa Excel (Microsoft
Corp., EE.UU.). En Para determinar la significacin estadstica de los datos, una prueba t se llev a cabo en el intervalo
de
confianza
del
95%
con
Statgraphics
Plus versin 5.1 (Statistical Graphics Corp., EE.UU.). El significado de los tratamientos combinados se determin por
comparacin de los datos desde el mismo tiempo de incubacin.
3. Resultados
3.1. Efecto de los tratamientos de lavado que contengan enterocina AS-48 sola
El efecto de los tratamientos de lavado con soluciones que contengan 25 mg AS-48 se estudi / ml de B. cereus LWL1
en la soja, alfalfa brotes y esprragos verdes (Fig. 1) almacenados a 6, 15 y 22 1C. Mejor Se obtuvieron resultados
para las muestras refrigerados a 6 1C. En todos los casos,estadsticamente significativas (Po0.05) reducciones de los
recuentos de clulas viables de 1,06, 1,3 y 1,59 unidades de registro se obtuvieron despus de lavar los tratamientos, y
la poblacin viable restante se reduce por debajo niveles de deteccin despus de das 1-3 de almacenamiento (Fig.
1A, D y G).Por el contrario, las reducciones de los recuentos de clulas viables obtiene despus de los tratamientos a
los 15 o 22 1C no fueron estadsticamente significativas para los tres tipos de alimentos probados, y las clulas viables
restantes se multiplicaron como los controles no tratados, al menos para el primer da de almacenamiento. Durante
almacenamiento prolongado, los recuentos de clulas viables de las muestras tratadas eran significativamente menor
que los controles no tratados nicamente para la alfalfa coles y esprragos en el da 3 y de brotes de soja despus de
3 dasde almacenamiento.
Lavar los tratamientos con AS-48 (25 mg / ml) tambin se aplica a B. weihenstephanensis CECT 5894 inoculado en
brotes de soja (Figura 2). El tratamiento redujo significativamente bacteriocina de clulas viables poblacin multiplica
durante el almacenamiento a temperaturas ms altas, especialmente en 15 1C y, en menor medida, tambin en 22 1C
(Fig. 2B y C).
3.2. Efecto de los tratamientos de lavado que contengan enterocina AS-48 en combinacin con otros
compuestos antimicrobianos
Enterocina AS-48 (25 mg / ml) fue probado en B. cereus encombinacin con varios otros compuestos antimicrobianos
en brotes de alfalfa almacenados a 15 1C. A esta concentracin, el bacteriocina sola no redujo significativamente el
nmero de viable B. cereus despus del tratamiento o durante las siguientes 24 h de almacenamiento (Fig. 3).
Muchos de los compuestos antimicrobianos probados individualmente reduccin del nmero de clulas viables de
manera significativa (Po0.05) en comparacin con los controles no tratados, ya sea en el tiempo 0 o despus de 24 h
de almacenamiento o ambos (Fig. 3). La comparacin de los recuentos de clulas viables obtenido para cada
conservante qumico y la combinacin conservante bacteriocina-qumico indic que el bactericida efecto de los
tratamientos se mejor significativamente por la adicin de AS-48 (Po0.05) para cinmico y hidrocinmico cidos,
carvacrol, cido polifosfrico (al 0,1% y 0,5%), cido peractico, hexadecilpiridinio cloruro e hipoclorito de sodio, tanto
en 0 y24 h de almacenamiento, y tambin para trimetafosfato trisdico a las 24 h.Curiosamente, algunos de los
tratamientos combinados (con sodio hipoclorito, cido peractico, cido polifosfrico y hidrocinmico cido) redujo los
recuentos de clulas viables de B. cereus a continuacin niveles de deteccin.
3.3. Preservacin de brotes despus del tratamiento

La eficacia de combinaciones de conservantes seleccionados y enterocina AS-48 para la inhibicin prolongada de

bacilos se ensayaron en muestras de alfalfa brotes almacenadas a 15 C durante 1 semana. En las muestras tratados
con carvacrol, cinmico y los cidos en hidrocinmico combinacin con AS-48, el recuento de clulas viables de B.
cereus LWL1
mantenido significativamente menor en comparacin con cada individuo tratamiento (Po0.05) durante la mayor parte o
la totalidad del perodo de almacenamiento (Fig. 4). Se obtienen los mejores resultados para el tratamiento combinado
con cido hidrocinmico, para los que no se detectaron clulas viables excepto en da 2 (Fig. 4C).
Compuestos La qumica hipoclorito de sodio, hexadecilpiridinio cloruro, cido peractico y cido polifosfrico reducida
la poblacin de B. cereus debajo de los niveles de deteccin para la totalidad o al menos la mayor parte del perodo de
almacenamiento cuando se ensay en combinacin con AS-48 (Fig. 5). Sin embargo, ninguno de los compuestos fue
capaz de eliminar completamente B. cereus cuando se prueba sin bacteriocina.
Los compuestos antimicrobianos tambin fueron probados contra B. weihenstephanensis CECT 5894 inoculado en los
brotes de alfalfa almacenada una 15 C. El tratamiento con bacteriocina sola redujo los recuentos de clulas viables
debajo de los niveles de deteccin desde el principio, pero no impidi una mayor proliferacin de las bacterias
supervivientes (Fig. 6). En contraste, las combinaciones de 25 mg / ml AS-48 y cido hidrocinmico,cido peractico, el
hipoclorito de sodio, as como hexadecilpiridinio cloruro de reducir la poblacin de B. weihenstephanensis debajo de los
niveles de deteccin para la totalidad o al menos la mayora del almacenamiento perodo (Fig. 6). En el caso de cido
polifosfrico, un mayor se requera concentracin de 0,5% para alcanzar un grado de tales inactivacin (Fig. 6E y F).
La adicin de la antimicrobiano compuestos nicamente tuvieron efectos mucho ms limitados en la mayora de los
casos.
3.4. Inhibicin de B. cereus en los brotes por cocultivo con una cepa productora de bacteriocina B. cereus LWL1 se
inocul en brotes de soja en combinacin
con la cepa productora de bacteriocina E. faecalis A-48-32 como una cultivo de proteccin a los 15 y 22 C (Fig. 7). Los
enterococos multiplicado rpidamente en los brotes de ambos en 15 y 22 1C. En ambos casos, bacteriocina actividad
podra ser recuperado de los brotes durante el da 1-3, pero no en otros puntos de almacenamiento. En las muestras
de cocultivo se almacena a 15 C,crecimiento de B. cereus se inhibi completamente para todo el almacenamiento
periodo, con recuentos de clulas viables de ser significativamente menor que monocultivos para los primeros 5 das
de almacenamiento (Fig. 7A). En contraste,
cocultivo con la cepa de la produccin a 22 1C slo produjo algunos inhibicin del crecimiento de B. cereus, durante los
primeros 3 das de almacenamiento (Fig. 7B).
4. Discusin
B. cereus es la principal aerbico ex endospora mesfilo de preocupacin en la industria alimentaria (Schoeni y Wong,
2005). los esporas de B. cereus sobrevivir procesos de pasteurizacin de 100 C durante 2/2 a 5/4 min y, adems, las
clulas vegetativas de algunas cepas pueden crecer a temperaturas bajas, de 4-5 1C (Dufrenne et al.,1995; Choma et
al., 2000). Brotes de semillas pueden contener esporas de B.cereus procedentes de diversas fuentes (sustrato vegetal,
tierra,fertilizantes), que pueden germinar y alcanzar alta poblacin densidades superiores a los niveles de riesgo. El
psicrotolerantes estrechamente relacionado especie B. weihenstephanensis ahora est siendo investigado, ya que
Tambin pueden producir toxinas, intoxicacin alimentaria. La necesidad de incluir obstculos adicionales para el
control de B. cereus en la cadena alimentaria podra ser resuelto mediante el uso de sustancias antibacterianas
naturales como bacteriocinas.
Estudios previos han demostrado que la adicin de enterocina AS-48 presenta una buena actividad inhibidora frente a
este bacterias en los alimentos de origen lcteo, el arroz hervido y purs de verduras(Mun~oz et al, 2004;.. Grande y
otros, 2006, 2007b). Sin embargo, el
potencial de esta bacteriocina en el control de B. cereus, as como B.weihenstephanensis en los brotes an no se ha
investigado. los resultados obtenidos en el presente estudio son prometedores claramente por descontaminacin de
estas dos especies, principalmente para muestras almacenadas bajo refrigeracin. Sin embargo, el tratamiento con
bacteriocina hizo
no proporciona ninguna proteccin en condiciones de temperatura de abuso15 o 22 C. Por esta razn, con el fin de
aumentar la temperatura mrgenes de seguridad sera necesario aplicar combinada tratamientos con otros agentes
antimicrobianos. Los resultados de la seleccin preliminar llevada a cabo en el presente estudio fueron altamente
satisfactorio para los tratamientos combinados de la AS-48 con la cidos cinmico y hidrocinmico, carvacrol,
polifosfrico cido, cido peractico, cloruro de hexadecilpiridinio y sodio hipoclorito. Para la mayora de ellos, los
recuentos de clulas viables de B. cereus eran reducida por debajo de los lmites de deteccin. En otros casos (cido
lctico, lactato de sodio, n-propil p-hidroxibenzoato de metilo y p-hydoxybenzoic cido metil ster), los recuentos de
clulas viables en el bacteriocintreated muestras fueron significativamente ms bajos en comparacin con el no tratado
los controles, pero no con los conservantes qumicos por s solos,lo que indica que no haba ningn sinergismo con la
bacteriocina.
Aunque los informes anteriores han estudiado los efectos sinrgicos de compuestos antimicrobianos con bacteriocinas
(revisado por Ga'lvezet al., 2007), este es el primer ejemplo de aplicacin de lavado tratamientos contra bacterias
formadoras de endosporas y tambin para aplicacin de una bacteriocina contra B. weihenstephanensis.Uno de los
principales problemas de los tratamientos de descontaminacin es que las reducciones de los recuentos de clulas
viables obtenidas pueden no ser suficiente para evitar el crecimiento de los sobrevivientes y heridos subletalmente las
clulas durante el almacenamiento. En el presente estudio, las combinaciones de AS-48 que fueron ms eficaces en la
reduccin de los recuentos de clulas viables durante el tratamiento tambin proporcion una muy buena proteccin
contra B. cereus y B. weihenstephanensis durante 1 semana de almacenamiento de coles en 15 1C, reduciendo la
concentracin de clulas viables por debajo los lmites de deteccin para la mayora de las muestras. Estos resultados
sugieren que tales combinaciones podran ser utilizados como altamente eficaz
tratamientos de descontaminacin contra Bacillus en semilla germinada coles.
Otra alternativa posible el control de microorganismos no deseados en los alimentos se basa en la aplicacin de la
exclusin competitiva tcnicas, en las que las cepas productora de bacteriocina se utilizan para inhibir el crecimiento de
bacterias patgenas o toxicognicas. En esto sentido, el uso de cepas productoras de enterocina AS-48 ha demostrado
buenos resultados en el control de B. cereus y S. aureus en queso como as como de S. aureus y L. monocytogenes
en un sistema de la carne (Mun~oz et al, 2004., 2007; Ananou et al., 2005a, b). Los enterococos son parte de la
microbiota normal del tracto gastrointestinal humano, y son Tambin se encuentra en muchos tipos diferentes de

alimentos (revisado por Foulquie' Moreno et al., 2006). Puesto que ahora hay una preocupacin de que los enterococos
pueden estar involucrados en la propagacin de la resistencia a los antibiticos y rasgos de virulencia en los alimentos,
las cepas utilizadas para aplicaciones alimentarias debe ser desprovisto de tales rasgos. A este respecto, los resultados
anteriores han demostrado que los rasgos genticos que codifica para enterocina AS-48 lata ser transferido
artificialmente en cepas adecuadas desprovistos de virulencia rasgos y con el rendimiento tecnolgico adecuado
(Ferna'ndez et. al, 2007). Los resultados obtenidos en el presente estudio frente a B.cereus en los brotes de soja
tambin indican que la AS-48 la produccin cepas podran servir para controlar el crecimiento de B. cereus en virtud
condiciones de temperatura adecuadas que permiten la produccin de suficiente cantidades de bacteriocina sin
favorecer a una excesiva crecimiento de B. cereus. Es de destacar la buena implantacin muestra por la cepa
bacteriocinognica A-48-32 en los brotes de soja,alcanzando densidades celulares elevadas dentro de los tres
primeros das de el almacenamiento de las muestras a 15 y 22 1C. Sin embargo, la aplicacin de esta cepa como una
cultura de proteccin estara limitado por la baja produccin de bacteriocina en condiciones de refrigeracin y la falta de
efectividad muestra en 22 1C. Por lo tanto, adems de ex-situ bacteriocina producida (ya sea solo o en combinacin
con otro antimicrobianos) sigue siendo la mejor opcin para el control de B. cereus y B. weihenstephanensis en brotes.