Guia Practicas Bacteriologia - Una 2009

Lab.
Microbiologa
Gua Prctica de
Bacteriologa
Oscar D. Ors B.
INTRODUCCION
El objetivo del Laboratorio de Microbiologa es el
aislamiento del agente etiolgico de la enfermedad que
aqueja a nuestro paciente. Luego a partir de ste se
proceder a la identificacin y determinar la
sensibilidad del microorganismo aislado.
Con el objeto de lograr esto y para dar una orientacin
temprana al clnico, se puede proceder a la tincin y
observacin directa de la muestra. Luego se sembrar
para obtener colonias aisladas del agente infeccioso. Es
a partir de estas colonias que se proceder a la
identificacin mediante pruebas bioqumicas y a la
determinacin de la sensibilidad a los antibiticos. En el
Laboratorio de Microbiologa deben tenerse especiales
precauciones a fin de evitar la contaminacin de las
muestras clnicas y de los cultivos, as como la infeccin
del operador.
Durante el siglo XX la Microbiologa ha experimentado
un rpido desarrollo en dos direcciones distintas, una
bsica y otra aplicada. En su aspecto aplicado, los
progresos de Koch condujeron a un extenso desarrollo
de la microbiologa mdica y la inmunologa en la
primera parte del siglo, con el descubrimiento de
muchas
nuevas
bacterias
patgenas
y
el
establecimiento de los principios por los que estos
patgenos infectan el cuerpo y se hacen resistentes a
las defensas del mismo
Hacia los aos setenta nuestros conocimientos sobre
los procesos bsicos de la fisiologa, la bioqumica y la
gentica bacteriana avanzaron de tal modo que
hicieron posible manipular experimentalmente el
material gentico de las clulas usando bacterias como
instrumentos. Esos conocimientos tambin permitieron
introducir material gentico (DNA) de origen exgeno
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en bacterias y controlar su replicacin y caractersticas.
Esto llev a la aparicin de la biotecnologa.

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CONTENIDO
INTRODUCCION
Pag.
RECOMENDACIONES Y BIOSEGURIDAD
03
Prac, Nro. 1. MATERIAL Y EQUIPO DE LABORATORIO
07
Prac, Nro. 2. PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO

12
Prac. Nro. 3.PLAQUEO Y ENTUBADO DE MEDIOS DE CULTIVO
15
Prac.
Nro.
4.MTODOS
MICROORGANISMOS.
DE
SIEMBRA
AISLAMIENTO
DE
20
Prac. Nro. 5.SENCIBILIDAD BACTERIANA

Prac. Nro. 6.TINCIN GRAM
24
27
Prac. Nro. 7.TINCIN DE ZIEHL-NEELSEN (acido resistente)

31
Prac. Nro. 8.COLORACIN DE ESPORAS, TINCIN NEGATIVA
33
Prac. Nro. 9.RECUENTO TOTAL DE BACTERIAS AEROBIAS MESOFILAS.
35
Prac. Nro. 10.RECUENTO DE COLIFORMES: DETERMINACIN DEL (NMP).
38
Prac. Nro. 11.IDENTIFICACIN DE COCOS GRAM POSITIVOS.
42
Prac. Nro. 12. IDENTIFICACION DE BACILOS GRAM POSITIVOS
47
Prac. Nro. 13.IDENTIFICACION DE COCOS GRAM NEGATIVOS
52
Prac. Nro. 14.IDENTIFICACIN DE BACILOS GRAM NEGATIVOS
56

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RECOMENDACIONES Y BIOSEGURIDAD
La BIOSEGURIDAD, se define como el conjunto de medidas preventivas, destinadas
a mantener el control de factores de riesgo laborales procedentes de agentes
biolgicos, fsicos o qumicos, logrando la prevencin de impactos nocivos.
Se entienden como Precauciones Universales al conjunto de tcnicas y
procedimientos destinados a proteger al personal que conforma el equipo de salud
de la posible infeccin con ciertos agentes, principalmente Virus
Medidas de Bioseguridad son un conjunto de medidas de sentido comn que
permiten prevenir la exposicin del personal a riesgos innecesarios.
En el Laboratorio de Microbiologa deben tenerse especiales precauciones a fin de
evitar la contaminacin de las muestras clnicas y de los cultivos, as como la
infeccin del operador.
Recomendaciones:
Antes de venir a clase lea el ejercicio o prctica que ser ejecutada ese da, de tal
forma que Ud. Pueda entender lo que se har en clase.
Siempre planifique su trabajo para evitar perdidas de tiempo. Tome nota de todo lo
que se est ejecutando durante las prcticas.
Asuma que todos lo microorganismos con que Ud. Est trabajando son patgenos
(causantes de enfermedad).
Riesgo por agentes biolgicos
Este se produce por la inhalacin, ingestin o contacto directo
con la piel, mucosas y conjuntiva de los microorganismos.

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Riesgo por agentes qumicos
Este se produce por la ingestin, inhalacin y contacto directo de
la piel, mucosas y conjuntiva con sustancias txicas, corrosivas,
inflamablese irritantes.
Riesgo por agentes fsicos
Este
se
produce
radioactivas,
al
estar en
radiaciones,
contacto
exposicin
con
sustancias
ruidos,
fuego
electricidad.
Medidas mnimas de bioseguridad que deben ser aplicadas en el Laboratorio
de Microbiologa
1.
Uso obligatorio de guardapolvo o mandil blanco.
2. Si tiene el pelo largo, ste debe ser recogido.

3. No comer, fumar ni beber dentro del Laboratorio.
4. Tener absoluto cuidado del material y equipo, mantenindola limpia y
cumpliendo con las instrucciones del jefe de prcticas.

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5.
En
caso
de
derrame
de
material
contaminado, avisar inmediatamente al encargado.

6. Nuncausar la boca directamente para pipetear ni etiquetar o rotular los
envases.
7.
Cualquier accidente (rotura de tubos,

placas que contengan cultivos, as como heridas de las personas) debe
comunicar al tcnico de laboratorio para que tome las medidas necesarias.
8. Desechar el material contaminado en los recipientes adecuados.

9. Uso cuidadoso de los mecheros (guantes) para evitar quemaduras.
10. No amontonar material innecesario en la mesa de trabajo, sino tener lo
indispensable.
11. Prever una probeta que contenga solucin de fenol al 2 %, lugol o amonio
cuaternario para introducir las pipetas usadas.

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12. Debe dejarse las mesas de trabajo limpias y en orden y no botar basura a las
canaletas para evitar obstrucciones.
13. Cerrar el gas cada vez que no sea empleada as como las llaves de grifos y
lmparas.
14. Lavarse las manos con agua y jabn antes de retirarse del Laboratorio.
Control de la contaminacin dentro del Laboratorio
Es de la mayor importancia el evitar la contaminacin de las muestras, para as
obtener un buen diagnstico. Es necesario por lo tanto que el operador trabaje
haciendo uso de una buena tcnica asptica y usando material estril.
Esterilizacin
Proceso que elimina toda forma de vida. Elimina bacterias y sus formas de
resistencia, las esporas, elimina virus, y hongos.
Tcnica asptica
Tanto los medios de cultivo como las muestras debern manipularse con tcnica
asptica, que ser practicada en el laboratorio. Las tcnicas de siembra asptica y
de siembra de aislamiento tambin sern llevadas a la prctica.

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PRACTICA Nro. 1
RECONOCIMIENTO DE MATERIAL Y EQUIPO DE LABORATORIO
En el laboratorio de microbiologa se usa una infinidad de materiales y equipos
desde las ms simples hasta las ms sofisticadas, a continuacin se mostrarn y
conocern su uso especialmente en microbiologa.
1. Refrigeradoras y congeladoras.
Las
refrigeradoras
se
requieren
para
almacenar medios de cultivo, sueros, discos

de sensibilidad. El uso de las congeladoras
son para el almacenamiento prolongado de
sueros, enzimas, etc.
Deben localizarse lejos de los hornos de aire
caliente, de radiadores y de tuberas de agua
caliente.
2. Autoclave.
Hay de diversos modelos y marcas, estos pueden
funcionar a electricidad o a gas propano, cuya
temperatura de funcionamiento es de 121C por 15
Libras de presin durante 15 a 30 minutos. Se
fundamenta en la ebullicin del agua a una presin
superior al normal, elevando la presin atmosfrica as
como la temperatura,en consecuencia el vapor de
agua penetra por osmosis a la clula coagulando su
citoplasma, destruyndose las formas vegetativas y
esporuladas.
3. Equipo para filtraciones.
En la actualidad se usan tres tipos de filtros, para la esterilizacin por filtracin:

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Filtro de membrana.- Disco de elevada porosidad de esteres de celulosa (acetato de
celulosa), con variada gama de dimetro de poros, retienen en su superficie aquellas
partculas que sobrepasan un tamao dado. La retencin de partculas se efectuar
por medio de poros y no por atraccin o adsorcin electrosttica.
Filtro Seitz.- Discos formados por una mezcla de
amianto y celulosa. La retencin de bacterias se
hace por adsorcin y atraccin electrosttica.
Filtros de placa filtrante de vidrio.- Compuesto de
fragmentos de vidrio fundido formando un disco, y
que
suelen
utilizarse
para
volmenes
relativamente baratos y resultan tiles para volmenes grandes.

4. Centrifuga.
Son
aparatos
diseados
para
acelerar
la
separacin de particular slidas suspendidas en

lquidos. La velocidad a la cual sedimentar las
partculas en un lquido depende de varios
factores como; Tamao de partcula, viscosidad
del lquido, peso de la partcula y fuerza
gravitacional.
Existen centrfugas de los ms diversos tipos de acuerdo al uso al cual estn
destinados. Las velocidades que se obtienen son tambin variables, hay centrfugas
de mano, centrfugas que dan 1,500 rpm y otras de 3,000 a 5,000 rpm y otras son
ultra centrfugas que dan hasta 18,000 rpm.
Para trabajar con las centrfugas, se debe tener en cuenta las siguientes
recomendaciones:
-
Asegurarse de conocer el manejo de una centrifuga determinada antes de

utilizarla, seleccionando los tubos adecuados a su velocidad.
Cubrir los tubos a centrifugar con tapn de algodn (sujetado de tal forma que

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no vaya al fondo) o con papel de aluminio.
-
Contrapesar los tubos por centrifugar que van opuesto uno del otro.
Subir la velocidad de la centrifuga lentamente, una vez terminada la operacin

reducirla tambin lentamente.
5. Microscopio.
El tipo de microscopio ms utilizado es el microscopio
ptico, que se sirve de la luz visible para crear una imagen
aumentada
del
objeto.Algunos
microscopios
pticos
pueden aumentar un objeto por encima de las 2.000 veces.

El microscopio compuesto consiste en dos sistemas de
lentes, el objetivo y el ocular, montados en extremos
opuestos de un tubo cerrado. El objetivo est compuesto
de varias lentes que crean una imagen real aumentada del
objeto examinado. Las lentes de los microscopios estn
dispuestas de forma que el objetivo se encuentre en el punto focal del ocular.
Cuando se mira a travs del ocular se ve una imagen virtual aumentada de la
imagen real. El aumento total del microscopio depende de las distancias focales de
los dos sistemas de lentes.
6. Estereoscopio.
Tambin, llamado microscopio estereoscpico, utilizado en
el laboratorio de microbiologa para realizar observaciones
de la morfologa de las colonias en medios de cultivo en
placas petri, etc.
7. Estufa elctrica.

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Equipo empleado para el cultivo de las muestras clnicas, en medios de cultivo. La
temperatura de este equipo se grada de acuerdo al tipo de microorganismo que se
quiere aislar (psicrfilos, mesfilos y termfilos).
8. Horno elctrico.
Equipo elctrico cuyo funcionamiento es automtico
llegando a un mximo de 220C de temperatura por
un tiempo de 2 horas. Se usa para esterilizar material
resistente al calor seco como acero inoxidable, pirex,
etc.
9. Cuenta colonias.
Equipo elctrico, provista de una fuente de luz y
una lupa, con la finalidad de visualizar las colonias
pequeas presentes en la placa petri, de esta
manera efectuar un conteo ms exacto del
nmero de colonias.
10. Balanza de precisin.
Este equipo es til para el pesado de los medios
de cultivo en su preparacin, as como muestras
clnicas, alimento que sern sometidas a
anlisis y cuantificacin de grmenes por gramo
de muestra.
11. Jarras de anaeobiosis.

Este equipo sirve para proporcionar un ambiente carente de oxigeno y muchas
veces proporcionarle un determinado porcentaje de CO2, en el proceso de cultivo de
microorganismos anaerbicos o microaerfilos.

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12. Estuches
para
pipetas
placas petri.
Necesarios para someter a las pipetas y placas
al proceso de esterilizacin. Posterior a esta
mantenerlos estriles hasta el momento de su utilizacin.
Homogenizador.
Equipo
elctrico
vibraciones
que
enrgicas
homogenizado
del
a
se
travs
de
consigue
el
contenido
que
generalmente es liquido mezclado con

partculas grandes.
13. Equipo de siembra.
Existe una variedad de materiales y equipos de siembra como; trpode, malla de
asbesto, mechero bunzen, guantes de asbesto,asa de kolle, aguja de kolle, esptula
de Drigalky, teas,placas petri, gradillas, etc. Algunos de ellos se muestran en las
siguientes fotos.

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PRACTICA Nro2
ESTERILIZACIN Y DESINFECCIN DE MATERIAL DE LABORATORIO
Introduccin.
Los microorganismos como otros seres vivos, son susceptibles a los cambios
de condiciones ambientales y en la medida en que se han podido adaptar a estos
cambios, se han distribuido en una gran diversidad de hbitats incluyendo los de
condiciones extremas sobre todo de tipo fsico y qumico.
Se han desarrollado y aplicado diversos procesos de desinfeccin y
esterilizacin para limitar su presencia o eliminarlos. La esterilizacin es un mtodo
de eliminacin total de todo tipo de organismo y que asegura la ausencia absoluta
de cualquier forma viviente, mientras que la desinfeccin es un proceso que
solamente elimina formas vegetativas de los microorganismos.
ESTERILIZACION POR METODOS FISICOS.
CALOR SECO. Realizada en hornos, elimina bacterias y esporas por destruccin
oxidativa de los componentes celulares a temperaturas de 180 a 200C por 1
hora.
CALOR HUMEDO.
Ebullicin. El agua hirviendo a 100C por 10 minutos destruye todos los
microorganismos no esporulados.
Autoclave. El vapor a 15 Lbrs. De presin a una temperatura de 121C
elimina a las esporas en 15 minutos.
Pasteurizacin. En la pasteurizacin lenta, la temperatura alcanza los
63C y debe permanecer durante 30 minutos, y en la pasteurizacin
rpida la T debe alcanzar 72C durante 15 minutos, sobreviven alguna
bacterias en forma vegetativa que resisten al calentamiento.
FILTRACION.
Filtros. A travs de filtros de membrana, estos poseen varios grados de
porosidad, el dimetro de los poros oscila entre 0.22 a 0.10 m. se emplea
para la purificacin de medios a travs de la retencin de bacterias.
RADIACION. La luz solar directa destruye con bastante rapidez las formas
vegetativas de los microorganismos que carecen de proteccin. La accin
bactericida de la luz solar se debe a la banda ultravioleta del espectro.
LUZ ULTRAVIOLETA. Es utilizada en flujo laminar, quirfanos y otras zonas, con
el fin de disminuir las infecciones transmitidas a travs del aire.
ESTERILIZACION
POR
METODOS
QUIMICOS.
Pueden
utilizarse

PUNOpag.
como
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desinfectante muchas sustancias qumicas, dado que el nmero y la variedad de
productos es cada vez mayor, deben elegirse cuidadosamente las formulaciones de
acuerdo a las necesidades concretas.
La actividad germicida de muchas sustancias qumicas pueden ser modificadas u
optimizadas por factores externos como: La temperatura, pH, tiempo de la actividad,
naturaleza del microorganismo, presencia de material extrao, etc.
Objetivos.
1. Conocer los principios generales de las tcnicas de esterilizacin de
materiales de vidrio y medios de cultivo de uso comn en microbiologa.
2. Observar el efecto de asepsia en el control de la contaminacin
microbiana en el laboratorio.
Materiales de laboratorio por equipo

Materiales del equipo
6 cajas Petri con agar nutritivo (AN)
Limpiador de pisos Marcador indeleble
6 cajas de Petri con agar papa dextrosa
cloro
Cerillos
(PDA)
Hisopos estriles
Franela
Algodn
Colores
Actividad prctica
Prueba de esterilidad
1. Abrir una caja de Petri de cada medio durante 1 min. En el laboratorio o zonas
accesorias al mismo y se etiquetar aire
2. La segunda caja de cada medio de cultivo se abrir durante 30 seg. En el
rea asptica y se etiquetar rea asptica
3. Tercer caja se conservar sin abrir y se etiquetar control
Prueba de desinfeccin
1. Limpiar el rea de trabajo con el limpiador de pisos siguiendo las
instrucciones del fabricante.
2. Con el hisopo estril recorre toda el rea que limpiaste y posteriormente
siembra tu caja de Petri con el mismo hisopo.
Resultados

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o Hacer la descripcin morfolgica de las colonias obtenidas en las cajas con
diferentes medios de cultivo y con los distintos tratamientos en relacin a la
caja control.
o Reportar el crecimiento en forma cualitativa: sin crecimiento (-), poco
crecimiento (+), crecimiento regular (++), crecimiento abundante (+++).
o Discuta los resultados y determine si la esterilizacin en la autoclave y horno
fue adecuada, as como el manejo de materiales.
Cuestionario
1. Cules son los mtodos de esterilizacin ms utilizados en microbiologa?
2. en que tipo de materiales se aplica cada uno?
3. Explique cuales son los procesos de esterilizacin, desinfeccin y asepsia.

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PRACTICA Nro. 3
PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO
INTRODUCCIN
Los medios de cultivo son fuentes nutritivas, naturales o sintticas, que semejan el
nicho ecolgico de los microorganismos. Especies bacterianas diferentes,
cultivadas en el mismo tipo de medio, pueden aparecer diferentes, de este
modo el conocimiento de la apariencia o de las caractersticas culturales, de las
especies bacterianas, es til para el reconocimiento de cierto tipo de
bacterias.
FUNDAMENTO
Cada individuo tiene propio ambiente y forma de vida, y para cultivar o
hacer multiplicar a los microorganismos, se les somete a un ambiente parecido
donde haya alimentos, temperatura, pH, presin atmosfrica, y presin osmtica
adecuados.
TIPOS DE MEDIOS DE CULTIVO
1- Por su origen.
Naturales, medios a base de leche y papa.
Artificiales, siendo transformados por medios mecnicos o qumicos,
Ejm. Agar nutritivo, Agar McConkey.
2- Por su consistencia.
Lquidos, soluciones acuosas; Caldo nutritivo, caldo BHI.
Solidos el componente principal es el Agar-agar; el Agar nutritivo,
Agar sangre, Agar SS etc.
3 - Por su objetivo.

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a. Medios
de
transporte,
mantiene
microorganismos
viables
conservados; Cary Blair, Medio Stuard.

b. Medios de enriquecimiento. Multiplica bacterias antes de su siembra;
Caldo selenito, Caldo tetrathionato.
c. Medios de enriquecimiento mejorados. Constituidos por un medio
base, se aade sustancias ricas en protenas como el Agar sangre.
d. Medios de aislamiento.
Medios de aislamiento no selectivos Sirven para aislar o cultivar
bacterias, no contienen inhibidores; Agar nutritivo Agar BHI, y
mejorados como el Agar sangre.

Medios de aislamiento selectivos. Presentan el medio base, adems
llevan un substrato ms indicadores y de manera
especial
inhibidores; sales, colorantes, como el Agar EMB, ENDO, Manitol
salado, Agar verde brillante.

De aislamiento especifico. Son altamente enriquecidos; Lowestein
(Mycobacterium) y el agar Sabouraud (hongos y levaduras).

e. Medios diferenciales o bioqumicos. Son aquellos que llevan un
medio corriente, caldo o Agar nutritivo al que se le ha aadido un
substrato conocido, adems lleva indicador de pH, as tenemos el TSI,
SIM, LIA etc.
MATERIALES
-
Matraz de Erlynmeyer.
Probeta graduada.
Balanza de precisin.
Medios de cultivo deshidratado.
Mechero bunzen.
Agua destilada.
Potencimetro.
Autoclave.

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-
Estufa a 37C.
FORMAS DE PREPARACIN E INTERPRETACIN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

POCEDIMIENTO
1. Algunos se preparan pesando ingrediente por
ingrediente, otros medios vienen ya preparados,
para un litro.
2. No mezclar los medios con esptula sucias,
luego tapar hermticamente, para evitar su
deshidratacin.
3. Pesar en papel manteca que no exceda del tamao del platillo, y no
dejar partculas de medio en el papel.
4. Usar frascos bien lavados, preferiblemente secos, de tamao adecuado a la
cantidad de medio de cultivo.
1. Usar agua destilada o bi-destilada y probeta limpia.
5. Se disuelven los substratos calentando a temperatura de ebullicin, y
cuando est a 40C se le ajusta el pH de 7.2 a 7.4; para ajustar el pH, se usa
soluciones de NaOH y/o HCI.
6. Se tapona el frasco con algodn y papel craft con el nombre del medio,
fecha e iniciales del que lo prepar, se amarra sujetando el papel al
cuello del frasco.
2. Llevar a autoclave, lavado y limpio con agua destilada.

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7. Se esterilizan los medios de cultivo a 15
libras de presin,121C por 15 minutos.
10. Dejar que la presin y la temperatura bajen
solas; cuando estos estn a 45C se reparten
en placas o tubos.

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PRACTICA Nro. 4.
PLAQUEO Y ENTUBADO DE MEDIOS DE CULTIVO
Existen medios de cultivo slidos y lquidos, dependiendo de esta caracterstica se
pueden utilizar placas petri y/o tubos para la siembra respectiva:
PLAQUEO
El plaqueo consiste el reparto de los medios de cultivo especialmente de
consistencia slida, utilizando para este fin placas petri, para cumplir los
siguientes objetivos:
OBJETIVOS
Aislam#iento.- Para la siembra de muestras, con el objeto de conseguir

colonias aisladas, la siembra es por estras.
Contaje de colonias.- Para contar el nmero de colonias por ml., se
coloca en la placa 1 ml. De la muestra problema, luego 10 ml. De
medio de cultivo (TSA, BHI, Agar Mueller Hilton). La siembra se realiza por
difusin.
Bacteriofagotipaje o antibiograma.- Se reparte el medio de cultivo,

luego de endurar, la siembra se hace por diseminacin, resbalando el
cultivo bacteriano con la ayuda de la esptula de Drigalsky o un hisopo.
CONSIDERACIONES PREVIAS
Se debe tener el ambiente limpio y desinfectado, el material de vidrio
esterilizado y fri.
MATERIALES
-
Placas petri.
Tubos de ensayo.

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-
Frascos
Mecheros con gas.

-
Medios de cultivo esterilizado, licuados y a una temperatura entre 48 y 52C.
Matraz de Erlynmeyer.
Bao mara.
Lpiz de cera.
Estufa.
PROCEDIMIENTO
1. Colocar todo el equipo necesario sobre la mesa de trabajo.
2. Abrir las placas Petri, del estuche o quitando el hilo y papel.
3. Abrir el medio a repartir, y flamear un, ida y vuelta sobre la llama.
4. Con la mano izquierda coger la placa Petri, los dedos anular y meique van
por debajo de la placa, pulgar y medio cogen por el borde, el ndice toca la
superficie externa de la placa.
5. Abrir lentamente la placa hasta el ngulo de 45, mantenindola cerca de la
llama.
6. Con la mano derecha coger el frasco que
contiene
el
medio
de
cultivo,
agitar
suavemente rotando, flamear la boca del

frasco y verter dentro de la placa una
cantidad adecuada, ms o menos 12 ml.
6. Cerrar la placa y dejar sobre la mesa sin que el
medio toque la tapa.

PUNOpag.
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7. Proseguir con el resto del medio y placas, flameando con una, ida y
vuelta la boca del frasco.
8. Una vez acabado de repartir, se debe enjuagar con agua de cao, los
frascos.
10.Una vez enfriado y endurado los medios en las placas, se voltean y
rotulan con lpiz de cera.
11. Se deja en refrigeradora a 4C.
REPARTO DE LOS MEDIOS DE CULTIVO EN TUBOS.
-
Medios lquidos.
Conocido tambin como "Caldo", si el medio es corriente puede servir para
estudios de desarrollo bacteriano, turbidez, sedimento. Si el medio presenta un
substrato conocido, se estudiar metabolismo, ejemplo, en caldo peptonado
se estudiar la prueba del Indol.
Medios slidos.
Este tipo de medio es aquel que lleva 1.5 % de agar-agar, y los medios
pueden adoptar las siguientes formas:
En columna.- Cuando no se inclina, se siembra por picadura o puntura,
por lo general sirve para conservar cepas.
En plano inclinado.- Se reparte la quinta parte del tubo, ms o menos,
2 ml. De medio, luego se le inclina en una varilla, el medio debe estar
por debajo de la tapa de algodn a 2 cm. En este medio se puede
estudiar desarrollo bacteriano, si el medio lleva un substrato conocido
ms indicador, entonces se estudiar la bioqumica, ejemplo: Agar
rea, se estudiar el metabolismo de la rea; en el Citrato de simons, se
estudiar el desdoblamiento del Citrato.
En plano semi inclinado.- El medio se reparte en 1/4 1/3 del volumen

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del tubo, se semi-inclina, recostndolo sobre una tablita que tenga una
altura o ancho de 3 cm. Este medio se siembra en la superficie por estras
y por picadura en el fondo, generalmente son medios de diferenciacin,
sirve para el estudio bioqumico, Ejm. TSI, LIA.
-
Medios semi-slidos.
Este medio es aquel que lleva solo el 0.5% de Agar-agar, al mismo tiempo
contiene substratos conocidos para estudios bioqumicos, por ejemplo; el
medio fluido de Thioglicolato, sirve para el control de esterilidad de
substancias, puede usarse para mantener Cepas: el medio SIM sirve para
estudiar las siguientes pruebas bioqumicas; H2S, Indol y Motilidad.
Para repartir los medios de cultivo en tubos, sean lquidos o slidos, el medio
debe estar estril, bien homogenizado, licuado y a una temperatura de
45C, en la que el operador no sufra por el calor, los tubos deben estar
estriles y fros, la mesa de trabajo debe estar desinfectado, el operador
debe sentase cmodamente, colocando los tubos al lado izquierdo y el medio
a repartir al lado derecho.
PROCEDIMIENTO.
1. Se desatan los hilos de los paquetes de tubos y de la boca del frasco.
2. Se abre el frasco tomndolo con la mano derecha y con la izquierda se
destapa, y se deja el tapn de algodn dentro del papel del capuchn que la
mantena envuelto.
3. Se flamea 2 a 3 ida y vueltas, la boca del frasco y se mantiene en
posicin semi-inclinado este frasco cerca del mechero.
4. Con la mano izquierda se coge el tubo de la parte central, y se lleva
arriba a la altura del trax del operador, cerca del mechero, con el borde
del margen inferior de la mano derecha y entre el dedo meique, y
anular se retira el tapn del tubo. Debe rotarse el tubo y tapn para mantener
estable el tapn.

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5. Se flamea el tubo y se lleva cerca del pico del frasco.
6. Se vierte una cantidad adecuada de medio de cultivo, en forma lenta.
7. Luego se flamea el tubo, se vuelve a taponar y se deja en una gradilla o se
inclina sobre un soporte en la mesa de trabajo.
8. Se contina de idntica manera.
9. Si sobra medio de cultivo en el frasco se flamea la boca, y se tapona, se
coloca el papel rotulado, se amarra el
hilo y se deja en la
refrigeradora.
10. Si se acab el medio de cultivo, se debe enjuagar el frasco antes que se
enfre, para evitar que el medio se enfri dentro del recipiente.
11. Se rotula los tubos, se colocan en una misma gradilla y se dejan en la
refrigeradora.
La siembra debe hacerse cuando el medio de cultivo est bien duro, esto en el caso
de medios slidos.

PUNOpag.
24
Lab. Microbiologa
Oscar D. Ors B.
Gua Prctica de Bacteriologa

PRACTICA Nro. 4
MTODOS DE SIEMBRA Y AISLAMIENTODE MICROORGANISMOS.

SIEMBRA.- Es el procedimiento que consiste en acondicionar el microorganismo en un
medio de cultivo frtil, de acuerdo a sus exigencias vitales, para que en condiciones ptimas de
temperatura y tiempo de incubacin pueda desarrollar y multiplicarse IN VITRO.
Todo aislamiento implica el agotamiento de una muestra sobre la superficie de un medio slido.
OBJETIVOS
Conocer los mtodos de siembra tiene los siguientes objetivos:
Realizar un correcto aislamiento de colonias.
Hacer un transplante de microorganismos.
Conocer la tcnica de siembra para recuento demicroorganismos.
IMPORTANCIA
En el aislamiento permite la separacin de losmicroorganismos al estado de pureza a
partir de unamuestra problema, y generar su progenie (cepa).
Si
se
aslan
especies
distintas,
cada
colonia
tendrcaracteres especiales
necesarios para la identificacinde un determinado microorganismo.

Se realiza trasplante con la finalidad de mantener en lafase exponencial una cepa
determinada.
El transplante en medios de cultivo especiales se lograconocer sus caractersticas
bioqumicas.
Una correcta siembra para recuento permite obtenerresultados reales.
Facultad De Medicina Veterinaria y Zootecnia UNA PUNO pag.
Lab. Microbiologa
Oscar D. Ors B.
MATERIALES
-
Estufa de incubacin.
Tubo de ensayo.
Esptula de Drigalsky.
Asa de Kolle.
Pipeta graduada de 5 - 10 ml.
Mortero.
Gradilla y canastillas.
Matraz de Erlyn Meyer.
Mechero bunzen.
Probeta graduada de 100 ml.
Placas petri, con medios de cultivo.
Cepas.
METODOLOGA
A. SIEMBRAS DIRECTAS:
1. Siembra por estra.
Poseer la muestra, tomada ya sea con
hisopo o torunda,aguja hipodrmica o
de kolle.
La muestra tomada se toca la
superficie
depositado
del
en
medio
la
decultivo
placa
petri,
colocndola en unextremo del medio.
un
asa
Lab. Microbiologa
Oscar D. Ors B.
Con un asa de siembra estril, se da inicio a la siembra, apartir de donde se deposit la

muestra, produciendo lneassigzageantes.
Concluida la siembra, cerrar la placa y dejarla sobre la mesacon la base hacia arriba.
Etiquetar la placa, y dejarla en la estufa a 37C por 24 a 48horas
Realizar este procedimiento con asepsia cerca del mecherobunzen.
B.
SIEBRA A PARTIR DE DILUCIONES SERIADAS. PREPARACIN Y DILUCIN DE LA MUESTRA.
Las siembras a partir de diluciones seriadas es un mtodo por agotamiento y se realiza con la finalidad de
cuantificar el nmero de colonias por una cantidad de muestra determinada Ejm. El Nmero ms Probable
de Coliformes, cuantificar mesfilos viables, etc.
En un mortero estril pesar un gramo de muestra, adicionar 9 ml. De agua peptonada
para obtener la dilucin 1 : 10 ml.
Pipetear 1 ml. De la dilucin anterior y trasvasarlo a otro tubode ensayo que contenga 9
ml de agua peptonada. Proseguirhasta obtener la dilucin 1 :1000000.
2. Siembra por diseminacin.
Mtodo de siembra mayormente usado para
el
Recuento total de mesfilos viables. El

resultado de dicha siembra presenta un
crecimiento de las colonias sobre la superficie
de
medio de cultivo en forma diseminada, no

siguiendo una lnea de siembra como en el
caso de la siembra por estras.
Obtener el inoculo preferentemente de
muestras lquidas oa partir de diluciones de muestras.
A adi r a cada pla ca 15 ml . de aga r para recu ento y enfriarlos a 45 a60C y dejar
solidificar.
Utilizando una nica pipeta, tomar O.1ml. de cada una dela diluciones, y depositarlo
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Oscar D. Ors B.
en la superficie del agar.Comenzar por la dilucin ms baja, llenando y vaciando

lapipeta 3 veces antes de transferir 0.1 ml.a la placa.
Extender las muestras de 0.1 ml. pronto despus dedepositarlas sobre la superficie
del agar con la ayuda de laesptula de Drigalsky, dejar secar la superficie del
agardurante 15 minutos.
Incubar las placas invertidas por dos das a 37 C.
Contar las colonias en las placas que presenten entre30 y 300 colonias.
3.
Siembra por difusin.

A diferencia de la siembra por diseminacin, en esta en el que el procedimiento es fundir el
medio de cultivo con el inculo o la muestra diluida, el crecimiento de las colonias adems de
observarse en la superficie del medio, hay crecimiento en el fondo as como en el medio del agar.
Pipetear en placas petri 1 ml. De las diluciones efectuadasen el punto B.
Inmediatamente verter en las placas inoculadas 10 a 15ml. De agar Estndar fundido y
templado a 45C.
Mezclar el inoculo de siembra con el medio de cultivo
Una vez solidificado el agar invertir las placas eincubarlas a 35 C durante 24 a 48 horas.
Utilizando
colonias,
el
y
contador
el
de
dispositivo
deregistro automtico, contar todas

colonias
en
las
placasque
presenten 30-300 colonias
las
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PRCTICANro5
SENSIBILIDAD BACTERIANA
INTRODUCCION.
El aislamiento de un agente infeccioso a partir de un paciente no es con frecuencia suficiente para
establecer la terapia adecuada. Muchas bacterias y algunos hongos presentan resistencia a los
agentes antimicrobianos y algunos virus han desarrollado resistencia a los agentes antivirales
ms actuales. Los patrones de resistencia cambian en forma constante y no importa lo
rpidamente que se introduzcan los nuevos agentes teraputicos porque los microbios parecen
siempre dispuestos a superarlos.
Ya que no se puede predecir la susceptibilidad de las bacterias, hongos y virus a los agentes
antimicrobianos, con frecuencia es necesario estudiar la sensibilidad individual de cada patgeno
a estas drogas, pudindose elegir entonces el agente apropiado (el ms activo contra el
patgeno, el menos txico para el husped, con las caractersticas farmacolgicas apropiadas y el
ms econmico), que proporciona mayores posibilidades de una evolucin favorable.
Un concepto importante sobre el que es necesario insistir es que no se pueden realizar pruebas
de sensibilidad in vitro con cultivos mixtos, slo los cultivos puros proporcionarn resultados
vlidos sobre la eficacia de un antibitico.
OBJETIVOS.
Medir la sensibilidad de una cepa bacteriana que se sospecha es la responsable de una
infeccin a uno o varios antibiticos.
Seguir la evolucin de las resistencias bacterianas. Gracias a este seguimiento
epidemiolgico, a escala de un servicio, un centro de atencin mdica, una regin o un
pas puede adoptar medidas de control.
FUNDAMENTO.
Las primeras pruebas se realizaron inoculando la superficie de una placa de agar con el
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microorganismo en estudio, colocando pequeas cubetas (de metal o vidrio) sobre el agar y
agregando las soluciones de los diferentes antimicrobianos dentro de dichas cubetas. Los agentes
antimicrobianos difundan en el medio en forma radial alrededor de la cubeta e inhiban el
desarrollo del microorganismo en la zona donde su
concentracin era suficientemente alta. Las reas de
inhibicin grandes indicaban una actividad antimicrobiana
ms
efectiva.
MATERIALES
-
Cultivo de bacterias de 24 horas de crecimiento.
Agua destilada estril.
Tubos de ensayo.
Asa de kolle, y esptula de drigalsky.
Pipetas graduadas.
Mechero bunzen.
Estufa elctrica a25C.
Placas petri con medio Mueller-Hinton.
PROCEDIMIENTO.
El microorganismo a investigar se inocula cepas recientemente incubadas y previamente
diluidas en agua destilada.en una o varias placas de agar.
Sobre su superficie se disponen los discos correspondientes a varios antibiticos.
Se incuban las placas durante 16-24 horas a 35C y al cabo de este tiempo se estudia el
crecimiento en ellas.
Se valora el dimetro de la zona de inhibicin que se forma alrededor de cada disco y se
compara con las referencias publicadas por el NCCLS.
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Con esta referencia podemos informar si el microorganismo es Sensible, Intermedio o

Resistente (S, I, R) a cada uno de los antibiticos ensayados en las placas.
En la imagen de la izquierda se muestra una vista general de una placa con crecimiento
bacteriano y con seis discos de antibiticos. La zona de color claro que ocupa la mayor parte de la
placa es el crecimiento bacteriano en las zonas no inhibidas. Los crculos negros que rodean a
cinco de los seis discos marcan las zonas en que los respectivos antibiticos han inhibido, con
mayor o menor eficacia, el crecimiento del microorganismo a estudio. El sexto disco (AM-10) no
tiene a su alrededor halo de inhibicin lo que indica la resistencia del microorganismo a ese
antibitico.
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PRACTICA Nro.6
TINCIN GRAM
INTRODUCCIN
La observacin de las bacterias fijadas sobre una lmina portaobjetos debe hacerse
mediante el empleo de tinciones. El tamao de la mayora de las clulas bacterianas es tal que
resultan difciles de ver con el microscopio ptico. La principal dificultad es la falta de
contraste entre la clula y el medio que la rodea. El modo ms simple de aumentar el contraste
es la utilizacin de colorantes,uno muy usado en microbiologa es la tincin Gram.
Esta tincin fue desarrollada empricamente por Christian Gram en 1884. A pesar del tiempo
transcurrido, la tincin apenas se ha modificado y es uno de los primeros pasos que se
realiza para cualquier identificacin bacteriana. La tcnica es capaz de diferenciar dos grandes
grupos de eubacterias: Gram positivas (G+) y Gram negativas (G-).
Esta tincin tiene gran importancia en taxonoma bacteriana ya que indica diferencias
fundamentales de la pared celular de las distintas bacterias.
Mientras que las bacterias gram-negativas son constantes en su reaccin, los microorganismos
gram-positivos pueden presentar respuestas variables en ciertas condiciones (son gramlbiles). Por ejemplo, los cultivos viejos de algunas bacterias gram-positivas pierden la
propiedad de retener el cristal violeta, y en consecuencia, se tien por la safranina
apareciendo como gram-negativas. Anlogo efecto se produce en ocasiones por cambio en el
medio del organismo, o por ligeras modificaciones en la ejecucin de la tcnica.
Para explicar el mecanismo de la tincin de Gram se han propuesto varias hiptesis
fundadas en la naturaleza qumica de las paredes celulares de los microorganismos.Diferencias
estructurales y qumicas de los dos tipos de pared bacteriana:
OBJETIVOS:
Iniciacin en las tcnicas del estudio de microorganismos: cultivo,tincin y morfologa.
Entrenamiento en preparacin de extendidos y realizacin decoloraciones.
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Observacin microscpica de morfologa y agrupamientosbacterianos.

MATERIAL NECESARIO:
Cultivo de bacterias.
Cristal violeta (1 g. de cristal violeta en 100 ce de agua destilada).
Lugol (1 g. de yodo en 2 g. de yoduro potsico en 100 cc de agua destilada).
Safranina (1 g. de safranina en 100 cc
de
agua destilada).
Aceite de inmersin.
Microscopio binocular.
Portaobjetos.
Asas de cultivo.
Mechero.
Placas de Petri,
TCNICAS DE FROTIS Y TINCIN GRAM.
Para
ello
se
debe
limpiar
un
portaobjeto con alcohol se evapora este

pasndolo rpidamente por el mechero, se
deja enfriar y se marca con un lpiz la parte que vamos a tomar.
PREPARACIN DEL FROTIS:
El frotis tiene como finalidad una delgada pelcula del preparado para una adecuada
tincin y observacin microscpica. La preparacin de un frotis se hace de la siguiente manera:
EXTENSIN:
Se coloca una gota de agua destilada en el centro del porta y enseguida se esteriliza un
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asa de argolla colocndola directamente en el mechero y se toma unpoco del material

biolgico a examinar. Se emulsiona la pequea cantidad de bacteria con la gota de agua
delporta, luego, se incinera el asa en el mechero.
SECADO:
Pasamos el porta por la parte mas alta del mechero (flamear) hasta que la gota con
bacterias quede seca (se hace sin que el porta se queme ya que puede carbonizar las clulas),
hasta que obtenemos una marca de una gota con material biolgico en el porta.
Fundamento
Se usa primero el cristal violeta (violeta genciana) el que penetra la pared celular tanto de
bacterias gram-positivas como gram-negativas. A continuacin se agrega el lugol (yodo +
yoduro), que acta como mordiente formando un complejo con el cristal violeta. Al decolorar con
una mezcla de alcohol y acetona, la pared de los gram-positivos formada por una gruesa capa
de peptidoglicano impide la salida del complejo cristal violeta-lugol, mantenindose la coloracin
violeta. En los gram-negativos por el contrario el complejo cristal violeta-lugol sale por los poros
que ha generado el alcohol-acetona en la membrana externa de la pared celular. La bacteria por
lo tanto se decolora y al agregar la safranina se tie de rojo.
PROCEDIMIENTO DE LA TINCIN GRAM
1. Rotular convenientemente cada uno de los portaobjetos.
2. Preparar extendidos de los microorganismos indicados por el docente.
1. Tomar material de la colonia elegida, con un asa previamente esterilizada a la llama y
suspender este material en una gota de agua colocada en lamitad del portaobjetos.
Extender el material sobre toda la superficie delportaobjeto.
3. Dejar secar al aire junto a la llama del mechero.
2. Se cubre completamente el frotis con una solucin de "cristal violeta", yse deja actuar
durante 60 segundos.
Lab. Microbiologa
Oscar D. Ors B.
3. Lavar con abundante agua destilada.

4. Agregar una solucin de "lugol" y dejar actuar
durante 30 segundos.
4. Decolorar el frotis obtenido colocndole
sobre este alcohol acetonadejando actuar
durante 10 a 20 segundos.
5. Cubrir el frotis con gotas de una solucin llamada "safranina", dejndola actuar durante
30 segundos.
7. Lavar con abundante agua destilada nuevamente.
8. Observar al microscopio con el objetivo de 100X
Secar el preparado colocando el porta objeto en papel absorbente, y si queda mucha agua se
puede flamear suavemente sin que se quemen las
muestras, y se observa bajo inmersin.
A la observacin en el microscopio binocular de
investigacin, esta se presenta como en la lmina
abajo
expuesta,
donde
se
observa
microorganismos bacilos gram-positivos teidos

azul, y los bacilos gram-negativos teidos de color
fucsia.
de
Lab. Microbiologa
Oscar D. Ors B.

PRACTICA Nro. 7
TINCIN DE ZIEHL-NEELSEN (acido resistente)

Tiene una enorme importancia en microbiologa puesto que permite poner en evidencia la
presencia de bacilos cido-alcohol resistentes (BAAR) tales como el Mycobacterium
tuberculosis, agente causal de la tuberculosis. Tambin puede ser usada para detectar la
presencia de Cryptosporidium en deposiciones.
Fundamento
El colorante que se usa en esta tincin, la fucsina forma un complejo con los cidos miclicos
de la pared celular de las Mycobacterias. Este complejo resiste la decoloracin con alcoholcido clorhdrico permaneciendo de color fucsia, en cambio las otras bacterias pierden la
coloracin. Al usarse el azul de metileno como colorante de contraste stas se coloran de azul.
INSTRUCCIONES:
1. Preparar extendidos de los microorganismos a estudiar.
2. Fijar con calor.
3. Cubrir todo el porta con fucsina bsica fenolada (carbolfucsina)
4. Calentar hasta emisin de vapores y seguir dicho calentamiento durante 2 minutos
ms. Si se seca alguna parte del porta
objeto, agregar el colorante sobre el
preexistente y no sobre la parte seca,
hasta cubrirlo nuevamente.
5. Lavar con agua.
6. Decolorar con alcohol-cido hasta que no
se
desprenda ms colorante.
7. Lavar con agua.
8. Cubrir el extendido con azul de metileno. Dejar en contacto durante 30 segundos.
Lab. Microbiologa
Oscar D. Ors B.
9. Lavar con agua. Secar.

10. Observar con objetivo de inmersin.
A la observacin en el microscopio se
observa teido de color azul todas las
clulas que corresponden a tejido epitelial,
si
la muestra procede de esputo. Pero el

bacilo acido resistente se presenta de un
color
fucsia,
manteniendo
el
colorante
primario, tal como se muestra en la

siguiente lmina.
PREPARACION DE COLORANTES:
Solucin de Ziehl (Fucsina fenicada)
1. Fucsina bsica
Alcohol etlico
2. Fenol
Agua destilada
0.3 g
10 ml.
5g
95 ml.
Mezclar soluciones 1 y 2.
Alcohol cido
HCI (densidad 1.19)
3 ml.
Alcohol etlico
97 ml.
Solucin de azul de metileno

Azul de metileno
1.4 g
Agua destilada
100 ml.
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PRACTICA Nro. 8
COLORACIN DE ESPORAS, TINCIN NEGATIVA

Coloracin de esporas
OBJETIVO:
Esta tcnica permite distinguir las esporas, del cuerpo vegetativo del microorganismo, como as
tambin ver su localizacin y forma.
INSTRUCCIONES:
1. Prepare un extendido del microorganismo.
2. Fijar por calor y cubrir todo el portaobjeto con una solucin de Verde de malaquita.
3. Calentar hasta emisin de vapores y seguir dicho calentamiento durante 3 minutos
(no permitir que se seque el colorante. Si esto ocurriera, agregar colorante, sobre el
preexistente y no sobre la parte seca, hasta cubrirlonuevamente.)
4. Lavar con agua y cubrir con solucin de Safranina.Dejar actuar 30 segundos.
5. Lavar con agua, secar y observar con
objetivo de inmersin.
6. lnformar: morfologa, color y tipo de
espora.
Solucin de Verde de Malaquita.
Verde de Malaquita al 5 % en agua destilada.
Solucin de Safranina
Safranina 0.5 g. en agua destilada.
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Oscar D. Ors B.
Tincin negativa
Es un mtodo de coloracin sencillo, se puede emplear para un frotis directo de la muestra clnica
en caso de no contar con la batera de coloracin Gram esto puede evidenciar solo si se trata de
cocos o bacilos. Tambin se puede emplear para la prueba de motilidad en porta objetos.
INSTRUCCIONES
1. Colocar una pequea gota de tinta china en la parte central del portaobjetos.
2. Utilizando el asa de kolle, colocar una gota de la suspensin de microorganismos sobre la
tinta china.
3. Colocar sobre el preparado un cubreobjeto para que se forme un film (tinta- cultivo).
4. Observar con objetivo de inmersin.
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Oscar D. Ors B.

PRACTICA Nro. 9
RECUENTO TOTAL DE BACTERIAS AEROBIAS MESOFILAS.

Recuento Estndar en Placa (REP): tambin conocido como recuento de aerobios
mesfilos, es el anlisis directo mayormente empleado para determinar la calidad
microbiolgica de la leche y otros alimentos.
OBJETIVOS
El objetivo de realizar este anlisis es conocer el " nmero de microorganismos
aerobios mesfilos que contiene un alimento.
Conocer el grado de contaminacin bacteriana, siendo indicador de la posible
presencias de microorganismos patgenos
Se aplica a todos los alimentos con excepcin de los productos fermentados o
madurados tales como queso, ciertos tipos de embutidos, yogurt, etc.
IMPORTANCIA
Los resultados de este anlisis permiten verificar la efectividad de los procedimientos de
limpieza y desinfeccin.
Determinar si las temperaturas aplicadas en los procesos fueron las adecuadas.
Determinar el origen de la contaminacin durante los procesos de elaboracin de
los alimentos. Verificar condiciones ptimas de almacenamiento y transporte.
Obtener informacin acerca de la vida til de los alimentos.
MATERIALES
-
Autoclave.
Balanza de precisin.
Lab. Microbiologa
Oscar D. Ors B.
Mechero Bunzen.
Asa de kolle.
Esptula de Drigalsky
Mortero y pistilo.
Gradilla y canastillas
Cuenta colonia.
Tubos de ensayo.
Placas petri.
Medio de cultivo.
METODOLOGA
A. PREPARACIN Y DILUCIN DE LA MUESTRA.
En un mortero estril pesar un gramo de muestra, adicionar 9ml. De agua peptonada para
obtener la dilucin 1 : 10 ml.
Pipetear 1 ml. De la dilucin anterior y trasvasarlo a otro tubode ensayo que contenga 9 ml. de
agua peptonada. Proseguir hasta obtener la dilucin 1 : 1000000
B. SIEMBRA.
1. MTODO STANDARD DE RECUENTO EN PLACA POR SIEMBRA EN PROFUNDIDAD.
Pipetear en placas petri 1 ml. De las diluciones efectuadas en el punto A.
Lab. Microbiologa
Oscar D. Ors B.
Inmediatamente verter en las placas inoculadas 10 a 15 ml. De agar Estndar fundido y templado
a 45C.
Mezclar el inoculo de siembra con el medio de cultivo
Una vez solidificado el agar invertir las placas e incubarlas a 35 C durante 24 a 48 horas.
Utilizando el contador de colonias, y el dispositivo de registro automtico, contar todas las
colonias en las placas que presenten 30-300 colonias.
2.
MTODO
DE
RECUENTO
EN
PLACA DE
SIEMBRA POR EXTENSIN EN
SUPERFICIE.
Aadir a cada placa 15 ml de agar para recuento y enfriarlos a 45 a 60C y dejar
solidificar.
Utilizando una nica pipeta, tomar 0.1 ml. de cada una de la diluciones a ensayar, y
depositarlo en la superficie del agar (2placas por dilucin). Comenzar por la dilucin
ms baja, llenando y vaciando la pipeta 3 veces antes de transferir 0.1 ml a la placa.
Extender las alcuotas de 0.1 ml. pronto despus de depositarlas sobre la superficie del
agar (esptula de Drigalsky), dejar secar la superficie del agar durante 15minutos.
Incubar las placas invertidas por tres das a 35 C .
Contar todas las colonias en las placas que presenten entre 30 y 300 colonias.
Lab. Microbiologa
Oscar D. Ors B.
PR ACTIC A Nro10
RECUENTO DE COLIFORMES: DETERMINACIN DEL NUMERO MAS PROBABLE (NMP).

El empleo de coliformes como indicadores de organismos patgenos en el agua es una
prctica vigente en la actualidad. Las bacterias Coliformes, comprenden la E. Coli y Enterobacter

aerogenes. Ambos organismos son bacilos cortos, gram-negativos que fermentan la lactosa con
produccin gas. E. Coli tiene su localizacin primaria en el tracto intestinal del hombre y de los
animales, y de all su nombre "Coli", que deriva del colon. E. Coli se encuentra normalmente en
el tracto gastrointestinal de los animales, donde no suele causar enfermedad.
Los organismos coliformes son buenos indicadores de la calidad higinica de los
alimentos, se basa en la experiencia positiva adquirida en el agua. El hallazgo de gran nmero

de organismos en los alimentos y en el agua indica la polucin o contaminacin fecal. Ya que
las enfermedades transmitidas por el agua generalmente son de carcter intestinal, la presencia
de polucin indica la posibilidad de que existan agentes etiolgicos productores de
enfermedades gastrointestinales.
-
OBJETIVOS
Estimar el nmero de microorganismos (coliformes) presentes en muestras de alimentos

lquidos o el agua.
Conocer la metodologa del NMP coliformes como, indicador de contaminacin de los
diferentes alimentos.
Determinar la presencia de coliformes, procesando tres diluciones proporcionales seriadas,
sembradas en 9 tubos con el medio adecuado para comparar con la tabla estndar.
-
IMPORTANCIA
Los resultados de este anlisis permiten:
Revelar el ndice de contaminacin fecal, proveniente de heces del hombre y animales

de sangre caliente.
Conocer que la presencia de coliformes es indicador de que pueda existir la presencia de
Lab. Microbiologa
Oscar D. Ors B.
patgenos como salmonelas y E.coli enterotixignica.

Determinar el origen de la contaminacin durante los procesos de elaboracin de los alimentos.
-
MATERIALES
Autoclave.
Balanza analtica.
Mechero Bunzen.
Asa de colle.
Campanas Durham.
Tubos de ensayo.
Placas petri.
Medios de cultivo.
METODOLOGA
1. Preparar las muestras de alimento hasta la obtencin de las diluciones.
2. Pipetear 1 ml. De cada uno de las diluciones del homogenizado del alimento en tubos
con medio de cultivo (tres tubos por dilucin).
Lab. Microbiologa
Oscar D. Ors B.
3. Incubar los tubos a 35C durante 24 a 48 horas.

4. Pasadas las 24 horas, anotar los tubos que muestren produccin de gas. Volver a la
estufa los tubos gas negativos para su incubacindurante 24 horas ms.
5.
Pasadas las 48 horas, anotar los

tubos que muestren produccin de
gas.
6. Elegir la dilucin ms alta (positivos a gas), los tres tubos y las dos diluciones superiores
ms prximas. Si no fuese factible seleccionarlas tres ltimas diluciones y anotar el
nmero de tubos positivos encada una.
7. Confirmar que los tubos inoculados y seleccionados, sean positivos a coliformes,
transfiriendo un asa de cada tubo a aplacas de agar eosina azul de metileno (EMB),
ENDO o McConkey, observar colonias tpicas de coliformes despus de 24 a 48 horas
de incubacin a 37C.
-
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Oscar D. Ors B.
8. Para obtener el NMP, ver en cada una de las tres diluciones seleccionadas el
nmero de tubos en los que se confirmo la presencia de coliformes. Buscar en la tabla del
NMP.
Para
obtener el Nmero Ms Probable (NMP); Ver en cada una

de las 3 diluciones seleccionadas, el nmero de tubos en los que se determin la presencia de coniformes previa
confirmacin. Buscar en la tabla del NMP y anotar el NMP que corresponda al nmero de tubos positivos de cada
dilucin. As si como ejemplo tenemos una lectura 3, 1, 0, la tabla indica que este resultado significa un NMP de 43/100
ml.
-
Para obtener el NMP de coniformes por gramo de alimento se utiliza la siguiente formula:
Lab. Microbiologa
Oscar D. Ors B.
NMP de la tabla X El factor de dilucin intermedio = NMP/ g.
100
Si el factor de dilucin intermedio empleado para la prueba es; 1 : 100, 1 : 1000, y 1: 10000
Entonces se reemplaza la formula de la siguiente manera:

43
X 1,000 = 430 coliformes por gramo
- 100
TABL A NMP
Indice del NMP y lmites de confianza 95% para varias combinaciones de resultados
positivos y negativos cuando se utilizan tres alcuotas de 10 ml., tres de 1 ml., y otras tres de 0,1
ml.
-
Nmero de tubos positivos del total de: Indice -del

NMP por 100 ml.
3
10 ml.
-
tubos;
3
1 ml.
0
0
1
1
1
1
1
2
2
2
2
2
2
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
-
tubos;
0.1
0
1
0
0
1
1
2
0
0
1
1
2
2
0
0
0
1
1
1
2
2
2
3
3
3
3 tubos;
ml.
1
0
0
1
0
1
0
0
1
0
1
0
1
0
1
2
0
1
2
0
1
2
0
1
2
-
Limites de confianza 95%

Inferior -
3
3
4
7
7
11
11
9
14
15
20
21
28
23
39
64
43
75
120
93
150
210
240
460
1100
0.5
0.5
0.5
1
1
3
3
1
3
3
7
4
10
4
7
15
7
14
30
15
30
35
36
71
150
Superior
-
9
13
20
21
23
36
36
36
37
44
89
47
150
120
130
380
210
230
380
380
440
470
1300
2400
4800
Lab. Microbiologa
Oscar D. Ors B.
-
Fuente: F.S. Thatcher y D.S. Clark 1972
Lab. Microbiologa
Oscar D. Ors B.

PR ACTIC A Nro 11
IDENTIFICACIN DE COCOS GRAM POSITIVOS.
Normalmente se encuentran Staphylococcus patgenos en procesos pyogenos, en
todas las especies animales y en pjaros. Ellos son frecuentemente aislados de

septicemias en animales, as como de los casos de artritis y mastitis. Normalmente se
encuentran patgenos en las superficies de la piel y en la nariz de personas sanas y algunas
especies animales.
-
Cultivo
Los estafilococos patgenas crecen eficazmente bajo condiciones aerbicas en la mayora
de los medios bacteriolgicos usuales de extracto de carne y peptona, pero lo hacen de manera
mas profusa en agar sangre que se usa por lo comn para aislar formas. Estos crecen
rpidamente a 37C pero tienden a formar pigmentos mejor a temperatura ambiente (20C).
Las colonias en medio slido son redondeadas, uniformes, sobresalientes y resplandecientes.
Pueden formar varios tipos de pigmentos: Staphylococcusaureuspresenta un color amarillo oro
intenso; S epidermis es de color blanco porcelana; tambin pueden observarse coloraciones
intermedias. Muchas colonias desarrollan pigmentos solo despus de una prolongada
incubacin a 20C.
-
En general las cepas recin aisladas de S. aeureusson las masexigentes en sus
necesidades alimenticias; los viejos cultivos de laboratorio y S. epidermis lo son menos.

-
EL AISLAMIENTO E IDENTIFICACIN DE ESTREPTOCOCOS Los estreptococos son
uno de los grupos ms importantes de organismos que son patgenos para los animales y
hombre. Las especies domsticas padecen de estreptococosis que varia desde lesiones
supurativas localizadas, mastitis, meningitis, artritis y septicemias. Ellos tambin pueden aislarse
de la nariz, garganta, piel y cavidad bucal de animales sanos.
-
EL AISLAMIENTO
El cultivo de muestras provenientes de lesiones supurativas locales, o del hgado, bazo,
glndula linftica, rin, fluido cerebro-espinal y sangre ascomo en condiciones del

septicemia, en agar sangre y agar MacConkey. Tambin es aconsejable inocular en caldo de
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Oscar D. Ors B.
suero o caldo de Todd-Hewittal mismo tiempo. Se incuba a 37C. La incubacin anaerobio

mejora actividad hemoltica.
-
IDENTIFICACIN
Las caractersticas culturales En agar sangre de oveja forman las colonias pequeas,
elevadas, semi-translcidas despus de 24 horas. Ellos pueden ser alfa hemolticas o beta,
cultivos recientes puede ser los mucoides si los cocos presentan una cpsula.
-
Caractersticas bioqumicas que Ellos son los llamados catalasa-negativos y
oxidasa-negativo. Ellos fermentan los azcares pero no producen gas.

-
OBJETIVOS
Describir las caractersticas microscpicas culturales y bioqumicasque permiten ejecutar el

aislamiento y la diferenciacin entreStaphylococcusaureus y los estafilococos coagulasa
negativa.
Seleccionar los medios de cultivo empleados para llevar a cabo ladeteccin de los
estafilococos.
Elegir, leer e interpretar las pruebas que permiten identificar a losestafilococos.
Describir los fundamentos, tcnicas y limitaciones de lasmetodologas asociadas a la
deteccin de los estafilococos en lasmuestras clnicas.
-
IMPORTANCIA
Los resultados de este anlisis permiten identificar al agente causal de la enfermedad materia de
anlisis de laboratorio.
-
MATERIALES
Autoclave.
Balanza analtica.
Lab. Microbiologa
Oscar D. Ors B.
-
Mechero Bunzen.
Asa de colle.
Pipeta graduada de 5 - 10 mi
Matraz de ErlynMeyer.
Campanas Durham.
Probeta graduada de 100 mi.
Placas petri.
Medios de cultivo.
Muestras clnicas.
Batera de coloracin Gram
METODOLOGA
1. Ponga a alcance los materiales y muestras junto al mechero.

2. Prepare la muestra a sembrar con estricta asepsia.
3. Tome un hisopo o asa de kolle
4. Retire todo tipo de proteccin de las muestras obtenidas.
5. Con el mechero de Bunsen encendido y respetando el margen deesterilidad inocule con el
hisopo o asa el material, en una placa con agarsangre y agar S110, empleando la tcnica de
estriacin.
6. Queme su hisopo para que no sea nuevamente utilizado
Lab. Microbiologa
Oscar D. Ors B.
7. Incube a 37Cdurante 24 horas.

8. Transcurrido las 24 horas, saque las cajas de la incubadora y encienda elmechero, para
realizar el repique correspondiente en agar sangre.
9. Haga un frotis de las colonias que crecieron
en
el agar sangre
10. Tina con la tcnica de Gram
11. Observe con aceite de inmersin el frotis
12. De acuerdo a lo observado en cada uno
los
frotis
realice
de
las
pruebascorrespondientes.
-
PRUEBAS BIOQUMICAS USADAS EN LA IDENTIFICACIN DECOCCEAS
Catalasa
Este test busca la presencia de la enzima catalasa
que desdobla el aguaoxigenada en agua + oxgeno.Esta

enzima la poseen los Staphylococcus, Micrococcusy
Listeria. Noposeen catalasa los Streptococcus.Se coloca
una gota de perxido de hidrgeno sobre un portaobjetos y luegose agrega la colonia en estudio,
la aparicin rpida y mantenida de burbujasindica que el test es (+).
-
Coagulasa
Este
test
busca
la
presencia
de
la
enzima
coagulasaproducida
por
elStaphylococcusaureus.Esta enzima es un activador del fibringeno, transformndolo en

fibrina. Lapared del Staphylococcusaureusadems posee un receptor del fibringenolo que
permite la formacin de uniones entre bacteria y bacteria, formndoseun cogulo.
Permite
diferenciar los estafilococos coagulasa (+) de losestafilococos coagulasa(-).Se realiza

usando de preferencia el plasma de conejo.
-
Lab. Microbiologa
Oscar D. Ors B.
Lab. Microbiologa
Oscar D. Ors B.

PRACTICA Nro. 12
IDENTIFICACION DE BACILOS GRAM POSITIVOS
INTRODUCCION.
El grupo de bacilos anaerbicos esporulados incluye diversas formas, algunas de stas son
patgenas para el hombre y animales. La patogenicidad de estos bacilos se atribuye ms bien a

la capacidad de formar potentes exotoxinas. Por tanto las infecciones por anaerobios esporulados
no es comn en circunstancias ordinarias, ya que en la mayor parte de los casos hay una lesin
traumtica antes de la infeccin.
-
Dentro de este gran grupo de microorganismos se puede diferenciar bacilos gram positivos
anaerbicos que generalmente son miembros del genero Clostridium, y los del grupo de aerobios
son muchos, dentro de los cuales estn el Genero Listeria, Lactobacilos y Bacilus.
-
Todos los bacilos gram-positivos anaerbicos esporulados son por definicin miembros del
gnero Clostridium. Adems indica que la prueba de la catalasa es til para diferenciar las
especies de Clostridium de las de Bacillus si las pruebas de aerotolerancia resultan dudosas.
-
Los bacilos del gnero Clostridium, se encuentran como comensales normales de los
tractos; gastrointestinal, respiratorio y urogenital del hombre y los animales. Los Clostridiums
tambin se hallan en mltiples substratos como: suelo, agua, aguas residuales, plantas,
alimentos, etc., como consecuencia de la contaminacin fecal.
-
MUESTRAS.
Las muestras para esta prctica se pueden obtener de pus, y lquidos de lesin local,
sangre, esputo, incluso del suelo.

-
CARACTERISTICAS CULTURALES;
Dentro del Gnero Clostridium existe una variedad de especies dentro de las cuales estn
el Cl. perfringens, Cl. botulinum, Cl, spticum, Cl. novy, Cl, tetani, etc. Estas difieren
enormemente en cuanto a sus caractersticas culturales. El aspecto de las colonias de Cl.
perfringens en agar yema de huevo son pequeas, globosas, traslcidas, mucosas y que
producen opalescencia. En agar-sangre las colonias que forman una fina pelcula rizoide y con
Lab. Microbiologa
Oscar D. Ors B.
tendencia a proliferar en el medio son consideradas como
Clostridiumspticum y
Clostridiumttani y que adems producen una discreta hemlisis en el medio.

-
Las caractersticas morfolgicas a la coloracin de Gram son: el Clostridiumperfringens
en el frotis demuestran ser bacilos gram-positivos gruesos de bordes redondeados y de longitud

poco variable. El Clostridiumttani son bacilos gram-positivos delgados con una longitud variable
en cuyos extremos se encuentra la espora
terminal. El Clostridiumspticum demuestran ser
bacilos
muy
variables
en
cuanto
sus
dimensiones y se colorean irregularmente.

-
OBJETIVOS.
La presente prctica tiene por finalidad
hacer que los alumnos se familiaricen con la identificacin de los bacilos gram-positivos.
Aislar e identificar miembros del Gnero Clostridium y Bacillus a partir de muestras clnicas
y substratos.
Seleccionar los medios de cultivo empleados para llevar a cabo la deteccin de los Bacilos
gram - positivos.
Elegir, leer e interpretar las pruebas que permiten identificar a los Clostridios.
MATERIALES.
Balanza analtica.
Mechero Bunzen.
Asa de kolle.
Matraz de ErlynMeyer.
Lab. Microbiologa
Oscar D. Ors B.
Tubos de ensayo.
Placas petri.
Medios de cultivo.
Muestras clnicas.
Batera de coloracin Gram
METODOLOGA
5. Con el mechero de Bunzen encendido y respetando el margen de esterilidad inocule con el
hisopo o asa el material, en una placa con agar sangre empleando la tcnica de
agotamiento porestra.
6. Queme
su
hisopo
para
que
no
sea
nuevamente utilizado
7. Incube
en
jarras
de
anaerobiosis
37Cdurante 48 horas.
8. Transcurrido las 48 horas, saque las placas
petri de la jarra de anaerobiosisy encienda el
mechero, para realizar el repique correspondiente nuevamente en agar sangre.
9. Haga un frotis de las colonias que crecieron en el agar sangre
Lab. Microbiologa
Oscar D. Ors B.

12. De acuerdo a lo observado en cada uno de los frotis realice las pruebas correspondientes.
Para la identificacin definitiva
-
Se ejecutaron las siguientes pruebas:
HIDROLISIS DE LA ESCULINA.
Para esta prueba se puede utilizar el medio base VL recomendado para anaerobios por el
"Crculo de Estudios e Investigacin Galeno" (1988), con la

adicin de 0.5% de esculina. La siembra se realiza
utilizando el asa de Kolle, e incubndolas a 37 oC durante
48
horas en anaerobiosis. Luego se procede a adicionar 2 a 3

gotas de solucin de citrato frrico amoniacal al 1%. La
presencia de una coloracin obscura indica una reaccin
positiva.
-
PRODUCCION DE INDOL.
Dado que el medio base VL para anaerobios
contiene triptona, se utiliza el rectivo de Kovac (tiras de

papel), el cual se introduce en los tubos inoculados e
incubados. El viraje del reactivo a un color rosado, indica
una reaccin positiva.
-
REDUCCION DE NITRATOS.
Para la ejecucin de esta prueba se utiliz el caldo nitrato (CN), la preparacin y
distribucin de este medio fue siguiendo la tcnica dada por el "Crculo de Estudios e
Investigacin Galeno" (1988). Luego de la inoculacin de las cpas en los tubos se incuba a 37 oC
durante 48 horas, posteriormente se agrega 2 gotas del reactivo A (*) y dos gotas del reactivo B
(**). La aparicin de un color rojo indica la presencia de nitritos, si no aparece el color rojo vinoso
se agrega mallas de zinc, si hubiera nitratos NO 3 en el medio este ser reducido a nitritos y
aparecer el color rojo vinoso, por tanto la bacteria no ha degradado el nitrato. Por el contrario si
no aparece el color rojo vinoso se debe a la ausencia de nitratos, es decir que la bacteria ha
reducido hasta NH3 y N2.
-
Lab. Microbiologa
Oscar D. Ors B.
* Reactivo A: -Acidosulfanlico
- Acido actico (5N) 100.00 ml.
** Reactivo B: - Alfa naftilamina
- Acido actico (5N) 100.00 ml.

0.8 g
0.6 g.
Lab. Microbiologa
Oscar D. Ors B.

PRACTICA Nro. 13
IDENTIFICACION DE COCOS GRAM NEGATIVOS
La gonorrea es una enfermedad de transmisin sexual (ETS), provocada por la
Neisseriagonorrhoeae, una bacteria que puede crecer y multiplicarse fcilmente en reas

hmedas y tibias del tracto reproductivo, incluidos el cuello uterino (la abertura de la matriz), el
tero y las trompas de Falopio (tambin llamadas oviductos) en la mujer, y en la uretra
(conducto urinario) en la mujer y en el hombre. Esta bacteria tambin puede crecer en la boca, la
garganta, los ojos y el ano.
-
MORFOLOGA E IDENTIFICACIN
Los microorganismos del grupo Neisseriason diplococos gram-negativos, no mtiles con
un dimetro aproximado de 0.8 micrmetros, de manera individual estos cocos tienen la

forma de un rin.
-
CULTIVO
A las 48 Horas de cultivo en medios enriquecidos (Mueller-Hinton, medioSller-
Martin
y otros)
los
gonococos y meningococos forman
coloniasmucoides convexas,
resplandecientes y elevadas, con un dimetro de 1 a5mm. La coloracin depende de la especie

variando desde no pigmentadas,opacas hasta amarillas.Son aerobios estrictos pero tambin
requieren para su crecimiento un 5% deCO2 o microaerofilia.
-
IDENTIFICACIN
La mayor parte fermentan los carbohidratos y producen cido, pero no gas, tiene
reaccin oxidasa positivas.

-
OBJETIVOS
Describir las caractersticas microscpicas culturales y bioqumicasque permiten ejecutar
el aislamiento y la diferenciacin cocos gramnegativos.
Seleccionar los medios de cultivo empleados para llevar a cabo ladeteccin de Neisseria.
Elegir, leer e interpretar las pruebas que permiten identificar a lasNeiserias.
Lab. Microbiologa
Oscar D. Ors B.

IMPORTANCIA.
Determinar la presencia de cocos gram negativos eninfecciones gnito urinarias.

Familiarizarse con la identificacin de cocos gram negativos.
MATERIALES
Autoclave.
Mechero Bunzen.
Asa de colle.
Pipeta graduada de 5 - 10 mi
Tubos de ensayo.
Placas petri.
Medios de cultivo.
Muestras clnicas.
Batera de coloracin Gram.

METODOLOGA

Lab. Microbiologa
Oscar D. Ors B.

5. Con el mechero de Bunsen encendido y respetando el margen deesterilidad inocule con el
hisopo o asa el material, en una placa con agarBHI, Mueller-Hintons, agar sangre,
empleando la tcnica de estriacin.
6. Queme su hisopo para que no sea nuevamente utilizado
7. Incube a 37C durante 48 horas.
8. Transcurrido las 48 horas, saque las
cajas de la incubadora y encienda
elmechero, para realizar el repique
correspondiente en agar sangre.
9. Haga un frotis de las colonias que
crecieron en el agar sangre.
10. Tia con la tcnica de Gram.
12. De acuerdo a lo observado en cada uno de los frotis realice las pruebascorrespondientes.
PRUEBAS COMPLEMENTARIAS.
Prueba de la oxidasa.
-
Se requiere de discos impregnados con oxidasa, se humedecen estos con agua destilada
esteril, luego se cologa sobre una colonia sospechosa, incubar a 35C por 25 minutos, obserbar
los cambios de color que se presenten.
-
Las colonias oxidasa positivas toman un color rosado, despus marron y finalmente
negro.
-
Las colonias oxidasa negativas no produce cambio de color en las colonias o solo
adquiere un ligero color rosado debido al reactivo.
Lab. Microbiologa
Oscar D. Ors B.
Fermentacin de carbohidratos; Lactosa, maltosa y sucrosa

-
Para la realizacin de esta prueba se utiliza un medio base al cual se le adiciona el
carbohidrato a testar (Glucosa, sacarosa, etc.). Una vez inoculado la cepa a testar se lleba a
incubacin a 37C por 24 horas. La fermentacin del carbohidrato se evidencia por el grado de
turbidez en el medio de cultivo ocasionado por el crecimiento del germen.
Lab. Microbiologa
Oscar D. Ors B.
PRACTICA Nro. 14
IDENTIFICACIN DE BACILOS GRAMNEGATIVOS
La familia de las enterobacteriaceaeincluyen muchos gneros como Escherichia,
Shigella, Salmonella, Enterobacter, Klebsiella, Serratia y Proteus. Algunos microorganismos

intestinales por Ejemplo Escherichiacolison parte de la microbiota normal y producen de
manera accidental enfermedad, en tanto que otros como Salmonelas y Shigelas son patgenos
de manera regular para el hombre y los animales.
Escherichiacoli. es causante de muchas infecciones intestinales especialmente
en neonatos de muchos animales y es la causa de mortalidad, as como enterotoxemias e

infecciones por Escherichiacoli en cerdos destetados . En la alpaca han sido observados
cuadros diarreicos en cras dentro de sus dos primeros meses de vida, de algunos de estos
casos se aislaron Escherichiacoli de heces diarreicas.
MORFOLOGA E IDENTIFICACIN
Son gram-negativos variando desde formas cocoides, bipolares hasta largos filamentosos,
frecuentemente se presenta aislados pero no son raras las cadenas cortas, no presentan
esporas. Los bacilos son cortos de 0.5 um. de ancho por 1 - 3 um. de largo entendindose
que se trata de bacilos delgados. Pero otros autores sealan que se trata de bacilos gruesos y
que mide 1.5 x 4 um.
-
CULTIVO
Cultivos fecales en agar McConkey muestran colonias circulares, convexas y lisas
con bordes definidos de un color rosado. En agar eosina - azul de metileno las colonias
presentan centros ennegrecidos con un brillo metlico caracterstico. Aparte de las
caractersticas mencionadas existe variaciones de colonias lisas y rugosas, y las cepas recin
aisladas son generalmente lisas. El desarrollo en la mayora de los medios artificiales de cultivo
es rpido y pueden aparecer sobre ellos como colonias lisas, rugosas mucoides,
generalmente las colonias rugosas no son patgenas, a diferencia de las colonias mucoides las
cuales estn asociadas a procesos enteropatognicos o septismicos.
Lab. Microbiologa
Oscar D. Ors B.
En
medios
selectivos como agar Salmonella - Shiguella (S-S) el desarrollo de las colonias de Salmonella
son incoloras con centro negro debido a la produccin de gas, H2S. Las especies de Shiguella
muestran inhibiciones variables y sus colonias incoloras no presentan ennegrecimiento. En
agar Xilosa Lisina Desoxicolato (XLD) la mayor parte de las especies de Salmonellay Arizona
forman colonias rojas, la mayora con centro negro por el gas, H2S. Los gneros Providencia y
Shiguella y muchas especies de Proteus no utilizan ningn hidrato de carbono y forman colonias
traslcidas.
-
IDENTIFICACIN Y DIFERENCIACIN
Se emplean bsicamente los patrones de reaccin bioqumica, los patrones de
fermentacin de los carbohidratos y la actividad de las descarboxilasas de los aminocidos y

otras enzimas.
OBJETIVOS
13.Describir las caractersticas microscpicas culturales y bioqumicasque permiten ejecutar

el aislamiento y la diferenciacin bacilos gramnegativos.
14. Seleccionar los medios de cultivo empleados para llevar a cabo ladeteccin de las
enterobacterias.
15. Elegir, leer e interpretar las pruebas que permiten identificar a lasenterobacterias.
-
IMPORTANCIA

Determinar la presencia de bacilos negativos en infeccionesgastrointestinales.
Lab. Microbiologa
Oscar D. Ors B.
Familiarizarse con la identificacin de bacilos gram negativos.

Interpretar las pruebas bioqumicas para la diferenciacin delas enterobacterias y otros
bacilos gram negativos.
MATERIALES
Autoclave.
Microscopio.
Estereoscopio
Mechero Bunzen.
Asa de kolle.
Pipeta graduada de 5 - 10 ml
Tubos de ensayo.
Placas petri.
Medios de cultivo.
Muestras clnicas.
Batera de coloracin Gram.
Laminas porta objetos.

METODOLOGA

Lab. Microbiologa
Oscar D. Ors B.
3. Tome un hisopo o asa de colle

5. Con el mechero Bunzen encendido y respetando el margen deesterilidad inocule con el
hisopo o asa, el material, en una placa con agarMcConkey, EMB, SS agar, empleando la
tcnica de agotamiento enestras.
6. Queme su hisopo para que no sea nuevamente
utilizado
7. Incube a 37C durante 24 horas.
8. Transcurrido las 24 horas, saque las placas de la
incubadora y enciendael mechero, para realizar el
repique correspondiente en agar McConkey.
9. Haga un frotis de las colonias que crecieron en el agar McConkey.
12. De acuerdo a lo observado en cada uno de los frotis
realice las pruebascorrespondientes.
-
PRUEBAS COMPLEMENTARIAS.
SIEMBRA EN AGAR TRIPLE AZCAR HIERRO (TSI).
Empleando el asade kolle se sembr en el fondo por
picadura y en la superficie en estra.La fermentacin de los carbohidratos se demuestra por el

viraje del colordel medio de rojizo a amarillo; la glucosa en el fondo del tubo, sacarosa enla parte
intermedia y la lactosa en la superficie.
Lab. Microbiologa
Oscar D. Ors B.
SIEMBRA EN AGAR CITRATO DE SIMMONS. Solo crecen
en
este mediolos grmenes que utilizan el citrato como fuente
de
carbono. Seconsideran citrato (-) si no muestran crecimiento

tras 4 das de incubacin.
SIEMBRA EN CALDO O AGARUREA. Los microorganismos
que tienen la enzimaureasa, desdoblan la urea en amoniaco y en

anhdrido carbnico, loscuales hacen virar el indicador rojo de
fenol al color rojo cereza.
-
SIEMBRA EN LISINA DESCARBOXILASA AGAR. Las descarboxilasas(+), hacen virar el
color
al
detiosulfato
violeta.Tambin
a
sulfuro
se
de
lee
la
reduccin
hidrgeno,
produce
ennegrecimientopor la sal de Fe.

-
PRODUCCION DE INDOL.
Para esta prueba se utilizan medios de cultivo que
contengantriptona o peptona, luego de la incubacin por

horas, se emplea el reactivo de Kovac (tiras de papel), el
cual se introduce en los tubos inoculados El viraje del
reactivoa un color rosado, indica una reaccin positiva.
-
24
Lab. Microbiologa
Oscar D. Ors B.

-
BIBLIOGRAFIA
1. AGURTO SAENZ T. 1999. Manual de Tcnicas en Microbiologa. Auspiciado por el

consejo Nacional de Ciencia y Tecnologa.
2. CIRCULO DE ESTUDIOS E INVESTIGACION GALENO. Medios de Cultivo en
Microbiologa. Manual de Laboratorio I y II parte. U.N.M.S.M., Lima 1988.
3. D.I.F.C.O. Manual de Bacteriologa. Editorial Mirasa, Madrid.1978.
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Espaa.
5. Freeman B. 1983. "Tratado de Microbiologa" 12va Edicin Edit. Nueva Editorial
Latinoamericana S.A. CU. Mxico D.F.
6. Jawetz E. Melnick J. y Adelberg E. 1990. "Microbiologa Mdica" 13va Edicin Edit. El
Manual Moderno S.A. Mxico.
7. MERK KGaA 2000. Microbiology Manual.
8. NICOLET, J. Compendio de Bacteriologa Mdica Veterinaria. Editorial Acribia
Zaragoza, Espaa 1986.
9. OSBALDISTON, G. Tcnicas de Laboratoria en Bacteriologa Clnica Veterinaria.
Editorial Acribia Zaragoza, Espaa 1975.
10. OROS, O, 1991. Aislamiento de los Gneros; Bacteroides, Clostridium, y Escherichia,
En El Intestino Grueso de la Vicua PUNO.1990. Tesis UNA.
11. Thatcher F. y Clarck D. 1973. "Anlisis Microbiolgico de los Alimentos" Edit. Acribia
Zaragoza Espaa.
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Lab.

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Prac, Nro. 1. MATERIAL Y EQUIPO DE LABORATORIO

Prac, Nro. 2. PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO

Prac. Nro. 5.SENCIBILIDAD BACTERIANA

Prac. Nro. 7.TINCIN DE ZIEHL-NEELSEN (acido resistente)

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Facultad De Medicina Veterinaria y Zootecnia UNA

Uso obligatorio de guardapolvo o mandil blanco.

2. Si tiene el pelo largo, ste debe ser recogido.

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contaminado, avisar inmediatamente al encargado.

Cualquier accidente (rotura de tubos,

8. Desechar el material contaminado en los recipientes adecuados.

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almacenar medios de cultivo, sueros, discos

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relativamente baratos y resultan tiles para volmenes grandes.

separacin de particular slidas suspendidas en

Asegurarse de conocer el manejo de una centrifuga determinada antes de

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Subir la velocidad de la centrifuga lentamente, una vez terminada la operacin

pueden aumentar un objeto por encima de las 2.000 veces.

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11. Jarras de anaeobiosis.

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generalmente es liquido mezclado con

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Materiales de laboratorio por equipo

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conservados; Cary Blair, Medio Stuard.

mejorados como el Agar sangre.

inhibidores; sales, colorantes, como el Agar EMB, ENDO, Manitol

salado, Agar verde brillante.

(Mycobacterium) y el agar Sabouraud (hongos y levaduras).

Medios de cultivo deshidratado.

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FORMAS DE PREPARACIN E INTERPRETACIN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

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Aislam#iento.- Para la siembra de muestras, con el objeto de conseguir

Bacteriofagotipaje o antibiograma.- Se reparte el medio de cultivo,

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Mecheros con gas.

Medios de cultivo esterilizado, licuados y a una temperatura entre 48 y 52C.

suavemente rotando, flamear la boca del

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Gua Prctica de Bacteriologa

MTODOS DE SIEMBRA Y AISLAMIENTODE MICROORGANISMOS.

necesarios para la identificacinde un determinado microorganismo.

Facultad De Medicina Veterinaria y Zootecnia UNA PUNO pag.

Gua Prctica de Bacteriologa

Pipeta graduada de 5 - 10 ml.

Matraz de Erlyn Meyer.

Probeta graduada de 100 ml.

Placas petri, con medios de cultivo.