El Laboratorio en El Diagnóstico de Las Enfermedades Metabólicas Hereditarias. Impacto de Las Nuevas Tecnologías

+Model
ARTICLE IN PRESS
LABCLI-241; No. of Pages 15

Rev Lab Clin. 2015;xxx(xx):xxx---xxx
Revista del Laboratorio Clnico

www.elsevier.es/LabClin
REVISIN
El laboratorio en el diagnstico de las enfermedades

metablicas hereditarias. Impacto de las nuevas
tecnologas
Celia Prez-Cerd y Beln Prez
Centro de Diagnstico de Enfermedades Moleculares, Facultad de Ciencias, Universidad Autnoma de Madrid, CIBER de
Enfermedades Raras, IdiPaz, Madrid, Espa
na
Recibido el 25 de noviembre de 2014; aceptado el 8 de enero de 2015
PALABRAS CLAVE
Diagnstico de
laboratorio;
Enfermedades
metablicas
hereditarias;
Espectrometra de
masas;
Anlisis de
mutaciones;
Secuenciacin masiva
KEYWORDS
Laboratory diagnosis;
Inherited metabolic
diseases;
Mass spectrometry;
Mutation analysis;
Next generation
sequencing
Resumen Las enfermedades metablicas hereditarias son enfermedades mendelianas que

agrupan a un colectivo de ms de 600 patologas clasicadas en funcin de la va metablica
alterada y su patognesis. La mayora se diagnostican posnatalmente tras el reconocimiento
por parte del clnico de una serie de sntomas sugestivos de enfermedad. Los laboratorios de
gentica bioqumica y molecular estn implicados en el reconocimiento de estas enfermedades
ya que el anlisis de metabolitos, protenas y genes son claves para su diagnstico. En este
artculo se revisa cmo (abordaje) se diagnostican estas enfermedades y las tcnicas bioqumicas y genticas de laboratorio comnmente utilizadas. Es en el mbito de la identicacin
de metabolitos (espectrometra de masas) y deteccin de mutaciones (secuenciacin masiva)
donde el impacto de las nuevas tecnologas en estos ltimos a
nos ha sido espectacular, lo que ha
facilitado el diagnstico rpido y con pruebas poco invasivas y facilitar en el futuro el cribado
poblacional.
2014 AEBM, AEFA y SEQC. Publicado por Elsevier Espaa, S.L.U. Todos los derechos reservados.
The impact of new technologies in the laboratory diagnosis of inherited metabolic

diseases
Abstract Inherited metabolic diseases are a group of more than 600 diseases classied according to the altered metabolic pathway and their pathogenesis. Most are diagnosed postnatally
after recognition by a number of clinical symptoms suggestive of disease. Laboratories of biochemical and molecular genetics are involved in the recognition of these diseases as the analysis of
metabolites, proteins and genes are key for diagnosis. This article reviews how (approach) these
diseases are diagnosed and the biochemical and genetic laboratory techniques commonly used.
Autor para correspondencia.

Correo electrnico: celia.perez@uam.es (C. Prez-Cerd).
http://dx.doi.org/10.1016/j.labcli.2015.01.002
1888-4008/ 2014 AEBM, AEFA y SEQC. Publicado por Elsevier Espaa, S.L.U. Todos los derechos reservados.
Cmo citar este artculo: Prez-Cerd C, Prez B. El laboratorio en el diagnstico de las enfermedades metablicas
hereditarias. Impacto de las nuevas tecnologas. Rev Lab Clin. 2015. http://dx.doi.org/10.1016/j.labcli.2015.01.002
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C. Prez-Cerd, B. Prez
It is in the area of identication of metabolites (mass spectrometry) and mutation detection
(massive sequencing) where the impact of new technology in recent years has been spectacular, which facilitated rapid diagnosis with minimally invasive tests and will facilitate future
population screening.
2014 AEBM, AEFA y SEQC. Published by Elsevier Espaa, S.L.U. All rights reserved.
Introduccin
Las enfermedades metablicas hereditarias (EMH) son
enfermedades mendelianas (www.ncbi.nlm.nih.gov/Omim/
mimstats.html), que agrupan a un colectivo de ms de 600
patologas diferentes clasicadas en funcin de la va metablica alterada y su patognesis. La mayor parte cumplen
el criterio de enfermedad rara segn la denicin de la
Unin Europea: enfermedades raras, minoritarias, hurfanas o enfermedades poco frecuentes, incluidas las de origen
gentico, son aquellas enfermedades con peligro de muerte
o de invalidez crnica que tienen una prevalencia menor
de 5 casos por cada 10.000 habitantes. Aunque individualmente son poco frecuentes, colectivamente son numerosas,
contribuyendo de una forma muy signicativa al nmero
total de enfermos en la sociedad.
Las EMH se denen como trastornos genticamente
determinados en la sntesis y/o funcin de molculas proteicas. Gran parte de estas protenas son enzimas cuyo defecto
da lugar a un bloqueo en la va metablica implicada y la
consiguiente acumulacin en uidos corporales del sustrato
de la reaccin y otros metabolitos derivados. Este aumento
no siolgico de estos compuestos, en muchos casos txicos, as como la disminucin del producto de la reaccin,
estn implicados en los mecanismos siopatolgicos de la
enfermedad1 .
La mayora se heredan de forma autosmica recesiva,
alrededor del 20% tienen herencia autosmica dominante,
el 10% una herencia ligada al cromosoma X y una parte
importante de las denominadas enfermedades mitocondriales tienen una herencia materna ya que afectan al ADN
mitocondrial.
Recientemente, la Society for the Study of Inborn Errors
of Metabolism ha elaborado una clasicacin de los EMH,
agrupando las enfermedades en 15 grandes grupos, segn
afecten a molculas sencillas del metabolismo intermediario o energtico o a molculas complejas localizadas en
diferentes organelas celulares (tabla 1)2 .
Abordaje del diagnstico de las EMH

La mayora de las EMH se diagnostican posnatalmente tras
el reconocimiento por parte del clnico de una serie de
sntomas especcos y sugestivos de enfermedad metablica. El comienzo puede ser a cualquier edad, aunque una
gran parte de los pacientes presentan la enfermedad antes
del a
no de vida. Suele comprometer a ms de un sistema simultneamente siendo el sistema nervioso central
el ms comnmente afectado. El diagnstico exacto de la

protena/gen afectado, permite el acceso a opciones preventivas para la familia que deben darse a conocer a travs
del asesoramiento gentico. Previo consentimiento informado al paciente o a los padres o tutores del paciente u
otros miembros de la familia, se buscaran posibles miembros afectos todava asintomticos, sobre todo si pueden
beneciarse de un tratamiento precoz, se podra hacer el
diagnstico de portadores de la enfermedad entre familiares, y se aportara informacin sobre el tipo de herencia,
riesgo de recurrencia, pronstico del curso clnico de la
enfermedad (si se conoce) y opciones reproductivas (diagnstico prenatal y preimplantacional). Existe una peque
na
parte de las EMH (10%) y algunas endocrinopatas que pueden
detectarse presintomticamente en los programas de cribado neonatal. El objetivo es identicar pacientes de pocos
das de vida mediante pruebas analticas poco costosas para
intervenir precozmente y evitar, en lo posible, los efectos
de la enfermedad.
Es en el mbito de la identicacin de metabolitos y
deteccin de mutaciones donde el impacto de las nuevas
tecnologas en estos ltimos a
nos ha sido espectacular, lo
que ha facilitado el diagnstico rpido y cada vez menos
invasivo.
El laboratorio en el diagnstico de las EMH

La mayora de las EMH se diagnostican posnatalmente a partir de una sospecha diagnstica realizada por el mdico
que reconoce una serie de sntomas y signos compatibles.
Es conveniente un cribado clnico revisando los algoritmos
diagnsticos de EMH en ni
nos y adultos antes de iniciar investigaciones bioqumicas complicadas3 . Es importante saber
qu tipo de muestra es necesaria segn la sospecha: sangre entera con anticoagulante, plasma o suero, orina de
una miccin o de 24 horas y lquido cefalorraqudeo (LCR).
Cundo debe tomarse, de forma urgente ante el cuadro
agudo y antes de iniciar tratamientos que intereran y cmo
debe conservarse (tabla 2). La sospecha clnica inicial de un
EMH exige la realizacin de una serie de estudios bsicos que
pueden hacerse en el hospital (tabla 2). Con estos resultados
se establece una estrategia diagnstica en coordinacin con
el laboratorio de gentica bioqumica, que realizar otros
anlisis ms especcos (tabla 2), a ser posible en las mismas
muestras en las que se realizaron las pruebas bsicas.
Estudio de las vas metablicas (metabolitos). La
cuanticacin de metabolitos en uidos siolgicos e identicacin de un perl metablico concreto es, en muchos
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El laboratorio en el diagnstico de las enfermedades metablicas hereditarias

Tabla 1
Clasicacin de las EMHs segn la SSIEM y enumeracin de las ms frecuentes o conocidas en cada grupo
Grupo de enfermedad
Enfermedad
GEN
OMIMGEN
1.-Enfermedades del metabolismo

de aminocidos y pptidos (incluye
aminoacidopatas, los defectos del
ciclo de la urea, defectos en el
transporte y las acidurias orgnicas)
Fenilcetonuria
Enfermedad de la orina con olor a jarabe de
arce
Tirosinemia tipo 1
Homocistinuria
Def. ornitinatranscarbamilasa
Citrulinemia
Hiperglicinemia no cetsica
Cistinuria
Aciduriaglutrica
Aciduriaisovalrica
Aciduriametilmalnica
Aciduriapropinica
Galactosemia clsica
Acidosis lctica congnita por def. de
piruvatocarboxilasa
Def. fructosa 1,6 difosfatasa
Glucogenosis tipo Ia (Von Gierke)
Glucogenosis tipo V (McArdle)
PAH
BCKDHA, BCKDHB
261600
248600
FAH
CBS
OTC
ASS
GLDC
SLC3A1, SLC7A9
GCDH
IVD
MUT
PCCA, PCCB
GALT
276700
236200
311250
215700
238300
220100
231670
243500
251000
232000
230400
PC
FBP1
G6PC
PYGM
CPT2
ACADM
266150
229700
232200
232600
255110
201450
ACADVL
201475
HADHA, HADHB
HMGCS2
ACAT1
PDHA1
143450
600234
100678
312170
DelecionesADNmt
MutionesADNmt
SUCLA2
530000
540000
612073
SDHA, SURF1 y otros
256000
ACAD9
ETFHE1
SLC6A8
HPRT
ADSL
XDH
UMPS
DPYD
TYMP
DHCR7
CYP27A1
HMBS
UROD
FECH
APOA5,LIPI
ABCA
ALDH3A2
PMM2
MPI
EXT1/2
ATP6V0A2
611126
602473
300352
308000
103050
278300
258900
274270
131222
270400
213700
176000
176100
177000
238600
205400
270200
601785
602579
133701
611716

de carbohidratos

de cidos grasos y cuerpos cetnicos

energtico

de purina, pirimidinas y otros
nucletidos

de esteroles
7.- Enfermedades del metabolismo
de la porria y grupo hemo
de lpidos y lipoprotenas
9.-Defectos congnitos de
glicosilacin y otras enfermedades
que afectan a la modicacin
proteica
Def. de carnitinapalmitoiltransferasa 2
Def. acilCoA deshidrogenasa de cadena
media
Def. acilCoA deshidrogenasa de cadena muy
larga
Def. de protena trifuncional mitocondrial
Aciduria 3-hidroxi-3-metilglutrica
Def. de beta-cetotiolasa
Def. del complejo piruvato deshidrogenasa
E1
Sndrome de Kearns-Sayre
Sndrome de Melas
Aciduriametilmalnica con
encefalomiopata
Sndrome de Leigh
Def. de complejo I de cadena respiratoria
con respuesta a riboavina
Aciduriaetilmalnica con encefalopata
Def. del transportador de creatina cerebral
Enfermedad de Lesch-Nyhan
Def. de adenilosuccinatoliasa
Xantinuria
Aciduriaortica
Def. de dihidropirimidina deshidrogenasa
Def. de timidinafosforilasa (MNGIE)
Sndrome de Smith---Lemli-Opitz
Xantomatosis cerebrotendinosa
Porria aguda intermitente
Porria cutnea parda
Protoporriaeritopoytica
Hipertrigliceridemia familiar
Enfermedad de Tangier
Sndrome de Sjogren-Larsson
Def. de fosfomanomutasa
Def. de fosfomanoisomerasa
Exostosis mltiple tipoI/II
Cutis laxa por dcit de ATPasa V
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Tabla 1 (continuacin)
Grupo de enfermedad
Enfermedad
GEN
OMIMGEN
10.-Enfermedades lisosomales
Enfermedad de Sanlippo A
Enfermedad de Morquio A
-Manosidosis
Enfermedad de Gaucher
Enfermedad de Fabry
Enfermedad de Krabe
Enfermedad de Niemann-Pick A o B
Cistinosis
Enfermedad de Wolman
Enfermedad de Pompe
Adrenoleucodistroa ligada al X
Sndrome de Zelweger
Condrodisplasia rizomlicapunctata tipo 1
Enfermedad de Refsum
Def. de tirosina hidroxilasa
Def. de succnico semialdehido
deshidrogenasa
Malabsorcin hereditaria de folato
Def. de metilentetrahidrofolatoreductasa
Aciduriametilmalnica con homocistinuria
SGSH
GALNS
MAN2B1
GBA
GLA
GALC
SMPD1
CTNS
LIPA
GAA
ABCD1
PEX1 y otros
PEX7
PHYH
TH
ALDH5A1
252099
253000
248500
230800
301500
245200
257200
219800
278000
232300
300100
214100
215100
266500
191290
271980
SLC46A1
MTHFR
MMACHC
MMADHC
SLC19A2
229050
236250
277400
277410
249270
BTD
ALDH7A1
MOCS1
GCH1
ATP7A
ATP7B
HFE
FMO3
253260
266100
603707
233910
309400
277900
235200
602079
11.-Enfermedades peroxisomales

de neurotransmisores
de vitaminas y cofactores

de elementos traza y metales
de xenobiticos
Anemia megaloblstica con respuesta a

tiamina
Def. de biotinidasa
Epilepsia dependiente de piridoxina
Def. del cofator molibdeno A
Def. de GTP ciclohidrolasa
Enfermedad de Menkes
Enfermedad de Wilson
Hemocromatosis hereditaria tipo 1
Trimetilaminuria
casos, diagnstico de una EMH y en otros permite orientar

una sospecha. Se utilizan diversas tcnicas analticas, fundamentalmente cromatografa y espectrometra de masas,
cada una de ellas es especca para un grupo de metabolitos. Para valorar los resultados, es importante tener
bien establecidos los intervalos control segn edad y conocer edad, alimentacin y medicacin en el momento de
la toma de la muestra al paciente. La cromatografa de
intercambio inico (CIO) es el mtodo de eleccin para la
separacin y cuanticacin de aminocidos4 . Est basado
en la separacin de los aminocidos en funcin de su carga
elctrica en una columna de intercambio catinico, elucin de los mismos secuencialmente utilizando tampones de
litio a diferentes pH y deteccin por colorimetra ti
nendo
con ninhidrina. Es una tcnica muy reproducible y sensible.
Todas las aminoacidopatas pueden diagnosticarse midiendo
aminocidos en uidos biolgicos (g. 1A). El anlisis de
aminocidos tambin se realiza para monitorizacin del tratamiento de numerosas EMH y se utiliza como marcador del
estatus nutricional y de la funcionalidad de rganos como
hgado, ri
nn, intestino etc. . . La cromatografa lquida de
alta resolucin (high performance liquid chromatography
[HPLC]) es un mtodo muy verstil, tambin basado en
la separacin de metabolitos segn sus propiedades fsicoqumicas. Se hace pasar las molculas a travs de una
columna cromatogrca (fase estacionaria) bombeadas por
un lquido o solvente (fase mvil) aplicando presin alta. El
metabolito se identica segn su tiempo de retencin y se
detecta y cuantica con distintos detectores. La deteccin
electroqumica se utiliza en el anlisis de neurotransmisores
en LCR5 , para el diagnstico de, p.ej., las distonas con respuesta a dopa por defectos de tirosina hidroxilasa (sndrome
de Segawa) o GTP ciclohidrolasa, que cursan con disminucin de cido homovanlico y/o cido hidroxiindolactico.
Con el detector de uorescencia se mide la homocistena6
y las pterinas7 , estos ltimos metabolitos alterados en las
hiperfenilalaninemias por defectos en la sntesis y regeneracin del cofactor BH4 de la fenilalanina hidroxilasa. Para la
cuanticacin de purinas y pirimidinas se utiliza el detector
diodearray (UV/visible)8 (g. 1B).
La cromatografa de gases (gas chromatography [GC]) es
la tcnica de excelencia utilizada desde hace dcadas para
el anlisis de cidos orgnicos, molculas en general voltiles de bajo peso molecular. En este caso, previamente
al anlisis en el cromatgrafo, las molculas se derivatizan (habitualmente se forman trimetilsilil-derivados), y la
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Tabla 2
grupo
Tipo de muestra, estudios bioqumicos bsicos y especcos (metabolitos) y tcnica utilizada en el diagnstico de EMH
Tipo de muestra
Estudios bsicos
Estudios especcos
Tcnica
Enfermedades
Sangre entera
(EDTA o
heparina)
Conservar a ta
ambiente
Plasma
Conservar a -20a
Suero
Conservar -20 C
Eritrocitos
Conservar a
-20 C
Hemograma
Gases y
electrolitos
Anin Gap
Glucosa
Calcio, fosfato,
magnesio
Transaminasas, CK
Coagulacin
Colesterol
Triglicridos, c.
rico
Lactato/piruvato
Cuerpos cetnicos
Aminocidos
CIO
Amioacidopatas
cidos grasos de
cadena muy larga
cidos tnico y
pristnico
Esteroles
Plasmalgenos
eritrocitarios
Carnitina y
acilcarnitinas
GC/SIM/MS
Enfermedades peroxisomales
GC/SIM/MS
GC/SIM/MS
GC/FID
Defectos biosntesis colesterol

ESI-MS/MS
Orina
Aleatoria
o fraccin de
24 h
Conservar a
-20 C
Olor y color
especial
Glucosa
cuerpos
reductores
(clinitest)
Cuerpo cetnicos
(comburtest)
Sultos (sultest)
pH
Urea
cido rico
creatinina
c. pipeclico
HPLC/ESI-MS/MS
Coenzima Q
HPLC/APCI-MS/MS
Homocistena
HPLC
Catecolaminas
HPLC
Piridoxal-P
HPLC
Tiamina y steres en
sangre entera
Galactosa
Galactosa-1-P
eritrocitaria
Isoformas de
transferrina (% CDT)
Isoformas de ApoC3
HPLC
Defectos -oxidacin
mitocondrial de cidos gasos.
Acidurias orgnicas
Enfermedades peroxisomales y
epilepsia dependiente de
piridoxina
Defectos biosntesis de CoQ y
enfermedades mitocondriales
Homocistinurias y defectos
metabolismo folato
Defectos metabolismo aminas
bigenas
Epilepsia dependiente de
piridoxina y de piridoxal-P
Defectos metabolismo tiamina
Espectrofotomtrico
Espectrofotomtrico
Galactosemias
Galactosemias
IEF y HPLC
Defectos N-glicosilacin
protenas
Defectos O-glicosilacin
protenas
Aminoacidopatas
Aminocidos
IEF
CIO
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Tabla 2 (continuacin)
Tipo de muestra
LCR
Conservar -20 C
Estudios bsicos
Glucosa
Lactato/piruvato
Estudios especcos
Tcnica
Enfermedades
c. orgnicos
Succinilacetona
Galactitol y
galactonato
c biliares
GC/MS
GC/MS
GC/MS
Acidurias orgnicas
Tirosinemia tipo 1
Galactosemias
ESI-MS/MS
Trimetilamina
Guanidinoacetato y
creatina
D,L 2-OHglutarato
cido
alfa-aminoadpico
semialdehido
Oligosacridos
c ortico y orotidina
Purinas y pirimidinas
ESI-MS/MS
ESI-MS/MS
Defectos metabolismo cidos

biliares. Enfermedades
peroxisomales
Timetilaminuria
Defectos metabolismo creatina
HPLC/ESI-MS/MS
HPLC/ESI-MS/MS
Aciduria 2-OHglutricas
piridoxina
ESI-MS/MS
HPLC
HPLC
Oligosacaridurias
Defectos ciclo de la urea
Defectos metabolismo purinas
y pirimidinas
Defectos metabolismo BH4
Defecto fructosa 1,6
difosfatasa
Mucopolisacaridosis
Aminoacidopatas
Pterinas
Glicerol-P
HPLC
GC-SIM-MS
Glucosaminoglicanos
Aminocidos
Espectrofotomtrico
IEC
Piridoxal-P
HPLC
Neurotrasmisores
HPLC
Pterinas
HPLC
elucin se produce por el ujo de una fase mvil de gas

inerte a travs de la columna cromatogrca. Histricamente, el detector utilizado era un detector de ionizacin
de llama (ame ionization detector), pero actualmente se
utiliza el espectrmetro de masas. La espectrometra de
masas (mass espectrometry [MS]) es una tcnica analtica
en la que los tomos o molculas de una muestra son ionizados, con mayor frecuencia positivamente, separados por
su relacin masa/carga (m/z) y posteriormente detectados
y registrados. As, el metabolito al entrar en el espectrmetro se ioniza y se fragmenta segn sus caractersticas
electroqumicas. El conjunto de fragmentos es nico y por
tanto identicativo de cada metabolito. La cuanticacin se
realiza por medio de calibradores con estndares internos.
Con esta metodologa (GC/MS) se identican y cuantican
los cidos orgnicos y otros compuestos hidrofbicos de
bajo peso molecular (aminocidos, cidos grasos, cidos
biliares. . ..), biomarcadores de numerossimas enfermedades que afectan al metabolismo intermediario, entre ellas
las acidurias orgnicas (g 1 C)9 . Para incrementar la sensibilidad de deteccin se utiliza la monitorizacin selectiva
de iones (selective ion monitoring), procedimiento utilizado, por ejemplo, en la cuanticacin de los cidos grasos
de cadena muy larga para el diagnstico de enfermedades
peroxisomales10 (tabla 2).
piridoxina y de piridoxal-P
Defectos de la
neurotransmisin cerebral
Defectos metabolismo BH4 y de
la neurotransmisin cerebral
Aunque las espectrometra de masas aplicada al diagnstico de EMH se empez a desarrollar en los a
nos sesenta del
siglo XX, ha sido a partir de la dcada de los 90 cuando hubo
un avance extraordinario en el desarrollo de nuevas aplicaciones para el anlisis de compuestos polares no voltiles
de menor o mayor tama
no de forma rpida, utilizando poca
cantidad de muestra e incluso en muestra de sangre y orina
en papel, con apenas manipulacin previa11 . La combinacin del sistema de ionizacin de electrospray (electrospray
ionization [ESI]) con la espectrometra de masas en tndem
(ESI-MS/MS) es la utilizada para la medida de la concentracin de acilcarnitinas (g. 1D) y otros metabolitos. La
separacin de ismeros de acilcarnitinas o de cidos orgnicos requiere una separacin previa por cromatografa lquida
(HPLC-ESI/MS/MS)12 . Otro sistema de ionizacin utilizado es
la ionizacin qumica a presin atmosfrica (atmospheric
pressure chemical ionization [APCI]) que en combinacin con
la cromatografa lquida (HPLC/APCI/MS/MS) se utiliza para
medir el coenzima Q1013 . Para el anlisis de molculas ms
grandes como pptidos, protenas o glicoprotenas se han
desarrollado otras tcnicas como, por ejemplo, la que utiliza
el sistema de ionizacin por desorcin mediante lser asistida por matriz (matrix-assisted laser desorption/ionization
[MALDI]) junto con el analizador de tiempo de vuelo (time
of ight [TOF]): MALDI/TOF/MS/MS, en el diagnstico de
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A
500
CIO de aminocidos
HPLC de purinas
450
Absorbance (mAU)
Leu
400
MSUD
350
Control
300
Val
250
Ile
alle
0
400
150
100
50
Control
Time (min)
30
Time (min)
30
0
0
S-Ado
Def.ADSL
Absorbance (mAU)
200
SAICAr
400
10
20
30
40
50
60
70
80
90
GC-MS de cidos orgnicos
100
110 120 130
Aciduria isovalrica
C0
LC-MS/MS de acilcarnitinas
IVG
Aciduria propinica
MADD
MC
C10
C4
PG
3OHP
C6
C8
C5
3OHIVA
C12
2OHIVA
C0
73
73
Espectro de masas
MC
Espectro de masas
IVG
102
C8
288
MCADD
287
147
147
130
176
261
57
361
221
389 419
479
303
C6
C10:1
333
Figura 1 Ejemplos de cromatogramas diagnsticos de diferentes EMH. A) Cromatograma de aminocidos en plasma por CIO de un
paciente de jarabe de arce (MSUD), se observa el aumento de los aminocidos marcadores de la enfermedad valina (Val), aloisoleucina (aIle), isoleucina (Ile) y leucina (Leu). B) Cromatograma de purinas en lquido cefaloraqudeo (LCR) por HPLC de un paciente
con deciencia en adenilosuccinato liasa (ADSL), se observa el aumento de los metabolitos diagnsticos succinilaminoimidazol
carboxamida ribsido (SAICAr) y succiniladenosina (S-ado). C) Cromatogramas y espectros de masas de cidos orgnicos en orina
por GC-MS de una aciduria propinica, se observan los biomarcadores cidos 3-hidroxipropinico (3 OHP) y metilctrico (MC) y la
propionilglicina (PG) y el espectro de masas del MC; y de una aciduria isovalrica, se observan los metabolitos marcadores cidos
2-hidroxiisovalrico (2 OHIVA) y 3-hidroxiisovalrico (3 OHIVA) e isovalerilglicina (IVG) y el espectro de masas de la IVG. D) Espectros
de masas de acilcarnitinas en plasma por ESI-MS/MS de una deciencia mltiple de acilCoA deshidrogenasa (MADD), se observa el
perl con aumentos de butirilcarnitina (C4), isovalerilcarnitina (C5), hexanoilcarnitina (C6), octanoilcarnitina (C8), hexanoilcarnitina (C6), decanoilcarnitina (C10) y dodecanoilcarnitina (C12); y de una deciencia de acilCoA deshidrogenasa de cadena media
(MCADD), con aumentos de C6, C8 y decenoilcarnitina (C10:1).
hemoglobinopatas14 , defectos congnitos de glicosilacin15

y diferentes enfermedades de depsito lisosomal16 .
Los procedimientos diagnsticos basados en la determinacin de metabolitos pueden dar resultados falsos negativos si la muestra no se ha tomado en el momento adecuado
(descompensacin metablica), por ello es muy importante
conocer cundo y cmo se ha tomado y conservado la
muestra, medicacin, dieta, incluyendo suplementos alimenticios y vitaminas que se han administrado al paciente.
Los resultados deben ser valorados en laboratorios expertos
familiarizados en el estudio y diagnstico de EMH.
Estudio del producto gnico (enzimas y protenas). El
anlisis de la protena afectada a nivel de su funcin o de
su expresin es, en muchos casos, importante bien como
conrmacin del resultado del anlisis de metabolitos o
gentico o bien cuando no existen metabolitos biomarcadores de la enfermedad. Para el estudio de la funcin proteica
se necesitan clulas (linfocitos, broblastos de piel cultivados a partir de una biopsia de piel, eritrocitos, linfoblastos) o
tejidos (biopsia heptica, muscular etc.). La actividad enzimtica suele medirse incubando con el sustrato del enzima
para medir disminucin de sustrato o aparicin de producto
por tcnicas espectrofotomtricas o radiactivas. As se conrma la actividad propionilCoA carboxilasa deciente en
pacientes con aciduria propinica, utilizando 14 CO3 H, uno
de los sustratos de la carboxilacin del metilmalonilCoA17 .
Las clulas cultivadas, fundamentalmente broblastos de
piel y linfoblastos, permiten realizar ensayos in vitro (incorporacin de aminocidos, oxidacin de sustratos), para
determinar la funcin de una va metablica completa,
+Model
ARTICLE IN PRESS
Control
Control
Control
PMM2-CDG
0,0090
0,0080
0,0070
0,0060
0,0050
0,0040
0,0030
0,0020
0,0010
Isoformas de la transferrina por IEF

PGM-CDG
Isoformas de la transferrina por HPLC
T4
0,0
1,0
3,0
4,09
3,47
2,0
5,78
T5
T2
T0
1,92
Volts
4,0
5,0
6,0
T5
T4
7,0
T3
Time (min.)
4,77
T1
T0
T4
0,0120
0,0110
5,50
T2
2,98
T0
3,92
Volts
0,0130
1,62
T2
Tipo 1
PMM2-CDG
0,0140
0,0100
0,0090
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
Isoformas de la ApoC3 por IEF
6,0
Time (min.)
T4
0,00300
0,00225
0,0
1,0
2,0
4,28
3,53
2,48
T0
T3
T2
T1
3,0
Def. congnito combinado

de N-y O-glicosilacin
Control
DSA
5,84
Tipo 2:
PGM-CDG
5,20
0,00675
0,00600
0,00525
0,00450
0,00375
1,75
Volts
Control
MSA
ASA
4,0
5,0
6,0
7,0
Time (min.)
Figura 2 Anlisis de las isoformas de la N-glicoprotena transferrina y de la

O-glicoprotena lipoprotena apoC3 en suero para la deteccin de defectos congnitos de glicosilacin. A) Perl de las isoformas
de la transferrina separadas y cuanticadas por HPLC-Variant. La isoforma mayoritaria en suero control es la tetrasialilada (T4);
se observa un perl alterado tipo 1, en un paciente con PMM2-CDG, con aumentos de las isoformas hipoglicosiladas: asialilada
(T0) y disialilada (T2) y de tipo 2 en un paciente con PGM-CDG, en donde se observan aumentos de las isoformas: asialilada (T0),
monosialilada (T1), disialilada (T2) y trisialilada (T3). En ambos casos se observa la disminucin de la isoforma mayoritaria T4. B)
Anlisis por isoelectroenfoque de la transferrina, en este caso las isoformas se separan por su punto isoelctrico en gradiente de
pH. Se observan las bandas patolgicas en los pacientes con PMM2-CDG (T0 y T2) y PGM-CDG (T0, T1, T2 y T3, respectivamente).
C) Anlisis por isolectroenfoque de la apoC3, las isoformas tambin se separan en funcin de su punto isoelctrico en un gradiente
de pH. Los carriles centrales corresponden a dos pacientes con un defecto combinado en la N- y O-glicosilacin de protenas. En
un caso se observa aumento de la isoforma asialilada (ASA) y desaparicin de las bandas correspondientes a las formas disialilada
(DSA) y monosialilada (MSA) y en el otro aumento de la isoforma MSA y fuerte disminucin de la DSA de la apoC3.
como por ejemplo la oxidacin de 14 C-propionato para el

anlisis de funcionabilidad de la va del propionato en el
diagnstico de las acidurias metilmalnicas18 , de la 14 Cleucina en el diagnstico de la enfermedad jarabe de arce
y del 14 C-piruvato, para los defectos del complejo piruvato
deshidrogenasa y en general, de la funcin energtica mitocondrial. En las enfermedades causadas por un defecto en
la glicosilacin de protenas, el anlisis en suero de las
isoformas de la transferrina, protena N-glicosilada transportadora de hierro, y de la lipoprotena O-glicosilada ApoC3
se utiliza para orientar junto con la sintomatologa clnica el
anlisis gentico. Su concentracin en sangre puede ser normal, sin embargo estn decientemente glicosiladas, lo que
se traduce en un cambio del perl de sus isoformas (g. 2)19 .
Estudio gentico (genes). La conrmacin gentica de las
EMH se lleva a cabo en los laboratorios especializados de
gentica molecular mediante el anlisis de mutaciones del
gen correspondiente.
El defecto primario en una EMH es una alteracin en la
secuencia nucleotdica del ADN que determina la secuencia de aminocidos de una protena. La secuencia de
nucletidos del ADN mediante un proceso llamado transcripcin genera una cadena de ARN, que se procesa (splicing)
para dar lugar al ARN mensajero (ARNm), que se traduce
(proceso de traduccin) en la secuencia de aminocidos de
la protena. Finalmente, la protena es sometida a una serie
de modicaciones postraducionales (fosforilacin, glicosilacin, etc.) para ser plenamente funcional.
Bsicamente, el diagnstico gentico consiste en buscar
mutaciones potencialmente patognicas del gen afectado en material gentico (ADN o ARN) del paciente. La
muestra a analizar puede ser sangre con anticoagulante
(EDTA), sangre seca impregnada en papel de ltro, tejidos
como biopsia de hgado o muscular, broblastos de piel
cultivados, biopsia corial o amniocitos para los estudios prenatales, etc. . . Las mutaciones pueden afectar a secuencias
reguladoras alterando su expresin, secuencias exnicas,
alterando la secuencia de aminocidos de la protena que
codica, o a regiones intrnicas, que en general afectan al procesamiento (splicing) del ARNm. En la secuencia
nucleotdica puede haber mutaciones puntuales que afectan
a un solo nucletido, deleciones o inserciones que afectan a
+Model
ARTICLE IN PRESS

Tabla 3
Tipo de mutaciones y nomenclatura
Efecto en la protena
De cambio de sentido (missense)
p.Gly631Arg
Sin sentido (nonsense)
p.Arg313Ter
Insercin/duplicacin
p.Leu308Phefs*35
Delecin
p.His140Leufs*44
Mutacin en el procesamiento de ARNm
(splicing)
p.Val681 Thr706del26
p.Thr62 Ser100del39
p.Val429Phefs*6
Gran delecin
p.Val681 Thr706del26
Cambio nucleotdico
c.1891G>C
c.937C>T
c.923dupT
c.419delA
c.2041-2A>G (IVS22-2A>G); delecionexon 23

c.231+1G>C (IVS3+1G>C); delecinexon 3-4
c.1285-1416A>G; insercin 84 pb
c.2041-2824 c.2118+987del3889;incluye delecin exon23
Ejemplos de mutaciones descritas en el gen PCCA (NM NM 000282.3), que causan aciduriapropinica.
uno o unos pocos nucletidos y grandes reordenamientos

genmicos, es decir deleciones, duplicaciones o inversiones
que pueden afectar a uno o ms genes. Segn su efecto en
la protena, las mutaciones se clasican como de cambio de
sentido (missense) cuando cambia un aminocido por otro,
de cambio sin sentido (nonsense) cuando un aminocido
cambia por un codn de parada de la traduccin. En el caso
de peque
nas deleciones o inserciones de nucletidos, estas
pueden ser en fase de lectura si la delecin es de tres o
mltiplo de tres nucletidos, eliminndose o insertndose
aminocidos o bien puede producir un cambio en la fase
de lectura (frameshift), dando lugar a un codn de parada
prematuro (tabla 3). Las mutaciones que afectan al procesamiento del ARNm se denominan mutaciones de splicing,
y son causadas por mutaciones puntuales, deleciones o
inserciones bien en la secuencia conservada donadora y
aceptora de splicing, localizadas en la unin exn-intrn o
bien en secuencias exnicas o intrnicas menos conservadas
que estn implicadas en la regulacin del proceso de splicing. El efecto es la generacin de transcritos aberrantes
portadores de deleciones de secuencias exnicas completas o parciales o inserciones de secuencias intrnicas
(pseudogen), transcritos que si son traducidos, dan lugar,
en general a protenas truncadas debido a cambios en la
fase de lectura (tabla 3). En la base de datos Human Gene
Mutation Database (www.hgmd.org; HGMD) estn tabuladas
las mutaciones descritas en los genes humanos de las EMH20 .
El conocimiento de las mutaciones en los afectos de
una determinada EMH es de gran utilidad para la bsqueda
de una posible correlacin genotipo/fenotipo clnico y bioqumico, para establecer la condicin de portador de la
enfermedad de otros miembros de la familia, para ofrecer un
diagnstico prenatal rpido y able y consejo gentico; por
ltimo, en trminos epidemiolgicos, para obtener informacin sobre frecuencia de alelos mutados y su distribucin
geogrca y poblacional. Adems, en los ltimos a
nos, el
conocimiento de la naturaleza de la mutacin y su efecto
est permitiendo el desarrollo de tratamientos personalizados basados en el genotipo del paciente21,22 .
Tcnicas convencionales de diagnstico gentico

El desarrollo de la tcnica de la reaccin en cadena de la
polimerasa en 1986 por Kary Mullis23 , supuso un hito en el
diagnstico de enfermedades genticas, ya que mediante
esta tcnica se amplica hasta 109 veces una regin de
copia nica del genoma partiendo de ADN genmico (ADNg),
obtenindose as grandes cantidades de la secuencia a
analizar. Para el anlisis de mutaciones de un gen, bsicamente, a partir del ADNg se amplican en la reaccin
en cadena de la polimerasa por separado los exones del
gen seleccionado junto con sus secuencias intrnicas anqueantes, que incluyen las secuencias aceptoras y donadoras
de splicing o se amplica el ADN complementario (ADNc),
obtenido por retrotranscripcin con la enzima transcriptasa en reverso utilizando como sustrato el ARNm. Tras la
puricacin de los fragmentos obtenidos, se someten a las
reacciones de secuenciacin mediante el mtodo enzimtico de terminacin de cadena de ADN por incorporacin de
dideoxinucletidos trifosfato (ddNTPs), mtodo de secuenciacin de Sanger24 , posterior separacin en aparatos de
electroforesis capilar y deteccin uorimtrica (g. 3A).
El anlisis partiendo de ARNm es ms rpido, ya que de
este modo se analizan todos los exones codicantes a la
vez en uno o dos fragmentos. Adems analizando el ADNc
se detectan con mayor facilidad los errores en el procesamiento del ARNm.
Existen otras tcnicas para el anlisis de reordenamientos
genmicos, que detectan grandes deleciones, inserciones, duplicaciones y disomas uniparentales. La tcnica de
multiplex-ligation dependent probe amplication, se basa
en la hibridacin con sondas especcas para los exones
del gen que se va a analizar, regiones que posteriormente
se ligan, amplican, se separan por electroforesis capilar
y detectan por uorescencia. Las deleciones se identican por disminucin o ausencia del pico correspondiente
al exn o grupo de exones delecionados. Es una tcnica
complementaria a la secuenciacin estndar ya que hay
genes en los que se producen deleciones con frecuencia
+Model
ARTICLE IN PRESS
10
Deteccin de una mutacin puntual con secuenciacin estndar de sanger.
c.483_484insT/wt
wt/c.373-?_543+?
c.483_484insT/c.373-?_543+?
150
160
Array CGH
Gen
PCCB
Deteccin de una gran delecin con un array CGH

Gran delecin en heterozigosis
g.135976819-135989453 (hg19)
de 12634 pb
Deteccin de una disoma uniparental con un array de SNPs
p.Pro113Leu/?
wt/wt
p.Pro113Leu/p.Pro113Leu
PMM2
(g.8788823-8849331)
rs12448572
(g.17980843)
D16S3395
D16S3134
D16S513
D16S3087
D16S407
D16S2613
D16S3114
D16S3131
D16S753
1
3
1
1
4
2
1
1
1
1
1
2
1
1
1
1
1
2
4
3
2
1
3
2
1
3
2
1
1
1
1
1
2
1
3
2
1/2
2/5
2/2
1/1
2/3
1/3
2/3
1/2
1/3
Figura 3 A) Secuenciacin convencional Sanger del exn 5 del gen PCCB de una muestra de ADN de un paciente con acidemia
propinica. Se observa la insercin de una T entre las posiciones 483 y 484 del cDNA en homocigosis que dar lugar a un cambio
en la fase de lectura y a la aparicin de un codn de terminacin prematura. Esta mutacin se encuentra en el alelo materno.
B) El anlisis de la segregacin mendeliana evidenci la posible presencia de una delecin que fue detectada en el alelo paterno
mediante hibridacin genmica comparada (aCGH metaboloarray). Se observa una delecin de 12,6 Mb, se indican las coordenadas
genmicas, en el cromosoma 3 que incluye parte del gen PCCB. C) Deteccin de una isodisoma uniparental segmental materna
de la regin del cromosoma 16 donde se localiza el gen PMM2, en un paciente con un defecto congnito de glicosilacin. En el
array de SNP se observa la prdida de heterozigosidad que se conrma mediante el estudio de microsatlites, lo que resulta en la
homocigosidad para la mutacin patognica p.Pro113Leu en el caso del ndice, siendo el padre no portador de la misma.
(genes OTC, GLDC, PCCA etc. . .)25 . Las tcnicas basadas en

arrays son muy verstiles y permiten el anlisis de todo el
genoma y en varias muestras a la vez. En el caso del array de
hibridacin genmica comparada (array-CGH), se identican
prdidas o ganancia de material gentico en la muestra de
ADN del paciente cuando se compara con una muestra de
ADN referencia. Bsicamente, se marcan con diferentes
uorforos el genoma del paciente y del control, se hibrida
con el array de oligos de las regiones seleccionadas y se
compara la uorescencia unida a la regin seleccionada lo
que permite detectar deleciones (prdida) o duplicaciones
(ganancia), (g. 3B). En los arrays de SNP (polimorsmos de
un solo nucletido), se analizan hasta 106 SNP del genoma; se

utilizan en estudios de ligamiento, mapeo de homozigosidad
y deteccin de disomas uniparentales, alteracin gentica
producida cuando se heredan dos cromosomas o segmentos
de un cromosoma del mismo progenitor, lo que da lugar a que
aparezca una mutacin recesiva en homozigosis cuando uno
de los progenitores no es portador de la misma (g. 3C)26 .
Por ltimo, existen otras tcnicas de rastreo de mutaciones, hoy ya prcticamente en desuso. Las tcnicas basadas
en el distinto comportamiento electrofortico de fragmentos de ADN segn su secuencia en geles desnaturalizantes
o electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante
+Model
ARTICLE IN PRESS

(Denaturing gradient gel elcetroforesis) o en geles no
desnaturalizantes (single-stranded conformational polymorphysm), permiten detectar el fragmento de ADN que
contiene la mutacin. Otro mtodo de rastreo ms actual
es el high resolution melting, basado en las diferentes temperatura de melting (temperatura a la cual se separan las
dos cadenas de ADN), de un fragmento de ADN que contiene una mutacin con respecto al fragmento control. Con
cualquiera de estas tcnicas, se requiere posteriormente la
secuenciacin estndar (Sanger) del fragmento seleccionado
para precisar la mutacin especca.
Para un correcto asesoramiento gentico en todos los
casos es imprescindible el anlisis de la segregacin mendeliana en muestras de los padres, para conrmar la presencia
de las mutaciones en alelos diferentes en el caso de enfermedades de herencia autsomica recesiva, para detectar
posibles deleciones o disomas uniparentales en los casos
en los que se haya detectado la mutacin en homocigosis y
para poder identicar mutaciones de novo en enfermedades
autosmicas dominantes o ligadas al cromosoma X.
Cribado neonatal de los EMH por tndem

masas (MS/MS)
El cribado neonatal de enfermedades endocrinometablicas es una actividad esencial dentro de la salud
pbica y tiene como objetivo la deteccin presintomtica
de estas enfermedades mediante pruebas que puedan
aplicarse a toda la poblacin de recin nacidos, de manera
que la intervencin mdica a tiempo reduzca la morbilidad,
mortalidad y las posibles discapacidades asociadas a dichas
enfermedades. Ya hace 50 a
nos se inici el cribado masivo
en recin nacidos de la fenilcetonuria o deciencia del
enzima fenilalanina hidroxilasa, que si no es diagnosticada
y tratada precozmente, produce retraso mental grave y
otras secuelas neurolgicas. El mtodo utilizado estaba
basado en un sistema de inhibicin bacteriana utilizando
sangre seca impregnada en papel de ltro que se toma
del taln de los recin nacidos27 . A lo largo de los a
nos,
se han desarrollado diferentes tcnicas analticas para
el cribado de diferentes EMH, cromatografa en papel,
cromatografa en capa na, uorometra, colorimetra,
radioinmunoensayo etc. Actualmente, la combinacin del
sistema de ionizacin ESI con la espectrometra de masas en
tndem (ESI-MS/MS) es la tcnica utilizada para la medida
de la concentracin de aminocidos y acilcarnitinas en
los programas de cribado neonatal ampliados de todo el
mundo28 . De manera que se detectan un importante nmero
de EMH que afectan al metabolismo de aminocidos, cidos
orgnicos y de la -oxidacin mitocondrial de cidos grasos.
Los aminocidos y las acilcarnitinas se extraen de la muestra en papel y se analizan bien derivatizndose mediante
butilacin (formacin de butil-esteres) que favorece la
ionizacin o bien sin derivatizar. La mayora de los aminocidos tienen la caracterstica de perder un fragmento
neutro de 102 Da al chocar con las molculas del gas en
el interior del espectrmetro, generndose un perl de
fragmentos reproducible (NL102). Los aminocidos bsicos
solo se pueden analizar mediante el mtodo de medida
de mltiples iones (multiple reaction monitoring), basado
en la seleccin del fragmento caracterstico de cada uno
11
de ellos. Tambin las acilcarnitinas tienen la caracterstica

comn de perder un fragmento de masas de 85 Da de carga
positiva cuando se someten a los choques moleculares
dentro del espectrmetro (PS85), obtenindose un espectro
de masas que cubre las acilcarnitinas desde 2 (C2) hasta 20
tomos de carbono (C20). La mayora de los programas de
cribado actuales utilizan la combinacin de ensayo de NL102
para aminocidos, de multiple reaction monitoring para
aminocidos bsicos y PS85 para la carnitina y acilcarnitinas
de forma secuencial.
En la actualidad, no existe an un consenso sobre el
nmero de patologas que deben cribarse. La comisin Europea elabor un informe publicado en 2012, en el que se
pone de maniesto las diferencias existentes entre pases
e incluso entre regiones del mismo pas29,30 . En el a
no 2006,
el Consejo Interterritorial del Sistema Nacional de Salud
bajo la coordinacin del Ministerio de Sanidad y Asuntos
Sociales, elabor un informe analizando la situacin de las
actividades del cribado neonatal en las diferentes CC.AA.
espa
nolas. En las conclusiones se recomienda una revisin
interna de los programas de cribado que garantice el acceso
a las mismas detecciones independientemente del lugar de
nacimiento del recin nacido (equidad), e insta a la creacin de un grupo de trabajo de expertos que denan los
criterios a utilizar para incorporar nuevas patologas a cribar y cules han de ser estas patologas. Con este motivo,
se elabor un documento en el que se reformulan estos criterios y se hace una valoracin de las patologas en base a
su importancia en la literatura cientca, proponindose un
panel de 24 enfermedades endocrinas y metablicas recomendables para cribar (tabla 4)31 . El 23 de julio de 2013 se
aprob en el Pleno del Consejo Interterritorial del Sistema
Nacional de Salud la relacin de enfermedades que formarn
parte del programa de cribado neonatal de enfermedades endocrino-metablicas del Sistema Nacional de Salud:
hipotiroidismo congnito, fenilcetonuria, brosis qustica,
deciencia de acil-CoA deshidrogenasa de cadena media
(MCADD), deciencia de 3-hidroxi acil-CoA deshidrogenasa
de cadena larga (LCHADD), acidemia glutrica tipo I (GA-I)
y anemia falciforme.
Diagnstico gentico de los EMH por

secuenciacin masiva
La tecnologa de la secuenciacin masiva del ADN con los
equipos de secuenciacin de nueva generacin (next generation sequencing) permite la secuenciacin del genoma
completo o del exoma celular (suma de los exones o regiones codicantes ms regiones intrnicas adyacentes) de
forma cada vez ms rpida y ecaz y est suponiendo
un avance sin precedentes en la elucidacin de las bases
moleculares de miles de enfermedades genticas, entre
ellas las EMH. En el mercado existen diferentes instrumentos para la secuenciacin masiva, pero para todos se
utiliza un esquema de trabajo similar. Se requiere la fragmentacin del ADN y amplicacin clonal masiva de los
fragmentos generados seguida de bien pirosecuenciacin
(plataforma Roche 454/FLX), bien secuenciacin por sntesis
(plataforma Illumina) o bien secuenciacin en una reaccin de ligacin (plataforma SOLID)32 . Tras la generacin
de libreras clonales, se alinean las miles de secuencias
+Model
ARTICLE IN PRESS
12
Tabla 4
Patologas recomendables para introducir en los programas de cribado neonatal y metabolito marcador
Aminoacidopata
Metabolito marcador
Hiperfenilalaninemia/fenilcetonuria
Defectos en la metabolismo de BH4
Enfermedad de la orina con olor a Jarabe de arce
Tirosinemia tipo 1
Homocistinurias
Defectos en la -oxidacin de cidos grasos
Def. de acilCoA deshidrogenasa de cadena media
Aumento
Aumento
Aumento
Aumento
Aumento
Def. primaria de carnitina

Def. 3-hidroxiacilCoA deshidrogenasa de cadena larga
Def. acilcoA deshidrogenasa de cadena muy larga

Def carnitina palmitoil transferasa 1
Def. carnitina palmitoil transferasa 2
Def carnitina/acilcarnitina translocasa
Acidemias orgnicas
Aciduria glutrica
Aciduria isovalrica
Acidurias metilmalnicas (MUT, CblA, CblB, CblC, CblD)
Acidemia propinica
Aciduria 3-hidroxi-3-metilglutrica
Def. beta cetotiolasa
Otras enfermedades endocrino-metablicas
Hipotiroidismo congnito
Hemoglobinopatas
Fibrosis qustica
Galactosemia
Deciencia biotinidasa
generadas con la secuencia del genoma humano de referencia. La gran cantidad de variantes detectadas se ltran
por una serie de programas informticos hasta determinar
cules podran ser las variantes causantes de enfermedad. Bsicamente, se analiza su presencia o no en bases
de datos de polimorsmos (dbSNP, db 1000 genomas, EVS,
db del laboratorio) y de mutaciones ya descritas [HMGD]),
se analiza su efecto funcional sobre la protena, siendo
buenas candidatas las variantes de cambio de sentido,
peque
nas duplicaciones o inserciones que afectan a la fase
de lectura (generan frameshifts o codones de parada de
la traduccin) o que afectan a las regiones conservadas
del procesamiento del ARNm. Las variantes de cambio aminoacdico (missense) se evalan mediante anlisis
estructural en programas bioinformticos (SIFT,polyphen2
etc.), que predicen su efecto patognico sobre la protena
de
de
de
de
de
fenilalanina (Phe) y cociente Phe/Tyr

fenilalanina (Phe) y cociente Phe/Tyr
leucina + isoleucina (Leu + Ile) y valina (Val)
succinilacetona (SA) y tirosina (Tyr)
metionina (Met) y homocisteina (Hcys)
Aumento de octanoilcarnitina (C8), hexanoilcarnitina (C6),

decanoilcarnitina (C10), decenoilcarnitina (C10:1) y cociente
C8/C10
Disminucin de carnitina libre (C0)
Aumento de 3-OH palmitoilcarnitina (C16OH), 3-OH
palmitoleilcarnitina (C16:1-OH), 3-OH oleilcarnitina
(C18:1-OH), 3-OH estearoilcarnitina (C18-OH) y cociente
C16-OH/C16
Aumento de miristoleilcarnitina (C14:1), miristoilcarnitina
(C14), miristodienoilcarnitina (C14:2) y cociente C14:1/C16
Aumento de C0; disminucin de palmitoilcarnitina (C16) y
estearilcarnitina (C18) y aumento del cociente C0/(C16 + C18)
Aumento de C16, C18, oleilcarnitina (C18:1) y linoleilcarnitina
C18:2)
Aumento de C16, C18, C18:1 y C18:2
Aumento de glutarilcarnitina (C5-DC) y del cociente C5-DC/C16
Aumento de isovalerilcarnitina (C5)
Aumento de propionil-carnitina (C3) y cocientes C3/C2
(acetilcarnitina) y C3/C16
Aumento de C3 y cocientes C3/C2 y C3/C16
Aumento 3-hidroxi-isovalerilcarnitina (C5OH) y
3-metilglutarilcarnitina (C6DC)
Aumento de 2-metil-3-hidroxibutirilcarnitina o
3-hidroxi-isovalerilcarnitina (C5OH) y tiglilcarnitina (C5:1)
Aumento de tirotropina (TSH) y disminucin de tiroxina (T4)
Alteracin en la movilidad electrofortica de hemoglobina S y
(Hb A, F, A2, S, C, E y D)
Aumento de la tripsina inmunorreactiva (IRT); anlisis de
mutaciones en el gen CFTR
Aumento de galactosa-1-fosfato; disminucin de actividad
Galactosa-1-P uridiltransferasa (GALT)
Disminucin de actividad biotinidasa
(g. 4). En todos los casos, las mutaciones se conrman

analizando la segregacin mendeliana en ADN de los padres
mediante la secuenciacin de Sanger. La secuenciacin
masiva del exoma se est utilizando en la prctica clnica,
en algunos casos mediante la estrategia de paneles para
grupos de EMH clnicamente denidos pero con gran heterogeneidad gentica, como por ejemplo las enfermedades
mitocondriales33 o los defectos congnitos de glicosilacin34 .
Elaboracin de informes de laboratorio

El ESHG Quality Committee ha publicado muy recientemente
unas recomendaciones para la elaboracin de informes en
un intento de armonizar su presentacin en Europa y pases vecinos35 . El informe es un documento mdico emitido
desde el laboratorio al clnico que enva las muestras en
+Model
ARTICLE IN PRESS
Sntomas
Consanguinidad
Retraso madurativo
Hipoplasia cerebelosa
Ataxia
Alteraciones oculares (Nistagmus)
Hepatopata
Transferrina alterada (35% disialoTfr)
13
SNV detectadas: 8167

Genes: 2907
SNV damaging: 403 (LOF,
damaging missense)
317 genes
SRD5A3 gene (4q12, NM_024592,4)

26,99 kb
Forward strand
Alelo materno
p. Trp19Ter (c.57G>A)
Chr4: g.56212560
CM107196 (HGMD)
MAF: 0
Alelo paterno
Figura 4 Estudio gentico en un caso con sospecha clnica y bioqumica de un defecto congnito de glicosilacin. Se analiz
el ADN del paciente utilizando el panel de genes TrusightOne, para el anlisis del exoma de 4800 genes del OMIM relacionados
con enfermedad. Tras la captura y secuenciacin de los fragmentos en un Myseq, se alinearon las secuencias y se detectaron 403
variaciones de un solo nucletido (SNV-single nucleotide variation) patognicas, de las cuales una (c.57G > A) se encontraba en la
regin codicante del gen SRD5A3 en homocigosis. Este cambio tiene un efecto presumiblemente severo, ya que da lugar a un
codn de parada prematuro (p.Trp19Ter). La presencia de la mutacin en homocigosis se conrm en muestras de los padres por
secuenciacin Sanger.
las que se reeren los resultados interpretados de las pruebas bioqumicas y genticas realizadas al paciente. Debe
ser claro, conciso, preciso e interpretativo, con el objetivo
ltimo de proporcionar respuestas tiles para el diagnstico
del paciente.
graves y la deteccin en un recin nacido de mutaciones

relacionadas con enfermedad o riesgo de enfermedad de
comienzo en la edad adulta requerirn un buen asesoramiento gentico41 .
Conicto de intereses
Conclusin
Los autores declaran no tener ningn conicto de intereses.
La implementacin de los dos avances tecnolgicos ms interesantes de los ltimos a
nos, la espectrometra de masas
para el anlisis de metabolitos y protenas, y la secuenciacin masiva en el anlisis del ADN, han tenido y van a seguir
teniendo un gran impacto sobre el modo de diagnosticar
las EMH. Tanto para el cribado de poblacin asintomtica
(neonatal) como para el de la sintomtica, la espectrometra de masas tiene un gran potencial en el desarrollo de
mtodos muy sensibles para la identicacin y cuanticacin
de metabolitos (metaboloma)36 o protenas (proteoma)37 en
muestras humanas no invasivas38 . Por otro lado, los mtodos para la secuenciacin masiva del genoma y del exoma
son cada vez ms econmicos y rpidos en la obtencin de
resultados y parece inevitable en un futuro no muy lejano
su aplicacin en el diagnstico prenatal39 o en el cribado
de poblacin asintomtica. Aunque en este caso, todava
quedan numerosas cuestiones prcticas y ticas que resolver, especialmente las que se derivan de la necesidad de
la aceptacin por parte del paciente o de sus padres de
un consentimiento informado complejo, y del manejo de
numerosos datos genticos, algunos de ellos de signicado
incierto40 . La identicacin de portadores de enfermedades
Agradecimientos
Los autores agradecen a todo el personal cientco, tcnico
y administrativo del Centro de Diagnstico de Enfermedades Moleculares de la Universidad Autnoma de Madrid, su
excelente trabajo durante estos a
nos, muy especialmente
a su directora, la Profesora Magdalena Ugarte. Tambin
agradecen a Rosa Navarrete la composicin de las guras
de este trabajo.
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El Laboratorio en El Diagnóstico de Las Enfermedades Metabólicas Hereditarias. Impacto de Las Nuevas Tecnologías

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LABCLI-241; No. of Pages 15

Revista del Laboratorio Clnico

El laboratorio en el diagnstico de las enfermedades

Resumen Las enfermedades metablicas hereditarias son enfermedades mendelianas que

The impact of new technologies in the laboratory diagnosis of inherited metabolic

Autor para correspondencia.

Abordaje del diagnstico de las EMH

el ms comnmente afectado. El diagnstico exacto de la

El laboratorio en el diagnstico de las EMH

El laboratorio en el diagnstico de las enfermedades metablicas hereditarias

1.-Enfermedades del metabolismo

SDHA, SURF1 y otros

2.-Enfermedades del metabolismo

3.-Enfermedades del metabolismo

4.-Enfermedades del metabolismo

5.-Enfermedades del metabolismo

6.-Enfermedades del metabolismo

12.-Enfermedades del metabolismo

14.-Enfermedades del metabolismo

Anemia megaloblstica con respuesta a

casos, diagnstico de una EMH y en otros permite orientar

El laboratorio en el diagnstico de las enfermedades metablicas hereditarias

Defectos biosntesis colesterol

Defectos metabolismo cidos

elucin se produce por el ujo de una fase mvil de gas

LABCLI-241; No. of Pages 15

El laboratorio en el diagnstico de las enfermedades metablicas hereditarias

GC-MS de cidos orgnicos

110 120 130

hemoglobinopatas14 , defectos congnitos de glicosilacin15

LABCLI-241; No. of Pages 15

Isoformas de la transferrina por IEF

Isoformas de la transferrina por HPLC

Isoformas de la ApoC3 por IEF

Def. congnito combinado

Figura 2 Anlisis de las isoformas de la N-glicoprotena transferrina y de la

como por ejemplo la oxidacin de 14 C-propionato para el

El laboratorio en el diagnstico de las enfermedades metablicas hereditarias

Tipo de mutaciones y nomenclatura

c.2041-2A>G (IVS22-2A>G); delecionexon 23

uno o unos pocos nucletidos y grandes reordenamientos

Tcnicas convencionales de diagnstico gentico

Deteccin de una mutacin puntual con secuenciacin estndar de sanger.

Deteccin de una gran delecin con un array CGH

Deteccin de una disoma uniparental con un array de SNPs

(genes OTC, GLDC, PCCA etc. . .)25 . Las tcnicas basadas en

un solo nucletido), se analizan hasta 106 SNP del genoma; se

El laboratorio en el diagnstico de las enfermedades metablicas hereditarias

Cribado neonatal de los EMH por tndem

de ellos. Tambin las acilcarnitinas tienen la caracterstica

Diagnstico gentico de los EMH por

Def. primaria de carnitina

Def. acilcoA deshidrogenasa de cadena muy larga

fenilalanina (Phe) y cociente Phe/Tyr

Aumento de octanoilcarnitina (C8), hexanoilcarnitina (C6),

(g. 4). En todos los casos, las mutaciones se conrman

Elaboracin de informes de laboratorio

El laboratorio en el diagnstico de las enfermedades metablicas hereditarias

SNV detectadas: 8167

SRD5A3 gene (4q12, NM_024592,4)

graves y la deteccin en un recin nacido de mutaciones

El laboratorio en el diagnstico de las enfermedades metablicas hereditarias

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