Manual de Bacteriologia

MANUAL DE
BACTERIOLOGIA.
INTRODUCCIN.
El presente Manual contiene los procedimientos de rutina en el Laboratorio de

Bacteriologa, con el fin de conocer las vas bioqumicas y metablicas que
sirven de base en las identificaciones bacterianas, a la vez se hace mencin de
las normas de bioseguridad tiles para mantener la seguridad dentro del
laboratorio y de quienes laboran en el, as como tambin normas generales en
toma, manejo y envo de muestras para los diferentes anlisis bacteriolgicos, y
su respectivo control de calidad.
CONSIDERACIONES PARA SU PROTECCIN PERSONAL
Todas
las
muestras
de
especmenes
biolgicos
deben
considerarse potencialmente infecciosas.

Vacunarse contra los principales agentes infecciosos.
Procurar no producir "salpicaduras" con la muestra obtenida.
Debe limpiarse y desinfectarse cualquier superficie contaminada
por algn espcimen biolgico.
Lavarse las manos correctamente, despus de haber tenido
contacto
con
cada
paciente
al
concluir
cualquier
procedimiento.
No deben ingerirse comidas, bebidas, goma de mascar o fumar
durante los diferentes procedimientos en el Laboratorio.
Vigile que los elementos de trabajo estn en perfectas
condiciones fsicas. Algn elemento en mal estado, podra
causarle una herida.
ESTERILIZACIN
Proceso mediante el cual se eliminan todas las formas de vida de los
microorganismos de un objeto o de una sustancia para evitar su
reproduccin.
ASEPSIA: Libre de microorganismos.
MTODOS DE ESTERILIZACIN
Comprende
todos
los
procedimientos
fsicos,
mecnicos
preferentemente qumicos, que se emplean para destruir grmenes

patgenos. A travs de esta, los materiales quirrgicos y la piel del
enfermo
alcanzan
un
estado
de
desinfeccin
que
evita
la
contaminacin operatoria. Hay varias formas de esterilizar como:
MTODOS QUMICOS
Estos
mtodos
provocan
la
perdida
de
viabilidad
de
los
microorganismos.
Hipoclorito de Sodio: Es el ms utilizado por su fcil
adquisicin y por su efectividad en la desinfeccin. Vida media
20 minutos.
xido de etileno: Destruye todos los microorganismos incluso
virus.
Aldehdos: Son agentes alquilantes que actan sobre las

protenas. Estos compuestos destruyen las esporas.
Glutaraldehdo: Este mtodo tiene la ventaja de ser rpido y
ser el nico esterilizante efectivo fro.
Formaldehdo: Las pastillas de formalina a temperatura
ambiente esterilizan en 36 horas.
Alcohol: Esteriliza superficies, pero se evapora fcilmente.
MTODOS FSICOS
Calor: La utilizacin de este mtodo y su eficacia depende de
dos factores: el tiempo de exposicin y la temperatura. Todos los
microorganismos son susceptibles, en distinto grado, a la accin
del calor.
El calor provoca desnaturalizacin de protenas, fusin y
desorganizacin de las membranas y/o procesos oxidantes
irreversibles en los microorganismos.
Calor Hmedo: El calor hmedo produce desnaturalizacin y
coagulacin de protenas.
Autoclave: Se realiza la esterilizacin por el vapor de agua a
presin. El modelo ms usado es el de Chamberland. Esteriliza a
121 C, 15Lb de presin, por 20 minutos.
Calor seco: El calor seco produce desecacin de la clula, es
esto txico por niveles elevados de electrolitos, fusin de
membranas.
Estufas Hornos: Doble cmara, el aire caliente generado por

una resistencia, circula por la cavidad principal y por el espacio
entre ambas cmaras, a temperatura de 170 C para el
instrumental metlico y a 140 C para el contenido de los
tambores.
NORMAS DE BIOSEGURIDAD
Mantenga el lugar de trabajo en ptimas condiciones de higiene

y aseo.
Evite fumar, beber y comer cualquier alimento en el sitio de

trabajo.
NO SE DEBE UTILIZAR EL TELEFONO CELULAR DENTRO DEL

LABORATORIO DE BACTERIOLOGIA.
No guarde alimentos, en las neveras ni en los equipos de

refrigeracin de sustancias contaminantes o qumicos.
Lvese cuidadosamente las manos antes y despus de cada

procedimiento e igualmente si se tiene contacto con material
patgeno.
Utilice en forma sistemtica guantes plsticos o de ltex en

procedimientos que con lleven manipulacin de elementos
biolgicos
y/o
cuando
maneje
instrumental
equipo
contaminado.
Abstngase de tocar con las manos enguatadas alguna parte del

cuerpo y de manipular objetos diferentes a los requeridos
durante cualquier procedimiento.
Emplee
mascarilla
procedimientos
que
protectores
puedan
generar
oculares
durante
salpicaduras
goteos,
aerosoles de sangre u otros lquidos corporales.

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Use batas o cubiertas plsticas en aquellos procedimientos en

que se esperen salpicaduras, aerosoles o derrames importantes
de sangre u otros lquidos orgnicos.
Evite deambular con los elementos de proteccin personal por

fuera de su sitio de trabajo.
Mantenga sus elementos de proteccin personal en ptimas

condiciones de aseo, en un lugar seguro y de fcil acceso.
Evite cualquier contacto directo de muestras si usted presenta

lesiones exudativas o dermatitis serosas, hasta tanto stas
hayan desaparecido.
Las
mujeres
embarazadas
que
trabajen
en
ambientes
hospitalarios expuestas al riesgo biolgico VIH/SIDA y/o Hepatitis

B, debern ser muy estrictas en el cumplimiento de las
precauciones universales y cuando el caso lo amerite, se deben
reubicar en reas de menor riesgo.
Aplique en todo procedimiento asistencial las normas de asepsia

necesarias.
Utilice
las
tcnicas
correctas
en
la
realizacin
de
todo
procedimiento.
Evite reutilizar el material contaminado como agujas, jeringas.
Realice desinfeccin y limpieza a las superficies, elementos,

equipos de trabajo al final dcada procedimiento y al finalizar la
jornada.
En caso de derrame o contaminacin accidental de sangre u

otros lquidos corporales sobre superficies de trabajo, cubra con
papel u otro material absorbente; luego vierta hipoclorito de
sodio (o cualquier otro desinfectante indicado) sobre el mismo y
sobre la superficie circundante, dejando actuar durante 30
minutos;
despus
limpie
nuevamente
la
superficie
con
desinfectante y realice limpieza con agua y jabn. El personal
encargado
de
realizar
dicho
procedimiento
debe
utilizar
guantes, mascarilla y bata.
En caso de ruptura de material de vidrio contaminado con

sangre u otro lquido corporal, los vidrios deben recogerse con
escoba y recogedor, nunca con las manos.
Los recipientes para transporte de muestras deben ser de

material
irrompible
cierre
hermtico.
Deben
tener
preferiblemente el tapn de rosca.
Manipule, transporte y enve las muestras disponindolas en

recipientes
seguros,
con
tapa
debidamente
rotuladas,
empleando gradillas limpias para su transporte. Las gradillas a

su vez se transportarn en recipientes hermticos de plsticos o
acrlico que retengan fugas o derrames accidentales. Adems
deben ser fcilmente lavables.
En caso de contaminacin externa accidental del recipiente,

ste debe lavarse con hipoclorito de sodio al 0.5% y secarse.
Restrinja el ingreso a las reas de alto riesgo biolgico al

personal no autorizado, al que no utilice los elementos de
proteccin personal necesarios y a los nios.
La ropa contaminada con sangre, lquidos corporales u otro

material orgnico debe ser enviada a la lavandera en bolsa
plstica roja.
Disponga el material patgeno en bolsas resistentes de color

rojo que lo identifique con smbolo de riesgo biolgico.
En caso de accidente de trabajo con material corto punzante

haga el reporte inmediato de accidente de trabajo.
GENERALIDADES
A. OBJETIVO GENERAL
Conocer las tcnicas, procedimientos y controles que se desarrollan en el
rea de bacteriologa dentro de un Laboratorio Clnico.
B. OBJETIVOS ESPECFICOS.
Verificar los controles de calidad que se llevan a cabo en el rea de

bacteriologa.
Conocer las normas de bioseguridad que se realizan en bacteriologa.
Conocer el manejo y envo de muestras en el rea de bacteriologa.
Conocer los diferentes procedimientos que se realizan en la preparacin
de medios de cultivo.
Conocer
las
diferentes
tcnicas
bacteriolgicas
aplicables
para
la
identificacin de cepas bacterianas.
I- NORMAS GENERALES DE LA TOMA, MANEJO Y

ENVI DE MUESTRAS PARA ANLISIS CLNICOS.
1. Los anlisis clnicos se practicarn a los pacientes que sean referidos al
laboratorio, por el personal autorizado del Establecimiento.
2. Todo examen deber ser solicitado en el formulario proporcionado por el
laboratorio, completando los siguientes datos:
Nombre del paciente, nmero de registro, edad, sexo, servicio que lo refiere,
sello del establecimiento, diagnstico clnico, firma y nombre de quien lo
refiere y especificar si es de urgencia.
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3. Todo paciente con solicitud de exmenes de Laboratorio, deber

presentarse a ste para que se le de la orientacin sobre la coleccin de la
muestra, la hora y la fecha en que se le recibir. Estos datos debern ser
anotados en el libro de recepcin del laboratorio.
4. Toda solicitud de examen de Laboratorio, deber revisarse confirmando los
datos requeridos y comparando los datos de identificacin del paciente y
muestra que se recibe en el laboratorio.
5. El Laboratorio Clnico de cada establecimiento para efecto de control de
exmenes llevar un libro de entrada en el que anotar el nmero
correlativo, fecha, nombre del paciente y anlisis a realizarse.
6. Los tubos, lminas, cajas de petri y frascos utilizados para colectar las
muestras, debern ser identificados inmediatamente despus de tomadas o
recibida la muestra con el nmero correlativo de Laboratorio, nombre o
iniciales del paciente.
7. Previo al envo de muestras a otro laboratorio debe hacerse contacto con
ste para notificar del envi y saber quien recibir la muestra.
8. Toda muestra clnica que se enve a otro laboratorio, debe ser transportada
en envases y condiciones que proporcionen la mayor seguridad para evitar
roturas, derramamientos de la misma o extravo.
9. En el transporte de la muestra se consideran tres aspectos importantes:
a) Protegerlas del calor excesivo.
b) Protegerlas de la luz solar.
c) Acondicionarlas en forma tal que no haya riesgo de derrame.
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10. Para el envi de la muestra es conveniente disponer o mejor dicho conocer

de la tcnica de triple embalaje, donde se pretende proteger al mximo, que
no se derrame la muestra y mucho menos contamine todo su alrededor
luego de preparar la mx., se anotar la direccin del Laboratorio al cual se
enva y se le marcarn flechas verticales indicado la posicin en que debe
mantenerse. Cada envo deber ir acompaado de la lista con la
identificacin de cada muestra contenida en la caja.
RECEPCIN DE LA MUESTRA:
Comprobar que las muestras estn bien identificadas y que correspondan a la
lista adjunta.
1. Si hay derrame del material, desinfectar el exterior del envase con algodn o
toallas de papel impregnado en fenol al 5 % u otra solucin bactericida. Si se
comprueba derrame masivo esterilizar el envase por autoclave o
incineracin
2. Notificar al servicio remitente las deficiencias que hubieren en la calidad y
cantidad de las muestras o en la forma en que se hizo el envo.
ENVI DE MUESTRAS AL LABORATORIO DE REFERENCIA.

ALMACENAMIENTO Y ENVI:
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1. Suero: Deben almacenarse entre- 20C y/o 4C y transportarse a iguales

temperaturas, evitando as el congelamiento y descongelamiento de las
mismas que daara a los microorganismos.
2. Deben hacerse: llegar al laboratorio con la mayor prontitud, y por la va ms
rpida, mximo una semana, adems cada envo de muestra debe
acompaarse con la ficha epidemiolgica correspondiente.
3. Sangre completa: Debe almacenarse a 4 C (refrigeradora) y enviarlas

rpidamente al laboratorio dentro de las 24 horas siguientes a la obtencin
de la sangre. Nunca deben congelarse, pues se hemolizan, adems siempre
deben ser acompaadas por su ficha epidemiolgica correspondiente.
4. Los sueros enviados estarn en tubos o viales perfectamente cerrados, las

tapas o tapones se aseguran bien con cinta adhesiva para que no se aflojen
con la vibracin del transporte. Se pueden sujetar con una banda de goma y
colocar cada lote en un recipiente de plstico o en una pequea bolsa del
mismo material, cada paquete se dispondr verticalmente en una hielera
que contenga bloques refrigerantes (pinginos).
5. Al enviar sangre completa debe evitarse el contacto de los bloques
refrigerantes o del hielo de agua con las paredes de los tubos, para que las
muestras no se hemolicen.
NORMAS DE BACTERIOLOGA.
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Siempre que sea posible, la muestra para cultivos tiene que ser
recolectada antes de la administracin de antibiticos.
ORINA.
La muestra para cultivo de orina puede ser por cateterismo, puncin

suprapbica, muestra limpia o de medio chorro. Esta ltima exige las siguientes
condiciones:
a) Antes de tomar la muestra practicar un cuidadoso aseo de la zona genital
con agua y jabn.
b) Colectar la primera orina de la maana o tener como mnimo 2 horas de
retencin urinaria.
c) En un frasco estril de boca ancha, tapn de rosca, transparente, recoger

una cantidad de 15 a 20 ml de orina medio chorro.
d) El tiempo transcurrido entre la toma de la muestra y su proceso, no debe
exceder de 2 horas; sino se puede procesar al recibirla, se puede refrigerar
hasta por 12 horas.
SECRECIN URETRAL.
Toma de muestra: efectuar presin suave sobre la uretra, eliminar la secrecin

luego exprimir desde atrs con fuerza y recoger la secrecin con dos hisopos
estriles, 1 para el frotis y el otro para el cultivo (Thayer Martn o Agar
chocolate).
Si la secrecin es escasa introducir en la uretra un hisopo fino y raspar la pared
uretral con delicadeza. Hacer de inmediato el frotis para coloracin de Gram e
inocular los medios de cultivo.
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Si se va a transportar colocarlo en medio de transporte de Stuart, Amies o Cary

Blair. Si no se puede sembrar de inmediato hacer frotis y mantener el hisopo en
un medio de transporte.
SECRECIN VAGINAL.
Toma de muestra: colocar a la paciente en posicin ginecolgica, introducir el

especulo, tomar la muestra con dos hisopos del endocervix y vagina; se
recomienda sea tomada por el mdico. El hisopo debe estar estril e
impregnado con solucin salina fisiolgica al 0.85% estril. Hacer de inmediato
un frotis para coloracin de Gram y hacer un examen directo al fresco,
colocando una gota de solucin salina en un porta objetos y suspender en ella
la secrecin vaginal;
cubrir
con el cubre objetos
y buscar Trichomonas
vaginalis o levaduras.
Si el examen al fresco no se puede hacer de inmediato colocar el hisopo en 0.5
mL de solucin salina, en refrigeracin no ms de 2 horas. En la coloracin de
Gram reportar Vaginosis bacteriana si hay predominio de bacilos gram
negativos.
HECES.
La muestra debe tomarse en los tres primeros das de la enfermedad y antes de

comenzar el tratamiento antimicrobiano. En los lactantes lo indicado es el
hisopado rectal. Introducir el hisopo, ( previamente humedecido con solucin
salina estril ), dos o tres cms. en el ano imprimindole movimientos de
rotacin amplia, pero con suavidad arrastrando mucosidad de la pared del
recto. En el adulto la muestra puede obtenerse del recipiente con heces o del
hisopo rectal. Las mejores muestras son aquellas diarreicas, con mucus, o con
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sangre, la muestra debe ser de 1 a 2 gramos si es slida y de 3 a 4 mL. Si es

diarreica.
Si el cultivo se hace dentro de las dos horas despus de tomada la muestra, no
se requiere medio de transporte. Pasado ese perodo se recomienda usar el
medio de transporte Cary Blair, o el caldo de Selenito o Tioglicolato.
SECRECIN FARINGEA.
La muestra debe tomarse de amgdalas y faringe, colocar al enfermo en

posicin
cmoda y buscando
la mejor
iluminacin, pedir al paciente que
pronuncie la letra A, baje la lengua suavemente con un bajalengua, frote el

hisopo con firmeza pero con suavidad en ambas caras de las amgdalas y
luego en la pared posterior de la faringe de manera que el hisopo quede
impregnado de exudado farngeo, evite tocar con el hisopo lengua y vula.
Introducir el hisopo en 1mL. de medio de enriquecimiento, 0.5 mL de caldo de
tripticasa soya, infusin cerebro corazn, o sembrar de inmediato en agar
sangre y Mac Conkey. Si hay pseudomembrana hacer un frotis y colorear por
Gram para investigar difteria.
EXPECTORACIN.
Toma de muestra: el paciente debe efectuar repetidos enjuagatorios previos con

solucin de bicarbonato de sodio o con solucin salina estril.
Tomar la primera expectoracin de la maana (este esputo debe ser purulento
no saliva). El frasco debe ser de boca ancha, con tapn de rosca y estril, debe
taparse
bien
identificarse
correctamente.
Enviarlo
al
Laboratorio
inmediatamente.
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SECRECIN NASAL.
Introducir el hisopo con solucin salina estril profundamente en direccin
paralela al piso de la fosa nasal. Frotar suave y firmemente (1 minuto en cada
fosa nasal). Colocar el hisopo en 0.5 mL. De caldo de tripticasa soya o inocular
de inmediato en agar sangre y Mac Conkey.
SECRECIN OCULAR.
La muestra debe tomarse con cuidado y con la ayuda de otra persona para que
inmovilice la cabeza del paciente. Previa separacin del prpado inferior con el
pulgar de la otra mano, tomar con un hisopo de la secrecin conjuntival dirigida
hacia el ngulo interno del ojo, rotar el hisopo suavemente (tomar 2 hisopos uno
para lcera corneal) sembrar en el medio de agar sangre, Mac Conkey,
tioglicolato y tambin un tubo de sabouraud.
En este caso es recomendable que el oftalmlogo, con anestesia local tome la

muestra con careta. Siempre hacer examen directo.
SECRECIN OTICA.
Con dos hisopos colectar el pus del conducto auditivo externo. Hacer un frotis y
teirlo con Gram e inocular en agar sangre, agar chocolate y agar Mac Conkey.
PUS DE HERIDAS.
En un absceso cerrado si el contenido es fluido extraer con jeringa, si el

absceso es abierto tomar con un hisopo o bistur de las paredes internas y no
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del centro: hacer frotis de inmediato y colocar los hisopos en medio de

tioglicolato.
LESIONES DE LA PIEL.
Lavar con agua, jabn y desinfectar con alcohol o yodo. Primero remover las
costras y la piel que cubre las pstulas o vesculas, frotar firmemente con
hisopo o bistur dentro de la lesin. Si la lesin es seca usar hisopo hmedo y
colocarlo en caldo tioglicolato.
SANGRE.
Para la toma de muestra realizar aseo cuidadoso con jabn y agua despus
aplicar tintura de yodo al 1% y luego limpiar con alcohol al 70%. Con jeringa
colectar 5 a 10 mL. Y colocar en medio de cultivo lquido en volumen 10 veces
mayor.
LQUIDOS CEFALORRAQUDEO Y OTROS

LQUIDOS DE DERRAME.
Este examen es uno de los de mayor urgencia dentro del Laboratorio
Bacteriolgico, por lo cual debe examinarse sin demora ya que la enfermedad
es de evolucin rpida y de alta mortalidad o de secuelas importantes. Es
bsico la identificacin del agente causal y su antibiograma. Se necesitan de 1
a 2 mL. De muestra en tubos de tapn de roscas estriles, enviarlos al
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Laboratorio a temperatura ambiente: usualmente se toman 2 tubos uno para

bacteriologa y otro para qumica. Si no es posible, primero procesar
bacteriologa y luego remitirlo para qumica, la muestra debe guardarse en la
estufa a 35C. Hasta completar la rutina. Centrifugar la muestra y con el
sedimento inocular los medios de cultivo y hacer un frotis para Gram y una
preparacin con tinta china.
1. PUS.
Si las lesiones son cerradas colectar en jeringa gruesa, previa asepsia con
yodo. Si las lesiones son abiertas, lavar primero con agua y jabn y colectar
con bistur el pus del borde de las lesiones.
Colocarlo directamente en los medios de cultivo o en porta - objetos. Si el
pus es abundante colocarlo en un tubo estril con tapn de rosca.
2. SECRECIONES.
Lavado bronquial, lquidos de derrame, LCR, mdula sea y biopsia. Sern
colectadas por el mdico con estricta asepsia y colocadas en un tubo estril
con tapn de rosca u otro recipiente estril sin preservativo.
Las muestras deben ser procesadas de inmediato y si no es posible,
guardarlas en refrigeracin no ms de 24 horas.
EXAMEN DIRECTO.
3. SECRECIONES VAGINALES, URETRALES Y ORALES.
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Colocar una gota de secrecin en un porta objeto y cubrir con laminillaexaminar al microscopio. Es recomendable hacer simultneamente un frotis
de la secrecin y colorearla por Gram.
4. PUS Y MEDULA
Hacer un frotis delgado en un portaobjeto y colorearlo por Giemsa.
5. ESPUTO Y LAVADO BRONQUIAL.

Seleccionar las porciones purulentas y hacer frotis y colorear por Giemsa al
mismo tiempo hacer una preparacin con KOH al 10 20%.
6. LIQUIDO CEFALORRAQUIDEO Y LQUIDOS DE DERRAME
Centrifugar la muestra a 3000 rpm. Por 15 minutos. Del sedimento tomar 1 gota
pequea y colocarla a la par de una gota de tinta china. Cubrir ambas gotas con
una laminilla para que se forme un gradiente de color negro.
Observar con el objetivo 10 x; si se ven crculos claros, contra fondo negro
observar con el 45x para apreciar la morfologa. Adems colocar una gota del
sedimento en un porta objeto y dejar secar. Colorear por Giemsa y observar con
objetivo de inmersin, esto para LCR. En caso de lquido pleural y asctico se
agrega 3 gotas de citrato de sodio al 10% por cada 10 ml. Y se conserva en
refrigeracin si la muestra no se procesar inmediatamente.
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7. BIOPSIA.
Macerar el tejido con 1 mL. De solucin salina en un mortero
homogenizador
estril, preparar un frotis y colorear
o con un
con Giemsa y hacer
preparacin al fresco.
8. SANGRE.
Colocar la sangre en un tubo de Wintrobe y centrifugar a 3000 rpm. Por 15
minutos. Con pipeta Pasteur descartar el plasma y tomar 1 gota de la capa de
leucocitos, preparar un frotis en un porta objetos y colorearlos por Giemsa.
CONTROL DE CALIDAD.
1. ALMACENAMIENTO DE CULTIVO DESHIDRATADOS:
Los medios de cultivo deshidratados son higroscpicos y absorven agua del
exterior, (as como la formacin de agua dentro de una botella) como
consecuencia de las fluctuaciones de temperatura en el ambiente. Adems
favorecen el crecimiento bacteriano. Esto puede conducir al consumo de
nutrientes, variaciones de pH y cambios de color en el medio. Tambin la
exposicin a la luz puede llevar a cambios importantes o alteraciones en los
constituyentes del medio de cultivo.
21
Tomando en cuenta los factores antes sealados, los medios de cultivo

deshidratados deben almacenarse siempre en un lugar fresco, protegidos
contra la humedad y la luz. Cuando se requiera abrir un frasco, debe hacerse
en un lugar seco, utilizando condiciones de almacenamiento adecuadas, los
medios elaborados en forma de polvo tienen una vida til de al menos un ao y
los medios en forma granular tienen una duracin de al menos tres aos. Para
asegurarnos que un medio de cultivo est en buen estado, es conveniente
marcar cada frasco de medio con la fecha en que fue recibido y tomarse las
previsiones necesarias para que la existencia del mismo en bodega cubra las
necesidades del laboratorio por perodos de al menos seis meses. De esta
manera controlaremos su vida til y evitaremos que se nos deterioren durante el
almacenamiento.
El material que ha sufrido cambios sustanciales, tales como hidratacin y
endurecimiento, debe descartarse.
2. RECONSTITUCIN O REHIDRATACIN.
El grado de disolucin del medio deshidratado, as como la eficacia del medio
de cultivo ya preparado dependen en gran medida del procedimiento empleado
en la rehidratacin.
Debe
emplearse
siempre
agua
recin
destilada
completamente
desmineralizada y erlenmeyers con un volumen, al menos, dos veces mayor a

la cantidad de medio que se va a preparar. Siempre se agrega la cantidad
indicada de medio deshidratado a la mitad del volumen de agua requerido, se
mezcla vigorosamente hasta obtener una suspensin homognea y luego, se
agrega el resto del agua asegurndose que cualquier partcula de medio
adherida a la pared del erlenmeyers sea lavada en el proceso.
22
Se ajusta el pH del medio al valor que establece la casa fabricante. Para este
propsito, se utilizan soluciones de NaOH y HCL 0.1 N y un potencimetro
debidamente calibrado. En el caso que no se disponga de ste y para medios
que no tengan colorantes o indicadores pueden utilizarse las tiras del pH.
Si un medio de cultivo contiene Agar, gelatina o cistina, es indispensable
calentarlo en un bao de agua hirviendo y agitarlo frecuentemente hasta lograr
su disolucin completa. Esta se logra cuando no se observen partculas
adheridas a la pared del erlenmeyer y el medio disuelto se observe homogneo.
Una vez logrado el propsito anterior, debe suspenderse el calentamiento, ya
que un exceso del mismo puede ocasionar deterioro de algunos constituyentes
del medio, tornndolo inadecuado.
Si el medio debe ser distribuido en tubos (TSI, Citrato, etc.) debe agitarse
frecuentemente para asegurar una distribucin homognea del mismo en cada
tubo. Los medios que no contienen agar, gelatina o cistina se solubilizan sin
necesidad de calentarlos.
3. ESTERILIZACIN.
El medio de cultivo una vez disuelto (y distribuido en tubos si fuera necesario)
debe someterse al proceso de esterilizacin, excepto aquellos que no lo
requieran (agar Salmonella Shiguella, por ejemplo).
Deben seguirse las instrucciones en cuanto a tiempo y temperatura para
asegurarse la obtencin de medios de cultivo tiles. Debe tenerse en mente que
la presin vara de acuerdo con la altura y por tanto no es un factor constante.
23
De tal manera que son el tiempo y la temperatura los parmetros que deben
tomarse en consideracin en el proceso de autoclavado.
3. DISTRIBUCIN DEL MEDIO EN PLACAS.

El medio esterilizando debe enfriarse a 45- 50C en un bao mara ajustado a
esa temperatura para evitar la formacin de agua de condensacin. Debe ser
vertido en las placas evitando la formacin de burbujas. En caso de que stas
se presenten, pueden ser eliminadas por calentamiento en la superficie del
medio con ayuda de la llama del mechero. Durante el vaciado los componentes
del medio deben estar distribuidos uniformemente, por lo que es necesario
agitarlo con frecuencia. Si el medio de cultivo se ha enfriado a 45-50C, el agua
de condensacin que pueda formarse en las placas ser poca y por tanto,
pueden mantenerse cerradas para evitar contaminacin.
Debe guardarse una pequea cantidad del medio para determinar el pH
despus de autoclavado. Si el valor no es el indicado para el medio, descrtelo.
5. PRUEBA DE ESTERILIDAD.
Para cada lote que se prepare debe tomarse una muestra de un 10% y
someterla a control de esterilidad a 35C por 24 horas. Este procedimiento dar
una idea sobre la contaminacin obtenida en la preparacin del medio.
Esto a su vez permitir determinar si se deben tomar medidas ms rigurosas en
la limpieza y desinfectacin del sitio en que se preparan los medios de cultivo y
en el procedimiento de distribucin del medio.
6. ALMACENAMIENTO DEL MEDIO PREPARADO.
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El medio de cultivo reconstituido tiene una vida til limitada. Si no se emplea de

inmediato, debe almacenarse bajo condiciones apropiadas para garantizar su
utilidad durante un perodo de tiempo.
El almacenamiento a 4C es el mejor para la mayora de los medios. Sin
embargo, aquellos que contienen tioglicolato es indispensable mantenerlos a
temperatura ambiente para que mantengan su viabilidad.
Los medios deben mantenerse en sitios oscuros, ya que la luz puede afectar
algunos de sus componentes. Para evitar la desecacin los medios pueden
guardarse en bolsas plsticas bien cerradas. Las placas de petri almacenadas
de esta forma deben colocarse con el fondo hacia arriba.
Dado que los medios almacenados

temperatura
ambiente
tienden
en refrigeracin cuando pasan
a formar
agua de
condensacin en la
superficie, se recomienda poner las placas en el incubador a 35C por un

perodo de dos horas, colocndolas con el fondo hacia arriba. De esta manera
se obtendr una superficie seca.
CONTROL DE CALIDAD EN TINCIONES Y PRUEBAS DE IDENTIFICACIN.
Para determinar que los reactivos empleados tanto en tinciones como en

pruebas de identificacin bacteriana funcionen adecuadamente, deben utilizarse
bacterias que muestren las diferentes caractersticas distintivas para cada
prueba o tincin.
Para ello, deben hacerse controles diarios con las cepas bacterias de referencia
y seguir estrictamente las indicaciones en cuanto al almacenamiento de
reactivos, inoculacin de medios, perodos de incubacin, metodologa para
efectuar las pruebas y tiempo de lectura de las mismas.
25
PREPARACION DE MEDIO DE CULTIVO.

Los medios de cultivo usados en Bacteriologa contienen los nutrientes y factores
fsicos y qumicos (pH, concentracin de iones), necesarios para la reproduccin
bacteriana. Existe una gran variedad de medios de cultivo. Los medios lquidos permiten
la proliferacin bacteriana por todo el medio, son de fcil manejo. Los medios slidos
permiten el crecimiento aislado de grupos de bacterias (colonias) cuyas caractersticas
macroscpicas sirven de gua para la identificacin de ciertas bacterias.
MATERIAL.
26
Soporte con maya metlica
Frascos Erlenmeyer o balones volumtricos con tapn de algodn o gasa
Cajas de Petri
Baja lenguas de madera y/o varilla de vidrio.
Balanza
Agua destilada
Probetas tubos de ensayo
Autoclave
Mecheros
PROCEDIMIENTO.
MEDIO DE CULTIVO LQUIDO
1. se pesa el medio a preparar sobre una balanza granatara o digital (calibrada
previamente). Se observan las especificaciones en el frasco.
2. el medio (polvo) debe ser pesado sobre un papel o recipiente para que no haga
contacto con la superficie de la balanza, teniendo en cuenta que hay que llevar a
cero la balanza ya con el peso del recipiente o el papel que se utilizara.
3. colocar agua destilada en un Erlenmeyer (el volumen se mide en una probeta)
segn especificaciones del medio a preparar y tambin depender de la cantidad
que se necesita, si en caso se necesita menos de la cantidad descrita en la frmula
del medio; se hace la relacin con una simple regla de 3, para ver la proporcin
de soluto y solvente que se necesita.
4. agregar el medio deshidratado. Disolver por agitacin y calentamiento hasta que
empiece a hervir. Luego esterilizar en autoclave a (121 C de temperatura con
una presin de 15 lbs. Con un tiempo de 15 minutos).
27
5. despus de esterilizar se procede a colocar el medio de cultivo sobre cada tubo de

ensayo (esterilizados previamente) quedando as listo el medio de cultivo. Los
medios lquidos deben mantenerse debidamente
enroscados o sellados para
evitar la contaminacin.
MEDIO DE CULTIVO SLIDO.
6. se pesa el medio
slido, en una balanza granatara o digital ( seguir
instrucciones especificadas en el frasco del medio)

7. el procedimiento es igual a la de los medios lquidos
Nota: para la distribucin en placa de Petri se deber esperar que el medio tenga
una temperatura alrededor de 30 a 40C, porque si lo distribuimos a una
temperatura ms alta; formara gotas de agua condensada.
En caso de formacin de burbujas a la hora de estar vertiendo el medio en las cajas
de Petri; se flamea con cuidado con el mechero hasta lograr disolver las burbujas.
OBTENCION DE BACTERIAS EN CULTIVO PURO

Un paso fundamental para el diagnostico bacteriolgico es el aislamiento de
bacterias en cultivo puro. Luego por procedimiento de laboratorio de naturaleza
variada (pruebas bioqumicas, coloraciones, serologa, etc.) se procede a su
identificacin.
Por lo tanto es de gran importancia poder realizar las tcnicas para obtencin
de cultivos puros a partir de una flora mixta.
PROCEDIMIENTO
28
Sembrar las placas de agar tripticasa soya, Mac Conkey y agar sangre con la
suspensin de heces utilizando el mtodo de estras para extenderlo.
Incubar todas las placas a 36C +/- 1C, hasta la siguiente practica de
laboratorio.
PROCEDIMIENTO.
1- Observar el nmero y tipo de colonias que hayan crecido en las placas de

agar tripticasa soya, Mac Conkey y agar sangre. Notar las diferencias que
hay entre el crecimiento de todas las placas, interpretar los resultados.
2- Hacer frotis de colonias diferentes obtenidas en el medio de Mac Conkey y

agar sangre, colorearlos por el mtodo de Gram. Observarlos en el
microscpio y anotar los resultados.
3- En base a los resultados de los frotis seleccionar una colonia formada por
bacterias Grampositivas y resembrarla en el medio de agar tripticasa soya,
29
incubarla a 36C hasta el prximo laboratorio. Hacer lo mismo con una

colonia Gramnegativa.
PARTE III
PROCEDIMIENTO
1- De cada una de las placas sembradas tomar tres colonias aisladas, hacer
frotis y colorearlo por Gram. Observar al microscopio indicar si obtuvo
cultivos puros.
2- Discusin
a) Mtodo de estras (fundamento y objetivo)
b) Anlisis de cada medio de cultivo: nombre, funcin, clasificacin,
composicin (sustratos, nutrientes e inhibidores)
c) Descripcin de colonias.
d) Anlisis de los resultados.
Frotis Bacteriano.
1. Se observa Morfologa
2. Se observa tincin ( Gram, Acido resistencia).
30
PRACTICA No. 3
PRUEBA DE SUSCEPTIBILIDAD A LOS
ANTIMICROBIANOS (ANTIBIOGRAMA)
PROPOSITOS
La prueba de susceptibilidad sirve para determinar IN VITRO a que antibiticos
es susceptible o resistente una determinada cepa bacteriana aislada del
paciente.
Este mtodo permite al mdico escoger el antibitico ms adecuado con base
cientfica proporcionada por el laboratorio y as poder dar un buen tratamiento.
Bsicamente hay dos tcnicas para verificar estas pruebas: dilucin en tubo y
difusin en agar. La tcnica del disco sobre agar, se adapta a las necesidades y
fines de la prctica diaria en el laboratorio. Adems las pruebas de
susceptibilidad constituyen una ayuda invaluable para la eleccin de los
agentes
antimicrobianos
ms apropiados
para
el
tratamiento
de
las
enfermedades infecciosas.
OBJETIVOS
1. Verificar la prueba estandarizada de susceptibilidad bacteriana a los
antimicrobianos por el mtodo de difusin en agar (mtodo de KIRBY
BAUER).
2. Reconocer la importancia de adherirse a las normas estandarizadas
recomendadas para obtener resultados confiables y reproducibles.
3. Analizar las posibles fuentes de error inherentes al mtodo e indicar la forma
de evitarlas.
31
Suceptible: Cuando los microorganismos responsables de una infeccin son

inhibidos por concentraciones de antibiticos obtenidos con un rgimen usual
de dosificacin.
Resistente: Si los microorganismos que causan la infeccin, toleran
concentraciones de antibiticos superiores a las que pueden obtenerse en la
sangre por medio de un rgimen usual de dosificacin.
Intermedio: Hoy en da se considera como prueba errtica, que por lo tanto
debe repetirse, ya que realmente se trata de una poblacin bacteriana
resistente.
PROCEDIMENTO
Por medio de la tcnica de Kirby-Baver modificada se obtienen resultados
confiables, reproducibles y de gran utilidad clnica siempre y cuando se sigan al
pie de la letra las instrucciones.
Es una tcnica relativamente sencilla. Y siempre debe efectuarse con el Agar de
Mueller-Hinton; el grosor de la caja, concentracin del inoculo, humedad,
temperatura y otros factores deben estar perfectamente estandarizados para
que los resultados puedan ser comparables entre los diversos laboratorios. Es
muy importante tomar en cuenta que esta tcnica solo sirve para efectuar el
antibiograma a las siguientes bacterias aerbicas o facultativas de crecimiento
rpido:
1. Staphylococcus aureus
2. Enterobacterias
3. Pseudomonas
El antibiograma para Haemophilus spp y Neisseria sp, debe hacerse en

Mueller-Hinton con 5% de sangre achocolatado.
Para prepara el agar de Mueller-Hinton debe seguir las siguientes indicaciones:
32
1. Las cajas de petri deben tener un tamao estndar (100 mm de dimetro)

deben llenarse
con aproximadamente
25 mL de agar lquido
ya
autoclaveado, a manera de obtener un medio de 4mm de grueso.

2. Deben guardarse en refrigeracin dentro de bolsas plsticas selladas (de 2 a
8C) por no ms de 7 das.
3. El pH del medio debe ser de 7.2 a 7.4.
4. De cada lote de medio, incubar de 2 5 cajas por 24 horas a 36C para
comprobar su esterilidad.
ALMACENAMIENTO DE LOS DISCOS CON ANTIBITICOS:

Almacenar los discos de acuerdo con las siguientes instrucciones para que no
pierdan su potencial:
1. Congelar (idealmente a 20C) los discos de Penicilina, Ampicilina,
Carbenicilina y Cefalosporinas. Descongelar peridicamente slo los discos
que sern usados durante la semana. Descongelarlos por lo menos 2 horas
antes de usarlos.
2. Los discos del resto de antibiticos pueden almacenarse refrigerados sin
congelacin. De preferencia con un desecante.
PROCEDIMIENTO:
1. Con el asa flameada y fra tomar 4 a 5 colonias bien aisladas y de igual
morfologa del cultivo. Debe trasladarse siempre a un cultivo puro.
2. Inocular un tubo con 4 mL de caldo tripticasa soya o caldo infusin de
cerebro - corazn.
33
3. Incubar el caldo de 2 a 5 horas a 36C, hasta que aparezca una ligera

turbidez.
4. Ajustar la turbidez del caldo, con la turbidez del tubo estndar de Mac
farland 0.5. Si el caldo es ms turbio que el estndar, agregar ms caldo o
solucin salina estril.
5. Luego inocular la caja presecada de agar Mueller-Hinton as: introducir un
hisopo estril en el caldo, exprimir bien el hisopo presionndolo ligeramente
contra las paredes del tubo, arriba del nivel del caldo.
6. Con el hisopo exprimido sembrar la caja en 4 direcciones opuestas sobre
toda la superficie, cerca del mechero encendido.
7. Dejar secar la caja de 3 a 5 minutos; pero no ms de 15 minutos, con la
tapadera cerrada.
8. Con pinzas estriles, colocar los discos impregnados de antibiticos a
manera que queden lo ms separado entre s. Escoger los antibiticos a
colocar dependiendo de la bacteria aislada.
9. Invertir las cajas o incubarlas por 16 a 18 horas. Nunca usar jarro con
candela (excepto para Hemophiles spp y Neisseria spp)
INTERPRETACIN DE RESULTADOS.
1. Despus de 16 a 18 horas de incubacin, examinar con buena luz las cajas
ya con crecimiento.
2. Medir en milmetros el dimetro de los halos de inhibicin completa con una
regla por detrs de la caja petr.
34
3. En caso de sulfonamidas, puede ocurrir crecimiento dentro del halo, el cual

no debe tomarse en cuenta.
4. Transformar las medidas de los dimetros de los halos de inhibicin en
milmetros, hacer lecturas de acuerdo a tablas actualizadas.
INTERPRETACIN DE LOS DIMETROS DE LAS ZONAS DE

INHIBICIN
(mm)
PARA
MIEMBROS
DE
LA
FAMILIA
ENTEROBACTERIACEAE
Agente
antimicrobiano
Amikacina
Amoxicilinacido
clavulnico
Ampicilina
Ampicilinasulbactan
Aztreonam
Cefamandol
Cefazolina
Cefmetazol
Cefonicida
Cefoperazina
Cefotaxima
Cefotetan
Cefoxitina
Ceftazidima
Ceftizoxima
Ceftriaxona
Cefuroxima
(oral)
Cefuroxima
(parenteral)
Cefalotina
Cloranfenicol
Ciprofloxacina
Gentamicina
Imipenem
Kanamicina
Mezlocilina
Netilmicina
Piperacilina
Tetraciclina
Ticarcilina
Contenido del
disco (meg)
Resistente
Intermedio
Moderadamente
susceptible
14-17
14-16
Susceptible
30
20/10
14
13
15-16
10
10/10
13
11
12-14
16-21
17
15
30
30
30
30
30
75
30
30
30
30
15
14
14
12
14
15
14
12
14
14
15-17
15-17
13-15
15-17
16-20
15-22
13-15
15-17
15-17
15-19
22
18
18
16
18
21
23
16
18
18
30
30
30
14
13
14
14-20
15-22
15-17
20
21
23
30
14
15-17
18
30
30
5
10
10
30
75
30
100
30
75
14
12
15
12
13
13
17
12
17
14
14
15-17
18
18
21
15
16
18
21
15
21
19
20
13-17
16-20
13-14
14-15
14-17
18-20
13-14
18-20
15-18
15-19
17
18
35
(Continuacin)
Contenido
del disco
(mcg)
75/10
Resistente
10
12
1.25/23.75
10
11-15
16
100
19
20-22
23
Cinoxacina
100
14
15-18
19
Nitrofurantona
300
14
15-16
17
Norfloxacina
10
12
13-16
17
Ofloxacina
12
13-15
16
Sulfisoxazol
250 300
12
13-16
17
Trimetroprim
10
11-15
16
Agente
antimicrobiano
Ticarcilina-cido
clavulnico
Tobramicina
Trimetoprimsulfametoxazol
Reportar slo
en Urocultivo
Carbenicilina
Intermedio
14
Moderadamente
susceptible
Susceptible
15-19
20
15
13-14
INTERPRETACIN DE LOS DIMETROS DE LAS ZONAS

Agente
Contenido del
antimicrobiano
disco(mcg)
Amoxicilinacido
clavulnico
Ampicilina
Ampicilinasulbactan
Cefazolina
Cefotaxima
Ceftriaxona
Cefalotina
Cloranfenicol
Ciprofloxacina
Clindamicina
Eritromicina
Gentamicina
Imipenem
Resistente Intermedio
Moderadamente
susceptible
Susceptible
20/10mcg
19
14-16
20
10mcg/ml
10/10mcg.
28
11
12-14
29
15
30mcg.
30mcg
30mcg
30mcg
30mcg
5mcg
2mcg
15mcg
10mcg.
10mcg.
14
14
13
14
12
15
14
13
12
13
15-17
15-22
14-20
15-17
13-17
16-20
15-17
14-22
13-14
14-15
18
23
21
18
18
21
18
23
15
16
Continuacin
Agente
antimicrobiano
Meticilina
Contenido del
disco (mcg)
Resistente
Intermedio
5mcg
10-13
Moderadamente
susceptible
Susceptible
14
36
Ofloxacina
5mcg
Oxacilina
1 mcg
Penicilina G
10 U
Rifampicina
5mcg
Tetraciclina
30mcg
Trimetoprim1.25/23.75m
sulfametoxazol
cg.
Vancomicina
30mcg
Reportar slo
en Urocultivo
Nitrofurantona
300mcg
Norfloxacina
10mcg
12
10
28
16
14
Sulfisoxazol
250
300mcg
12
13-16
17
5mcg
10
11-15
16
Trimetroprim
13-15
16
13
29
20
19
11-15
16
11-12
17-19
15-18
10
9
10-11
12
14
15-16
17
12
13-16
17
DISCUSION
1- Caractersticas del medio de cultivo.
2- Principio del mtodo de difusin.
3- Elaboracin del reporte.
4- Antibitico. Quimioteraputico.
5- Otros controles: inculo, discos, siembra e incubacin.
PRACTICA No. 4
COPROCULTIVO
La infecciones ntericas pueden ser causadas por varios microorganismos,
siendo de mayor importancia las bacterias del genero Shigella, Salmonella y
desde 1991 el Vibrio cholerae O1
PROPSITO:
37
Demostrar por medio del cultivo, la presencia de bacterias enteropatgenas, es

decir que infectan el intestino penetrando o no su mucosa. Esto causa diarrea,
dolor abdominal, fiebre y a veces la muerte.
OBJETIVOS
1- Observar y describir la morfologa de las Enterobacterias aisladas de la
muestra de heces.
2- Utilizar un medio selectivo y diferencial para el aislamiento de bacterias
entricas y sepa interpretar los resultados obtenidos.
3- Utilizar medios diferenciales para evaluar la actividad bioqumica de las
bacterias que aisle e intrprete los resultados obtenidos.
4- Realizar pruebas serolgicas para la identificacin de las principales
Enterobacterias patgenas.
5- Elaborar su reporte final en base a los resultados obtenidos utilizando las
tablas de referencia para la identificacin de Enterobacteriaceae .
MUESTRA:
Para efectuar un coprocultivo pueden inocularse las siguientes muestras:
Heces frescas (la mejor muestra)
Hisopo rectal (cuando no se obtienen heces)
Material obtenido por proctoscopia.
Biopsia de mucosa intestinal.
Las muestras deben tomarse antes de iniciar tratamiento con antibiticos. Las
heces debern procesarse lo ms pronto posible, de preferencia antes de 2-3
horas de ser emitidas.
El hisopo rectal es una buena toma de muestra (en caso de no ser posible
obtener muestras de heces recientes), porque arranca las bacterias que se
encuentran dentro de la mucosa.
38
En los adultos, introducir con cuidado en el ano un hisopo estril 4 centmetros,

dar 3 vueltas a la derecha y 3 vueltas a la izquierda. En nios, introducir el
hisopo 2.5 centmetros y dar la misma cantidad de vueltas.
Cuando las heces, que se encuentran a 37C dentro del intestino, son
colocadas y permanecen a temperatura ambiente (aproximadamente a 20C),
el pH baja considerablemente (acidez) y hace que las bacterias, especialmente
Shigella sp pierdan su viabilidad (capacidad de reproducirse en cultivo). Por
esta razn si la muestra de heces no se procesa con la velocidad ya indicada,
debe colocarse en un medio de transporte bufferado que evite los cambios
bruscos de pH.
Para ste propsito colocar con hisopo estril una porcin de las heces (con
sangre, moco o pus) bien cargado en tubos con 3 mL del siguiente medio de
transporte:
Glicerol Salino bufferado, (especialmente para Shigella).
Caldo de Hagna GN (Gramnegativo).
Pero el mejor medio de transporte para Enterobacterias es el Cary - Blair.
Otros caldos de enriquecimiento como Selenito, no deben usarse excepto en

encuestas especiales para buscar Salmonella sp, ya que su uso retrasa 24
horas el resultado del coprocultivo, lo que disminuye considerablemente su
utilidad clnica.
La coloracin de Gram en heces nunca debe practicarse por carecer de
significado clnico a menos que el mdico lo solicite.
PROCEDIMIENTO:
Debe conocerse la edad del paciente, anotar si es nio menor de 6 meses. Para
efectuar el coprocultivo deben usarse medios que sean selectivos (contienen
inhibidores, por lo que slo permiten el crecimiento de bacilos gram-negativos) y
39
diferenciales (contienen lactosa e indicadores de pH que viran cuando se

produce cido, lo que hace cambiar el color de las colonias y as las diferencia).
Algunos de estos medios contienen sales de hierro que precipitan en forma de
sulfuro ferroso de color negro intenso si las bacterias producen cido sulfdrico.
El coprocultivo debe efectuarse en dos medios selectivos-diferenciales de
preferencia uno ms inhibidor que otro. Se recomienda usar rutinariamente agar
Mac Conkey, Agar XLD o Agar SS (Salmonella-Shigella). En caso de heces con
moco y sangre (disentera) debe incluirse adicionalmente el medio de Hektoen.
EFECTUAR EL COPROCULTIVO DE LA SIGUIENTE MANERA:

1. Inocular una porcin anormal de heces (con moco, sangre o pus) o de
muestra similar, directamente en una caja de Mac Conkey y una caja de SS.
El inculo se coloca con asa en anillo (flameado y fro) o con hisopo en las
cajas de ambos medios. Inocular slo cm en un extremo en el Mac
Conkey y 1 cm en el SS. El Hektoen se inocula igual que el Mac Conkey.
2. Diseminar el inculo utilizando dos asas en anillo. Flamear una de las asas
mientras la otra se enfra.
3. Ya diseminadas de esta manera las muestras en la superficie de las cajas,
incubar a 36C por 18 a 24 horas.
INTERPRETACIN DE RESULTADOS:
1. Despus de incubadas, observar cuidadosamente las placas. Debe contarse
con una luz de lmpara que ilumine las cajas por detrs y observarlas.
Marcar por detrs con un crculo de crayn graso cada tipo diferente de
colonias sospechosas as: primero Mac Conkey escoger colonias lactosa-
40
negativo (incoloras). Si el paciente es un nio menor de un ao, se marcaran

colonia tpica de Escherichia col (roja, brillante y de bordes lisos pero no
mucosa).
Examinar el SS de la misma forma, en este medio el crecimiento ser ms
escaso ya que es ms inhibidor. Marcar por detrs una colonia lactosanegativo (incoloras), o incluyendo una colonia con centro negro (cido
sulfhdrico) si las hay. Si inocula Hektoen, marcar una colonia pequea
verde azulado (lactosa-negativo).
2. Colocar las cajas con las colonias previamente marcadas, usando una asa
en aguja bien recta, flameada y fra, toque la superficie de la colonia
seleccionada, teniendo cuidado de no pincharla o pasar tocando otras
colonias cercanas. Con cuidado de no contaminar la punta del asa que ya
toc la colonia sospechosa, destape un tubo (13 x 100mm) de TSI flame la
boca del tubo, luego pnche el medio en el centro y hasta el fondo a manera
de tocar exactamente el centro del fondo del tubo, retire el asa sin salir del
tubo de TSI y estre rpido y parejo en la superficie inclinada. Flamear y con
la misma asa inocule el medio de Citrato de Simmons, estre la superficie del
medio, flamear y con la misma asa toque la misma colonia e inocule al
medio de urea, flamee nuevamente y proceda a inocular el medio de
movilidad y los caldos, siempre tocando la misma colonia inocule indol, rojo
metilo y el Voges Proskauer.
3. Incube a 36C la gradilla que contiene las bioqumicas. Deben permanecer
en incubacin de 18-24 horas. Los tapones de rosca deben quedar
ligeramente flojos para permitir la entrada de oxgeno.
4. Examine las reacciones e interprete los resultados de acuerdo a la tabla de
identificacin de pruebas bioqumicas.
5. Complete haciendo la respectiva sensibilidad (Antibiograma
41
CULTIVO PARA EL AISLAMIENTO DE VIBRIO

CHOLERAE O1
En el caso de clera el reporte debe ser inmediato, ya que en los casos graves
la vida del paciente puede depender de ste resultado.
MATERIALES:
Hisopos estriles
Tubos de vidrio 15 x 100 mm
Tubos de vidrio 16 x 100 mm
Asa redonda
MEDIOS:
Cary Blair 2 hisopos impregnados con heces o vmito.
Agua pectonada alcalina (APA)
Agar T.C.B.S.(Tiosulfato, citrato, sales biliares y sacarosa).
MUESTRAS:
Heces lquidas
Hisopo rectal
Vmito
PROCEDIMIENTO:
1. Con uno de los hisopos del tubo con medio de transporte colocar el inoculo
en el medio T.C.B.S regresar el hisopo al tubo de medio.
2. Estriar por agotamiento e incubar a 35C por 18 a 24 horas.

42
3. El otro hisopo introducirlo en el agua peptonada alcalina e incubar a 35C

por 6 a 8 horas mxima a las 8 horas, hacer un subcultivo del agua
peptonada, tomando 2 a 3 asadas de la superficie de dicho caldo o inocular
otra caja de medio de TCBS, estriar por agotamiento o incubar a 35C por
18 a 24 horas.
LECTURA:
Observar ambas cajas de TCBS buscando colonias amarillas cremosas y

chiclosas, de estas inocular un TSI y un TSA (Tripticas soya agar), incubar a
35C por 18 a 24 horas.
Al observar el TSI A/A sin gas, hacer del TSA la prueba del hilo mucoso: en
una lmina porta objetos suspender el inoculo de un cultivo de 18 a 24
horas en una gota de suspensin acuosa de desoxicolato de sodio al 0.5%)
y la prueba de oxidasa.
Si ambas pruebas son positivas pasar a la serotipificacin con: antisuero

polivalente y solucin salina para ver si es una cepa autoaglutinable. Con
solucin salina no tiene que aglutinar.
Si aglutina con el suero polivalente continuar con el antisuero INABA, si con

ste antisuero tambin aglutina reportamos: Se asla Vibrio cholerae O1
INABA, si no aglutina con el INABA, continuar con el antisuero OGAWA. Si
este aglutina, reportamos. Se asla Vibrio cholerae 01 OGAWA.
Si en los tres antisueros aglutina se reporta: Se asla Vibrio cholerae O1

HIKOJIMA.
Si la oxidasa nos da positiva y con el antisuero polivalente no aglutina se

reporta: Se asla Vibrio cholerae N O1.
43
Si no se observan colonias con caractersticas antes mencionadas se
reporta: No se asla Vibrio cholerae.
VIBRIO CHOLERAE
Cary Blair
Hisopo rectal
Vmito
Heces
TCBS
Agar Mac Conkey
Agua Peptona
Colonias lactosa (-)

Colonias amarilla de 3 mm de dimetro
(Trabajar con varias colonias sospechosas)
Resiembra en TCBS a las

6-8 horas
Identificar Salmonella
o Shigella
Si
No crecimiento
No se asla
Vibrio cholerae
TSI
TSA
A/A K/A
Gas (-)
H-S(-)
Si
Reporte
No
TSA
No se asla Vibrio cholerae
Oxidasa y prueba del collar
NEGATIVO
Reporte
No se asla Vibrio cholerae
POSITIVO
Aglutina con Antisuero

Polivalente anti. V.Cholerae
Serogrupo 01.
POSITIVO
V. cholerae
Serogrupo 01
NEGATIVO
V. cholerae
No Serogrupo 01
44
UROCULTIVO
PROPSITO:
El cultivo de orina que ha sido colectada adecuadamente o Urocultivo se
efecta para demostrar la presencia de un nmero significativo de bacterias.
En condiciones normales, la orina dentro del cuerpo es estril, pero siempre se
contamina con bacterias al obtener la muestra. Por esta razn, el criterio para
interpretar el crecimiento es cuantitativo.
De acuerdo con el llamado Criterio de Kass un nmero de bacterias mayor o
igual a 100,000 UFC/ml (Unidades formadoras de colonias por mililitro de orina)
se considera infeccin verdadera, es decir es un recuento significativo. A
diferencia de otros cultivos bacteriolgicos, las bacterias que causan la
infeccin urinaria, se limitan a unos pocos microorganismos de crecimiento
rpido. Las principales bacterias que afectan el sistema urinario son las
Enterobacterias (bacilos Gramnegativos).
La Escherichia coli es sin duda la bacteria que con ms frecuencia se asla de
urocultivos positivos, luego tenemos:
Klebsiella spp.
Enterobacter spp.
Proteus spp.
Pseudomona aeruginosa (no es Enterobacteria).
De menor frecuencia tenemos los cocos grampositivos:
Enterococcus spp.
Staphylococcus aureus
Streptococcus pyogenes y Streptococus spp. (raros).
Staphylococcus epidermidis (puede ser por contaminacin)
Staphylococcus saprophyticos(puede ser por contaminacin).

45
Las infecciones mixtas causadas por dos o ms especies bacterianas son raras,
por lo que el crecimiento con varios tipos de colonias indican contaminacin.
La demostracin de piuria (presencia de leucocitos poliformonucleares en el
sedimento urinario) y la Bacteriuria (bacterias en orina), son ambas de gran
importancia para establecer el diagnstico de infeccin urinaria.
OBJETIVOS
1. Aprender a tomar una muestra limpia de orina y a dar indicaciones sobre
dicho procedimiento.
2. Realizar examen directo con coloracin de Gram de las muestras de orina
proporcionadas. Observar los resultados, los interprete y hacer el reporte
preliminar.
3. Verificar el recuento de bacterias en las muestras por el mtodo del asa
calibrada, sembrar en placas e interpretar los resultados.
4. Identificar
los
posibles
microorganismos
patgenos.
Interprete
los
resultados.
RECOMENDACIONES GENERALES.
TOMA DE UROCULTIVO EN EL HOMBRE:
a) Desinfectar bien el glande del pene del paciente con una gasa estril
empapada con jabn antisptico no irritante. Remover el jabn con otra gasa
estril, empapada en agua estril.
b) Pedir al paciente que orine directamente en el inodoro.
c) Despus de transcurrido unos 3 a 5 segundos, destapar rpidamente pero
con cuidado un frasco estril de boca ancha tomar al vuelo a medio chorro
una muestra de orina de la parte central de la miccin.
Se deja correr la primera porcin de orina para que remueva las bacterias de
la parte anterior del meato urinario, que contaminara el Urocultivo. Tapar
rpidamente el frasco.
46
d) Si no es posible inocular el Urocultivo antes de una hora de obtenida la

muestra, refrigerarla (no congelar). La muestra conservada en refrigeracin
se mantiene en buenas condiciones para ser inoculada, por un mximo de
48 horas.
TOMA DE UROCULTIVO EN LA MUJER:
En el caso de la mujer, debe observarse especial cuidado en la toma de la
muestra, ya que sus genitales estn expuestos, por lo tanto hay una abundante
colonizacin de bacterias. Proceder de la siguiente manera:
a) Solicitar a la paciente que se coloque sobre la tasa del inodoro con las
piernas abiertas. Con los dedos ndices y medio de la mano derecha
izquierda debe separarse los labios genitales mayores.
b) Con una gasa empapada con jabn antisptico no irritante, limpiar bien toda
el rea y luego remover el jabn con otra gasa empapada con agua estril.
c) Obtener la muestra de orina a medio chorro, que corra el chorro de orina
unos segundos y luego la tomar de la porcin central de la miccin. Tapar
rpidamente.
d) Sembrar antes de una hora refrigerar la muestra.
TOMA DE UROCULTIVO EN NIOS PEQUEOS:
a) En nios varones desinfectar bien con jabn antisptico no irritante, todo el
pene y el rea genital.
En las nias desinfectar bien los labios mayores y el rea genital que los rodea.
Quitar bien el jabn con gasa y agua estril, luego secar
finalmente con una
gasa estril seca.

b) Pegar una bolsita de plstico estril y descartable, especial para tomar
urocultivos pediatricos. En nios tener la precaucin de introducir todo el pene
47
en el orificio del llenado y en las nias que el agujero de la bolsa quede pegado
al centro por donde saldr la orina.
MATERIALES
Placas de agar sangre.
Placas de Mac Conkey
Tubos de orina de pacientes con pielonefritis (la traer el alumno)

Asa calibrada de 0.001ml
PROCEDIMIENTO:
1. Sembrar la orina en dos medios de cultivo segn la tcnica del Asa
calibrada. Los medios de cultivo a utilizar son:
a. Agar sangre de carnero al 5% crecen la mayora de microorganismos
b. Agar Mac Conkey: Crecen solo bacilos Gramnegativos aerobios
(Enterobacterias) pues es selectivo y diferencial.
2. Para sembrar usar un asa calibrada de platino (95% platino, 5% radio) que
tome 0.001 mL. agitar el frasco de orina, abrir delante del mechero y flamear
la boca del mismo. Introducir verticalmente el asa flameada y fra en la orina,
justamente por debajo de la superficie.
3. Inocular primero el agar sangre deslizando el asa una sola vez a lo largo de
la caja de petri pasando por el centro. Flamear o inocular en igual forma el
medio de Mac Conkey.
4. Inmediatamente estriar con asa corriente en anillo el inoculo de orina, en

ambas cajas, haciendo estras tupidas y perpendiculares a la estra dejada
por el asa calibrada.
48
5. Inmediatamente incubar el agar sangre a 36C en jarro de boca ancha con

un trozo de papel absorbente hmedo y una candela encendida, cerrar bien.
6. Incubar el Mac Conkey sin jarro en la incubadora a 36C.
INTERPRETACIN:
1. Despus de incubar ambas cajas durante 18-24 horas interpretar resultados
de ambas cajas simultneamente y con buena luz.
2. Contar el nmero de colonias presentes y multiplicar por 1000; si se us el
asa calibrada de 0.001 mL, multiplicar por 100 si se utiliz un asa calibrada
de 0.01 mL.
3. Recuento mayores de 100,000 UFC/ml de orina, cepa pura: identificarlo con
bioqumica, hacer sensibilidad y reportarlo.
UFC/ML
0 10,000
CRITERIO PARA REPORTAR

Negativo a las 24 horas de incubacin a 36C
Sugerir repetir cultivo. Revisar condiciones de toma
10,000-50,000
de muestra y correlacin de leucocitos en sedimento

urinario.
Se aisl ___, _____, 000 UFC / mL(reportar el
50,000-100,000
100,000 ms
nmero de UFC contado y especie bacteriana con su

sensibilidad antimicrobiana.
Se aisl ___, ms de 100,000 UFC / mL infeccin
urinaria verdadera, hacer antibiograma y reportar.
UROCULTIVOS
49
Sembrar con Asa

calibrada de 0.001 mL
Agar sangre (carnero)
Agar Mac Conkey
Incubar 18 a 24 horas
Crecimiento
Recuentos mayores
de 50,000 de un solo
tipo de bacterias
No Crecimiento
Recuentos menores
de 50,000 de un solo
tipo de bacterias
Reporte
Recuento de
ms de un tipo
de bacterias
Recuento y
cultivo negativo
Reporte
Identificar bacteria
sensibilidad
Reporte
Reporte
Recuento
Bacteriano
Sensibilidad
Crecimiento
mixto. Pedir
nueva muestra
Recuento y
nombre de
bacteria
50
LQUIDO CEFALORRAQUDEO Y OTROS LQUIDOS DE

DERRAME.
PROPSITO:
Demostrar por medio de la tincin de Gram y el cultivo, la presencia de
bacterias en estas muestras que normalmente deben ser lquidos estriles ya
que son tomadas por el mdico que las solicita en condiciones quirurgicas
estriles, por eso, todo microorganismo que se aisle es patgeno. Las bacterias
de mayor importancia en el lquido cefalorraqudeo son:
GRAMNEGATIVOS.
Neisseria meningitidis (causa meningitis meningococica severa)
Haemophilus influenzae (Meningitis en nios de 6 meses a 4 aos de edad)
Escherichia coli y otras Enterobacterias (en pacientes inmunodeficientes)
Pseudomonas aeruginosa
GRAMPOSITIVOS:
Streptococcus pneumoniae (muy importante)
Staphyloccus aureus
Streptococcus sp
Streptococcus pyogenes.
OTROS MICROORGANISMOS IMPORTANTES:
Mycobacterium tuberculosis, Treponema pallidum
Cryptococcus neoformans, Candida albicans
51
MUESTRA:
Las muestras incluidas en los fluidos corporales son:
Lquido cefalorraqudeo
Lquido ventricular
Fluido abdominal (lquido peritoneal o asctico)
Lquido pleural
Lquido pericardico
Lquido sinovial
Mdula sea.
Las muestras deben transportarse rpidamente al laboratorio y ser procesadas

inmediatamente no despus de 30 minutos de recolectados. Rotular con el
nombre del paciente, nmero de registro, fecha y naturaleza de la muestra. Si el
mdico sospecha que la muestra puede contener bacilos alcohol cido
resistentes debe hacerlo saber en su solicitud al laboratorio.
PROCEDIMIENTO:
1. El mdico debe obtener la muestra (LCR o cualquier otro fluido corporal del
cual desee examen completo).
2. Uno de los tubos no se centrfuga, enviarlo para que se le haga el
citoqumico (recuento total de clulas) recuento diferencial (frmula) y
anlisis qumico. El otro tubo sirve para anlisis microbiolgico.
3. Centrifugar la muestra 15 minutos a alta velocidad. (2500-3000 RPM).
Decantar aspticamente, tapar, agitar y procesar slo el sedimento.
4. Sembrar una asada del sedimento en cada uno de estos medios:
a. Agar sangre de carnero al 5%
b. Agar chocolate
c. Agar Mac Conkey
d. Sabouraud (hongos)
52
e. Tioglicolato
f. Lowenstein-Jensen (solo si se investiga BAAR)
5. Diseminar por estras en toda la superficie de los medios slidos. Introducir
el agar sangre de carnero y el agar chocolate en jarro hmedo con candela
encendida. Incubar todos los medios a 36C, excepto el sabouraud que se
incuba a temperatura ambiente, para el aislamiento de hongos patgenos
especialmente (Cryptococcus neoformans).
6. En porta-objetos nuevos o bien limpios con alcohol, hacer dos frotis
pequeos (de aproximadamente un centmetro de dimetro) en el centro de
la lmina.
7. Colorear un frotis con Gram y otro con Ziehl- Neelsen.
Observa los frotis de sedimento de LCR con el objetivo de inmersin. En vista
que del resultado de los frotis depende el tratamiento inmediato de pacientes
con infeccin grave de las meninges, su observacin debe hacerse con todo
cuidado. Observar las siguientes morfologas:
1. Diplococos gram-negativos (rojos o rosados), arrionados, dispuestos en
parejas como granos de caf, idnticos a N. gonorrhoeae de pus uretral:
morfologa
compatible
con
N.
meningitidis.
Dar
alerta
al
mdico
inmediatamente.
2. Cocobacilos Gram-negativos (rojo plido) pleomorficos, con escasas formas
bacilares: morfologa compatible con H. Influenzae agente de meningitis en
nios de 6 meses a 4 aos.
53
3. Cocos gram-positivos (morados), lanceolados, ovalados, dispuestos en

parejas o cadenas cortas, la cpsula se insina como halo claro alrededor
de las bacterias: En LCR morfologa compatible con Streptococcus
pneumonae.
4. Bacilos gram-negativos (rojos) de coloracin slida, no pleomorficos,
bacilos
alargados:
morfologa
compatible
con
Enterobacterias
Pseudomonas (E. Coli, Salmonella sp, Pseudomonas aeruginosa).

5. Levaduras redondeadas. Algunas con gemaciones laterales, gram positivo
se insina cpsula, hacer tinta china, para demostrar la presencia de
levadura capsulada sugestiva de Cryptococcus neoformans.
6. En Zielh-Neelsen: bacilos alcohol-cido resistente (rojos) cortos, algunos
con coloracin dispareja en forma de grnulos: morfologa compatible con
Mycobacterium tuberculosis.
INFORME:
El primer informe, entregar el mismo da de la obtencin del muestra: Frotis
de Gram: se observan morfologa de bacterias, cantidad de leucocitos.
Cultivo pendiente.
El segundo informe; entregar el da que termina la identificacin:
Cultivo: se asla: Nombre de la bacteria, gnero, especie ms
antibiograma.
54
L.C.R. Y LQUIDOS DE DERRAME
Agar sangre
Agar chocolate
Caldo, Tripticasa soya
Gram
Incubar 18 a 24 horas
Crecimiento
No crecimiento
Reincubar 24 horas
ms
Gram
Sensibilidad
Crecimiento
Reporte
Bacteria aislada
Sensibilidad
No crecimiento
Reporte
Gram
Subcultivo del caldo
Cultivo negativo
a las 48 horas
Antibiograma
Reporte
Se aisl: (Dar nombre de bacteria y sensibilidad
55
HEMOCULTIVO
PROPSITO:
El hemocultivo o cultivo de sangre, sirve para detectar las bacterias que se
estn reproduciendo en la sangre, lo que provoca septicemia. Cuando las
bacterias se multiplican a una velocidad que excede la capacidad del sistema
retculo-endotelial para removerlos de la sangre, ocurre la septicemia. Se
diferencia de la bacteremia, que es la presencia transitoria de bacterias en el
torrente circulatorio. Usualmente causa septicemia una sola especie bacteriana.
MUESTRA:
Los sntomas del paciente que indican la necesidad de obtener un hemocultivo
son: Aumento sbito del pulso y la temperatura, cambios sensoriales,
escalofros, postracin y presin baja. Adems la recuperacin de las bacterias
de la sangre depende de los siguientes factores.
1. Cantidad de sangre que se cultiva. En nios debe ser al menos 2.5 mL y en
adultos usualmente 5 mL.
2. La relacin entre la sangre y caldo de cultivo debe ser siempre 1:10 es decir
sangre al diez por ciento en caldo, con el objeto de evitar coagulacin.
3. La presencia de inhibidores bacterianos en el suero tales como anticuerpos,
complemento o antibiticos.
4. La caracterstica de la bacteria de ser fastidiosa es decir que requiere de
un medio de cultivo enriquecido y complejo.
5. El hemocultivo debe obtenerse siempre antes de iniciar el tratamiento con
antibiticos.
6. En algunos casos se justifica obtener varias muestras del paciente, en
tiempo y sitios diferentes, es decir seriado.
56
INSTRUCCIONES PARA LA TOMA DE UN HEMOCULTIVO:

1.
Destapar el frasco con caldo de hemocultivo, para descubrir el tapn de

hule perforable. Dejar la tapadera a un lado y con un algodn empapado
en solucin de yodo al 3% y alcohol, limpiar bien el tapn perforable. Dejar
secar mientras se atiende al paciente.
2.
Colocar la ligadura en el brazo del paciente, luego palpar la vena y

localizar con precisin el sitio donde se va a puncionar.
3.
Lavar con agua y jabn el brazo del paciente, antes de aplicar

desinfectante. Limpiar el sitio correcto con un algodn empapado en tintura
de yodo al 3%. Dejar secar y luego limpiar el sitio de puncin con un
algodn empapado en alcohol, con movimientos circulares en forma de
espiral que se inicia en el sitio de puncin.
4.
Con aguja y jeringa estriles, puncionar la vena y obtener aspticamente

5 mL o ms de sangre.
5.
Inyectar exactamente 5 mL de sangre en el frasco que contiene 45 mL de

caldo o 10 mL en un frasco con 90 mL de caldo. En los hemocultivos
peditricos, inyectar 2.5 mL de sangre en 25 mL de caldo.
6.
Agitar suavemente las botellas ya inoculadas e incubar a 36C.
PROCEDIMIENTO:
1.
Incubar los hemocultivos por siete das, excepto en casos especiales en

los cuales debe prolongarse la incubacin, por ejemplo para el aislamiento
de Brucella spp.
2.
Con mucho cuidado para que el caldo no se agite, examinar diariamente

los frascos contra la luz, para buscar algunos de los siguientes signos
visibles que indican crecimiento bacteriano, los cuales orientan hacia el
tipo de bacteria que esta creciendo:
57
Signos Visible
Turbidez
Posible Bacteria
Bacilos Gramnegativos aerobios
Staphylococcus spp.
Bacteroides spp.
Estreptococcus spp.
Staphylococcus spp
Hemlisis
Listeria spp
Clostridium spp.
Formacin De Gas
Colonias Visibles Como Motas
de Algodn
Formacin De Pelcula
Bacillus spp.
Bacilos Gramnegativos aerobios
Anaerobios
Staphylococcus spp.
Streptococcus
Pseudomonas spp.
Bacillus spp.
Levaduras
Coloracin Verdosa (Raro)
1. En caso de observar cualquiera de estas caractersticas, agitar suavemente,

limpiar el tapn perforable con algodn y alcohol, puncionar con jeringa y
aguja estril, y aspirar una pequea cantidad de caldo. Inocular una gota y
luego estriar con asa sobre una caja de agar sangre y una caja de agar
chocolate; incubar ambas en jarro con candela. Simultneamente dejar secar
dos gotas del caldo sobre un porta objetos, colorear con Gram.
2. Observar cuidadosamente el frotis coloreado por Gram con objetivo de

inmersin, pues la observacin de las bacterias es la base de su
58
caracterizacin. Adems, algunas bacterias como Haemophilus influenzae,

no producen signos visibles en el caldo si se observan bacilos o cocobacilos
gram-negativos, inocular adicionalmente una caja de Agar Mac Conkey;
incubar
aerbicamente.
Esto
es
especialmente
importante
para
el
aislamiento o identificacin de Salmonella typhi.
3. Si se observan cocos gram-positivos esfricos y con tendencia a agruparse

en racimos, inocular una caja de agar manitol-sal, para facilitar el aislamiento
e identificacin de Staphylococcus aureus. Si se observan diplococos o
cadenas cortas de cocos gram-positivo ovalados, aplicar los discos de
optoquina y bacitracina sobre la segunda estra del agar sangre, para aclarar
la identificacin presuntiva de Streptococcus pneumoniae y Streptococcus
pyogenes.
4. Rutinariamente
revisar
los
hemocultivos
aparentemente
negativos.
Proceder as: hacer aspticamente un frotis de Gram del caldo a las 48

horas y tambin al sptimo da de incubacin. La incubacin prolongada
puede producir una leve turbidez de fibrina.
59
1. Con siete das de incubacin a 36C se recupera el 95% de las bacterias

clnicamente significativas. Si se observa en Mac Conkey el crecimiento de
colonias lactosa-negativo sospechosas de Salmonella typhi, aglutinar
inmediatamente el crecimiento en agar sangre con antisuero polivalente antisalmonella, anti-salmonella del grupo D y anti-antgeno Vi. Si hay
aglutinacin franca, reportar inmediatamente la presencia de salmonella
typhi.
2. Algunas bacterias importantes en hemocultivos positivos, son las siguientes:
Salmonella typhi
Escherichia coli
Streptococcus pneumoniae
Streptococcus pyogenes
Haemophilus influenzae
3. Algunas bacterias que frecuentemente crecen en hemocultivos como

contaminantes provenientes de la microbiota de la piel son:
Bacillus sp
Corynebacterium sp.
60
INFORME:
1. Los hemocultivos deben reportarse como negativos si no se observan
bacterias en el Segundo control por coloracin de Gram, a los siete das de
incubacin, NUNCA ANTES. Reportar as: NEGATIVO A LOS SIETE DAS
DE INCUBACIN A 36C.
2. Si el hemocultivo presenta crecimiento a cualquier tiempo de incubacin

reporta cuanto antes la bacteria aislada, identificada si es posible, hasta
especie, aunque la identificacin sea presuntiva. Reportar as: SE AISL
____________________SUSCEPTIBILIDAD PENDIENTE.
3. En el caso del aislamiento e identificacin de Streptococcus pneumoniae

Streptococcus
pyogenes
de
hemocultivo,
Streptococcus________________,
se
reportar
recomienda
as:
SE
AISLO
tratamiento
con
penicilina. S se trata de S. pneumoniae, hacer la prueba de sensibilidad a la

penicilina.
4. Despus de interpretar
los resultados de la prueba de susceptibilidad
antimicrobiana, enviar otro reporte, as:

Se aisl:__________________________________
Susceptible a:______________________________
Intermedio a:_______________________________
Resistente a: _______________________________
61
HEMOCULTIVOS
Muestra N 1
Muestra N 2
5 mL de sangre
45 mL de medio
Incubar 24 horas
Sub-cultivo en agar
chocolate y hacer
coloracin de Gram
Subcultivo y
Gram positivo
Subcultivo y
Gram negativo
Incubar
Sensibilidad
Observar diariamente
Reporte
Bacteria
Sensibilidad
7 da hacer Subcultivo en
agar chocolate y
Gram
Cultivo negativo al
6 da de incubacin
CULTIVO DE GARGANTA.
Debido a la gran ocurrencia de procesos infecciosos en el rea farngea, el
estudio bacteriolgico del exudado farngeo es uno de los procedimientos que
62
con mayor frecuencia se realizan en el laboratorio clnico. La flora aislada

incluye cocos y bacilos, tanto Grampositivos como Gramnegativos adems de
encontrarse cierto nmero de levaduras.
Para un estudio satisfactorio del exudado farngeo es necesario tomar una
adecuada muestra de la regin de amgdalas y faringe. El cultivo se efecta
para demostrar la presencia de Sreptococcus pyogenes, Steptococcus
agalactiae y otras especies del gnero Streptococcus.
Otras bacterias que frecuentemente se pueden aislar en un cultivo de garganta
son las siguientes:
Streptococcus pneumoniae
Haemophilus influenzae
Klebsiella pneumoniae
Estos microorganismos solo se deben reportar si predominan sobre la
microbiota normal.
MUESTRA:
La muestra debe tomarse siempre antes de iniciar algn tratamiento con
antibiticos. Adems si el paciente ya comi se recomienda dejar pasar unas
dos horas para que se vuelva a formar la secrecin deglutida.
Localizar el fondo de la garganta y en las amgdalas (que se encuentran a los

lados), observar las siguientes lesiones:
63
Inflamacin (Enrojecimiento)
Pus (secrecin blanquecina o amarillenta)
lceras blanquecinas.
Con un hisopo estril frotar firmemente las lesiones con sumo cuidado de no
tocar la lengua, la campanilla, la pared interna de los carrillos, labios y dientes al
retirar el hisopo.
PROCEDIMIENTO:
1. Inocular inmediatamente una caja (placa) de agar sangre al 5%, hacer dos
cortadas en el agar durante la siembra. Las cortadas deben ser
aproximadamente de 1 cm de largo y el asa debe llegar al fondo de la caja.
El propsito de las cortadas es introducir las bacterias dentro del agar para
alejarlos del oxgeno atmosfrico y as incrementar la hemlisis tipo beta.
2. Con el objeto de obtener cultivos evidentes de Streptococcus pyogenes, sin
necesidad de hacer sub-cultivos proceder as: Con pinza flameada y fra,
colocar en la zona de ms fuerte inoculacin en el agar sangre de carnero
(primera estra), un disco de 30 mcg de neomicina. A unos 8 10 mm de
distancia, colocar un disco de 0.04 unidades de bacitracina. Streptococcus
pyogenes y Streptococcus pneumoniae son resistentes al antibitico
neomicina, por lo que crecen en cultivos casi puro alrededor de ste disco.
3. Introducir la caja en un frasco de vidrio de boca ancha, poner en el fondo
una toalla de papel hmeda, colocar la caja con el medio y luego introducir
una candela corta y encendida, cerrar el frasco. La candela se apagar sola.
4. Incubar por 18 a 24 horas a 36C
INTERPRETACIN.
64
Para interpretar correctamente los crecimientos de los cultivos de exudados

farngeos, tomar en cuenta lo siguiente:
Tipo de Hemlisis
ALFA
Apariencia del Halo

Verde (Incompleta)
BETA
Claro, del color del medio (Completa )

REPORTE
Inhibicin por Bacitracina

+ (Si produce halo)
Reportar
Se aisl Streptococcus pyogenes beta
hemoltico
del
grupo
de
Lancefield
- (No inhibicin)
Streptococcus sp. beta hemoltico no

del grupo A de Lancefield
DISCUSION
1- Reporte preliminar
2- Toma de muestra.
3- Cultivo. Medios utilizados. Inoculacin. Lectura e interpretacin.
4- Subcultivo. Identificacin. Antibiograma.
5- Reporte final.
SECRECIONES GENITALES
PROPSITO:
65
Demostrar la presencia de microorganismos de varios tipos bacterianos que

infectan los rganos genitales femeninos y masculinos, tales como:
Neisseria gonorrhoeae: Bacteria, causante de la gonorrea.
Garnerella vaginalis: Bacilo gramnegativo causante de la vaginosis.
Treponema pallidum: Bacteria causante de la sfilis.
Candida albicans: Hongo levaduriforme, causante de la vulvovaginitis.
Trichomonas vaginalis: Protozoo, causante de tricomoniasis vaginal.
OBJETIVOS
1. Realizar el examen directo de la secrecin uretral utilizando la coloracin de
Gram.
2. Elaborar el reporte preliminar.
3. Cultivar la muestra en los medios de cultivo adecuados y seguir la marcha
bacteriolgica correspondiente para la identificacin del microorganismo
causante de la infeccin.
4. Realizar la prueba de susceptibilidad a los antimicrobianos.
5. Elaborar el reporte final.
LA TOMA DE LA MUESTRA
HOMBRES:
1. Tener listo: hisopos estriles, porta-objetos limpios, agar sangre y agar
Thayer Martin.
2. Con el hisopo estril tomar una gota de la secrecin.
3. Preparar cuidadosamente un frotis delgado sobre el porta objetos, haciendo
rodar el palillo sobre la lmina, no frotar
4. Simultneamente inocular los medios slidos (agares)
MUJERES:
1. En las mujeres la muestra la debe obtener el gineclogo. Tener listo el
mismo material que en el caso de los hombres.
66
2. Hacer el mismo procedimiento.

PROCEDIMIENTO:
1. Colorear los frotis con coloracin para Gram.
2. Con asas flameadas y fras, diseminar por estras el inoculo sobre la
superficie de las placas.
3. Incubar el agar sangre y el de Thayer Martn durante 24 a 48 horas a
36C en jarro hmedo con candela encendida.
GRAM: Buscar diplococos adosados en forma de granos de caf y
Gramnegativos (rojos). Anotar si se encuentran intracelularmente, dentro de
los leucocitos polimorfonucleares o fuera de ellos (extracelular.)
CULTIVO: Despus de 24 a 48 horas de incubacin a 36C en jarro con

candela, examinar el Thayer Martn, ya que este contiene sustancias
enriquecidas que favorecen el crecimiento de Neisseria gonorreae. Efectuar la
prueba de oxidasa para verificar gnero.
La prueba de oxidasa puede efectuarse aplicando directamente el reactivo
lquido al cultivo o sobre discos de papel filtro ya impregnado con el reactivo.
Luego identificar la especie Neisseria gonorreae por medio de la prueba de
oxidacin de tres azcares (CTA): maltosa, glucosa y sacarosa (sucrosa).
SECRESIONES
67
Agar Sangre
Agar Chocolate
Agar Mac Conkey
Tioglicolato
Gram
Incubar de 18 a 24 horas
Crecimiento
Gram
Sensibilidad
Bacteria aislada
Sensibilidad
No crecimiento
Re incubar 24 horas ms
Crecimiento en placas
en subcultivos de
caldo
Reporte
Gram
Sensibilidad
No crecimiento
Reporte
Cultivo negativo a
las 48 horas de
incubacin
Reporte nombre de
bacteria y sensibilidad
BIBLIOGRAFA
Gustavo A. Gini Q.B. Manual de Procedimientos para la Identificacin de

las bacterias con importancia clnica, Segunda Edicin, Guatemala 1995.
68
Ministerio de Salud Pblica y Asistencia Social. Unidad de Laboratorio

Manual Normativo, toma, manejo y envi de muestras para anlisis de
laboratorio. Pginas 1-11, San Salvador. El Salvador 1995.
Miguel Francisco Torres. Manual Prctico de Bacteriologa Mdica.

Segunda Edicin. Pginas 41-189, Guatemala 1999.
Giuseppe Nicoletti, Vito Nicolosi Diccionario de Bacteriologa Humana

Centro Documentacin Cientfica Menarini Barcelona 1990.
Hospital Nacional de Nios Benjamn Bloom. Manual de Tcnicas de

Microbiologa Pg. 1-44. San Salvador, El Salvador 1996.
Koneman/ Allen/ Dowell/ Janda y otros. Texto y Atlas, Diagnostico

Microbiolgico. 4ta Edicin. Editorial Mdica Panamericana.
69
Anexos
70
Anexo 1
Coloraciones
COLORACIN DE GRAM.
1. Hacer un frotis.
2. Fijar el frotis con calor y dejar enfriar.
3. Cubrir el frotis con cristal violeta por 1 minuto.
4. Lavar con agua de chorro, eliminar el exceso de agua
5. Cubrir el frotis con lugol para Gram por 1 minuto.
6. Lavar con agua de chorro.
7. Decolorar con alcohol acetona por 20-30 segundos.
8. Lavar con agua de chorro.
9. Cubrir con safranina el frotis por 30 segundos.
10. Lavar con agua de chorro. Dejar secar al aire y observar al microscopio con
objetivo 100x.
INTERPRETACION
Bacterias Gramnegativas: Color rojo o rosado.
Bacterias Grampositivas: Color violeta oscuro.
71
TINCION DE ALCOHOL CIDO RESISTENTE.

(Ziehl- Neelsen).
Esta es una tincin diferencial que permite distinguir entre algunas bacterias
que por su alto contenido de sustancias lipdicas o creas se tien con dificultad
por los procedimientos usuales; sin embargo, una vez teidas resisten el
colorante an cuando se les lave con una mezcla de alcohol- cido clorhdrico.
Esta tincin es importante para distinguir, entre otras las bacterias cido
resistentes causantes de la tuberculosis y la lepra. (Mycobacterium sp). Existen
varias tcnicas para este tipo de tincin, sin embargo nos referimos a la de
Ziehl- Neelsen.
REACTIVOS:
1. FUCSINA:
Fucsina bsica...................................... 0.3 g
Etanol 95C........................................... 10.0mL
Cristales de fenol fundidos por calor...... 5. 0mL
Agua destilada....................................... 95.0mL
Disuelva la fucsina bsica en el alcohol y el fenol en el agua. Mezcle las dos
soluciones y deje en reposo por una semana antes de usar. Almacene en
frascos mbar a temperatura ambiente.
2. ALCOHOL- CIDO:
Etanol 95C.............................................97.0mL
cido clorhdrico concentrado................ 3.0mL
Agregue el HCL al alcohol, homogenice y almacene en frascos a temperatura
ambiente.
3. AZUL DE METILENO:
72
Azul de metileno.................................... 0.3 g

Agua destilada....................................... 100.0mL
Disuelva el azul de metileno en el agua mediante agitacin. Almacene en
frascos mbar a temperatura ambiente.
FILTRE LOS COLORANTES AL MENOS UNA VEZ AL MES.
PROCEDIMIENTO:
1.
Prepare un frotis adecuado de la muestra a estudiar.
2.
Cubra la lmina con CARBOLFUCSINA y caliente suavemente hasta que

haya emisin de vapor. NO DEJE QUE EL COLORANTE HIERVA NI SE
SEQUE. Agregue ms carbolfucsina si es necesario. Mantenga la emisin
de vapor durante 3-5 minutos.
3.
Lave la preparacin con agua del grifo.
4.
Decolore con alcohol- cido durante 2 minutos o hasta que queden slo
trazas de color rosado.
5.
Lave con agua del grifo
6.
Aplique el colorante de contraste AZUL DE METILENO por un minuto.
7.
Lave con agua del grifo.
8.
Deje secar y observe con objetivo de inmersin.
RESULTADO:
Bacterias alcohol- cido resistente: rojas.
Bacterias alcohol- cido sensible: azules.
CONTROL DE CALIDAD:
73
Utilice una mezcla de bacterias que contengan bacilos alcohol cido resistentes
(Mycobacterium sp.) y cocos alcohol- cido sensibles (Staphylococcus sp.)
COLORACIN DE AZUL DE METILENO PARA

MUESTRAS DE HECES.
Es una coloracin directa simple usada para diferenciar las caractersticas
morfolgicas de microorganismos y glbulos blancos en materia fecal. Utilizado
para diferenciacin de glbulos blancos en muestras de heces el procedimiento
puede desarrollarse: Con un montaje hmedo (directo al fresco) o con frotis de
heces que contengan leucocitos (el cual ha sido previamente fijado).
PROCEDIMIENTOS PARA FROTIS FIJADOS.
1.
Hacer un frotis a partir de una muestra de heces dejar sacar al aire.
2.
Fijar con metanol al 95% por 1-2 minutos dejar secar.
3.
Cubrir la preparacin con azul de metileno por 30-60 segundos.
4.
Lavar con agua. Dejar secar. Observar microscopio con objetivo 100x.
INTERPRETACIN.
En este caso se usa para diferenciar leucocitos fecales en enfermedades
invasivas.
Predominio de Neutrfilos: se asume que existe un proceso infeccioso de
origen bacteriano.
Predominio de Linfocitos: se asume que el proceso infeccioso es de origen
viral.
74
Elevado nmero de Eosinfilos: Se sospecha la presencia de parsitos o una

enfermedad crnica.
REPORTE.
Contar 100 clulas y reportar: porcentaje de linfocitos y porcentaje de PMN.
Si estn escasas las clulas reportar: solo el nmero de clulas encontradas
sin reportar porcentaje. Ejemplo: 25 PMN, 2 Linfocitos.
Si no se observan clulas, reportar: 0% de linfocitos, 0% de PMN.
75
Anexo 2.
Otras pruebas bacteriologicas
PRUEBA DE LA COAGULASA.
La coagulasa es una enzima que tiene la capacidad de convertir el fibringeno
que est presente en el plasma humano o animal, en fibrina, lo cual se
evidencia en el laboratorio por la formacin de un cogulo visible.
Esta prueba se usa para diferenciar Staphylococcus aureus que siempre
produce esta enzima, de otras especies de Staphylococcus que no la producen.
La coagulasa est presente en las bacterias en dos formas: a) libre y b) unida a
la pared de la bacteria. La coagulasa unidad a la pared se evidencia haciendo la
prueba en lmina, y la coagulasa libre se determina haciendo la prueba en tubo.
La prueba en lmina es presuntiva y a todos los cultivos que den la prueba dbil
o negativa se les debe hacer la prueba en tubo, porque algunas cepas de S.
aureus slo producen la coagulasa libre.
MEDIOS Y REACTIVOS.
1.
Plasma de conejo o plasma humano obtenido de sangre fresca estril, no

nitratada.
76
2.
Cloruro de calcio al 5%: Pese 5.0 gramos de Cloruro de calcio, deposite en

un baln aforado de 100 mL y lleve con agua destilada hasta la marca de
aforo.
3. Medio de cultivo: Cualquier medio slido, libre de sal (NaCl) debe usarse
para que crezca el microorganismo a probar.
PRUEBA EN LMINA.
1.
Ponga una gota de solucin salina estril en un portaobjeto limpio.
2.
Tome una asada del cultivo a probar. Debe tener 18 horas y haber crecido
en un medio libre de sal. Haga con el asa una emulsin homognea en la
gota de solucin salina.
3.
Agregue una gota de plasma a la suspensin de bacterias y mezcle.
4.
Observe si hay formacin inmediata o no de un precipitado granular de

cogulos blancos.
PRUEBA EN TUBO.
1.
Agregue aspticamente 0.5 mL de plasma a un tubo estril 12 x 75 mm.
2.
Aada 0.5 mL de cultivo crecido en caldo infusin de cerebro y corazn o

una asada de un cultivo crecido en un medio slido.
3.
Incube el tubo en un bao Mara a 35C.
LECTURA E INTERPRETACIN
1.
PRUEBA EN LAMINA:
PRUEBA POSITIVA: Formacin de un precipitado granular dentro de un

perodo de tiempo de 5 segundos a 1 minuto. Despus de 1 minuto si aparece
precipitado, monte la prueba en tubo.
PRUEBA NEGATIVA: Suspensin homognea.
77
Confirme el resultado con la prueba en tubo.
2.
PRUEBA EN TUBO:
Observe cada 30 minutos y si a las 4 horas est

Negativa, deje 24 horas en el bao Mara.
PRUEBA POSITIVA: Cualquier indicio de cogulo.
PRUEBA
NEGATIVA:
Suspensin
permanece
homognea.
CONTROL DE CALIDAD:
a. Control de esterilidad del plasma: 24 horas a 35C.
b. Control de coagulacin: Agregue una gota de solucin de Cloruro de calcio
al 5% a 0.5 mL de plasma. El plasma debe coagular en un periodo de 1
minuto.
c. Control positivo: S. aureus.
d. Control negativo: S. epidermidis.
PRECAUCIONES Y RECOMENDACIONES:
1. Si se usa plasma citrato, agregue 5 unidades de heparina/ mL para eliminar
falsos positivos en la prueba de la coagulasa, ya que microorganismos que
utilizan citrato causan coagulacin del plasma al consumirlo.
78
2. Si el cultivo a probar tiene ms de 24 horas o es escaso se puede obtener

una prueba de coagulasa dbil.
3. Si una colonia no se suspende en la solucin salina en la prueba en lmina,

el resultado es imposible de interpretar.
4. No se deben emplear inculos provenientes de medios con alta
concentracin de sal, ya que el cultivo autoaglutina en solucin salina.
5. Cuando realice la prueba en tubo no agite el tubo para observar la
formacin de cogulo. Un falso negativo puede ocurrir debido a un
rompimiento del cogulo inicial que no se formar de nuevo.
6. Es muy importante observar el tubo cada 30 minutos, ya que existen cepas
de S. aureus que producen grandes cantidades de fibrinolisina, por lo que
el cogulo se puede lisar antes de 4 horas e interpretar errneamente el
resultado como negativo.
7. Algunas cepas producen poca coagulasa, por lo que la formacin del
cogulo se evidencia hasta las 24 horas de incubacin.
79
PRUEBA DE LA CATALASA.
La catalasa, es una enzima que poseen la mayora de las bacterias aerobias y
anaerobias facultativas.
El perxido de hidrgeno es uno de los productos finales del metabolismo
oxidativo de los carbohidratos y si se acumula es letal para el microorganismo.
La catalasa convierte el perxido de hidrgeno en agua y oxgeno de acuerdo a
la siguiente reaccin:
CATALASA
H202
2H2O+O
Esta prueba es de vital importancia en la diferenciacin de Streptococcus

(catalasa negativa) y de los Staphylococcus (catalasa positiva).
REACTIVO
Perxido de hidrgeno al 3%: Se prepara con perxido de hidrgeno y agua
destilada. Este es un reactivo muy inestable que cuando se expone a la luz se
80
descompone fcilmente. Debe almacenarse en refrigeracin y en botella color

mbar. Adems justo cuando se va a usar debe revisarse que d bien con los
controles de calidad.
1. PRUEBA EN LMINA.
a) Con una aguja bacteriolgica o un aplicador estril, pique el centro de una
colonia bien aislada y transfiera el inculo a un portaobjeto limpio.
b) Aada 1 o 2 gotas de perxido al 3%.
c) Observe si se forman burbujas o no inmediatamente despus que se aade
el reactivo.
d) Descarte la lmina en un recipiente con desinfectante.
2. MTODO EN PLATO O TUBO CON AGAR.

a) Aada unas gotas del perxido de hidrogeno al 15% directamente sobre la
superficie donde hay crecimiento.
b) Observe si se forman o no burbujas de inmediato.
CONTROL DE CALIDAD.
a) Control positivo: Staphylococcus sp.

b) Control negativo: Streptococcus sp.
PRECAUCIONES.
1. El orden de la prueba en lmina no debe invertirse cuando se use asa de
platino ya que puede dar un resultado falso positivo. El alambre de
nihcrome no interfiere.
2. La prueba debe realizarse a cultivos de 18- 24 horas; cultivos ms viejos
pueden perder su actividad de catalasa dando una reaccin falsa negativa.
3. El perxido de hidrgeno es extremadamente custico por lo que se debe

evitar que toque la piel ya que puede causar quemaduras dolorosas. En
81
caso que ocurran, inunde de inmediato el rea afectada con alcohol al 70%
para neutralizar la accin. NO DEBE USAR AGUA.
PRUEBA DE OXIDASA.
La enzima Oxidasa, conocida tambin como CITOCROMO O OXIDASA O
INDOFENOL OXIDASA. Se encuentra presente en una gran variedad de seres
vivientes entre los que incluyen bacterias hasta animales superiores. Su funcin
es la de promover la oxidacin del citocromo c a expensas del oxgeno
molecular.
En bacteriologa se puede determinar su presencia al hacer reaccionar una
poblacin bacteriana con su sustrato oxidable como el dimetil o tetrametil- pfenilendiamina y el resultado observado es la aparicin de color que va del
rosado al prpura.
Las siguientes reacciones ilustran lo anteriormente expuesto:
2 citocromos c reducidos + 2H* + O2 CITOCROMO.c2 citocromo c oxidativos + H2O

OXIDASA.
2 citocromos c reducidos + REACTIVO
COMPUESTO COLOREADO
OXIDACIN
Esta prueba es sumamente importante en la identificacin de bacterias Gram

negativas y en la diferenciacin de cocos Gram positivos de importancia clnica:
Micrococcus (prueba positiva) y Staphylococcus (prueba negativa excepto S.
Sciuri).
82
REACTIVOS.
I. PARA GRAM NEGATIVOS.

1. REACTIVO DE KOVAC
Tetrametil P- fenilendiamina dihidrocloruro....................... 0.1 g
Agua destilada................................................................... 10 mL.
Agregue agua al tetrametil p- fenilendiamina y disulvalo. Si es necesario
caliente lentamente para lograr la disolucin completa.
Este reactivo debe ser incoloro o mostrar un tono rosado sumamente leve. Si
presenta otro aspecto, descrtelo; es poco estable y se oxida rpidamente, de
tal forma que debe prepararse justo antes de usarlo.
De los reactivos empleados para detectar OXIDASA, este es el MS
SENSIBLE.
2. REACTIVO DE GORDON Y McLEOD:
Dimetil p- fenilendiamina monohidrocloruro...................0.1 g
Agua destilada...................................................................10 mL
Agregue el agua al dimetil p- fenilendiamina y disulvalo. Si es necesario,
caliente lentamente para lograr la disolucin completa.
Este reactivo debe presentar un tono lila muy tenue. Si presenta otro
aspecto, descrtelo. Es ms estable que el reactivo de Kovac pero MENOS
SENSIBLE. Debe prepararse justo antes de usarlo.
II. PARA COCOS GRAM POSITIVOS.

1. REACTIVO DE FALLER Y SCHLEIFER:
Tetrametil p- fenilendiamina dihidrocloruro...................0.6g
Dimetilsulfxido.................................................................10 mL.
83
Agregue el dimetilsulfxido al tetramil- p- fenilendiamina y disulvalo. Este

reactivo presenta un tono lila suave, es muy sensible.
Almacnelo en botellas color mbar.
Si el reactivo presenta otro color,
DESCARTELO.
PROCEDIMIENTO
I. PARA GRAM NEGATIVOS
A. TIRAS DE PAPEL
A partir de un cultivo de 18-24 horas, tome un inculo denso con asa de platino
o palillo de madera estriles y depostelo sobre una tirilla de papel filtro
impregnada con el reactivo para oxidasa
B. PRUEBA DIRECTA EN PLACA.

Inunde las colonias en estudio en la placa con el reactivo para oxidasa.
II. PARA COCOS GRAM POSITIVOS.

A partir de un agar incubado a 36C por 18-24 horas en atmsfera aerobia tome
una asada del cultivo y esprzala en una tira de papel filtro. Agregue 1 gota del
reactivo de Faller y Schleifer.
LECTURA E INTERPRETACIN:
a) REACTIVO DE KOVAC: Se debe hacer la lectura en un perodo de hasta 10
segundos.
b) REACTIVO DE GORDON Y McLEOD: Se debe de leer en un perodo de
hasta 30 minutos.
c) REACTIVO DE FALLER Y SCHLEIFER: Se debe leer en un perodo de
hasta 2 minutos.
84
PRUEBA POSITIVA: Aparicin de color prpura en el tiempo estipulado

PRUEBA NEGATIVA: No aparicin de color prpura en el perodo sealado.
CONTROL DE CALIDAD:
a) Control positivo para:
Gram negativos: Aeromonas hydrophila.
Pseudomonas aeruginosa.
Gram positivos: Micrococcus sp.
b) Control negativo para: Gram negativos: Escherichia coli

Gram positivos: Staphylococcus aureus.
PRECAUCIONES Y RECOMENDACIONES:
85
1.
La cristalera empleada para preparar y almacenar los reactivos para

oxidasa debe ser lavada escrupulosamente para eliminar restos de materia
orgnica, ya que sta contribuye a oxidar el reactivo.
2.
No realice la prueba de oxidasa a colonias bacterianas crecidas en medios

que contengan glucosa, ya que su fermentacin inhibe la actividad de la
enzima y ocasiona falsos negativos.
3.
La prueba debe realizarse nicamente a colonias provenientes de medios

no selectivos y no diferenciales.
4.
Para la prueba no debe utilizarse el asa corriente (NIHCROME) dado que

sta, por las trazas de hierro que deja, puede inducir la oxidacin del
reactivo y dar falsos positivos.
5.
La reaccin debe observarse NICAMENTE en la colonia y no alrededor

de sta.
6.
El dimetil- p- fenilendiamina es menos sensible y las colonias viscosas

(mucosas) pueden aparecer como oxidasa negativas por la poca
penetracin del reactivo.
86
Anexo 3.
PROCEDIMIENTOS BACTERIOLGICOS
PARA LA INOCULACIN O INTERPRETACIN DE LAS
PRUEBAS BIOQUMICAS.
1. AGAR HIERRO TRES AZUCARES (TSI).
A partir de una colonia pura y bien aislada, tomar una asada, utilizando el
asa en punta. Picar el medio hasta el fondo solamente una vez y luego
estriar el Bisel. Incubar a 36C. Por 18 a 24 horas.
Interpretacin de las reacciones en TSI:
A- Utilizacin de los carbohidratos.
1. Fermentacin slo de la glucosa:
Bisel: alcalino (rojo), Fondo: cido (amarillo).
2. Fermentacin de la glucosa y otro azcar:
Bisel: cido (amarillo), Fondo: cido (amarillo).
3. Ninguno de los carbohidratos es fermentado:
Bisel: alcalino (rojo), Fondo: alcalino (rojo).
B- Produccin de gas.
87
Positivo:
Burbujas dentro del medio
Rompimiento del medio
Desplazamiento del medio hacia arriba.
Negativo:
No se produce lo anteriormente descrito en el medio.
C- Produccin de H2S
Positivo:
Todo el fondo del tubo se observa negro, se produce un precipitado
escaso, (se observa un color negro, entre el fondo y el bisel).
Negativo:
No se observa ningn precipitado negro.
2. LA UTILIZACIN DEL CITRATO.

Se inocula el medio slido de Simmons a partir de un cultivo puro o colonia
aislada, se estra nicamente el bisel.
88
Incubar por 24-48 horas a 35- 36C, en algunos casos puede requerirse una
incubacin de 4 das.
INTERPRETACIN.
Positivo: Crecimiento con viraje azul del indicador (Control: Citrobacter
freundii).
Negativo: No hay crecimiento ni cambio de color (Control: Escherichia col
ATCC 25922).
3. PRUEBA DE LA UREASA:
Inocular el medio de urea (caldo o slido) a partir de una colonia pura, el
ms utilizado es el Medio de Christensen, el cual se estra nicamente en el
bisel.
Incubar a 35C, leer de 6 - 24 horas y dejar hasta 6 das si es necesario.
INTERPRETACIN.
Positivo: Color rosado intenso en el bisel (Control: Proteus mirabilis).
Negativo: No hay cambio de color (amarillo) (Control: E. Col ATCC 25922).
4. PRUEBA DE LA MOVILIDAD.
Deben de inocularse dos tubos de agar movilidad a partir de un cultivo de
18-24 horas, utilizando para ello la aguja bacteriolgica e introducindola en
el centro hasta una profundidad de 1.5 cm. un tubo se incuba a 35C por 2448 horas y el otro se mantiene durante el mismo perodo de tiempo a
temperatura ambiente, por cuanto existen bacterias que presentan movilidad
nicamente a temperatura ambiente.
INTERPRETACIN
Una vez transcurrido el tiempo de incubacin, se observan los tubos inoculados
comparndolos con un tubo sin inocular para determinar si la bacteria es mvil.
89
Prueba positiva: Se observar migracin de la bacteria a partir de la lnea de

inculo que se manifiesta por la aparicin de turbidez en el tubo. En bacterias
no fermentadoras puede observarse esta misma migracin pero a nivel de la
superficie del medio.
Prueba negativa: La bacteria crecer solamente a lo largo de la lnea de
inoculacin y el resto del tubo permanece sin turbidez.
CONTROL DE CALIDAD:
a) Control de esterilidad: 24 horas a 35C.
b) Control positivo: Escherichia col y Pseudomonas sp.
c) Control negativo: Klebsiella sp.
5. PRUEBA DE INDOL.
Inocular el microorganismo en un caldo o medio semislido que contenga
triptfano.
Incubar a 36C por 24 horas.
Agregar al medio cultivo 5 gotas del reactivo de Kovac y agitar suavemente.
INTERPRETACIN
Positivo: Color rojo en el anillo de interfase del reactivo con el medio.
Negativo: No hay cambio de color y el reactivo queda amarillo
Control positivo: E. Col ATCC 225922.
Control negativo: Enterobacter cloacae.
ROJO DE METILO Y VOGES PROSKAUER

Inocular un tubo de caldo RM-VP con un cultivo puro o con una colonia bien
aislada. Incubar por 18 a 24 horas a 36C.
90
INTERPRETACION
ROJO DE METILO (RM).
A partir del tubo incubado con el microorganismo pasar 2. 5 mL a otro tubo
limpio.
Agregar a ste 5 gotas del indicador rojo de metilo.
Positivo:
El indicador permanece rojo.
Negativo:
El indicador cambia a un color amarillo.
VOGES-PROSKAUER (VP):
A los otros 2.5 mL del medio que quedaron del paso anterior, agregarles 6
gotas del reactivo de alfa- naftol ( - naftol) y luego 2 gotas de KOH al
40%. Agitar fuertemente y luego dejar en reposo por 15 minutos. Se sugiere
agitar de vez en cuando.
INTERPRETACION
Positivo: Color rojo o rosado en el medio.
Negativo: El medio no tiene color o es amarillo.
Control positivo: Klebsiella pneumoniae.
Control negativo: Escherichia Col ATCC 25922.
91
TABLA PARA LA IDENTIFICACIN DE ENTEROBACTERIAS.
BACTERIA
Proteus
BISEL
FONDO GAS
H2S
CITRATO
UREA
INDOL MOVILIDAD
ROJO
DE
METILO
VOGESPROSKAUER
AK
2-4+
+-
4+
+ (+)
-/+
-
+w
+
-+
1/2
+
-A
+-
-A
Pseudomona
s aeroginosa
Pseudomona
flurorecens
Pseudomona
s multophilia
Pseudomona
s cepacias
+-
Pseudomonas
vulgaris
Proteus
mirabilis
Morganella
morganii
Proteus
retgeri
Providencia
stuartii
Providencia
alkalifaciens
Edwarciella
torda
Yersinia
pseudoteberculosis
Yersinia
enterocolitica
pseudomollei
Pseudomona
s mallei
Pseudomona
92
s stutzeri
Pseudomonas
putrefaciens
Alcaligenes
fecales
Alcaligenes
odorans
Alcaligenes
Denitrificans
+-
+-
+-
BACTERIA
BISEL
Escherichia col A K
Escherichia col
K
Alcalescens
dispar
Shigella
K
dysenteriae
Shigella
K
flexneri
Shigella boydii
K
Shigella sennei
K
Salmonella sp.
K
Salmonella
K
Typha
Salmonella
K
paratyphi A
Salmonella
d
arizonae
Arizona sp.
KA
Citrobacter
A
intermedius
Citrobacter
KA
freundii
Klebsiella
A
pneumoniae
Klebsiella
K
ozonae
Klebsiella
K
rhinoschleronal
is
Enterobacter
A
cloacae
Enterobacter
A
aerogenes
Enterobacter
K
hafnae
Enterobacter
AK
agglomerans
A
A
+-
+
+
-+
-
ROJO
DE
METILO
+
+
-**
A
A
A
A
d
-
-***
D
+w
d
-
+
+
+
+
+
+
A
A
+
+
2-4+
-
+
+
+
+
+
+
2-4+
(+)
+-
-+
+-
- +s
-+
-/+
+/-
FONDO
GAS H2S
CITRATO
UREA
INDOL
MOVILIDAD
TABLA PARA LA IDENTIFICACIN DE ENTEROBACTERIAS.
93
VOGESPROSKAUER
NOMENCLATURA.
D = Diferentes tipos de bioqumicas.
**= Algunas S. Flexneri serotipo 6 producen.
***= Serotipos 13 y 14 son gas+ W = reaccin dbil.
(+) = positivo lento tardo.
S = dbil
A cido - negativo.
Pseudomonas aeruginosa.
Pseudomonas fluorecens
Pseudomonas multophilia.
Pseudomonas cepacia.
Pseudomonas pseudomallei
Pseudomonas mallei
Pseudomonas stutzeri
Pseudomonas putrefaciens.
Oxidasa positiva
Oxidasa positiva
Oxidasa positiva
Oxidasa positiva
Oxidasa positiva
Oxidasa positiva
Oxidasa positiva
Oxidasa positiva
BIBLIOGRAFIA
94
Microbiologia Mdica Jawetz, Brooks, Geo 1997, Manual Moderno,

Mexico 15 Edicin.
Tecnologa y Mtodos de Lab. Clnico, Gonzlez de Butriago, Jos,

1990 Editorial Salvat, Mxico 1 Edicin.
Microbiologa e Inmunologia, Levison Warren, Manual
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Mxico 2 Edicin, 1998.
Microbiologa Mdica de Divo, Carmona Osvaldo, Editorial McGraw Hill,

Caracas 5ta. Edicin 1997.
Microbiologa. Brock Thomas, Prentice Hill, Mxico, 4ta Edicin 1987.
Microbiologa
Zinsser,
Jolik,
Walfgang
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Editorial
Medica
Panamericana, Buenos Aires, 20 Edicin 1997.
Diagnstico y Tratamiento para el Laboratorio, Henry- John Bernard,
Masson S.A., Espaa 9 edicin, 1993.
Microbiologa
Parasitologa,
Romero
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Ral
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Medica Panamericana, Mxico, 2 edicin, 1993.
Laboratorio Clnico. Microbiologa, Delgado Iribarren, Alberto,
Mc
Graw Hill, Madrid, 1 edicin, 1994.
Prevencin de enfermedades Nosocomiales OMS, 2003,
Ginebra, 2
edicin.
NAR/aa
95

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considerarse potencialmente infecciosas.

ASEPSIA: Libre de microorganismos.

preferentemente qumicos, que se emplean para destruir grmenes

contaminacin operatoria. Hay varias formas de esterilizar como:

Aldehdos: Son agentes alquilantes que actan sobre las

Estufas Hornos: Doble cmara, el aire caliente generado por

Mantenga el lugar de trabajo en ptimas condiciones de higiene

Evite fumar, beber y comer cualquier alimento en el sitio de

NO SE DEBE UTILIZAR EL TELEFONO CELULAR DENTRO DEL

No guarde alimentos, en las neveras ni en los equipos de

Lvese cuidadosamente las manos antes y despus de cada

Utilice en forma sistemtica guantes plsticos o de ltex en

Abstngase de tocar con las manos enguatadas alguna parte del

aerosoles de sangre u otros lquidos corporales.

Use batas o cubiertas plsticas en aquellos procedimientos en

Evite deambular con los elementos de proteccin personal por

Mantenga sus elementos de proteccin personal en ptimas

Evite cualquier contacto directo de muestras si usted presenta

hospitalarios expuestas al riesgo biolgico VIH/SIDA y/o Hepatitis

Aplique en todo procedimiento asistencial las normas de asepsia

Evite reutilizar el material contaminado como agujas, jeringas.

Realice desinfeccin y limpieza a las superficies, elementos,

En caso de derrame o contaminacin accidental de sangre u

desinfectante y realice limpieza con agua y jabn. El personal

guantes, mascarilla y bata.

En caso de ruptura de material de vidrio contaminado con

Los recipientes para transporte de muestras deben ser de

preferiblemente el tapn de rosca.

Manipule, transporte y enve las muestras disponindolas en

empleando gradillas limpias para su transporte. Las gradillas a

En caso de contaminacin externa accidental del recipiente,

Restrinja el ingreso a las reas de alto riesgo biolgico al

La ropa contaminada con sangre, lquidos corporales u otro

Disponga el material patgeno en bolsas resistentes de color

En caso de accidente de trabajo con material corto punzante

Verificar los controles de calidad que se llevan a cabo en el rea de

identificacin de cepas bacterianas.

I- NORMAS GENERALES DE LA TOMA, MANEJO Y

3. Todo paciente con solicitud de exmenes de Laboratorio, deber

10. Para el envi de la muestra es conveniente disponer o mejor dicho conocer

ENVI DE MUESTRAS AL LABORATORIO DE REFERENCIA.

1. Suero: Deben almacenarse entre- 20C y/o 4C y transportarse a iguales

3. Sangre completa: Debe almacenarse a 4 C (refrigeradora) y enviarlas

4. Los sueros enviados estarn en tubos o viales perfectamente cerrados, las

La muestra para cultivo de orina puede ser por cateterismo, puncin

c) En un frasco estril de boca ancha, tapn de rosca, transparente, recoger

Toma de muestra: efectuar presin suave sobre la uretra, eliminar la secrecin

Si se va a transportar colocarlo en medio de transporte de Stuart, Amies o Cary

Toma de muestra: colocar a la paciente en posicin ginecolgica, introducir el

con el cubre objetos

La muestra debe tomarse en los tres primeros das de la enfermedad y antes de

sangre, la muestra debe ser de 1 a 2 gramos si es slida y de 3 a 4 mL. Si es

La muestra debe tomarse de amgdalas y faringe, colocar al enfermo en

iluminacin, pedir al paciente que

pronuncie la letra A, baje la lengua suavemente con un bajalengua, frote el

Toma de muestra: el paciente debe efectuar repetidos enjuagatorios previos con

En este caso es recomendable que el oftalmlogo, con anestesia local tome la

En un absceso cerrado si el contenido es fluido extraer con jeringa, si el

del centro: hacer frotis de inmediato y colocar los hisopos en medio de

LQUIDOS CEFALORRAQUDEO Y OTROS

Laboratorio a temperatura ambiente: usualmente se toman 2 tubos uno para