CROMATOGRAFA LQUIDA

La Cromatografa lquida, tambin conocida como Cromatografa de lquidos, es una

tcnica de separacin y no debe confundirse con una tcnica cuantitativa o cualitativa de
anlisis. Es una de las tcnicas analticas ampliamente utilizadas, la cual permite separar
fsicamente los distintos componentes de una solucin por la adsorcin selectiva de los
constituyentes de una mezcla. En toda cromatografa existe un contacto entre dos fases,
una fija que suele llamarse fase estacionaria, y una mvil (fase mvil) que fluye
permanente durante el anlisis, y que en este caso es un lquido o mezcla de varios
lquidos. La fase estacionaria por su parte puede ser almina, slice o resinas de
intercambio inico que se encuentran disponibles en el mercado. Los intercambiadores
inicos son matrices slidas que contienen sitios activos (tambin llamados grupos
ionognicos) con carga electrosttica (positiva o negativa). De esta forma, la muestra
queda retenida sobre el soporte slido por afinidad electrosttica. Dependiendo de la
relacin carga/tamao unos constituyentes de la mezcla sern retenidos con mayor fuerza
sobre el soporte slido que otros, es decir sern adsorbidos, lo que provocar su
separacin. Las sustancias que permanecen ms tiempo libres en la fase omega,
avanzan ms rpidamente con el fluir de la misma y las que quedan ms unidas a la fase
estacionaria o retenidas avanzan menos y por tanto tardarn ms en salir o fluir. ste es
el principio fundamental de la cromatografa. Un ejemplo notable es la cromatografa de
intercambio inico. Las columnas ms utilizadas son las de slice.

3.2. Tipos de cromatografa de alta resolucin. Fases estacionarias.

3.2.1. Cromatografa de reparto (particin).
La fase estacionaria es un lquido qumicamente ligado a un soporte a travs de una
reaccin de silanizacin entre los grupos silanoles presentes en la superficie de las
partculas de slice y un reactivo silanizante:

R es, en general, una cadena lineal de C8 o C18. Tambin se usan cadenas carbonadas
cortas conteniendo grupos amino, fenilos o nitrilos, para aumentar la polaridad de la
superficie y, en consecuencia, lograr la retencin y separacin de molculas de
polaridades diversas.
Es posible distinguir dos tipos de fases enlazadas, segn la polaridad relativa entre fase
mvil y fase estacionaria. En la cromatografa en fase normal (NPLC), la fase estacionaria
es polar y la fase mvil es un solvente no polar como n-hexano o mezclas de alcano con
metil-tert-butileter o cloroformo. El componente menos polar de la muestra eluye primero
y los ms polares son ms retenidos en la columna. En la cromatografa en fase reversa
(RPLC), la fase estacionaria es apolar y la fase mvil es polar, generalmente una mezcla

de agua con metanol, acetonitrilo o tetrahidrofurano; los componentes que eluyen primero
son los ms polares, y los ms hidrofbicos son altamente retenidos.
Actualmente se calcula que un 75% de las separaciones con HPLC se realizan en la
modalidad fase reversa con columnas de C18 (tambin denominadas ODS) o de C8. En
estos rellenos, los hidrocarburos de cadena larga se alinean paralelos entre s y
perpendiculares a la superficie, formando una superficie de hidrocarburo no polar
semejante a un cepillo.
El xito o fracaso de una separacin requiere de un equilibrio adecuado entre las fuerzas
intermoleculares de los tres participantes del proceso: analito, fase mvil y fase
estacionaria. Estas fuerzas intermoleculares se basan en la polaridad relativa de cada
uno de los tres componentes. La polaridad de los grupos funcionales orgnicos ms
comunes en orden creciente es: hidrocarburos alifticos < olefinas < haluros < sulfuros <
teres < compuestos nitro < steres aldehdos cetonas < alcoholes aminas <
sulfxidos < amidas < cidos carboxlicos < agua.
Como regla general, las mejores chances de separacin se logran haciendo coincidir la
polaridad del analito con la de la fase estacionaria, y empleando fases mviles de
polaridad muy distinta.
La Tabla siguiente rene la variedad de muestras en la que la tcnica es aplicable.
Campo de aplicacin
Farmacutico
Bioqumica
Alimentos
Industria
Contaminantes
Qumica forense
Medicina clinica

Mezclas habitualmente separadas

Antibiticos, sedantes, esteroides, analgsicos
Aminocidos, protenas, carbohidratos
Edulcorantes artificiales, antioxidantes, aflatoxinas y aditivos
Aromticos condensados (PAH), agentes tensoactivos,
colorantes
Plaguicidas, herbicidas, fenoles y bifenilos policlorados
(PCBs)
Drogas, venenos, alcohol en sangre, narcticos
Sales biliares, metabolitos de frmacos, extractos de orina y
estrgenos

3.2.2. Cromatografa de adsorcin

La fase estacionaria es la superficie de un slido finamente dividido. El analito compite
con las molculas del eluyente por los sitios activos superficiales y la retencin se basa
en estas fuerzas de adsorcin. La slice y la almina finamente divididas son las nicas
fases estacionarias de uso generalizado. Las fases mviles son las que permiten
optimizar la separacin entre picos. Su uso est menos difundido que la RPLC, aunque
constituye una excepcin la resolucin de mezclas de ismeros geomtricos como por
ejemplo, las formas meta y para de derivados de benceno.
3.2.3. Cromatografa de intercambio inico (IEC)
En este tipo de cromatografa, la fase estacionaria es una resina polimrica sintetizada a
partir de estireno y entrecruzada con divinilbenceno, que en su superficie posee grupos
inicos sulfnicos o carboxlicos (cargas negativas) para la separacin de cationes o bien
grupos aminos (cargas positivas) aplicable a la separacin de aniones:

R= -COO-, SO3- , NR4+

El control sobre el grado de entrecruzamiento del polmero permite obtener un material de

poros de dimensiones controladas, que regulan la selectividad de la columna. Los
contraiones de estas superficies cargadas son mviles y pueden ser desplazados por los
solutos inicos de la muestra.
La fase mvil son bufferes de distinta fuerza inica que permite modular la intensidad de
la retencin. La retencin se basa en la carga que porta el analito, y en su grado de
hidratacin.
Usualmente, el sistema de deteccin usado en esta cromatografa consiste en medir la
conductividad del eluyente. Sin embargo, la fase mvil constituida por sales posee una
conductividad de base muy alta que tiende a atenuar la conductividad de los analitos
inicos de la muestra, reduciendo la sensibilidad. Este problema se resolvi usando una
columna supresora del eluyente que se coloca inmediatamente a la salida de la columna
de intercambio. Esta columna supresora est rellena con una segunda resina que
convierte a los iones del disolvente en una especie molecular de conductividad nula, de
modo que la conductividad que registre el detector se deba nicamente al soluto. Por
ejemplo, en la separacin de cationes se puede usar cido clorhdrico como eluyente, y
como columna supresora se usar una resina intercambiadora aninica en la forma de
hidrxido. El producto de la reaccin ser agua:

H+ (aq.) + Cl- (aq.) + resina+OH-

resina+Cl- + H2O

Esta columna supresora aninica no retendr a los analitos (cationes) de la muestra.

En el caso de separacin de aniones, la columna supresora ser la forma cida de una
resina intercambiadora de cationes, y el eluyente puede ser carbonato o bicarbonato:

Na+ (aq.)
H2CO3 (aq.)

HCO3- (aq.) + resina-H+

resina-Na+ +

El cido carbnico es un cido dbil y est muy poco disociado, por lo que su
contribucin a la conductividad es mnima.
Este tipo de cromatografa se aplica a la separacin de iones inorgnicos y orgnicos. La
Figura 29 muestra dos cromatogramas con ejemplos de aplicaciones.

3.2.4. Cromatografa de exclusin molecular

El relleno consiste en partculas de slice o polimricas de tamao de poro uniforme,
dentro de los cules puede difundir las molculas de soluto y de solvente. El tiempo de
retencin del soluto depende de su tamao efectivo. Las molculas de mayor dimetro
que el dimetro del poro son excluidas y por lo tanto eluyen primero. Las molculas ms
pequeas ingresan a los poros y su tiempo de residencia es mximo. Entre ambos
extremos, se encuentran molculas de tamao intermedio, cuyo tiempo de permanencia
en los poros depender de su dimetro efectivo. En este tipo de cromatografa, a
diferencia de los otros modos descriptos, se minimizan las interacciones fsicas y/o
qumicas entre el soluto y la fase estacionaria o con la fase mvil, la retencin es
exclusivamente por tamao.
Los rellenos que constituyen las columnas pueden ser hidroflicos, para ser usados con
fases mviles acuosas, o hidrofbicos, que se utilizan con solventes orgnicos no
polares. Para ambos rellenos existen disponibles dimetros de poros que varan desde 50
a 4000 en el caso de slice o desde 50 a 1.000.000 para polmeros de
estireno/divinilbenceno; la eleccin del tamao de poros del relleno depender del peso
molecular de los analitos que se van a separar. Estos pesos moleculares pueden variar
desde algunas centenas a millones de daltons.
Su campo de aplicacin ms desarrollado es la separacin de mezclas de polmeros
sintticos (polmeros y oligmeros de sntesis industrial) o naturales (protenas y
polisacridos) que difieren en su distribucin de pesos moleculares. La Figura 30 muestra
la separacin de seis protenas empleando una combinacin de tres columnas con
rellenos de 150, 300 y 500 , colocadas en serie.