"El canal de potasio KcsA: modelo para el estudio de la oligomerizacin y el

plegamiento de protenas de membrana".

M Lourdes Renart, Francisco N. Barrera, M Luisa Molina, Jos A. Encinar, Asia
Fernndez, Jos A. Poveda, Jos M. Gonzlez-Ros.
Instituto de Biologa Molecular y Celular, Universidad Miguel Hernndez. Elche
(Alicante).
El canal de potasio KcsA de Steptomyces lividans es considerado un sistema modelo
para el estudio de canales inicos, ya que puede ser expresado y purificado con relativa
facilidad y su estructura atmica ha sido resuelta mediante difraccin de rayos X. KcsA es
un homotetrmero, con subunidades de 160 aminocidos formadas por dos hlices
transmembrana y dominios citoplasmticos en los extremos amino y carboxilo terminal. Su
estructura secundaria es preponderantemente alfa helicoidal y es resistente a condiciones
desnaturalizantes tales como urea 8M, cloruro de guanidinio 6M o SDS 2%.
Trabajando con KcsA en su forma solubilizada ( en -D-dodecilmaltsido, DDM)
hemos observado que los tetrmeros de KcsA son capaces de autoasociarse, en un proceso
dependiente de concentracin. Adems, cuando la protena es reconstituida en asolectina o
solubilizada en micelas mixtas de DDM y DOPE (1,2-dioleoil-sn-glicero-fosfoetanolamina)
y DOPG (1,2-dioleoil-sn-glicero-3[fosfo-rac-(1-glicerol)], se da un incremento en el estado
de oligomerizacin, formndose clusters de tamao heterogneo. La formacin de este
tipo de estructuras explicara la diversidad funcional de este canal observado mediante
tcnica de pinzamiento de membrana (patch-clamp).
Analizando la estabilidad proteica del canal solubilizado en DDM frente
concentraciones crecientes de 2,2,2-trifluoroetanol (TFE), observamos que manifiesta tres
transiciones sucesivas. La primera transicin ocurre a porcentajes bajos de TFE, menores a
15%, es poco cooperativa y constituye la prdida de las estructuras de peso molecular
superior al tetrmero. La segunda de las transiciones es cooperativa y dependiente de la
concentracin de protena, ocurre a concentraciones medias de TFE (alrededor de 25% v/v),
en donde KcsA incrementa la exposicin de sus triptfanos al disolvente y pierde
parcialmente su estructura secundaria caracterstica. Conjuntamente con estos cambios en
la estructura secundaria y terciaria, ocurre la disociacin del tetrmero en sus monmeros
constituyentes. Bajo estas condiciones de TFE podemos lograr un alto porcentaje de
replegamiento de la protena por simple dilucin con tampn y detergente. El canal as
replegado mantiene su funcin caracterstica cuando posteriormente a la dilucin es
reconstituido y sometido a medidas funcionales por patch-clamp. Por otro lado, la
transicin entre tetrmero plegado y monmero desplegado fue completamente reversible
(100% rendimiento) cuando se utiliz KcsA en micelas mixtas de DDM y DOPE (1,2dioleoil-sn-glicero-fosfoetanolamina) y DOPG (1,2-dioleoil-sn-glicero-3[fosfo-rac-(1glicerol)]) en una relacin molar 7:3. No fue posible obtener la forma nativa de KcsA
partiendo de concentraciones elevadas de TFE, correspondientes a la segunda transicin,
donde la protena se desnaturaliza de manera irreversible.
De esta manera comprobamos que puede replegarse de manera eficiente una
protena de membrana preponderantemente helicoidal como es KcsA y que ciertos factores
como la presencia de lpidos en la mezcla de reaccin favorece la aparicin de estructuras
relevantes para la funcionalidad de este canal.