CURSO DE BIOLOGIA MARINHA E BIOTECNOLOGIA

RAMO DE BIOTECNOLOGIA
DISCIPLINA DE CULTURA DE CLULAS E TECIDOS
6 SEMESTRE - ANO LECTIVO 2008 / 2009

1. Segurana Biolgica e Regras de Funcionamento em Laboratrios

de Cultura de Clulas e Tecidos Vegetais

1.1. Introduo
Ao iniciar qualquer trabalho em ambiente laboratorial dever ter presente um conjunto
de regras e de conceitos muito elementares que o vo ajudar a realizar os trabalhos propostos
nesta unidade curricular. Nesta primeira aula vamos apresentar de uma forma simplificada,
algumas noes que se iro revelar de extrema utilidade para executar os trabalhos propostos
ao longo deste semestre.
O nosso meio ambiente est repleto de microrganismos. Podemos encontr-los no ar,
na gua, nos vrios objectos e superfcies que nos circundam. por este motivo que o trabalho
em cultura de clulas e tecidos dever ser executado em condies de assepsia que impeam
a contaminao dos meios usados e das culturas com microrganismos adventcios.

1.2. Regras Gerais de Segurana no Laboratrio

A segurana num laboratrio envolve a implementao de procedimentos particulares,
associados s metodologias necessrias para manipular as culturas em condies de
assespsia. Por um lado, devido s reduzidas dimenses das clulas, que para ns so
imperceptveis, e por outro, pela necessidade de trabalhar com culturas celulares puras, o
laboratrio dever estar organizado de forma a garantir a boa execuo dos trabalhos. Em
qualquer espao laboratorial, os procedimentos a seguir devem incluir o cumprimento de regras
de funcionamento, de medidas de segurana obrigatrias e o manuseamento correcto e
cuidadoso do material, dos reagentes qumicos e do equipamento laboratorial. Atender a estes
princpios contribui para a preveno de acidentes impedindo a existncia de fontes de
contgio ou de perigo no local de trabalho. O sucesso das experincias depender do grau de
rigor com que as mesmas forem executadas e dos baixos nveis de contaminaes cruzadas.
boa prtica observar, cumprir e fazer cumprir as regras, procedimentos e comportamentos que
se indicam em seguida

1.2.1. Acesso
O acesso ao laboratrio de cultura de clulas e tecidos restrito s pessoas qualificadas para o
efeito, que incluem os estudantes / formandos apenas durante os perodos de aulas previstos.
1.2.2. Bata
O uso de uma bata comprida, limpa e devidamente ajustada ao corpo indispensvel sempre
que se opere em laboratrio, sendo o seu uso obrigatrio e responsabilidade de cada aluno. A
bata protege o operador e o seu vesturio de eventuais acidentes e evita o transporte de
microrganismos indesejveis para o ambiente esterilizado da sala de cultura. A bata dever ser
usada apenas no laboratrio, sendo vestida entrada e despida sada. Desta forma,
minimiza-se o transporte de microrganismos exteriores para o laboratrio, permitindo a
manuteno de uma baixa carga contaminante. Relembramos que no permitida na ESTM a
utilizao de bata fora dos laboratrios.
1.2.3. Cabelos e Vesturio
Os cabelos compridos devero sempre ser atados e no permitido o uso de peas de
vesturio soltas, como batas desabotoadas, lenos de pescoo ou gravatas soltas. Alm da
movimentao excessiva de ar que provocam, a sua eventual inflamao nos bicos de gs
poder ter consequncias desastrosas. Quando se trabalha na cmara de fluxo laminar devese ainda retirar os relgios, pulseiras ou anis, permitindo assim a desinfeco correcta das
mos, pulsos e antebraos.
1.2.4. Mos
entrada e sada do laboratrio imprescindvel lavar bem as mos com abundante gua e
sabo, para minimizar as contaminaes.

1.2.5. Comer e beber

expressamente proibido comer, beber, fumar, manipular lentes de contacto ou aplicar
cosmticos durante a execuo de experincias laboratoriais. Nunca pipetar com a boca.
aconselhvel adquirir o hbito de manter as mos longe da boca.
1.2.6. Bancada de trabalho
O local de trabalho dever estar sempre devidamente limpo, para o que se impe proceder
desinfeco da bancada antes de iniciar os trabalhos, evitando contaminaes com
microrganismos. No incio da sesso de trabalho a desinfeco executada com lcool a 70%
e no final com detergente desinfectante. Mantenha sempre a bancada arrumada e o material
em ordem.

1.2.7. Bicos de Bunsen e Lamparinas

Para evitar risco de incndio ou queimaduras os bicos de Bunsen e lamparinas devem ser
mantidos acesos apenas quando so necessrios. Logo que terminado o trabalho devem ser
imediatamente apagados. A utilizao de bicos de Bunsen no interior de hottes ou cmara de
fluxo laminar expressamente proibida, podendo apenas utilizar lamparinas.
1.2.8. Livros e cadernos
S permitido levar para a bancada o material de apoio estritamente indispensvel execuo
do trabalho, como o protocolo experimental, um bloco de notas ou um caderno e um lpis.
Todos os restantes pertences do operador, como pastas, casacos ou sacos devero ser
acondicionados em local prprio, antes de iniciada a experimentao.
1.2.9. Materiais e Equipamento
Todo o equipamento e material de laboratrio amovvel, utilizado durante a experimentao,
dever ser reposto no local indicado depois de concluda a sua utilizao. As placas e tubos
contaminados devero ser desinfectados ou colocados em local prprio para descontaminao.
Todo o material deve ser marcado utilizando marcadores de acetato (no fornecidos nas
aulas). Deve-se manusear com muita precauo certos materiais e aparelhos frgeis e/ou
muito sensveis e mant-los devidamente limpos. o caso dos termmetros, cabeas de
aquecimento termostatizadas, aparelhos de medio de pH e balanas, entre outros. Nunca
usar os aparelhos sem conhecer em pormenor o procedimento de utilizao e pedir sempre
que necessrio instrues aos responsveis. Colocar as pipetas de vidro sujas em contentores
de plstico com uma soluo com detergente e esto devidamente identificados para esse fim.
Colocar as pontas sujas das pipetas automticas no recipiente devidamente identificado para
esse fim.

1.2.10. Manuseamento de compostos qumicos

No manuseamento de compostos qumicos considerados perigosos, evitar o contacto cutneo
ou a sua inalao, recorrendo ao uso da hotte, de luvas, mscara ou culos de proteco,
consoante as caractersticas dos compostos.
1.2.11. Acidentes
Qualquer acidente dever ser de imediato reportado ao responsvel pela sesso de trabalho.
Lquidos ou outro material infectado, inadvertidamente transferidos para fora dos contentores a
que se destinam devero ser de imediato desinfectados com o apoio do responsvel.

1.3. Agentes de desinfeco e de esterilizao

A desinfeco de um determinado objecto ou ambiente, consiste na destruio, inibio
ou remoo de agentes microbianos causadores de doenas ou de outros problemas, como
por exemplo a degradao de alimentos, com recurso a agentes fsicos ou a agentes qumicos.
Neste processo so eliminadas as clulas vegetativas, mas no se promove a destruio de
esporos. Muitos dos produtos de limpeza domstica tais como a amnia e a lixvia, so
desinfectantes. Os desinfectantes domsticos, na sua grande maioria, so fortes agentes
oxidantes. Os sabes, sais biliares e fenis, actuam por alterao da tenso superficial na
interface clula/meio. O xido de etileno, o glutaraldedo ou o formaldedo so os agentes
qumicos de maior utilizao a nvel industrial. Outros agentes como os lcoois promovem a
desnaturao de protenas e a solubilizao de lpidos. Os agentes fsicos mais utilizados na
esterilizao e desinfeco de ambientes ou objectos so: o calor hmido, o calor seco, a
filtrao e as radiaes (ver tabela). Estas so sobretudo muito teis para esterilizao de
espaos, salas, instrumentos e materiais que no suportam as temperaturas exigidas pelas
tcnicas do calor.

2. Procedimento Bsicos da Preparao de Meios de Cultura

2.1. Introduo
A maioria dos procedimentos envolvidos na propagao in vitro de plantas so simples
e de fcil compreenso, apenas sendo necessrio algum cuidado a nvel da preciso, limpeza
e desinfeco e com alguns detalhes tcnicos.

2.2. Solues stock para preparao de meios de cultura

Os meios de cultura para plantas podem ser preparados a partir de misturas dos sais
que compem esses meios, preparadas como solues stock concentradas entre 10 a 100 X a
concentrao final. As solues stock podem ser preparadas na forma de uma soluo com
todos os macronutrientes e uma outra soluo com os micronutrientes. Estas solues no
podem ser muito concentradas (10-20X) para evitar a precipitao dos fosfatos e sulfatos de
clcio e magnsio.
Um mtodo mais comum consiste em preparar vrias solues stock de acordo com os
ies que cada uma contm. Deste modo prepara-se uma srie de solues que contm os
componentes inorgnicos do meio de cultura, em concentraes que rondam 100X a
concentrao final e cujas formulaes so variveis com o laboratrio. As solues stock so
normalmente armazenadas no frigorfico.

2.3. Misturas pr-formuladas

Muitos fornecedores j vendem as misturas de sais e vitaminas na forma de p, sendo
apenas necessrio adicionar gua, na quantidade indicada. As misturas podem conter apenas
os sais ou a formulao completa do meio de cultura. Normalmente estas misturas so
altamente higroscpicas e uma vez a embalagem aberta devem ser utilizadas num curto
espao de tempo.

2.3. Aditivos orgnicos

Muitos aditivos como por exemplo as vitaminas, so utilizados em to baixas
concentraes que a sua pesagem seria muito difcil e com erros. Assim, nestes casos so
preparadas solues stock 100-1000X concentradas, sendo depois divididas em pores e
congeladas. Os reguladores de crescimento so estveis em soluo stock por vrios meses,
sendo preparadas com diversos solventes.

2.4. Pesagem
A preparao de meios de cultura exige pesagens rigorosas, especialmente se
estivermos a preparar solues stock. Mesmo que se utilizem formulao j prontas, deve

haver rigor na preparao das mesmas. Normalmente a sacarose, o mio-inositol e o agente

gelificante so pesados independentemente.
As balanas devem estar localizadas em bancadas niveladas e estveis, longe de
vibraes e correntes de ar. A balana deve sempre ser limpa aps a utilizao.

2.5. pH
O valor de pH da maioria dos meios de cultura ajustado a 5.7 0.1 antes da
autoclavagem. O valor de pH pode influenciar a solubilidade dos ies, a capacidade gelificante
do agar e em ltima anlise o crescimento das culturas. Por exemplo, a pH 4.5 o agar no
solidifica. A medio do pH geralmente feita atravs de um medidor de pH (digital ou
analgico) o qual calibrado utilizando solues de pH conhecido. Apesar do pH diminuir com
a autoclavagem regra geral o seu valor no corrigido.

2.6. Distribuio e armazenamento de meios de cultura

Uma vez o meio preparado e o seu pH devidamente ajustado, este pode ser aquecido
de forma a dissolver o agente gelificante e seguidamente distribudo pelos recipientes de
cultura, como sejam tubos, potes de vidro (baby food jars) ou caixas Magenta. Isto feito caso
no seja necessrio adicionar ao meio componentes que necessitem de ser esterilizados por
filtrao
Em alternativa os meios podem ser colocados em frasco tapado e autoclavados. Uma
vez arrefecidos adicionam-se ento os componentes esterilizados por filtrao e o meio bem
misturado. Procede-se ento distribuio do meio pelos recipientes de cultura, isto j na
cmara de fluxo laminar. Todos os meios devem ser devidamente etiquetados e os recipientes
selados de modo a evitar contaminaes. O armazenamento regra geral feito s escuras a
4C (frigorfico), durante o mximo de 1 ms.

3. Tcnicas de Assepsia
3.1. Introduo
As tcnicas de assepsia so absolutamente fundamentais para o estabelecimento e
manuteno de culturas in vitro de clulas, tecidos e rgos vegetais. O ambiente in vitro no
qual o material vegetal se encontra ideal para a proliferao de microrganismos, os quais
rapidamente crescem e invadem todo o ambiente de cultura eliminando rapidamente os tecidos
ou clulas vegetais presentes. Os microrganismos contaminantes podem ter origem no
ambiente ou serem propagados entre culturas. As tcnicas de assepsia visam minimizar a
possibilidade desses microrganismos permanecerem ou entrarem no ambiente de cultura.

O controlo da qualidade do ar ambiente tambm alvo de ateno pois muitas vezes

representa uma fonte de contaminao bastante forte. Um simples espirro provoca entre 100
000 a 200 000 gotculas na forma de aerossol que podem depois agregar-se s partculas de
p e ficar em suspenso durante semanas. O ar pode ainda conter esporos bacterianos e de
fungos, tal como a prpria roupa e pele do operador.

3.2. Agentes contaminantes

As bactrias so os agentes contaminantes mais comuns. So usualmente introduzidas
na cultura por via do explant, podendo sobreviver aos processos de esterilizao superficial do
mesmo por se localizarem em tecidos interiores. Deste modo a contaminao bacteriana pode
somente ser detectvel muito depois da cultura ter sido iniciada. Alguns esporos bacterianos
mesmo que estejam localizados superfcie podem sobreviver aos procedimentos de
esterilizao. Podem encontrar-se nos tecidos vegetais muitos tipos bacterianos diferentes,
como Agrobacterium, Bacillus, Corynebacterium, Enterobacter, Lactobacillus, Pseudomonas,
Staphylococcus, e Xanthomonas. As colnias bacterianas apresentam um aspecto tpico
podendo apresentar colorao branca, creme, rosa ou amarelo e um odor caracterstico.
Os fungos filamentos podem entrar na cultura por via do explant ou por via de esporos.
Frequentemente os fungos filamentosos so patognes das plantas e esto tambm presentes
nos solos. Podem ocorrer numa multiplicidade de cores mas apresentam sempre um aspecto
filamentoso. As leveduras so tambm contaminantes bastante comuns, que vivem superfcie
das plantas e esto frequentemente presentes no ar.
Os vrus, micoplasmas e ricktesias so seres de dimenso extremamente reduzida e
como tal de difcil deteco. Frequentemente uma cultura pode estar contaminada sem que
ocorram sintomas. Estes seres podem ser erradicados por via de cultura de meristemas.
Os insectos que mais problemas podem causar so as formigas e afdeos, que podem
infectar culturas j estabelecidas ou terem os seus ovos sobre o explant no caso dos afdeos.
Os insectos contaminam as culturas com fungos sendo de difcil erradicao.
3.2.1. Contaminao Inicial
A maioria das contaminaes introduzida por via do explant devido a uma
esterilizao ineficiente ou apenas porque o material vegetal se encontra demasiado sujo e
contaminado de fungos ou bactrias. Este tipo de contaminao pode ser bastante difcil de
evitar no caso de explant ser colhido em campo ou numa estufa. Normalmente estas
contaminaes so visveis poucos dias aps a instalao das culturas em ambiente in vitro.
3.2.2 Contaminao Latente
Este tipo de contaminao normalmente de origem bacteriana e s se detecta algum
tempo depois da cultura estar instalada. Aparentemente a bactria estava presente de forma

endgena nos tecidos do explant, no sendo patognica na planta-me. No entanto, uma vez
em ambiente in vitro podem surgir e crescer de forma a eliminar as culturas. A contaminao
latente particularmente perigosa pois facilmente se transfere entre recipientes de cultura.
3.2.3 Contaminao Introduzida pelo Operador
Este tipo de contaminao resulta de condies laboratoriais inapropriadas ou de
tcnicas de assepsia deficientes, sendo facilmente prevenida.

3.3. A cmara de fluxo laminar

As cmaras de fluxo laminar so utilizadas na cultura de tecidos quer a nvel comercial
quer nos laboratrios de investigao. Estes aparelhos permitem a remoo de partculas do
ar, ao puxarem para o seu interior ar ambiente atravs de um filtro HEPA (High Energy Particle
Air) com uma velocidade uniforme e ao longo de toda a superfcie de trabalho. A filtrao
atravs do filtro HEPA remove todas as partculas de dimenso superior a 0.3 m incluindo
esporos de bactrias e de fungos, tornando o ar estril. A manuteno de presso positiva do
ar no interior da cmara evita que os esporos entrem na zona de trabalho. Dependendo do
design da cmara os filtros podem estar no topo ou na parte de trs da cmara de fluxo.

4. Tcnicas de Esterilizao de meios de cultura, recipientes e

utenslios
4.1. Autoclavagem
Mtodo mais utilizado para esterilizar materiais resistentes ao calor, consiste em manter
o material a 121C e 15 psi pelo menos durante 15 minutos. importante que os diversos itens
atinjam a temperatura adequada antes de se iniciar a contagem do tempo, pelo que o tempo de
vai depender por exemplo do volume dos recipientes e do nmero de recipientes a esterilizar.
Recipientes vazios, erlenmeyers, provetas e outros recipientes devem ser fechados com folha
de alumnio. Os utenslios devem ser envolvidos em alumnio, papel pardo ou manga adequada
e colocados num cesto. fundamental que o vapor penetre nos itens a esterilizar.

4.2. Autoclavagem e filtrao de meios de cultura e outros lquidos

Para esterilizar meios lquidos utilizam-se principalmente dois mtodos: a autoclavagem
e a esterilizao por filtrao. Os meios de cultura, gua destilada e outras misturas estveis
aps aquecimento so normalmente autoclavadas em recipientes de vidro tapados com rolhas
de algodo e papel de alumnio ou com rolhas plsticas.

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As solues sensveis ao calor como as que contm reguladores do crescimento,

animocidos ou vitaminas devem ser esterilizadas por filtrao, pois degradam-se durante a
autoclavagem. Os filtros utilizados tm normalmente poros de dimetro 0.2 m. Os filtros de
nitrocelulose podem ser esterilizados por autoclavagem, mas na maioria dos casos os filtros
so adquiridos j esterilizados. Os filtros menores so adaptveis a seringas sendo que os
filtros maiores so colocados em suportes de filtrao onde possvel aplicar vcuo. O
tamanho dos filtros depende do volume de soluo a esterilizar e dos componentes presentes
em soluo.

4.3. xido de etileno gasoso

O material de plstico que no pode ser esterilizado pelo calor esterilizado com xido
de etileno gasoso. Estes itens so vendidos esterilizados a no podem ser re-esterilizados,
incluem placas de petri em plstico, tubos de centrifuga em plstico, etc.

4.4. Radiao ultravioleta

possvel utilizar radiaes UV para esterilizar superfcies quer na sala de culturas quer
no interior da cmara de fluxo laminar. As lmpadas UV no devem ser utilizadas quando esto
presentes pessoas pois a luz pode causar danos na pele e nos olhos. As plantas que so
deixadas sob luz UV morrem.

5. O trabalho na cmara de fluxo laminar

5.1. Autoclavagem

A cmara deve estar ligada em permanncia, se por alguma razo for desligada
deve sempre funcionar durante pelo menos 20 minutos antes de ser utilizada.

Garanta que tm no interior da cmara todo o material de que necessita e retire

sempre os itens desnecessrios. Deve ter no interior da cmara o menor nmero
de itens possvel.

Verifique regularmente se a entrada de ar da cmara de fluxo se encontra

desimpedida.

Retire relgios e pulseiras, enrole as mangas e lave bem as mos com sabonete
bactericida e gua abundante.

Pulverize ou limpe o interior (parede e superfcie de trabalho) da cmara de fluxo

com etanol a 70%. Deixe secar a zona antes de iniciar o trabalho.

Pulverize as mos e antebraos com etanol a 70%, assim como todos os

recipientes e materiais que colocar no interior da cmara de fluxo laminar

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Trabalhe o mais possvel no interior da cmara de fluxo. Os movimentos dentro

da cmara devem estar restritos a reas pequenas.

No toque em nenhuma superfcie que deva estar estril com os dedos, utilize
sempre pinas esterilizadas.

Os instrumentos (pinas, bisturis) devem ser mergulhados em etanol a 95% a

passados chama de uma lamparina. Um esterilizador de contas de vidro pode
ser mais seguro, no entanto, continua a existir o risco de queimaduras.

Arranje os itens na cmara de fluxo de modo a que no tenha de passar as

mos sobre o material esterilizado. Para um dextro a lamparina e o lcool deve
estar direita e os frascos com as plantas esquerda, devendo a rea de
trabalho localizar-se mesmo em frente ao operador.

As plantinhas devem ser manipuladas numa superfcie estril. Pode utilizar-se

placas de petri descartveis (dispendioso, tm 2 reas de trabalho), toalhas de
papel esterilizadas ou placas de papel. Mais usual so as placas de vidro que
podem ser esterilizadas por autoclavagem.

Esterilize os instrumentos (pina, bisturi) com frequncia, especialmente quando

muda de recipiente de cultura. Os instrumentos devem ser colocados num
suporte na cmara de fluxo e arrefecidos antes de tocar nas plantas
(mergulhando em gua esterilizada ou no meio de cultura).

Enquanto trabalha, limpe a superfcie com etanol a 70% com frequncia

Quando abre um recipiente esterilizado toque apenas no exterior da tampa e

evite tocar na borda do tubo ou frasco com a pina, o bisturi ou os dedos.

Retire tudo o que no necessita da cmara de fluxo, os recipientes de cultura

devem estar devidamente selados antes de ser retirados.

No final do trabalho torne a limpar a bancada com etanol a 70% e apague a

lamparina.

Guarde as culturas em locais prprios e verifique a ocorrncia de contaminao

todas as semanas

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