Regenerativa

Prlogo
MARA CASCALES ANGOSTO Y FLORA DE PABLO DVILA
Entre las actividades ms destacadas y reconocidas de la Real Academia Nacional de Farmacia del Instituto de Espaa, figura la realizacin de Monografas de temas de actualidad, que se incluyen en el
campo de las Ciencias Farmacuticas. La publicacin de estas Monografas se inici en el ao 1994, y en los quince aos transcurridos se han
publicado 26, siendo la presente la nmero 27. Todas ellas han sido muy
bien recibidas, tanto entre los Acadmicos de las Reales Academias de
Medicina y Ciencias, como entre profesores de Universidad, profesionales farmacuticos y alumnos, y tambin entre las comunidades cientficas de Amrica. La difusin dentro y fuera de nuestras fronteras, desde
la pgina Web de la Academia (www.ranf.com), recibe un nmero de
visitantes en continuo crecimiento, que ha alcanzado ya la cifra de ms
de un milln/mes.
La presente Monografa sobre CLULAS MADRE Y TERAPIA
REGENERATIVA, ser de utilidad ya que trata de un tema de indiscutible actualidad. No hay semana que no se publique en la prensa algn
nuevo avance sobre estas clulas y su relacin con la Medicina Regenerativa. Los cientficos y los clnicos de hoy en da esperan hacer
realidad el concepto legendario de la regeneracin de Prometeo, mediante el desarrollo de terapias dirigidas al mantenimiento y restauracin
de clulas y tejidos deteriorados en casos de enfermedad, prdida, lesin
o envejecimiento celular.
Las clulas madre adultas o somticas son clulas capaces de autorrenovarse y diferenciarse en clulas de los rganos o tejidos donde
residen (mdula sea, intestino, cerebro, msculo, hgado etc.). Esta
capacidad de diferenciarse es lo que les permite la renovacin y el
13
PRLOGO
reemplazo de las clulas daadas de los diferentes rganos y tejidos del

organismo. El potencial regenerativo de estas clulas es la base de su
aplicacin en la correccin de errores (defectos de nacimiento), o como
fuente renovable de clulas de reemplazo en enfermedades, muchas de
ellas las asociadas con el envejecimiento, tales como las enfermedades
de Parkinson y Alzheimer, osteoartritis, diabetes, cncer, ictus, quemaduras, etc.
En la actualidad, es necesario profundizar en los mecanismos moleculares que conducen a la especializacin celular in vivo de las clulas
madre residentes en los tejidos, y en la naturaleza y regulacin de las
interacciones que puedan existir entre las clulas trasplantadas y el
paciente receptor. Una preocupacin fundamental, de cara a su uso teraputico, es conocer bien la regulacin de la divisin celular (en ciertos
tejidos es una ventaja si han salido de ciclo) y la estabilidad a largo
plazo de las propias clulas trasplantadas.
En el ltimo ao se ha dado un giro importante en la investigacin
con las clulas madre, sus aplicaciones y la obtencin de productos,
especialmente lneas celulares, por parte de empresas biotecnolgicas.
De hecho, ha sido un ao de avance espectacular en la biologa de las
clulas madre pluripotenciales y en el conocimiento de su maduracin
natural en el organismo durante el desarrollo (cmo se mantienen estas
clulas con capacidad regeneradora en los nichos especficos de cada
rgano y tejido). A su vez, la reprogramacin inducida hacia estas clulas a partir de clulas somticas, abre perspectivas importantes tanto
a la investigacin bsica como a la clnica.
Hoy se pueden manipular clulas humanas de adulto y generar clulas con pluripotencialidad inducida (iPS), que posiblemente poseen el
mismo potencial de crecimiento y diferenciacin de las clulas madre
embrionarias, y sustituirn o ampliarn con creces las posibilidades biotecnolgicas soadas para las embrionarias. El compromiso de Shinya
Yamanaka, diseador de esta tecnologa, en relacin con su uso hacia
otros fines, es un ejemplo de la tica y la responsabilidad del investigador y supone asumir que la ciencia triunfa al servicio del hombre.
Un nuevo abordaje conecta las clulas madre con la terapia gnica
selectiva, para intensificar las opciones de regeneracin o reemplazo de
clulas que se han destruido o estn lesionadas, como tambin para la
14
PRLOGO
destruccin tumoral. El mnimo requerido para el xito de la terapia

gnica es conseguir el producto gentico teraputico, en el correcto
contexto biolgico con mnimos efectos colaterales perjudiciales. Para
conseguir este fin se requieren nuevas estrategias para modular la expresin gnica teraputica, y mtodos eficiente para el envo de genes a las
clulas madre. Queda an mucho por hacer, pero la ingeniera gentica
aplicada a las clulas madre, unido a un mayor conocimiento de la
biologa de estas clulas, ha de llevarnos a obtener su aplicacin teraputica que, en ltimo lugar, tendr que aprobarse por sus resultados en
el propio paciente.
El presente volumen consta de diez captulos, realizado cada uno
por expertos y expertas en el tema que desarrollan. Los temas elegidos,
an no cubriendo todos los sistemas posibles, creemos que abordan los
esenciales, es decir, aquellos en los que hay significativos avances recientes. Cada captulo incluye desde datos obtenidos en investigacin
bsica a aquellos de potencial, o ya real, aplicacin en clnica.
Las editoras estamos profundamente agradecidas a las personas que
han colaborado en la realizacin de esta Monografa de la Real Academia Nacional de Farmacia, a quienes citamos a continuacin por orden
de aparicin en el volumen: Jos Antonio Lpez Guerrero (CSIC-UAM);
Jordi Barquinero Maez (IR-HU Vall dHebron); Lluis Montoli (CSICCNB); Flora de Pablo Dvila (CSIC y RANF), Mara Cascales Angosto
(CSIC y RANF), Augusto Silva Muoz, (MSPS y CSIC); Damin Garca Olmo (Hospital La Paz y UAM); Jos Luis Jorcano Noval (CIEMAT); Ana Snchez Garca (IGBM) y Bernat Soria Escoms (CABIMER). Todos ellos/as han hecho el esfuerzo de proporcionarnos una
visin no solo experta, sino muy actualizada, de este campo tan extraordinariamente dinmico.
Tambin deseamos mostrar nuestro agradecimiento a la Presidenta
de la Academia, que tan amablemente ha realizado la Introduccin a la
obra, al Secretario General que nos ha proporcionado toda suerte de
facilidades, a la Junta de Gobierno y a todos los Acadmicos que nos
han apoyado y han puesto su confianza en nosotras. Un agradecimiento
muy especial tenemos que dedicar a todo el personal de la Academia
que ha contribuido de manera muy eficaz en la elaboracin de esta
publicacin y de su difusion on line. Sin ellos este volumen no sera hoy
una realidad.
15
PRLOGO
Y para terminar este captulo de agradecimientos, queremos dar las

gracias a nuestro querido amigo Pedro Garca Barreno por su generosa
e incondicional ayuda, a la Fundacin Vodafone por financiar la edicin
de esta Monografa, y al Instituto de Espaa por haber aceptado programar para el prximo mes de Octubre una serie de conferencias que
darn la posibilidad del contacto directo con los autores.
Si con esta obra conseguimos difundir los avances en el conocimiento actual de las clulas madre, haciendo llegar a las comunidades
de farmacuticos, mdicos, veterinarios y bilogos, que un amplio espectro de nuestras propias clulas humanas va a poder ser utilizado, en
el futuro no lejano, en nuevas terapias para el tratamiento de enfermedades y lesiones hoy en da incurables, habremos logrado el fin que nos
proponamos. No obstante, a pesar de nuestro entusiasmo no debemos
crear expectativas irreales. Es imposible predecir cuan largo ser el
camino por recorrer hasta que la aplicacin clnica de estos logros llegue
a ser una amplia realidad.
16
Introduccin
MARA TERESA MIRAS PORTUGAL
Presidenta de la Real Academia Nacional de Farmacia
De manera natural, los tejidos del organismo sufren a lo largo de la

vida un desgaste del que se defienden desarrollando su propia capacidad
intrnseca de regeneracin y reparacin. De no existir esta renovacin,
se reducira considerablemente la esperanza de vida de los seres vivos.
Por otro lado, gran parte de la amplia variedad de enfermedades que
afectan al ser humano, tienen su origen en la degeneracin y muerte, de
manera aguda o crnica, de clulas de los distintos tejidos que conforman el organismo. Hasta la fecha, las tcnicas utilizadas para reparar y
regenerar los tejidos son los trasplantes, cuya introduccin en la medicina moderna supuso, en su momento, una revolucin que algunos han
comparado al descubrimiento de la penicilina. Sin embargo, los trasplantes no estn exentos de complicaciones y de limitaciones importantes, tales como la escasez de donantes y la posibilidad real de rechazo
del rgano trasplantado.
En la actualidad con la Terapia regenerativa se abren nuevas esperanzas de reparar tejidos daados, mediante la utilizacin de mecanismos similares a los que, de forma natural, usa el organismo para el
mantenimiento y renovacin de las poblaciones celulares daadas o envejecidas. Los mecanismos de regeneracin, reparacin y renovacin
celular, que posee el organismo, son limitados y dependen en gran parte
del grado e intensidad de la instauracin del dao o degeneracin. De
esta manera, la destruccin aguda de grandes cantidades de tejido (infarto) no es susceptible de ser reparada por los medios naturales. Entran
entonces en escena las nuevas terapias de cultivo y trasplante de clulas
17
madre, que sirvindose de su capacidad de regeneracin, y las innovaciones tecnolgicas para su administracin, van a proporcionar una terapia eficaz y prometedora para el tratamiento de este tipo de enfermedades. La terapia regenerativa o reparadora, basada en el uso
teraputico de las clulas madre, sale al paso del gran aumento en la
incidencia de enfermedades de tipo degenerativo que se asocian al irremisible incremento del envejecimiento de la poblacin.
Las clulas madre se clasifican en dos grupos principales: las embrionarias que derivan de la masa celular interna del blastocisto y las
adultas o somticas especficas de rgano. El ejemplo ms claro y ms
estudiado de clulas madre especficas de rgano es el de las clulas
madre de la mdula sea, que son capaces de generar todos los tipos
celulares de la sangre y del sistema inmune. Las clulas madre adultas
existen en todos los tejidos del cuerpo humano, piel, grasa subcutnea,
msculo cardaco y esqueltico, hgado, cerebro, etc. Actualmente se ha
conseguido identificar y aislar muchas de ellas, e incluso diferenciarlas
o desdiferenciarlas in vitro, con el objeto de utilizarlas en la reparacin
de tejidos daados. A pesar de todo, la aplicacin de estas tcnicas de
trasferencia de clulas madre de adulto para el recambio y reparacin de
tejidos enfermos, se encuentra todava en sus comienzos.
Los experimentos iniciales en humanos de Edward Donnall Thomas
en 1959 demostrando que un organismo irradiado poda beneficiarse de
un trasplante de medula sea, en el tratamiento de la leucemia, mereci
junto con Joseph Murray la concesin del premio Nobel en Medicina en
el ao 1990. Este fue el primer paso, pero la posibilidad de que clulas
de otros tejidos pudieran igualmente ocupar y regenerar el sistema
hematopoytico se debe a trabajos de otros pioneros, sobre todo a Siminovitch, Till y McCulloch. Estos autores, en 1964, demuestran que clulas procedentes de bazo de hgado embrionario fetal, podan ser
utilizadas para recuperar la mdula de ratones irradiados en los cuales
se haban destruido las clulas hematopoyticas de la medula sea. Estos
resultados proporcionaron una visin ms amplia, pues era necesario
suponer la existencia de clulas precursoras y, adems, la necesaria
plasticidad y adaptacin de estas clulas a su nuevo entorno tisular.
Un avance cientfico importante se produca en 1981, cuando Evans
y Kaufman anunciaron el cultivo de clulas madre embrionarias de ratn. Posteriormente Thompson et al., en 1998, lograban el cultivo en
18
INTRODUCCIN
laboratorio de clulas madre embrionarias de origen humano. La importancia de estos hallazgos fue enorme, pues demostr que estas clulas
eran capaces de dividirse de manera ilimitada, dando lugar a una progenie que poda dar origen a los distintos tipos de clulas presentes en
el organismo. Estas clulas madre embrionarias, merced a su capacidad
de diferenciarse en cualquier tipo de clula, podan ser utilizadas para
regenerar tejidos lesionados por diversos tipos de enfermedades o traumatismos o por el envejecimiento. Los trabajos con clulas madre embrionarias de ratn y sus posibilidades para restaurar funciones o reparar
malformaciones y enfermedades genticas, fueron reconocidos con el
premio Nobel de 2007 en Medicina, conjuntamente a los investigadores
Mario Capecchi, Martin Evans y Oliver Smithies.
La ingente cantidad de trabajo desarrollado desde entonces permite
afirmar que el organismo adulto contiene reservorios de clulas madre
residuales, que se parecen a las clulas primitivas del embrin y que
tienen la capacidad de ser instruidas para producir una panoplia de tipos
celulares que puedan ser utilizados para beneficio teraputico. Actualmente se estn introduciendo con gran rapidez nuevas tecnologas que
permitirn que las clulas maduras diferenciadas retornen al acceso
completo al genoma; reactivando factores, en el futuro cercano, en que
casi cualquier clula podr reprogramarse para producir clulas con propiedades de clulas madre similares a las embrionarias.
El haber encontrado este manantial de clulas madre adultas en el
organismo postnatal es un gran paso, pero requiere el avance del conocimiento de su diferenciacin en otros linajes celulares, y de su potencialidad teraputica, puesto que con el uso de estas clulas madre se
habrn paliado gran parte de los problemas ticos derivados del uso de
las clulas madre embrionarias.
Hoy las clulas madre adultas se obtienen de la mdula sea, de la
sangre perifrica, de sangre del cordn umbilical, del tejido adiposo,
etc., y para ello se utilizan tcnicas especficas para cada caso. Como la
obtencin de clulas madre embrionarias, no solo presentan muchas
controversias bioticas, sino que requiere de tcnicas ms complejas,
como la clonacin y el cultivo celular, una gran parte de investigadores
se dedican en la actualidad al estudio de las clulas madre adultas, por
presentar mayor facilidad de obtencin y procesamiento y porque todas
ellas poseen cierta capacidad de diferenciacin.
19
Hasta hace poco tiempo ha existido la creencia generalizada de

que las clulas madre especficas del rgano, estaban limitadas a
generar slo clulas especializadas y diferenciadas del tejido donde
residan, es decir, haban perdido la capacidad de dar lugar a otras
estirpes celulares del organismo, por lo que se las consideraba con
menor grado de potencialidad. Sin embargo, recientes descubrimientos
han hecho cambiar esta visin, al hacerse evidente que las clulas
madre adultas procedentes de cualquier tejido, pueden diferenciarse en
clulas de al menos algunos tipos de otros tejidos. El descubrimiento
del proceso de transdiferenciacin, mediante el cual una clula madre adulta puede dar lugar a otros tipos celulares, hace que la potencialidad de estas clulas pueda ser considerada similar a la de las
clulas embrionarias. Adems se ha evidenciado que podan diferenciarse en tejidos derivados de cualquiera de las capas embrionarias,
sealndose como el caso ms tpico el de las clulas madre hematopoyticas. Este fenmeno de transdiferenciacin ha sido calificado
como versatilidad de las clulas madre adultas, tomando en cuenta la
flexibilidad que tienen algunas de ellas para formar otros linajes celulares. De esta manera, se cuestiona el paradigma tradicional de la
biologa del desarrollo, de la capacidad limitada de diferenciacin de
estas clulas, sugirindose que poseen una enorme plasticidad. Ante la
evidencia de que las clulas madre adultas tienen la capacidad de
transdiferenciarse, se han postulado incluso mecanismos alternativos
como la fusin celular, pero est demostrado que la transdiferenciacin puede ocurrir a travs de un proceso de desdiferenciacin y rediferenciacin. Es de esperar que en el futuro prximo se profundice
en el estudio del fenmeno de la versatilidad de las clulas madre
adultas y de los mecanismos moleculares y factores que la regulan, lo
cual ha de redundar en nuevos conocimientos para el diseo de nuevas
estrategias aplicadas a la terapia de regeneracin y renovacin tisular
y celular.
Todas las clulas del organismo poseen un repertorio de unos
20.000-25.000 genes de los cuales, en cualquier momento, solo una
cuarta parte se expresa. Las bases fundamentales de las diferencias en
los diferentes tipos de clulas (corazn, cerebro, hgado, piel, etc), que
comprende el organismo, se encuentran en la decisin celular de qu
genes expresa o reprime. Durante el desarrollo fetal, las clulas madre
embrionarias con completo acceso al genoma van a dar lugar a la mul20
INTRODUCCIN
titud de tipos celulares requeridos para un completo individuo, generando progenies con acceso al genoma cada vez ms restringido, lo que las
compromete a ciertos destinos celulares.
Con la perspectiva actual se espera que, en los prximos aos, estos
avances podrn ser empleados para el tratamiento de afecciones del
miocardio, circulatorias, diabetes, Parkinson, otras enfermedades degenerativas del tejido nervioso y, en general, de todo rgano con problemas funcionales.
Los costes de esta nueva terapia dependern de los mtodos de
obtencin de esas clulas. En principio no son muy costosos, pero si
muy laboriosos y requieren personal muy cualificado con gran experiencia. Las clulas madre obtenidas se inyectan directamente en el rgano
daado o a travs de los vasos que lo irrigan.
Si la esperanza de vida se alarga, se produce el consecuente envejecimiento de la poblacin, como binomio inseparable. Las terapias para
mantener en el mejor estado de salud a la poblacin envejecida recibirn
una demanda proporcional y los estamentos sanitarios tendrn que adaptarse a lo que ser esa demanda en el futuro. Cuales van a ser esas
terapias, como hacerlas accesibles, como administrarlas de modo rutinario, como conseguir que su coste no sea un impedimento para su uso
generalizado?, estas son algunas de las preguntas a las que tienen que
responder las terapias de curacin/reparacin/renovacin de rganos y
tejidos mediante clulas madre.
Es un hecho indiscutible que uno de los campos de la Ciencias de
la Salud que ms expectativas ha despertado en los ltimos aos es la
terapia con clulas madre. El aislamiento de clulas embrionarias humanas, la inesperada pluripotencialidad de las clulas madre adultas inducidas y el desarrollo de la terapia gnica, nos llevan a creer en la realidad del campo emergente de la terapia regenerativa, y a vislumbrar
nuevas terapias en un futuro esperanzador para un importante nmero de
enfermedades actualmente incurables. No hay duda de las grandes posibilidades que se ofrecen, pero es muy importante reconocer que se est
todava muy lejos de alcanzar el objetivo de utilizar esta nueva herramienta. Es imprescindible eludir el optimismo exagerado y continuar
desarrollando una investigacin cientfica de calidad que permita alcanzar importantes logros de aplicacin clnica en un futuro no lejano.
21
A lo largo de las siguientes pginas diversos autores, expertos en la

materia, van a tratar de exponer el panorama actual de la investigacin
con clulas madre, describiendo los principales logros en este campo,
as como algunas de las preguntas pendientes de responder. A pesar de
las grandes expectativas, es fundamental que mantengamos un espritu
crtico y realista en cuanto a la aplicabilidad clnica.
Para finalizar, decir que este libro ha sido realizado gracias al empeo y desvelos de sus dos coordinadoras, Doctoras Mara Cascales
Angosto y Flora de Pablo Dvila. Dejar constancia del agradecimiento
a la ayuda de la fundacin Vodafone y el apoyo del Doctor Pedro Garca
Barreno para la realizacin material de la edicin. Agradecer igualmente
a los autores que han contribuido en cada uno de los captulos, pues nos
han permitido acceder, mediante una puesta al da rigurosa, a las fronteras en el conocimiento de las clulas empleadas en terapia regenerativa de los diferentes tejidos y rganos.
Como los libros no tienen sentido si no tienen destino, agradecer a
los lectores el tiempo que dediquen a leerlo, ya que este libro que merece
ser ledo con atencin, permitir poder saciar las ansias de conocimiento
y tiene la ventaja, para muchos, de acceder a l en la propia lengua
materna.
Con la tpica deformacin que todo docente arrastra, y yo lo soy,
quiero pensar que esta monografa va a ilusionar con su lectura a los que
trabajamos en ciencias de la vida y la salud, pero deseara que despertara vocaciones entre los jvenes titulados de nuestras Universidades
que fueran capaces de ver lo que ya est, pero mucho ms de imaginar
lo que est por venir, y que piensen que ellos son los que tienen que
hacer realidad el futuro de la terapia regenerativa celular.
Evans MJ y Kaufman MH (1981) Establishment in culture of pluripotent cells from
Mouse embryos. Nature 292, 145-156.
Capecchi M (2008) The first transgenic mice: an interview with Mario Capecchi. Dis
Model Mech 1, 197-201.
Gurtner GC, Callaghan MJ y Longaker MT (2007) Progress and potential for regenerative medicine. Annu Rev Med 58, 299-312.
Lagasse E, Connors H, Al-Dhalimy M et al. (2000) Purified hematopoietic stem cells
can differentiate into hepatocytes in vivo. Nat Med 6, 1229-1234.
22
INTRODUCCIN
Siminovitch L, Till JE y McCulloch EA (1964) Decline in colony forming ability of
marrow cells subjected to serial transplantation into irradiated mice. J Cell
Physiol 64, 23-31.
Thomas ED, Lochthe HL Jr, Cannon JH, et al. (1959) Supralethal whole body irradiation and isologous marrow transplantation in man. J Clin Invest 38,
1709-16.
Thomson JA, Itskovitz-Eldor J, Shapiro SS, et al. (1998) Embryonic stem cells lines
derived from human blastocysts. Science 282, 1145- 1147.
Wagers AJ y Weissman IL. (2004) Plasticity of adult stem cells. Cell. 116, 639-48.
23
1.
Clulas madre y nuevas terapias.

Una visin general
JOS ANTONIO LPEZ GUERRERO
RESUMEN
Algunas terapias basadas en la multi o pluripotencia de las inapropiadamente denominadas Clulas Madre se estn llevando a cabo desde
mediados del siglo pasado. La investigacin actual en terapia celular y
medicina regenerativa se agrupa en dos grandes polos: la centrada en
las Clulas Madre Adultas (ASC), y la que estudia los misterios de la
pluripotencia de las clulas madre de origen embrionario (ESC), todava
sin aplicacin biomdica debido, entre otras cosas, a la menor inversin
pblica por recelos morales, que no bioticos. Entre ambos polos,
podramos situar las investigaciones llevadas a cabo con clulas madre derivadas de sangre de cordn umbilical, fetales o, incluso, germinales.
Tras unas breves pinceladas histricas, el presente captulo describir las caractersticas moleculares principales de las clulas madre y los
avances ms significativos tanto in vitro, modelos animales o en terapias
desarrolladas en humanos. Finalmente, pero no por ello menos importante, se describirn los frentes actuales de investigacin ms innovadores: en terapia celular, con o sin complemento de ingeniera gentica; la
siempre polmica transferencia nuclear, mal llamada clonacin teraputica; y, por supuesto, la reprogramacin celular, el Valhala actual de la
investigacin biomdica y la tcnica que ms expectativas y esperanzas
parece estar suscitando entre investigadores, legisladores, medios de
comunicacin y sociedad, en general.
25
ABSTRACT
There are many therapies based on multi or pluripotency of the
unsuitably denominated Stem Cells that have been carried out since the
mid-20th century. Current studies in cellular therapy and regenerative
medicine can be grouped into two major categories. One is focused in
Adult Stem Cells (ASC), the other category is focused on Embryonic
Stem Cells (ESC) pluripotency mechanisms these results have not
yet been used in biomedicine due, among other factors, to the less public
funding as a result of moral, rather than bioethical, prejudices. In addition, other studies are based on stem cells derived from umbilical cord
blood, foetuses or even germ lineage.
After a historical introduction, the present chapter will describe the
main molecular features of stem cells and the key scientific findings
obtained both in vitro and in animal models, as well as those therapies
carried out on human beings. Last, but not least, we will tackle the most
innovative investigation fields currently developed: i) cellular therapy,
assisted or not by genetic engineering; ii) the controversial nuclear transfer technique, inappropriately defined as therapeutic cloning and, finally, iii) cellular reprogramming, the current biomedical investigation
Valhala, which represent the most promising technique for researchers,
law makers, the media and society.
INTRODUCCIN
Si pensamos en aquellos conceptos en la frontera entre la investigacin bsica y biomedicina aplicada, que ltimamente hayan calado profundamente a partes iguales en la sociedad y laboratorios de todo el
mundo, stos sern, sin duda alguna, el de Terapia Celular y Medicina
Regenerativa. A lo largo del presente captulo y, por extensin, del libro
que sostiene entre sus manos, se presentarn y discutirn muchos de los
aspectos moleculares y potencialmente teraputicos con base en el poder
replicativo y de diferenciacin de unas clulas muy especiales; unas
clulas que en Espaa fueron rebautizadas quiz ms desde un punto
de vista emocional que tcnico como Clulas Madre. Tras resear
alguna ancdota histrica trascendente, nos ocuparemos de los aspectos
26
CLULAS
MADRE Y NUEVAS TERAPIAS.
UNA
VISIN GENERAL
ms innovadores de la investigacin actual, detenindonos en las posibles implicaciones clnicas presentes a corto, medio y largo plazo: Terapia Celular (TC) con o sin manipulacin gentica, Transferencia Nuclear (TN) tambin llamada Clonacin Teraputica (CT) o
Reprogramacin Celular (RC). De hecho, esta ltima tcnica ya ha merecido el honor de figurar por segundo ao consecutivo entre los diez
hitos principales de la prestigiosa revista cientfica Science (1). Sin
embargo, hasta llegar a este prado experimental tan frtil, la comunidad
cientfica y las esperanzas de miles de enfermos han tenido que sortear
duros escollos, como aquellos intentos de innecesaria estafa llevados a
cabo por un ambicioso cientfico surcoreano, W.S. Hwang, de la Universidad Nacional de Sel. No nos merecamos sus falsos clones humanos o el abuso sistemtico de sus colaboradoras a las que, al parecer,
obligaba a donar los ovocitos para saciar su hambre de notoriedad.
Sea como fuere, y como sugiere el acadmico J.M. Snchez Ron en
su libro Viva la Ciencia, el objetivo inminente de la mayora de las
investigaciones actuales pretende dilucidar los mtodos de obtencin y
mecanismos de accin de las clulas madre; un nuevo El Dorado en
investigacin biomdica.
DEFINICIONES
A mediados de los aos 80, quien escribe imparta, como Profesor
Asociado de la Universidad Autnoma de Madrid, clases de inmunologa bsica. Al tratar el tema de la hematopoyesis, comenzaba por sealar
el comn origen de todos los linajes celulares a partir de aquella entraable Clula Troncal Pluripotente, que no Madre, en sintona con la
denominacin ofrecida por nuestros pases vecinos Cellules Souches,
Stammzellen, Clulas Estaminais, Cellule Staminali o, por supuesto,
Stem Cells. Aunque no he podido encontrar una fecha precisa, la
sustitucin del trmino troncal por madre empez a asentarse mediticamente, al parecer, a mediados de la pasada dcada, cuando comenzaron a hacerse eco en nuestro pas las investigaciones de los mejores laboratorios del mundo sobre cultivos de clulas extrados de fetos
y cordn umbilical para regeneracin de tejidos. Algunos diarios, ante
el potencial curativo milagroso de estos nuevos cultivos llegaron a
27
lanzar titulares como Los cientficos crean la clula filosofal (La Vanguardia, 6 noviembre 1998) (Figura 1).
FIGURA 1. Agregados celulares formados por clulas mesenquimales aisladas de miocardio

humano. Fuente: M. Gonzlez y A. Bernad.
A pesar de que la 23 edicin de la Real Academia Espaola (2005)

recoge el calificativo de madre, junto a troncal para estos tipos
celulares, muchos son los cientficos que se resisten a sucumbir a tan
amorosa acepcin. No obstante, y si se me permite, continuar utilizando el trmino ms popular de madre para referirme a estas peculiares
entidades biolgicas (2, 3).
Qu es realmente una clula madre?, cuntos tipos existen?, qu
potencial biolgico y teraputico tienen? Bsicamente, se puede definir
una clula madre por sus tres caractersticas principales: i) puede dividirse dando lugar a nuevas copias de s misma; ii) puede diferenciarse
bajo ciertas condiciones fisiolgicas o experimentales hacia otros tipos
y linajes celulares, y iii) puede acabar colonizando y originando nuevos
28
CLULAS
UNA
VISIN GENERAL
tejidos y rganos. As, y partiendo del cigoto la clula madre totipotente por excelencia, a medida que avanzamos a travs del desarrollo
embrionario y fetal hasta conseguir un individuo adulto, la capacidad
para cumplir las tres condiciones anteriores disminuye y, por ello, se
hablar de clulas toti, pluri, multi o, finalmente, unipotentes. Dicho
esto, y considerando el origen celular ltimo, podramos agrupar toda
esta escala de posibilidades en dos grandes bloques: Clulas Madre
Embrionarias o ESC (Embryonic Stem Cells) procedentes, esencial aunque no nicamente, de la Masa Celular Interna (MCI) del blastocisto, y
Clulas Madre Adultas o ASC (Adult Stem Cells), las cuales, por ejemplo, tendran la funcin de reparacin de tejidos daados o de renovacin celular fisiolgica (2-4). Entre ambos extremos, un abanico de
flexibilidad se abre con otros tipos clulas: fetales, germinales o las
tambin famosas clulas madre procedentes de Sangre de Cordn Umbilical (SCU), de las que tambin hablaremos. Actualmente, se est
evaluando el potencial teraputico de determinadas clulas procedentes
de lquido amnitico (5).
ALGUNA PINCELADA HISTRICA
Un posible arranque en TC podramos situarlo a mediados del siglo XVII: R. Lower, mdico de la corte de Luis XIV, experiment, en
1665, con transfusiones de sangre en perros, y J. B. Denis (1667) hizo
lo propio en Pars desde corderos a humanos, detallando lo que constituira la primera descripcin del proceso (6). Un brusco salto hasta 1919
nos situara en el origen del concepto de clula troncal (7). Tres dcadas
ms tarde, J. Hammond (8) lleva a cabo la primera descripcin del
mtodo para mantener embriones de ratn en cultivo. En todo caso,
y sin duda alguna, el principal antecedente del desarrollo posterior de
la TC fueron los trabajos pioneros de E. D. Thomas, que arrancan en
1957 (9) y finalizan con el establecimiento del trasplante de mdula
sea como la opcin teraputica de eleccin para el tratamiento de
muchos desrdenes neoplsicos humanos; su trayectoria le vali el Premio Nobel de Fisiologa y Medicina en 1990. Estos resultados constituyen la primera evidencia slida de la existencia de clulas madre pluripotentes en el organismo de mamferos adultos con gran capacidad
reparadora.
29
En 1981, M. J. Evans (10) junto a M. H. Kaufman obtuvieron ESC

de ratn, y dos aos ms tarde, J. McGrath y D. Solter desarrollaron una
nueva tcnica mediante microciruga para extraer el proncleo del
cigoto y fusin celular mediada por virus en experimentos de TN
(4, 5). Por otro lado, en 1996 se produce el nacimiento en el Instituto
Roslin de Edimburgo de dos ovejas por TN: el grupo de K.H.S. Campbell obtiene clones por transferencia de clulas embrionarias en cultivo
e I. Wilmut crea a Dolly a partir de una clula de ubre de su ovina madre
(11). Finalmente, En 1998 varios grupos de todo el mundo describen un
mtodo para aislar, cultivar y obtener lneas de ESC humanas (10, 12,
13). A partir de este punto, los acontecimientos se suceden vertiginosamente hasta vislumbrarse en la actualidad un nuevo horizonte en torno
a unas simples siglas, iPS (induced Pluripotential Stem cells), y la denominada reprogramacin celular.
MOLCULAS IMPLICADAS
La transferencia del conocimiento bsico al clnico es un proceso
que debe ser necesariamente lento, aunque firme. En palabras de J.C.
Izpisa, Director del Centro de Investigacin en Medicina Regenerativa
de Barcelona, estamos intentando correr antes de aprender a gatear.
Tanto el conocimiento de los genes implicados en replicacin y diferenciacin celular, como su regulacin transcripcional y epigentica se me
antojan fundamentales para poder integrar en terapias seguras todos los
resultados prometedores que actualmente estn dndose a conocer en
modelos celulares y animales.
No obstante, la presin social, con demanda inmediata de terapias
para nuestros seres queridos, podra llevar a la precipitacin meditica de algunos resultados bsicos, si no al fraude (a las pruebas, tras lo
ocurrido en Sel, me remito). Un ejemplo cercano a la estafa y buhonera lo encontramos en China, donde hace unos aos H. Hongyun, del
Sanatorio de Trabajadores de Xishan, en Pekn, salt a los medios de
masas por su ofrecimiento, a partir de 20.000 dlares, para tratar lesiones medulares y otras neuropatologas, como la Esclerosis Lateral
Amiotrfica (ELA), a travs de clulas madre procedentes de fetos (de
hasta ocho meses!). Poco parecen importarle a Hongyun los protocolos
internacionales de experimentacin en humanos. La desesperacin de
30
CLULAS
UNA
VISIN GENERAL
muchos pacientes con daos medulares severos supera cualquiera mala

praxis mdica. Algunos de estos pacientes, incluso, llegaron a afirmar
encantados, tras la operacin, que podan mover alguna falange de la
mano!...
Pero sin duda, y no renuncio a volver a comentarlo siquiera sucintamente, uno de los mayores fraudes de la historia quiz el mayor
junto al famoso Hombre de Piltdown lo protagoniz alguien que no
lo necesitaba. W.S. Hwang era, y probablemente lo siga siendo, uno de
los mayores expertos mundiales en clulas madre embrionarias y clonacin. Dos publicaciones en Science aparecidas con apenas un ao de
diferencia mostraban la clonacin de embriones humanos por la tcnica
de TN (3, 14). De hecho, el artculo de mayo del 2005 zanj la carrera
contra otros laboratorios por la clonacin humana y, de paso, pareca
allanar la pista hacia la Nobel Foundation. En dicho artculo, a partir de
11 pacientes con diferentes patologas y mediante TN se establecieron,
supuestamente, otras tantas lneas celulares (NT-hESC-2 hasta NThESC-12) con caractersticas de ESC. No obstante, lo que hubiera supuesto un paso de gigante para la obtencin de clulas madre pluripotentes derivadas de adultas del propio paciente, acab revelndose como
simples embriones sin manipular. Ni ms, ni menos. Seis millones de
dlares en paradero desconocido y unas becarias supuestamente obligadas a ceder sus vulos acabaron por destronar al cientfico surcoreano.
De poco sirvi que su grupo publicara, poco despus y ahora s, la
clonacin de varias lobas, Snuwolf y Snuwolffy (15).
Lejos del delito, la prudencia nos debera indicar siempre el camino
firme, lejos de la seduccin de las sirenas de los grandes titulares mediticos. Ciertamente, de muchos fracasos, que no errores, se pueden
revelar las claves de futuros xitos: del triste intento de curar, en 1983,
al joven de 13 aos, D. Vetter, de su Inmunodeficiencia Combinada
Severa con mdula sea de su hermana muri de la infeccin viral
que se le transmiti durante el tratamiento, se lleg a la terapia gnica
mediante retrovirus efectiva en otros casos posteriores de inmunodeficiencia, como la denominada ADA (Adenosina Desaminasa) (16). No
obstante, cuando nos referimos a medicina regenerativa, a manipulacin
y tratamientos con clulas madre pluri o multipotentes, no debemos
pasar por alto que la frontera que nos puede transportar desde la divisin
y posterior diferenciacin celular hasta el descontrol de la proliferacin,
31
con sus vertientes siniestras conocidas, no estn bien definidas. En este

sentido seguimos, como se ha sealado, apenas gateando, a pesar de la
caracterizacin de posibles nuevos genes mediante tcnicas de microarrays, por ejemplo implicados en replicacin, diferenciacin y
maduracin celular que, incluso, estn siendo ya utilizados con xito en
modelos animales.
Por supuesto, no pretendo elaborar una lista exhaustiva de todos los
factores y marcadores de divisin, maduracin o diferenciacin celular.
S mencionar brevemente algunos de los ms estudiados en clulas
madre, comenzando por aquellos factores que recientemente han trascendido ms all de las revistas cientficas gracias a su implicacin en
RC, tcnica que ms tarde volveremos a tratar.
Tal y como seala J.A. Thomson, en su artculo sobre la induccin
de clulas madre derivadas de somticas humanas (17), aunque el desarrollo embrionario de mamferos sigue un orden temporal muy estricto,
el hecho de que estos pasos estn dictados por eventos epigenticos ms
que genticos permitiran la reversin del proceso mediante el efecto
transactivador de diferentes factores, tal y como qued de manifiesto
con Dolly. Es ms, la bsqueda de tales factores ha permitido reprogramar clulas adultas sin la necesidad de TN. Cuatro ellos que acabaron
denominndose los cuatro magnficos, Oct4, Sox2, Klf4 y c-Myc,
lograron desdiferenciar y reprogramar fibroblastos humanos adultos (18).
Oct4 (Pou5f1), junto a Nanog y Sox2, est ntimamente involucrado en
el mantenimiento del estado pluripotente de las ESC y del embrin
temprano, mientras que Klf4 (Factor 4 similar a Krppel), junto a cMyc, estara implicado en el mantenimiento en cultivo del fenotipo de
las ESC y su rpida proliferacin, evitando la accin de factores antioncognicos como p53, el cual podra, entre otras opciones, unirse al promotor de Nanog e inhibir su expresin. Al propio grupo de Yamanaka,
de la Universidad de Kyoto y autor del trabajo, le sorprendi, en sus
estudios iniciales con ratones, que Nanog fuera prescindible para el
mantenimiento del estado pluripotente de las clulas reprogramadas. De
hecho, cuando en 2003 el escocs I. Chambers (Universidad de Edimburgo) describa la clonacin de dicho factor hometico en Cell (19), lo
haca completamente convencido de que era la llave principal del mantenimiento y virtual inmortalidad en cultivo de las ESC. Es ms, en un
arranque patritico recurri a la leyenda Tir na ng pas de la
32
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UNA
VISIN GENERAL
eterna juventud, en la mitologa celta para su denominacin. Por otra

parte, y en el caso de c-Myc, adems de estar implicado en ciertos
procesos de tumorognesis, poda causar muerte o diferenciacin de las
ESC humanas, por lo que se buscaron nuevas combinaciones genticas
para la reprogramacin: Oct4, Sox2, Nanog y Lin28 otros marcadores
de ESC indiferenciadas. Recientemente, investigadores del Instituto Max
Planck de Munster y de la Escuela Tcnica Superior de Aquisgrn, en
Alemania, han conseguido clulas iPS murinas utilizando nicamente
dos factores, Oct4 junto a Klf4 o c-Myc (20), aunque con truco: se
utiliz una poblacin celular neuronal que expresaba Sox2 de forma
endgena.
Abandonando hasta un posterior apartado la RC y centrndonos en
los procesos reguladores, activadores o inhibidores que rodean a las
clulas madre, otros muchos genes han de ser tomados en cuenta (1, 4,
21). Aunque injustamente no podr mencionarlos a todos, algunos de los
factores de mantenimiento de la pluripotencialidad en ESC
analizados y caracterizados inicialmente en ratn son: Ecat1,
Dppa5/ESG1, Fbxo15, Eras, Dnmt31, Ecat8, Gdf3, Sox15, Dppa4,
Dppa2, Fth117, Sal14, Rex1, Utf1, Tcl1, Dppa3, -catenina, Stat3, Grb2
(21), los cuales engrosaran una larga lista con otros miembros tales
como Piwi (Hiwi en humanos), Hes-1, Hif, FoxD3, Eras, Rex1, Utf1,
Pax3, Piwi, Pumilio o Bam.
La caracterizacin de los diferentes precursores pluri o multipotenciales adultos se suele llevar a cabo, aunque no exclusivamente, a travs de
la identificacin de los denominados Marcadores de Superficie o Grupos
de Diferenciacin (CD; Cluster of Differentiation) por supuesto, tambin nos encontramos marcadores especficos en ESC, tales como CD9,
CD24 o CD133, entre otros (4). Si bien todos los precursores celulares
neuronales, musculares, epiteliales o las polmicas y controvertidas
MAPC (Multipotent Adult Progenitor Cells), de las que ms adelante
hablaremos (22), entre otras muestran sus marcadores especficos, a
modo de ejemplo nos centraremos en dos tipos especficos: las Clulas
Madre Hematopoyticas (HSC; Hematopoietic Stem Cells) y las Mesenquimales (MSC; Mesenchymal Stem Cells). Cuando hablamos de HSC
mdula sea, sangre perifrica o de cordn umbilical, hacamos referencia al antgeno CD34 aunque, posteriormente, se han ido identificando fenotipos ms variados dependiendo del estado de diferenciacin,
33
como CD133 clulas inmaduras que pueden carecer incluso de

CD34, CD117/c-kit, CD38 y CD45. HSC con alta actividad de autorrenovacin seran, adems, VEGFR-2+ (Receptor tipo 2 del Factor de
Crecimiento del Endotelio Vascular). Adems de las HSC, otro tipo celular con creciente inters en investigacin, las MSC, constituyeron las
primeras clulas multipotentes no hematopoyticas aisladas y caracterizadas de mdula sea (Figura 2). Tienen aspecto fibroblstico en cultivo
FIGURA 2. Clulas madre mesenquimales de mdula sea humana sometidas a diferenciacin

adipognica y teidas con Oil red O. Fuente: M. Gonzlez y A. Bernad.
34
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UNA
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y gran adherencia al plstico. Pueden identificarse a partir de una serie

de marcadores especficos cuando se analizan en su conjunto, como
CD29, CD44, CD71, CD90, CD105 y CD106 (VCAM-1), adems de
SH2, SH3 o SH4. Por otra parte, no expresaran CD45, CD34, CD11 o
CD14. Aparte de colaborar con el mantenimiento y expansin de las HSC
en mdula sea o en SCU, las MSC podrn diferenciarse, en presencia de
los factores adecuados, hacia osteoblastos, mioblastos o condroblastos,
entre otros tipos celulares.
TERAPIA CELULAR
En la actualidad ya existen diferentes tratamientos en humanos, adems del trasplante de mdula sea o el de piel artificial sobre grandes
quemados, que dependen del potencial de las clulas madre, como hepticos, traumatolgicos, del epitelio corneal o de implantacin de condrocitos. En breve, esta lista podra ampliarse con terapia pulmonar, del Sistema Nervioso Central (SNC) o diabetes, por ejemplo. Por otra parte y
desde 2003, las clulas madre utilizadas en terapias estn siendo consideradas como medicamento por la reciente legislacin al respecto, siempre
y cuando para su obtencin sea necesaria una manipulacin experimental
sustancial para diferenciarlo del trasplante de tejidos u rganos.
An sin profundizar en aspectos tan importantes como los mtodos
de obtencin de todos los tipos celulares embrionarios, fetales o adultos o las connotaciones bioticas subyacentes, a continuacin se describirn algunos de los logros ms destacados, cerca o lejos de la poyata, sobre terapia celular.
En primer lugar, quera sealar que, como podra parecer lgico, la
falta de connotaciones ticas en realidad religiosas ha hecho avanzar claramente a la investigacin y terapias con ASC en detrimento de
los estudios con embriones. No obstante, ambos frentes son necesarios
si queremos apostar por el desarrollo pleno del potencial de uno u otro
sistema. Cada uno de ellos, como veremos, presenta aspectos que destacan sobre el otro, al mismo tiempo que desventajas por subsanar. Por
ejemplo, al comparar las ESC con las ASC observamos que, en cultivo,
las primeras crecen con mayor facilidad, aunque en modelos animales
pueden generar tumores recientemente se ha observado cierta inesta35
bilidad genmica en ESC humanas (hESC) basadas, principalmente, en

la amplificacin de un segmento gnico en la regin cromosmica
20q11.21 (23). No obstante, dicho potencial tumorognico podra minimizarse a travs de los estudios que se estn llevando a cabo.
En general, una clula ES podra ser capaz de generar ms de 200
tipos celulares diferentes pertenecientes a todas las capas germinales:
endoteliales, hematopoyticas, osteoclastos, musculares, neuronales,
adipocitos, epidrmicas...
Por otra parte, las ASC parten, como se ha indicado, con el beneplcito y consenso de todas las sensibilidades sociales. Pueden ser obtenidas directamente de un gran nmero de tejidos adultos incluyendo
a las derivadas de SCU sin que medie embrin alguno. Sin embargo,
su cultivo in vitro es ms tedioso, lento y, tras largo tiempo, puede
originar degeneracin cromosmica (2-4, 24). Adems, con polmica o
sin ella, parece bastante claro que la plasticidad, pluripotencia, est
bastante ms restringida que en el caso de las ESC y son clulas que han
envejecido con el individuo donante.
Debido a que el trmino clula madre es relativamente reciente,
se tiende a asociar su uso en clnica a potenciales tratamientos innovadores sin considerar, por ejemplo, que ya en la dcada de los 50 del
siglo pasado tuvo lugar la primera infusin de suspensin de mdula
sea alognica en un paciente con leucemia. Un trasplante con ms xito
hasta 20 meses de supervivencia se produjo en 1963, mientras que
la primera transfusin de clulas de cordn umbilical se produjo en
1972 (25). En los ltimos 15 aos, uno de los grandes avances con HSC
lo ha constituido la posibilidad de movilizarlas desde la mdula sea a
sangre perifrica, hasta constituirse en la opcin clnica fundamental, en
detrimento del trasplante de mdula sea convencional.
La terapia celular ya ha curado a animales en modelos de enfermedad humana como cncer, Parkinson, cardiopatas o traumas de mdula
espinal, aunque se siguen sin conseguir los efectos deseados en ensayos
humanos (Figura 3). Aqu, las patologas y enfermedades pueden ser
mucho ms complejas que las simulaciones en modelos animales. Factores ambientales diversos, como edad, dieta, metabolismo, estilo de
vida o, por qu no, estrs, adems de los genticos, siempre complejos,
pueden influir y modificar las posibilidades de xito de las terapias.
36
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UNA
VISIN GENERAL
FIGURA 3. Los estudios en modelo de gran animal, previos a la aplicacin humana de

clulas madre, son de gran inters para descartar efectos adversos, definir dosis celulares y
poner a punto tanto los procedimientos de cultivo como los quirrgicos. La imagen corresponde a ciruga en un equino llevada a cabo en el Hospital Clnico Veterinario de la Universidad Autnoma de Barcelona, en el contexto de un estudio orientado a la regeneracin
del cartlago articular.
37
APLICACIONES E INNOVACIN
Las aplicaciones potenciales de las clulas madre en terapias presentes y futuras podramos resumirlas como: i) Terapia celular estndar
para conseguir la diferenciacin de ASC y posterior integracin y regeneracin/reparacin de tejidos daados ya se llevan a cabo tratamientos con HSC, MSC y derivadas de SCU, con la obtencin, entre otros,
de tejido muscular, seo o epitelial, adems de la regeneracin celular
sangunea. ii) Terapia celular y modificacin gentica, a caballo entre
la anterior y la terapia gnica donde, al mismo tiempo que se reconstituye un tejido daado, se puede aportar la ventaja de la ingeniera
molecular para, por ejemplo, suplementar con la expresin de algn
factor que ayude al paciente como las terapias con HSC modificadas
genticamente para tratamientos de las inmunodeficiencias severas sealadas anteriormente. En este contexto querra mencionar, al menos,
el experimento ya clsico realizado por el grupo de R. Jaenisch (Instituto Whitehead de Investigaciones Biomdicas, Cambridge, EE.UU.) y
publicado en Cell (26) donde, mediante recombinacin gentica homloga en ASC se pudo recuperar el fenotipo salvaje de ratones que partan con la mutacin del gen Rag2, causante de una inmunodeficiencia
grave. iii) Clonacin en animales, en su acepcin ms literal, o como
herramienta de generacin de embriones (TN) para la posterior obtencin de ESC. iv) Reprogramacin celular; la quinta esencia del desarrollo cientfico al servicio de la biomedicina. Tal y como ya se ha indicado, una hipottica terapia con clulas iPS ofrecera la pluripotencialidad
de las ESC sin abandonar el contexto ASC, con todo lo que ello, desde
el punto de vista cientfico y social, representara para los futuros tratamientos humanos autlogos.
INNOVACIN CON ESC
Tal y como se ha comentado, hoy por hoy no existen terapias celulares regladas en humanos que tengan como base a las ESC aunque
ya se estn ultimando los protocolos para llevar a cabo los primeros
ensayos clnicos en pacientes con dao medular. No obstante, se est
avanzando mucho en modelos animales (Figura 4), en investigacin
bsica celular y molecular y en el control del poder transformador de
38
CLULAS
UNA
VISIN GENERAL
FIGURA 4. Proceso de diferenciacin desde una clula madre embrionaria de ratn hasta un
cardiomiocito. El proceso comienza con la formacin de un agregado celular, o cuerpo embrionario (fotografa superior izquierda), en el que se simula la formacin de un embrin. Ms
tarde, y a medida que crecen, las clulas se van diferenciando a diversos tejidos. En las siguientes fotografas podemos observar esta capa de clulas diferenciadas a cardiomiocitos que
presentaban latido espontneo (fotografa superior, medio), con tincin especfica para la protena cardiaca Troponina (fotografa inferior, izquierda) y para los ncleos (fotografa inferior, medio). En la fotografa derecha podemos observar las imgenes superpuestas de ambas
tinciones. Fuente: A. Izarra y A. Bernad.
estas clulas un ejemplo reciente lo constituyen las ratas parapljicas

que se estn curando con tratamiento de neuronas derivadas de hESC,
llevado a cabo en el Centro de Investigacin Prncipe Felipe de Valencia
(27, 28). Mientras tanto y en Espaa, se han estructurado Redes de
Investigacin, con centros de referencia principalmente en Andaluca,
Catalua y Comunidad Valenciana. Entre los proyectos que las correspondientes Administraciones han considerado y aprobado estn la TN y
la creacin de embriones quimera entre ncleos humanos y citoplasma
de ratn, tal y como solicit el equipo liderado por Izpisa. Enfermedades de calado social tan profundo como diabetes, Parkinson o diferentes
tipos de cnceres estn sobre la poyata. Uno de los inconvenientes que
se pretende solucionar en la utilizacin de ESC es su mayor capacidad
de inducir tumores (Figura 5). En este sentido, la diferenciacin celular
completa, partiendo de una poblacin homognea, pura, permitira evitar que una subpoblacin permaneciera en un estadio ms indiferenciado
y, por lo tanto, con potencial de seguir dividindose y escapando al
control de replicacin.
Segn la opinin generalizada entre investigadores del campo, ser
la diabetes una de las primeras enfermedades cruciales posiblemente
39
FIGURA 5. Clulas madre embrionarias de ratn modificadas para sobreexpresar la protena

verde fluorescente (EGFP), junto con microRNAs de inters en la diferenciacin a linaje
cardiovascular. Fuente: A. Izarra y A. Bernad.
tratadas con terapias basadas en ESC. Los intentos de generar islotes de

Langerhans funcionales productores de insulina para trasplantes tendrn
que considerar la amenaza autoinmune que subyace en la diabetes tipo
I, adems de los problemas inherentes a la histocompatibilidad. En este
mismo sentido, proyectos de TN han sido aprobados en Reino Unido a
propuesta de la Universidad de Newcastle con pacientes diabticos. Sin
embargo, tras la irrupcin de la RC, como ya se ha sealado, el foco de
investigacin se est escorando hacia esta ltima posibilidad.
Como acabamos de ver, una posibilidad que algunos pases contemplan consiste en la creacin de embriones quimricos procedentes de
ovocitos enucleados y ncleos de distintas especies. Existen estudios
con los binomios vaca-humano con el visto bueno de la Autoridad
para la Fecundacin y Embriologa Humana, HFEA, de Reino Unido,
ratn-humano o conejo-humano, si bien datos recientes apuntan a pro40
CLULAS
UNA
VISIN GENERAL
fundas alteraciones epigenticas que podran dificultar esta opcin. En

todos estos casos, donde el hbrido tendra un 99% de material gentico
procedente del ncleo y algo menos del 1% de ADN mitocondrial, el
producto quimrico es destruido a los 14 das de su obtencin. Estos
proyectos, no exentos de polmica, que persiguen prescindir de las donaciones de ovocitos humanos no exentas de dolor y peligro, podran beneficiarse de las nuevas posibilidades de obtencin de clulas
germinales a partir de ESC (29).
Adems de las ESC derivadas de la MCI, otras fuentes de clulas
madre pluripotentes las encontraramos en estadios embrionarios anteriores, mrula o embriones detenidos a partir de dos blastmeros, o
tejidos posteriores de origen extraembrionario (amnios, por ejemplo).
Estas y otras opciones buscan minimizar las connotaciones religiosas
que supone el tener que destruir embriones en investigacin: utilizar
blastmeros, como se acaba de mencionar, respetando el resto del embrin, o clulas derivadas de embriones no funcionales (cdx2 deficientes) (30). Finalmente, con o sin recelos morales previsibles, tanto la Ley
Espaola (14/2007) de Investigaciones Biomdicas (LIB) segn la
cual el ISCIII ya ha analizado 65 proyectos con embriones humanos,
como la HFEA britnica, han amparado estos primeros proyectos con
embriones quimricos.
INNOVACIN CON ASC

En primer lugar, querra mencionar el proyecto, todava en desarrollo, llevado a cabo por investigadores de Navarra, Salamanca y bilogos, hematlogos y cardilogos vinculados a la Red de Terapia Celular
de Valladolid, sobre la recuperacin de corazones infartados a partir de
ASC autlogas (31). En estos ensayos, el mecanismo ltimo que explicara la real recuperacin de los pacientes observada, sigue sin estar
aclarada y no se descarta la fusin, secrecin de factores y efectos
paracrinos, en vez de diferenciacin e integracin, de las clulas previamente inyectadas (32). Aunque muchos de estos tratamientos se realizan
mediante la inyeccin de las clulas lejos del foco a tratar, se sigue
desconociendo el mecanismo por el que dichas clulas son capaces de
alcanzar rganos diana distantes (33). Esto parece sugerir que, quiz,
41
ms que especie-especficas, las clulas utilizadas en terapias celulares

podran ser rgano-especficas.
Otro proyecto destacado y todava en marcha actualmente en ensayos clnicos avanzados Fase III con gran nmero de pacientes est siendo coordinado por el grupo de D. Garca Olmo, director de la Unidad de
Terapia Celular del hospital universitario madrileo La Paz y en colaboracin con la empresa biotecnolgica Cellerix (ver captulo 7). Mediante
liposuccin efectuada directamente al paciente, se obtuvieron hasta
400.000 clulas AdSC (en este caso, Adipose-derived Stem Cells) por
mililitro, capaces de favorecer la curacin de fstulas perianales (34).
Desde el Instituto de Biomedicina de Sevilla, Hospital Universitario
Virgen del Roco, el equipo de J. Lpez Barneo fue pionero en el anlisis de clulas madre localizadas en el cuello cerca de la bifurcacin
de la cartida, susceptibles de diferenciarse en clulas productoras de
dopamina, esencial si se pretende desarrollar un tratamiento contra el
Parkinson (35). Por otro lado, en el interior del cerebro humano adulto,
un equipo de investigadores del centro SUNY Stony Brook, de la Universidad de Nueva York, ha logrado detectar clulas madre directamente
del hipocampo, lo que podra suponer un paso firme en la deteccin
temprana de algunas enfermedades neurolgicas (36).
Sin abandonar el sistema nervioso, y desde el Departamento de
Biologa Celular de la Universidad de Valencia, el grupo de J.M. Garca
Verdugo representa un frente de investigacin destacado en neurognesis que ha hecho cambiar la imagen esttica de nuestra estructura neuronal: se ha demostrado la capacidad migratoria de neuroblastos originados en la zona subventricular que pueden desplazarse desde las
paredes de los ventrculos laterales hasta el bulbo olfatorio. Estudiar los
mecanismos moleculares de esta migracin y la capacidad de orientacin celular en tan larga distancia es un campo en constante desarrollo
(37) (Figura 6). Igualmente, en la actualidad se siguen llevando a cabo,
tras los resultados optimistas realizados en modelos animales y coordinados desde el Instituto de Neurociencias de la Universidad Miguel
Hernndez (UMH; CSIC), ensayos clnicos (Fase I) en enfermos de
ELA mediante el autotrasplante de clulas mononucleadas de mdula
sea a mdula espinal (38). De igual modo, la Esclerosis Mltiple est
siendo objeto de ensayos clnicos: investigadores de la Universidad de
42
CLULAS
UNA
VISIN GENERAL
FIGURA 6. Lnea Fetal Humana inmortalizada derivada de Mesencfalo Ventral (hVMs) con
propiedades multipotenciales y capaz de diferenciarse a los tres tipos de linajes neurales:
Neuronas y Oligodendrocitos. En la imagen se observan dichas clulas tras siete das de
diferenciacin, con medio Bradford, generando neuronas predominantemente dopaminrgicas, TH+ (Tirosina Hidroxilasa). En rojo, un marcador neuronal; verde, TH y, en azul, un
intercalante del ADN: Hoescht. Fuente: Laboratorio de AlbertoMartnez Serrano.
Northwestern (Chicago, EE.UU.) han llevado a cabo una experiencia

con 21 pacientes en fase inicial recurrente-remitente de la enfermedad
(39) donde, tras varias sesiones de tratamiento con HSC, se vieron
mejoras en todos los test realizados, funcin cognitiva y calidad de
vida, en general.
Dando un pequeo giro de especialidad, las ASC obtenidas de grasa
usadas como complemento en el tratamiento de fracturas es una realidad
clnica desde hace varios aos (Figura 7). En este sentido, uno de los
ejemplos ms llamativos, si a la repercusin en prensa nos remitimos, lo
constituy el tratamiento (diciembre del 2004) de una nia de siete aos
quien, a causa de una cada, requiri la regeneracin craneal de unos
43
FIGURA 7. Aplicacin del bioinjerto constituido por clulas madre autlogas expandidas con
biorreactor. Se introduce en el interior de la cabeza del fmur mediante control radioscpico.
cien centmetros cuadrados; logro alcanzado a travs de su tejido seo

de pelvis mezclado con ASC obtenidas de grasa de los glteos por un
equipo de cirujanos alemanes coordinados por H.P. Howaldt. En este
caso, la proeza teraputica vino precedida, apenas unos meses antes, por
la confirmacin cientfica en fracturas de tejido seo craneal de ratones,
transformando clulas de tejido adiposo en osteoblastos (40). Recientemente, aqu en Espaa, se ha conseguido otro hito de mbito mundial.
Desde el Hospital Clnic de Barcelona y en colaboracin con el Politcnico de Miln, entre otras instituciones internacionales, a finales
del 2008 se informaba del primer trasplante de trquea a una mujer, sin
necesidad de inmunosupresin, del mundo (41). El truco?, desvestir la
trquea enzimticamente de todo material molecular susceptible de ser
reconocido como antgeno alognico antes de volver a revestirla con un
cultivo de ASC de diferentes procedencias extradas de la propia paciente y diferenciadas a condrocitos.
44
CLULAS
UNA
VISIN GENERAL
La infertilidad, tanto en hombres como en mujeres, constituye, tambin, un frente de investigacin presente con clulas adultas. Desde la
Universidad de Tennessee (EE.UU.), investigadores coordinados por A.
Bukovsky lograron que ASC de epitelio superficial de ovario humano
produjeran ovocitos viables en fertilizacin in vitro (42). Ello abre una
va de esperanza para la posible utilizacin de precursores propios en
determinados casos de infertilidad.
A mediados de 2008 tuvo lugar, en el Centro Cacereo de Ciruga
de Mnima Invasin Jess Usn, el primer simposio nacional sobre terapia celular y medicina regenerativa. Si en algo coincidieron todos los
cientficos all reunidos fue en sealar que, desgraciadamente, lejos
quedan todava las terapias humanas efectivas contra enfermedades como
Alzheimer o Parkinson, a pesar de su mximo inters social. S se ha
avanzado, no obstante, en aquellas terapias en hematologa y con condrocitos, queratinocitos o clulas del limbo esclero-corneal, como tambin se indic anteriormente. En dicho congreso cacereo, se sealaron
distintos estudios clnicos en desarrollo en Espaa que abundan sobre el
establecimiento de la factibilidad y seguridad para la regeneracin miocrdica mediante HSC y derivadas de SCU. A propsito de seguridad,
y desde hace varios aos, el grupo de A. Bernad, actualmente en el
Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares de Madrid, est
utilizando este sistema de MSC humanas (Figura 8) para analizar la
bioseguridad de los cultivos de larga duracin. Tras sucesivos pases
varios meses que nos llevaran a la postsenescencia los cultivos de
hMSC muestran una clara incidencia de inestabilidad gentica. Curiosamente, cuando el cultivo se llevaba a cabo al 3% de oxgeno bastante
menos que el que suelen tener los incubadores estndares de clulas,
el comportamiento era mucho ms satisfactorio.
Las limitaciones en cuanto a plasticidad que las ASC pueden sufrir,
en comparacin con las ESC, han sido, asimismo, centro de polmica.
Un artculo aparecido en Nature en 2002 (22) describa la supuesta
caracterizacin de unas nuevas clulas, obtenidas en mdula sea murina, denominadas MAPC y de pluripotencia supuestamente comparables
a las ESC. Por desgracia, la coordinadora de la investigacin, C. M.
Verfaillie, directora del Stem Cell Institute, de la Universidad de Minnesota, acaba de ser cuestionada incluso algunos de sus colaboradores
han mencionado la maldita palabra fraude, hacindonos recordar nue45
FIGURA 8. Clulas progenitoras de mdula sea en cultivo (clulas mesenquimales). La

imagen corresponde a clulas de un paciente procesadas en el Instituto de Gentica y Biologa Molecular (U. Valladolid, CSIC) durante el desarrollo de un Ensayo Clnico orientado
a la regeneracin del disco intervertebral lumbar. Este ensayo, enmarcado
en el Plan de Terapias Avanzadas impulsado por el Ministerio de Sanidad,
se lleva a cabo en el Instituto de Terapia Regenerativa Tisular del Centro Mdico Teknon de
Barcelona.
vamente el triste espectculo surcoreano. Varios expertos que han

analizado los resultados concluyeron que el famoso Nature (22) contena algunos datos significativamente falsos. La propia Verfaillie habla,
sospechosamente, de errores en algunas figuras. Sea como fuere,
existan las MAPC murinas o no, todava no se ha encontrado algo as
en humanos.
Un campo de investigacin, apenas en fase incipiente pero muy
prometedor, es el que concierne a los biomateriales y polmeros biodegradables como sustrato y soporte en terapia celular (4, 43, 44). Desde
el Instituto de Bioingeniera de la UMH, nuevas investigaciones se estn
46
CLULAS
UNA
VISIN GENERAL
centrando en polmeros de hidroxiapatita o fosfato triclcico, fcilmente

reabsorbidos por el organismo, para posibles usos con hMSC en diversas patologas osteoarticulares (Figura 9). Lanzando la vista a un futuro
ms lejano, la combinacin del fosfato triclcico con biocermicas, como
la wollastonita, podra originar matrices tridimensionales. Ya no hablaramos de implantes planos.
Finalmente, y aunque slo se mencione sucintamente, parece lgico
sealar que, lo que hace tan especiales a las clulas madre, podra llevar
un lado oscuro intrnseco. Un estudio que mereci la portada de Nature
(45) sealaba la presencia de clulas madre como agentes claves en
algunos tipos de cnceres, como el de mama, la leucemia o tumores
FIGURA 9. Las clulas madre cultivadas se presentan en una suspensin lquida adecuada
para su supervivencia. En algunos casos pueden aplicarse directamente (infiltradas o por va
intravenosa) pero en algunas situaciones conviene conformar un injerto consistente como en
la ciruga orientada a regeneracin sea. En la imagen, bioinjerto constituido por clulas
expandidas con el biorreactor Aastrom Replicell y grnulos de fosfato triclcico compactados
con un cogulo de plasma autlogo.
47
cerebrales. Desde la Universidad de Harvard (Boston, EE.UU.) se aislaron aquellas clulas posiblemente implicadas en el origen de melanomas, las cuales, adems, eran altamente resistentes a la quimioterapia.
Nuevos estudios sobre la naturaleza de estas clulas permitirn la definicin de nuevas dianas moleculares.
CLULAS MADRE DERIVADAS DE SCU

Las terapias celulares que derivan de la sangre de cordn umbilical
cedida, tras el nacimiento, a bancos pblicos o, cada vez ms frecuentemente, privados, no suponen, en trminos absolutos, un porcentaje
demasiado alto entre los tratamientos actuales. No obstante, existen ya
ms de 40 enfermedades, con componentes genticos o sin ellos, para
las cuales puede ser considerado apropiado este material. Un estudio
multicntrico, coordinado desde Minnesota (46) ha demostrado que
clulas obtenidas de SCU es la opcin ms vlida para algunos tipos de
leucemias estudiado en unos 800 nios con leucemia linfoblstica o
mieloide aguda en aquellos casos en los que no existan donantes de
mdula sea de la misma familia. Es un hecho contrastado, aunque no
del todo explicado, la menor inmunoagresividad de estas clulas tras su
utilizacin en trasplantes alognicos para regeneracin de todos los linajes sanguneos. Una posible explicacin podra verificarse definitivamente en poco tiempo: segn las investigaciones del equipo de S. Querol Giner, director de los Servicios Londinenses Anthony Nolan de
Cordn Umbilical expuestas durante el simposio Cellular Therapy in
Hematology que tuvo lugar en Sevilla en mayo de 2008, una nueva
subpoblacin de clulas reguladoras de linfocitos T, CD4/CD25/
CD45RA que coexpresa el factor Foxp3, habra sido caracterizada desde
SCU. Estas clulas podran estar detrs de la mayor tolerancia tras una
infusin celular. Es ms, en ensayos de proliferacin mixta de linfocitos,
se desarrollaran como supresoras, abriendo una nueva va de explicacin a la menor incidencia de Reaccin de Injerto Contra Husped
(GVHD, en sus siglas en ingls) observada en trasplantes de SCU (47).
La congelacin de material procedente de SCU est aumentando en
nuestros das. De hecho, casi la mitad de las muestras guardadas actualmente derivadas de este tejido se encuentran en bancos privados aunque,
48
CLULAS
UNA
VISIN GENERAL
por otra parte, de los pocos ms de 8000 trasplantes con clulas de SCU
registrados en todo el mundo, solo cuatro casos parecen haber sido
autotrasplantes (con tejido procedente de bancos privados). Por otro
lado, a la sombra de estos bancos de SCU, estn floreciendo algunas
empresas que ya anuncian la posibilidad de poder congelar, a la espera
de que la ley legisle este campo sin trillar, clulas tan diversas como
las procedentes de sangre menstrual, dientes de leche o grasa de liposuccin. Todo un espectculo del pasen y congelen, tal y como se comenta desde la direccin de la Organizacin Nacional de Trasplantes.
CLONACIN VERDADERA Y TRANSFERENCIA NUCLEAR

Segn el propio I. Wilmut ha avanzado, una de las vctimas del
desarrollo de la RC ser la Transferencia Nuclear (Clonacin Teraputica). Sin embargo, actualmente la tcnica que permiti la clonacin de
la oveja posiblemente ms famosa de la historia, sigue activa en muchos
laboratorios dentro y fuera de nuestras fronteras. Sucintamente, en qu
consiste dicha tcnica?, dnde radica el problema? Antes de entrar en
estas consideraciones, querra comentar una cuestin lingstica: no est
tan claro cmo denominar al producto de la transferencia de un ncleo
diploide adulto a un ovocito enucleado. En este sentido, el Presidente de
la Sociedad Internacional de Biotica, M. Palacios, tras comprobar la
forma de obtencin, las diferencias epigenticas, ADN mitocondrial,
actividad mittica o movilizacin del calcio intracelular de un embrin
constituido por fecundacin verdadera y otro originado por TN, decidi
llamar, a este ltimo, nuclvulo. En cualquier caso, las comisiones
tico-cientficas nacionales o internacionales de aquellos pases con
legislacin al respecto consideran que esta tcnica se ajusta a derecho
y tica.
En teora, la TN conseguira minimizar, sino eliminar completamente, dos de los mayores problemas de los trasplantes: la obtencin de la
suficiente cantidad del tejido a implantar y su completa histocompatibilidad donante y receptor sern el mismo paciente. Para obtener
ESC clonadas desde un individuo adulto, se extrae una de sus clulas y
de ella su ncleo diploide, que se inyectar en un ovocito donado y sin
ncleo (enucleado) para formar, tras estimulacin, un cigoto o algo
49
morfolgica y funcionalmente anlogo con el que se proceder tal y

como se establece para las ESC procedentes de preembriones sobrantes.
El oocito en metafase II ser capaz de reprogramar al ncleo de la clula
somtica hacia un estado pluripotente para comenzar el proceso de desarrollo embrionario. Solo las clulas que pierdan su memoria epigentica seguirn con el proceso proliferativo, produciendo estructuras muy
similares a las embrionarias obtenidas mediante fecundacin (48).
En cuanto a ejemplos significativos de TN, adems del ratn deficiente en Rag2, ya mencionado, otro trabajo muestra cmo neuronas
dopaminrgicas derivadas de TN-ES fueron capaces de corregir el fenotipo de un modelo de Parkinson murino (49). Recientemente, un grupo de cientficos de la empresa californiana Stemagen Corporation,
coordinados por A. French, ha conseguido lo que el surcoreano Hwang
so y fingi: la obtencin de embriones humanos a partir de ncleos
de clulas adultas mediante TN (50). Nuevamente, el hecho de que solo
pudieran constatar la identidad gentica total en un caso y, hasta la
fecha, no hayan podido obtener lneas celulares derivadas del embrin
activado algo que pareca ser el plato fuerte en el montaje fantasma
del cientfico de Sel, apunta claramente a las dificultades tcnicas
del proceso. Uno de los obstculos tcnicos principales, la obtencin de
oocitos humanos, podra pasar por la constitucin de quimeras con los
problemas ya sealados, donde el ncleo humano diploide ofrecer su
acervo gentico a un citoplasma procedente de otro mamfero (conejo,
ratn o, incluso, elefante).
Dejando a nuestra especie al margen, la clonacin de animales s ha
visto en la TN un mtodo efectivo de reproduccin a la carta: adems
de la pionera Dolly, otras ovejas clonadas y transgnicas (Polly) han
visto cmo diferentes factores y protenas humanas factor de coagulacin IX o antitripsina alfa 1, por ejemplo con posible finalidad
farmacolgica, se acumulaban en su leche mediante la conduccin del
transgn deseado con el promotor de la beta-lactoglobulina. Asimismo,
se han podido obtener vacas argentinas clonadas y transgnicas enriquecidas con la hormona de crecimiento bovino que producen hasta un 20%
ms de leche (51).
Ya han sido clonados una docena de mamferos oveja, vaca, ratn, cabra, cerdo, gato, conejo, mula, caballo, rata, perro o lobo. Sin
50
CLULAS
UNA
VISIN GENERAL
embargo, toda tecnologa innovadora puede desarrollar su faceta ms

pintoresca: desde hace poco, varias empresas en EE.UU. o en Corea se
ofrecen a clonar mascotas por unas decenas de miles de euros. De hecho, a finales de enero de 2009 se anunciaba a bombo y platillo la
obtencin de un nuevo perro clonado comercialmente para mitigar la
pena de una familia que, por unos insignificantes 155.000 dlares,
volvi a sentir la presencia de su labrador fallecido.
Finalmente, la clonacin podra permitir recuperar especies extintas
como el Tilacino, desaparecido desde 1936 o, recientemente, el rinoceronte blanco del norte del Congo, del que no deben quedar ms de una
docena de ejemplares, si acaso. Para ello, investigadores pertenecientes
a la Royal Zoological Society y la Universidad de Edimburgo, quieren
mezclar clulas reprogramadas de la piel de uno de estos escasos mamferos con embriones de una especie hermana, el rinoceronte del sur, para
obtener quimeras con la esperanza de que se colonice la lnea germinal.
REPROGRAMACIN CELULAR
Destacada por segundo ao consecutivo por la revista Science como
uno de los mayores hitos del ao, la RC supone un verdadero punto de
inflexin en la biomedicina que sea de todos los tiempos o no, depender de su evolucin futura. Los antecedentes moleculares y celulares
sobre diferenciacin, transdiferenciacin, desdiferenciacin y regeneracin que subyacen tras la RC ya han sido, en mayor o menor medida,
tratados. A todos los efectos, dos publicaciones recientes, aparecidas
prcticamente al unsono (17, 18) trazan la lnea divisoria de dichos hitos. En el primero de dichos trabajos, el prolfico grupo de la Universidad de Kioto, Japn, coordinado por S. Yamanaka quien ya destac en
2006 por la obtencin de otras clulas Pluripotentes Inducidas, iPS, en
ratn (21) describe la obtencin de clulas iPS desde fibroblastos de la
dermis facial de una mujer de 36 aos mediante los mismos factores que
haba utilizado en ratn los ya descritos Sox2, Klf4, Oct4 y c-Myc.
Tal y como se observ en el modelo murino, las clulas iPS humanas
obtenidas eran equivalentes a ESC en morfologa, capacidad proliferativa, antgenos de superficie, expresin gentica, actividad telomerasa y,
por supuesto, el status epigentico que determina, al fin y al cabo, el
51
estado de desarrollo y pluripotencia que una clula tiene en un momento

dado. En este sentido, estas clulas iPS demostraron plena capacidad para
diferenciarse a linajes tisulares procedentes de todas las capas germinales
y para originar teratomas. Sin apenas tiempo para digerir estos fantsticos resultados, desde Wisconsin, EE.UU., el grupo de J.A. Thomson se
asegura su parcela de gloria al publicar, asimismo, la derivacin de
clulas iPS humanas desde fibroblastos fetales. En este caso, partiendo
desde una lista de posibles factores presentes en precursores mieloides de
ESC, fueron acotando los candidatos hasta llegar a un cctel final de
tambin cuatro genes: Oct4, Sox2, Nanog sorprendentemente ausente
en el trabajo de los japoneses y Lin28, que sustituira a c-Myc sugiriendo, de este modo, un menor potencial tumorognico de la mezcla. Ambos
grupos opinan, no obstante, que para futuras terapias en humanos la seguridad del cctel gentico y del vector retrovirus o lentivirus tendra que estar garantizada. Sobre esta cuestin de la posible bioseguridad,
ya en el mismo nmero de Science con el artculo de Thomson, se describe la normalidad fenotpica, en un modelo de ratn de anemia falciforme,
tras la obtencin y transduccin gnica de clulas iPS derivadas de
piel autloga (52). Este trabajo, llevado a cabo por el equipo de R. Jaenisch es especialmente interesante por la combinacin, precisamente, de
dos terapias claras del siglo XXI: la gnica, que no termina de convencer, y la celular derivada de clulas iPS. En cuanto a otro de los aspectos
claves para una futura terapia en humanos, la del nmero de factores necesarios para la milagrosa transformacin celular, podemos recrearnos en
el estudio coordinado por H.R. Schler descrito al principio del presente
captulo (20): utilizando clulas neuronales con alta expresin endgena
de Sox2, y mediante la introduccin de nicamente dos factores, Oct4 y
Klf4 (o c-Myc), se consiguieron clulas iPS murinas tan plsticas como
las del laboratorio de Yamanaka.
De lo que no hay duda es del enorme inters cientfico y social que
han generado estas investigaciones I. Wilmut ya ha anunciado su
enroque desde la TN, su parcela natural, hacia esta prometedora va.
Sin embargo, en este necesariamente escueto recorrido por la RC, no
querra terminar sin sealar, que no describir, otro prometedor trabajo
desarrollado bsicamente en nuestro pas y coordinado por uno de los
principales bilogos del panorama internacional, J.C. Izpisa (53). En
dicho estudio, se describe la rpida generacin de clulas iPS a partir de
52
CLULAS
UNA
VISIN GENERAL
queratinocitos humanos. La transduccin retroviral con Oct4, Sox2, Klf4

y c-Myc (el cctel magnfico de Yamanaka) de clulas primarias,
adultas, procedentes incluso de un nico pelo humano, result, al menos, 100 veces ms eficaz y el doble de rpida que la llevada a cabo con
fibroblastos.
De avance decidido tambin ha de considerarse la obtencin de
clulas iPS, generadas de una paciente de 82 aos diagnosticada con la
forma familiar de ELA, que fueron derivadas con xito hacia neuronas
motoras y gla, las mismas que fallan en dicha enfermedad neurodegenerativa (54). De hecho, poco despus de estos resultados se haca pblica una relacin de lneas celulares especficas de pacientes con distintas enfermedades, como la diabetes tipo 1, distrofia muscular,
Huntington, ADA o Parkinson, entre otras (55). Y esto no ha hecho ms
que empezar. Mes a mes, el nmero de enfermedades con su representacin en cultivos celulares iPS crece decididamente, ofreciendo una
herramienta nica para el estudio de los mecanismos moleculares subyacentes, como banco de pruebas de nuevos frmacos o para futuras
correcciones de defectos genticos previas al tratamiento de pacientes
con sus propias clulas. En este sentido, un trabajo publicado apenas
unos das antes de haber escrito estas lneas (enero 2009), muestra la
curacin de la hemofilia en un modelo de ratn, reprogramando fibroblastos mediante la insercin, con retrovirus, de tres factores (56).
Sea como fuere, est o no prxima la terapia en humanos, estos
nuevos avances biomdicos suponen la apuesta clnica de futuro ms
prometedora y aceptada por propios y extraos.
UN LTIMO COMENTARIO SOBRE LEGISLACIN
No podra cerrar este breve captulo sin, al menos, destacar los
firmes y prometedores pasos legislativos acontecidos en Espaa durante
el ltimo lustro, y que nos han situado a la vanguardia del progresismo
cientfico. Cuando hablamos de clulas madre, la normativa actual espaola se encuentra entre las ms avanzadas del mundo, siendo garantista tanto en el control de la autorizacin de los proyectos como en su
seguimiento. Dos leyes han tenido la culpa: Ley 14/2006 (26 de mayo)
sobre Reproduccin Humana Asistida y, sobre todo, la Ley 14/2007
53
(3 de julio) de Investigaciones Biomdicas (LIB). Tal y como se refleja

en el prembulo de esta ltima, uno de sus ejes prioritarios consiste en
proteger la dignidad del ser humano respecto de las aplicaciones de la
biologa y la medicina tal y como se suscribi en Oviedo el 4 de abril
de 1997. La LIB permitira la utilizacin de cualquier tcnica de
obtencin de clulas troncales embrionarias humanas con fines teraputicos o de investigacin que no comporte la creacin de un preembrin o de un embrin exclusivamente con este fin y en los trminos
definidos en la Ley.
En el mbito mundial, los polos estn bien definidos. Un curioso
sentido de la defensa de la dignidad humana llev al anterior presidente de EE.UU. a secundar a Honduras y Costa Rica en la Asamblea
General de la ONU, cuando el 18 de febrero de 2005 se aprob una
declaracin, no vinculante, que instaba a todos los gobiernos a tomar las
medidas oportunas para prohibir todo tipo de clonacin, incluyendo la
TN. Por supuesto, Blgica, Reino Unido y Singapur, entre otros pases,
se opusieron. Y como no poda ser de otro modo, el nuevo inquilino de
la Casa Blanca ya ha realizado alguna declaracin a favor de la financiacin con dinero pblico de esta clase de proyectos, aprobando, entre
otras medidas, el primer ensayo clnico con ESC.
Por cierto, quienes piensen que las clulas iPS estn libres de pecado moral, debern analizar los resultados del equipo investigador de
la compaa Advanced Cell Technology, con R. Lanza al frente, quienes
ya han anunciado la clonacin de ratones a travs de la colonizacin de
un preembrin murino por clulas reprogramadas (57). Entonces?
AGRADECIMIENTOS
Deseo expresar mi ms sincero agradecimiento al Dr. Antonio Bernad por la lectura y correccin del presente artculo; al Dr. Llus Orozco
por sus oportunos y siempre interesantes comentarios y a los grupos de
ambos investigadores, junto a los miembros del laboratorio de Alberto
Martnez, por las fotografas y figuras ofrecidas para documentar el presente trabajo. Finalmente, quisiera reconocer a Daniel Contreras y a
Hayleigh Stewart la ayuda prestada en la redaccin de algunos de los
apartados.
54
CLULAS
UNA
VISIN GENERAL
ABREVIATURAS
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(Clula Madre Embrionaria); HFEA, Human Fertilisation and Embryology Authority (Autoridad para la Fecundacin y Embriologa Humana);
ISCIII, Instituto de la Salud Carlos III; HSC, Hematopoietic Stem Cells
(Clulas Madre Hematopoyticas); iPS, Induced Pluripotential Stem
cells (Clula Madre Pluripotente Inducida); LIB, Ley de Investigaciones
Biomdicas; MAPC, Multipotent Adult Progenitor Cells (Clulas Multipotentes Adultas Progenitoras); MCI, Masa Celular Interna; MSC,
Mesenchymal Stem Cells (Clulas Madre Mesenquimales); RC, Reprogramacin Celular; SCU, Sangre de Cordn Umbilical; SNC, Sistema
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Clulas madre hematopoyticas

JORDI BARQUINERO MEZ
RESUMEN
Las clulas madre hematopoyticas (CMH) son, con diferencia, las
mejor conocidas de las clulas madre adultas. Se definen como aqullas
capaces de repoblar a largo plazo todos los linajes hematopoyticos
cuando son trasplantadas a receptores sometidos a un tratamiento mieloablativo que permita su injerto. En humanos adultos, las CMH se
encuentran fundamentalmente en la mdula sea (MO), con una frecuencia relativa de 1 entre 104 a 1 entre 105 clulas nucleadas. Aunque
quedan muchas lagunas por conocer, y de hecho an no es posible su
identificacin ni su aislamiento de forma prospectiva con una certeza o
pureza absoluta, los ltimos aos han sido prdigos en avances relativos
a su caracterizacin y aplicaciones clnicas.
En cuanto a sus aplicaciones, las CMH fueron las primeras en ser
trasplantadas con xito hace ms de medio siglo. Inicialmente slo
podan obtenerse a partir de la MO, pero actualmente se obtienen mediante un proceso mucho menos traumtico llamado afresis, tras ser
movilizadas a la sangre perifrica o, ms recientemente, a partir de la
sangre del cordn umbilical. Los trasplantes hematopoyticos han salvado miles de vidas de pacientes con hemopatas malignas y enfermedades
hereditarias. Otra potencial aplicacin de las CMH es la induccin de
tolerancia inmunolgica. Finalmente, las CMH constituyen una diana
excepcional para la terapia gnica (TG), y no es casualidad que los dos
primeros xitos de esta joven disciplina estn basados en CMH.
59
ABSTRACT
Hematopoietic stem cells (HSC) are by far the best known among
adult stem cells. They are defined by their ability to repopulate all hematopoietic lineages long-term upon transplantation into myeloablated hosts.
In human adults, HSC are primarily found in the bone marrow at a relative frequency of 1 in 104 to 1 in 105 nucleated cells. Although many gaps
remain and their prospective identification and isolation in pure form are
still not possible, considerable progress has been made in the recent years
both in their characterization and in their clinical applications.
Regarding their applications, HSC were the first stem cells to be
successfully transplanted, more than 50 years ago. Initially they could
only be obtained from the bone marrow, but now they can be harvested
using a much less painful procedure called apheresis, upon mobilization
of the progenitor cells into the peripheral blood or, more recently, from
umbilical cord blood. Hematopoietic transplants have saved thousands
of patients with hematological malignancies and with genetic diseases.
Another potential application of HSC is the induction of immune tolerance. Finally, HSC constitute a preferred target for gene therapy, and
it is not by chance that the first two successful clinical trials reported so
far were based on HSC.
INTRODUCCIN
El creciente xito del trasplante hematopoytico ha constituido durante ms de medio siglo el paradigma de la existencia de clulas madre
adultas. Hasta hace poco ms de una dcada, hablar de clulas madre no
embrionarias era referirse casi inequvocamente a la MO o a las CMH,
ya que fueron stas las primeras en conocerse y en ser aplicadas al
tratamiento de enfermedades humanas. Al ser el hematopoytico un
tejido lquido trasplantable que se puede cultivar y manipular ex vivo,
las CMH se han convertido en una herramienta insustituible para un
sinfn de terapias celulares y aplicaciones en medicina regenerativa, as
como en una diana preferida para la TG.
La hematopoyesis (palabra que literalmente significa fabricacin o
produccin de sangre, y que indirectamente lleva implcita la nocin de
60
CLULAS
MADRE HEMATOPOYTICAS
clulas madre) es un proceso que garantiza una produccin continua de

clulas sanguneas que permita mantener unas concentraciones de stas
dentro de unos rangos o niveles normales, a lo largo de toda la vida de
un individuo. La hematopoyesis humana tiene una organizacin jerrquica, que est esquematizada en la figura 1. La tabla 1 da una idea de
las ingentes cantidades de clulas que se deben estar produciendo cada
da para mantener esta homeostasis. Es una obviedad que las clulas
sanguneas se estn produciendo (en la MO) a la misma velocidad que
se destruyen (principalmente en el bazo). Si tenemos en cuenta que en
su inmensa mayora las CMH son quiescentes, se hace evidente que
todas estas clulas maduras que cada da acceden a la circulacin san-
FIGURA 1. Esquema simplificado de la hematopoyesis. Una rara poblacin de CMH genera

de manera continua y regulada una progenie de clulas maduras, que pasan a la circulacin
sangunea. La multipotencialidad se va perdiendo a medida que las clulas se van diferenciando en los distintos linajes. La MO tambin alberga otros tipos de progenitores, como los
mesenquimales y los endoteliales. (Tomado de http://stemcells.nih.gov, modificado por la
Dra. H. Eixarch).
61

TABLA 1
Tipo celular
Tipo celular
Vida media
Vida media
Hemates
Granulocitos
Plaquetas
120 das
8-10 horas
7-10 das
Valores normales Cantidad total

normales (por
(en L de
L de sangre)
sangre)
4.5 x 106
7.5 x 103
3 x 105
22.5 x 1012
37,5 x 109
15 x 1011
Produccin
diaria
1,8 x 1011
9 x 1010
2,1 x 1011
Valores normales de los principales tipos de clulas sanguneas y estimacin de la produccin diaria de stas. Las cifras son aproximadas y estn calculadas a partir de las medias
para un adulto humano varn de 70 Kg de peso (5 L de sangre), y no se tiene en cuenta la
produccin de otros tipos celulares (monocitos o linfocitos), ms minoritarios. Slo la produccin de los tres tipos celulares indicados supone generar aproximadamente 5 x 1011
clulas cada da. Tampoco se tiene en cuenta posibles situaciones patolgicas o de estrs, en
las que esta produccin basal puede estar muy aumentada.
gunea proceden de unas pocas CMH. Si se tiene en cuenta que un ratn

normal tiene unas 5000 CMH, y que cuando se analiza un preparacin
en fresco slo un 1-3% de stas se encuentran en una fase activa del
ciclo celular (aunque se van alternado de manera continua), se puede
comprobar que la hematopoyesis es un proceso que se produce de una
forma relativamente oligoclonal.
Por otra parte, esta produccin ha de estar muy finamente regulada,
pues las necesidades de cada tipo celular pueden ir variando a cada
momento; por ejemplo, tras una hemorragia aguda o durante un cuadro
sptico. Esta regulacin depende de factores exgenos, que incluyen
mediadores solubles (factores de crecimiento hematopoytico, citocinas,
factores inhibidores, etc), que seran liberados de forma endocrina o
paracrina, o contactos directos clula-clula que tendran lugar en el
nicho hematopoytico, as como de substancias neuroendocrinas liberadas por las terminaciones nerviosas que inervan la MO, y tambin de
factores intrnsecos de las propias CMH, como la mayor o menor expresin de determinados factores de transcripcin (PU-1, GATA-1, GATA2 o SCL/TAL-1) o de modificaciones epigenticas (1).
Aunque muchos libros de texto definen las CMH como pluripotenciales, en realidad, estrictamente hablando son multipotenciales, pues
por el momento no se ha descrito que puedan generar cualquier tipo
celular del organismo, slo los de los distintos linajes hematopoyticos,
y quizs algn otro no hematopoytico, pero no todos.
62
CLULAS
Se ha descrito que muchas poblaciones de clulas madre en general,

y de CMH en particular son altamente heterogneas (2), lo que tendra
un papel en hacerlas ms o menos receptivas a influencias externas o del
microambiente y ayudara a explicar que, en un momento dado, slo
algunas de ellas respondan a determinados estmulos. Las principales
vas de sealizacin que regulan la toma de decisiones celulares en
relacin a la diferenciacin o la autorrenovacin son las de Notch, Wnt
y Hedhehog, entre otras. La protena Bmi-1, codificada por un oncogn
de la familia polycomb, tambin ha demostrado jugar un papel esencial
en la autorenovacin de las CMH (3).
Recientemente tambin se ha demostrado la existencia de CMH con
distintos patrones de repoblacin in vivo. Estos patrones se mantendran
en la progenie de cada una de estas CMH, pero pueden ser modificados
por factores externos (4). Un aspecto que debe estar finamente regulado
es el mantenimiento de un nmero relativamente constante de CMH a lo
largo de la vida. Hay evidencias que, en el ratn, este nmero est determinado genticamente. De acuerdo con el conocimiento actual, las CMH
experimentaran divisiones asimtricas, de manera que una de las clulas
hijas conservara la multipotencialidad, mientras que la otra entrara en
procesos de diferenciacin/amplificacin, con lo que se tendera a mantener constante el nmero de CMH. En relacin a este hecho, una caracterstica que define las CMH es su capacidad autorregenerativa que debe
mantenerse durante toda la vida del individuo. As, se ha comprobado que
las CMH expresan telomerasa, si bien la reposicin de los telmeros con
cada divisin celular no es del todo completa, por lo que con los aos los
telmeros de sus cromosomas se van acortando (5).
Durante el desarrollo embrionario humano la primeras CMH aparecen en el saco vitelino hacia las 2 semanas de vida, aunque las
primeras que tienen capacidad de repoblacin se originan en el interior
del propio embrin, primero en la esplacnopleura paraartica y posteriormente en la regin aorta-gonadal-mesonefros (AGM). A partir de
la sexta semana el principal rgano hematopoytico es el hgado, y lo
seguir siendo hasta poco antes del parto, producindose la migracin
de las CMH hacia la MO (y ello explica que la sangre del cordn
umbilical durante el periodo perinatal contenga progenitores hematopoyticos), que ser el lugar que albergar la hematopoyesis adulta
definitiva.
63
Un tema muy controvertido es la plasticidad de las CMH, es decir,

si stas pueden transdiferenciarse a clulas maduras de otros linajes no
hematopoyticos. En los ltimos diez aos diversos estudios han descrito aparente transdiferenciacin a diversos tejidos (msculo, hgado,
miocardio, o sistema nervioso). Sin embargo, otros investigadores han
puesto en duda el rigor de dichos estudios, y han demostrado que en
algunos casos lo que se produce es fusin de clulas hematopoyticas
con clulas de otras estirpes, y no verdadera transdiferenciacin. Lo que
es seguro es que la transdiferenciacin, si ocurre, no lo hace con una
frecuencia elevada, al menos en circunstancias normales. Dado que ya
existen otros captulos en este monogrfico que profundizan en esta
cuestin, dejaremos este tema abierto.
ALGUNOS APUNTES HISTRICOS SOBRE LAS CMH

La primera evidencia de la existencia de progenitores hematopoyticos de vida media larga fue desvelada hace ya ms de 60 aos. En
1945, R.D. Owen observ que, en el ganado bovino, los hermanos no
idnticos de una misma camada que haban compartido la misma placenta eran en realidad quimeras que compartan ambos tipos de clulas
sanguneas (las suyas y las de su hermano) de por vida. A partir de ello
dedujo correctamente que deban existir clulas ancestrales a los hemates de los animales adultos. Por pura casualidad, el siguiente avance en
este terreno tambin deriv de otra observacin en el ganado bovino.
Billingham y Medawar practicaban injertos cutneos entre hermanos
idnticos y no idnticos, y se sorprendieron al comprobar que en la
mayora de casos stos no eran rechazados. En su bsqueda de una
explicacin satisfactoria se encontraron con los estudios de Owen y
demostraron, en una elegante serie de experimentos en el modelo murino, que la creacin de quimerismos hematopoyticos mixtos en ratones
neonatos induca tolerancia especfica frente a las clulas del donante
(6), resultados que se publicaron en 1953 y que le valieron a Peter
Medawar el Premio Nobel de Medicina y Fisiologa en 1960.
Desafortunadamente, otras evidencias procedan de las vctimas de
explosiones atmicas, como los habitantes de Hiroshima y Nagasaki en
1945. Si bien en un primer momento no se comprendi demasiado bien,
64
CLULAS
mirado retrospectivamente, las personas que fallecieron tras la exposicin a una mnima dosis letal lo hicieron debido a una aplasia medular,
transcurridos varios das desde la exposicin, ya que la normal renovacin de las clulas sanguneas (principalmente leucocitos y plaquetas)
haba quedado interrumpida. Sin embargo, en experimentos realizados
en ratones irradiados se observ que si se protega el bazo con una
pantalla de plomo se evitaba el sndrome hematolgico (7), y tambin
que podan rescatarse animales sometidos a una dosis letal de radiacin
infundindoles clulas del bazo o de la MO de un ratn no irradiado (8),
hallazgos que sentaban las bases de los trasplantes hematopoyticos,
que desde los aos 70-80 del pasado siglo se realizan de manera rutinaria en muchos de nuestros hospitales.
Con todas estas evidencias indirectas, a partir de los aos 60 se inici
la bsqueda prospectiva de las CMH. Se haba observado que los progenitores de la MO podan formar colonias en el bazo de ratones sometidos
a irradiacin letal, de ah su nombre CFU-S (Colony Forming UnitSpleen). Till y McCulloch demostraron que las CFU-S eran en realidad
clonales, es decir, que procedan de una nica clula. Tambin se producan colonias (CFU) de tamaos y morfologas diversas si los progenitores hematopoyticos se cultivaban in vitro en determinados medios semislidos (agar, metilcelulosa). Cada uno de estos tipos de CFU se lleg a
identificar con un tipo de progenitor, ms o menos inmaduro. As, se
describieron las CFU-GM (unidades formadoras de colonias de granulocitos y macrfagos), las CFU-E (unidades formadoras de colonias de
eritrocitos), las CFU-Meg (unidades formadoras de colonias de megacariocitos) o las CFU-Mix (unidades formadoras de colonias mixtas), entre
otras. Las colonias hematopoyticas constituan otra demostracin de la
existencia de una jerarqua de progenitores con diferentes potencialidades, y de la naturaleza clonal de la hematopoyesis. Estos ensayos clonognicos todava se usan en investigacin o para evaluar indirectamente la
calidad de un producto celular (por ejemplo, una muestra de sangre de
cordn umbilical, o de MO congelada) pero, aunque proporcionan una informacin funcional, actualmente no se consideran indicadores del contenido en CMH, sino de progenitores ms o menos diferenciados. Otros
ensayos clonognicos que permitan analizar progenitores ms inmaduros
que las CFU son el LTC-IC (long-term culture initiating cell) (9) y los
CAFC (cobblestone area forming cell) (10), o clulas formadoras de reas
65
en empedrado, por la disposicin que adoptan las clulas de la colonia,

que recuerda a la de los adoquines de las calles antiguas. En ambos ensayos se emplean cultivos a largo plazo, y requieren un soporte estromal.
Con todo, ningn ensayo in vitro permite por el momento evaluar rigurosamente la funcionalidad de las CMH, los nicos que lo hacen son los que
atienden a la propia definicin de estas clulas, es decir, que demuestran
su capacidad de repoblacin in vivo y de diferenciacin hacia los principales linajes hematopoyticos, y a largo plazo (un mnimo de 4 meses en
el ratn y varios aos en un humano). Por otra parte, los ensayos de repoblacin in vivo tambin tienen sus limitaciones, pues una vez se documenta que se ha producido repoblacin, las CMH que la originaron ya han
desaparecido. Adems, en los ensayos de repoblacin in vivo hay que
tener en cuenta que las clulas que se trasplantan tienen que llegar a alcanzar los tejidos hematopoyticos y anidar (o hacer homing) en los nichos adecuados, un factor que puede ser crtico cuando se trasplantan
nmeros muy reducidos de clulas (hay estudios en los que se trasplanta
una sola clula). Una solucin a estos problemas son los ensayos de repoblacin competitiva, en que una poblacin de clulas problema es
trasplantada simultneamente con otra poblacin control, de manera
que unas puedan ser cuantificadas y diferenciadas de las otras en las
muestras de tejidos hematopoyticos de los animales receptores mediante algn marcador fenotpico. As, se han definido las unidades de repoblacin competitiva (o CRU), que equivaldra a una nica clula que es
capaz de producir linaje mieloide y linfoide a largo plazo cuando es trasplantada a un animal irradiado letalmente. En el caso de las CMH humanas, ante las dificultades para utilizar personas como herramienta experimental, se han utilizado desarrollado modelos de trasplante de clulas
hematopoyticas humanas en diversas cepas de ratones inmunodeficientes, como los NOD/scid u otros, en los que se pueden realizar estudios
cuantitativos (11). As, se ha llegado a definir la unidad de repoblacin
en ratones NOD/scid (o SRC) (11). Con todo, estas exigencias de los ensayos de repoblacin in vivo imponen enormes restricciones y dificultades para el estudio de las CMH, y ello ha impulsado la bsqueda de
mtodos alternativos que permitan identificar CMH de una manera prospectiva. En este sentido, aunque por el momento no existe ninguna tcnica que permita identificar CMH de forma inequvoca y apriorstica, se han
producido avances muy notables en este terreno, de manera que, utilizando distintos marcadores fenotpicos, en humanos se pueden conseguir po66
CLULAS
blaciones celulares que enriquecen la capacidad de repoblacin

en varios rdenes de magnitud, mientras que, en el ratn se pueden llegar
a obtener poblaciones prcticamente puras de CMH, as como de la mayora de los distintos tipos de progenitores hematopoyticos ms diferenciados.
En la MO, las CMH se localizan en unas zonas llamadas nichos, que
juegan un importantsimo papel en su regulacin. Estos nichos hematopoyticos estn divididos en tres partes: 1) una zona osteoblstica (cercana a los osteoblastos), 2) una zona medular de CMH quiescentes y
proliferativas y, 3) una zona vascular (cerca de los sinusoides) que
permite que salgan las clulas maduras a la circulacin (12).
HACIA UNA CARACTERIZACIN FENOTPICA DE LAS CMH
Tras los primeros intentos de enriquecimiento basados en el tamao
y la densidad celular, la aparicin de anticuerpos policlonales o monoclonales frente a distintos marcadores inmunofenotpicos, acoplados a
nuevos y mejores fluorocromos y los avances en la citometra de flujo,
que permiten anlisis multiparamtricos a tiempo real y la separacin de
poblaciones celulares con fenotipos cada vez ms complejos, han revolucionado el conocimiento sobre la hematopoyesis.
En 1984, Kurt Civin descubri el antgeno My10 en la lnea leucmica humana KG-1a. El marcador, que posteriormente se denomin
CD34, se expresaba en la membrana del 1-4% de las clulas nucleadas
de la MO humana, y se comprob que dicha poblacin contena la
prctica totalidad de la capacidad de repoblacin hematopoytica, lo que
indicaba que, al menos de forma mayoritaria, las CMH humanas expresaban dicho marcador. De hecho, se ha utilizado la seleccin positiva de
clulas CD34+ como un mtodo para depleccionar o purgar ex vivo de
clulas tumorales contaminantes en productos hematopoyticos (MO,
productos de afresis) autlogos antes de ser trasplantados, bien sea
como nico mtodo de purga o en combinacin con la seleccin negativa (por ejemplo, de clulas B en algunos linfomas). Ms tarde se
descubri que la mayora de progenitores con capacidad de repoblacin,
adems de ser CD34+, eran CD38-, lo que permite enriquecerlos al menos
en una orden de magnitud ms. El fenotipo que mejor define las CMH
67
humanas se describi recientemente la sangre de cordn umbilical como

Lin- CD34+ CD38-/low CD45RA- CD90- (13).
En el ratn, con mucho la especie en que los distintos progenitores
hematopoyticos estn mejor caracterizados, y a pesar de que muchos de
los marcadores que los identifican se han conservado bien a lo largo de
la evolucin, las cosas son algo distintas (por ejemplo, en el ratn las
CMH son CD34-). Una caracterstica que define a los progenitores inmaduros es que no expresan ninguno de los marcadores especficos de los
distintos linajes maduros (CD3, CD4 o CD8 para clulas T, CD11b o Gr1
para clulas mieloides, B220 para clulas B, o el Ter-119 para clulas de
la serie roja), es decir son Lin-. La denominada deplecin Lin- utiliza una
mezcla de anticuerpos frente a estos marcadores y permite eliminar la
inmensa mayora de clulas maduras y de precursores diferenciados, enriqueciendo unas 20 veces en capacidad de repoblacin en comparacin
con la MO no fraccionada. Los marcadores c-Kit y Sca-1 suponen un
paso ms all en la purificacin de las CMH murinas. Las clulas LinSca-1+ c-kit+ (o simplemente KLS) estn enriquecidas unas 1000 veces en
capacidad de repoblacin a largo plazo, en comparacin con las de MO
no fraccionada. An as, slo una de cada 10 clulas KLS es una CMH.
La tabla 2 es un listado de los principales marcadores que se utilizan en
TABLA 2.
Marcadores utilizados en el fenotipado de los diversos tipos de clulas

hematopoyticas murinas.
Marcador
Funcin
CD45
Antgeno panleucocitario (marca todas la clulas nucleadas de origen

hematopoytico). Se trata de una tirosina fosfatasa.
Stem cell antigen-1
Receptor para el factor de clulas madre (SCF)
Fetal liver kinase-2
Receptor tirosina cinasa especfico de endotelio
Sialomucina, ligando para L-selectina
Integrina IIb
Ligando para el CD2
SlamF1 (molcula de la familia SLAM)
Receptor de protena C endotelial (EPCR)
Subunidad alfa del receptor de la IL-7
Receptor de baja afinidad para el fragmento Fc de la IgG murina
Sialoglicoprotena especfica de la serie roja (desde el proeritroblasto al
hemate maduro)
Sca-1
c-Kit
Flk-2
Tie-2
CD34
CD41
CD48
CD150
CD201
IL7R
CD16/32
Glicoforina A
68
CLULAS
TABLA 3.
Inmunofenotipo de los principales progenitores hematopoyticos murinos.

Modificado de Challen y Goodell (36).
Fenotipo
Tipo celular y referencia
KLS
Flk-2- CD34- KLS
CD150+ CD48- CD41- KLS
Flk-2+ CD34+ KLS
IL7r+ KLS
Lin- IL7R+ c-Kit+ Sca-1Lin- IL7R- c-Kit+ Sca-1- CD34+ CD16/32Lin- IL7R- c-Kit+ Sca-1- CD34- CD16/32Lin- IL7R+ c-Kit+ Sca-1- CD34+ CD16/32+
CMH y progenitores (30)

CMH (repoblacin a largo plazo) (31)
CMH (repoblacin a largo plazo) (32)
clula repobladora a corto plazo (33)
progenitor linfoide comn (CLP) (34)
progenitores mieloides (35)
progenitor mieloide comn (CMP) (35)
megacariocito-eritrocito (MEP) (35)
progenitores de granulocitos y macrfagos
(35)
clulas T
monocitos
granulocitos
CD3
CD14
CD15
CD33
CD41
B220
Ter-119
Glicoforina A
serie plaquetar
clulas B
serie roja
serie roja
la identificacin de progenitores hematopoyticos murinos, mientras que

la tabla 3 describe los fenotipos ms aceptados de los distintos tipos de
stos.
En 1996, Goodell y colaboradores describieron en la MO una subpoblacin celular muy minoritaria (representara entre el 0.01 y el 0.07% del
total de las clulas nucleadas), que en presencia de Hoechst 33342
(Ho342), un fluorocromo que se une al DNA, se tien menos que las
dems, pudindose ser identificadas y aisladas por citometra de flujo,
pues forman una exigua cola adyacente a la poblacin mayoritaria de
clulas en fase G0G1 del ciclo celular (figura 2), por lo que se denomin
Side Population o clulas SP. Posteriormente estas clulas se han encontrado en la mayora de los tejidos de muchas especies de mamferos estudiadas. En la MO murina, es un marcador de clulas altamente inmaduras, que permite enriquecer 1000 veces la capacidad de repoblacin
hematopoytica. En humanos no se ha conseguido demostrar este enriquecimiento (14). La molcula responsable del fenotipo SP es el trans69
FIGURA 2. Histograma de citometra de flujo correspondiente al anlisis de clulas de MO

murina marcadas con Hoechst 33342. Este fluorocromo se une al DNA y, al excitarse con un
lser ultravioleta, tiene una emisin dual, en el rojo y el azul (la seal en cada uno de los
canales se representa en los ejes de abscisas y ordenadas). Ntese la distribucin de la
poblacin celular de la ventana poligonal (de ah el nombre de side population, o poblacin
lateral), menos fluorescente debido a que pueden extruir el fluorocromo por la accin del
transportador de membrana ABCG2. (Cortesa del Dr. Jordi Ptriz).
portador de membrana ABCG2, un miembro de la familia ABC (ATP-binding cassette), que se encargara de extruir agentes genotxicos en clulas o tejidos que estn expuestos a stos y que deban ser protegidos
(CMH, placenta, rin, intestino, epitelio biliar, clulas germinales). Su
sobreexpresin en tumores tambin confiere resistencia a agentes quimioterpicos. El marcaje con Ho342 puede acoplarse al de diversos marcadores inmunofenotpicos, lo que permite anlisis multiparamtricos mediante citometra de flujo que pueden afinar ms an en la caracterizacin y aislamiento de las clulas hematopoyticas ms inmaduras (15).
70
CLULAS
TRASPLANTES HEMATOPOYTICOS
Los supervivientes a largo plazo de trasplantes hematopoyticos
algenicos han constituido durante casi medio siglo la prueba ms palpable de la existencia de CMH adultas, y concretamente el hecho de
encontrar en su sangre clulas de vida media corta (como los granulocitos) derivadas del donante, dcadas despus del trasplante.
Existen dos tipos de trasplantes, autlogos y alognicos, en funcin
de si las clulas trasplantadas proceden del mismo individuo o de otro
distinto. A stos habra que aadir los xenognicos, si las clulas trasplantadas proceden de otra especie distinta, aunque stos slo se han
realizado de forma experimental. Durante muchos aos la MO constituy la nica fuente de clulas hematopoyticas para el trasplante, pero a
raz de la observacin pionera de la existencia de CMH en sangre perifrica de ratones por Goodman y Hodgson (16), y tras comprobarse
que las CHM podan ser movilizadas de la MO a la sangre perifrica
mediante quimioterapia y/o factores de crecimiento como G-CSF, a
partir de los aos 90 se popularizaron los trasplantes de progenitores
hematopoyticos movilizados a sangre perifrica, de forma que en la
actualidad los trasplantes de clulas movilizadas de sangre perifrica
han desplazado en gran medida a los de MO.
Una tercera fuente de progenitores que se ha revelado con un enorme
potencial es la sangre de cordn umbilical (SCU). En 1989 el grupo de
Broxmeyer describi la existencia de CHM en la SCU en cantidades
suficientes para utilizarlas en trasplantes (17). Muy poco despus se realiz el primer trasplante exitoso utilizado esta fuente en un nio con anemia de Fanconi (18). Las principales ventajas de la SCU son su disponibilidad y una menor aloreactividad en comparacin con otras fuentes
(MO o sangre perifrica) debido que las clulas inmunitarias que contiene son las de un recin nacido, lo que se traduce en una menor incidencia
de EICH, y en que puedan utilizarse unidades de SCU menos histocompatibles que en el caso de las otras fuentes. Sus mayores desventajas son
su escaso volumen (y por tanto el relativo bajo nmero de progenitores
que contiene), lo que limita su aplicabilidad en adultos y se traduce en
ms largos periodos de aplasia tras el trasplante, y la defectuosa reconstitucin inmunolgica en adultos, que pone a los receptores en un elevado riesgo de infecciones graves. A pesar de todo, los trasplantes de SCU
71
se aplican cada vez ms y existe una red internacional cada vez mayor de
bancos pblicos (NETCORD, https://www.netcord.org) y tambin privados de SCU que en conjunto ya almacenan cientos de miles de unidades.
Las principales aplicaciones de los trasplantes son las hemopatas
malignas (leucemias, linfomas), aunque tambin se han utilizado en
algunos tumores slidos, y en un buen nmero enfermedades hereditarias que afectan a clulas hematopoyticas (Tabla 4).
TABLA 4. Lista de las principales enfermedades en las que el trasplante hematopoytico
tiene algn valor teraputico.
Leucemias
Leucemia
Leucemia
Leucemia
Leucemia
Leucemia
linfoblstica aguda (LLA)

mieloide aguda (LMA)
linftica crnica (LLC)
mieloide crnica (LMC)
mielomonoctica (LMM)
Linfomas
Enfermedad de Hodgkin
Linfomas no-Hodgkin
Mieloma mltiple
Sndromes mielodisplsicos (SMD)
Tumores slidos
Sarcoma de Ewing
Neuroblastoma
Carcinoma de clulas renales
Tumores cerebrales
Enfermedades por depsito
Adrenoleucodistrofia
Sndrome de Hurler
Enfermedad de Krabbe
Leucodistrofia metacromtica
Sndrome de Maroteaux-Lamy
Anemia aplsica
Inmunodeficiencias primarias
Inmunodeficiencia severa combinada
Sndrome de Wiskott-Aldrich
Enfermedad granulomatosa crnica
Otras
72
enfermedades hereditarias
Anemia falciforme
Anemia de Fanconi
Osteopetrosis
Talasemia
CLULAS
En el caso de las hemopatas malignas, la base racional del trasplante hematopoytico depende de si es autlogo o alognico. En el primer
caso se persigue la eliminacin de los clones malignos mediante quimioterapia (con o sin radioterapia) a dosis elevadas (mieloablativas). En
estos pacientes el trasplante debe realizarse para rescatar su hematopoyesis de una aplasia potencialmente mortal, y no se busca un efecto del
injerto contra el tumor. Tras los trasplantes autlogos el implante suele
ser rpido y no suelen producirse complicaciones inmunolgicas, si bien
tienen como inconveniente una mayor tasa de recadas de la enfermedad
de base. En los trasplantes alognicos, adems de eliminar el mximo
nmero de clulas malignas mediante la quimioterapia (con o sin radioterapia) tambin es decisiva la aloreactividad, es decir, la respuesta por
parte de las clulas inmunitarias del donante frente a las malignas del
receptor, el llamado efecto injerto contra leucemia o contra tumor,
que en muchos casos llega a erradicar las clulas malignas y se asocia
a una menor tasa de recadas que en los trasplantes autlogos. Sin
embargo, la otra cara de la aloreactividad, muchas veces indisoluble del
efecto antileucmico, es la respuesta inmunitaria frente a antgenos presentes en otros tejidos del receptor (hgado, tubo digestivo, piel), lo que
clnicamente se traduce en la llamada enfermedad del injerto contra el
husped (EICH), una grave complicacin que puede llegar a ser invalidante y mortal. Otra limitacin de los trasplantes alognicos es la necesidad de encontrar donantes histocompatibles adecuados, slo disponibles en aproximadamente un tercio de los casos.
Una modalidad de trasplante alognico que reduce la mieloablacin
con la idea de reducir la toxicidad asociada a sta son los llamados
minialoinjertos (o simplemente minialos) (19). Ideados por Rainer Storb
y su grupo de Seattle, utilizan un acondicionamiento de intensidad ms
reducida cuyo objetivo es facilitar un mnimo injerto de las clulas
trasplantadas en una fase inicial (es decir crear un quimerismo mixto)
para, en una segunda fase, conseguir el quimerismo completo mediante
infusiones de linfocitos del donante (DLI). De esta forma se sigue aprovechando el efecto inmunolgico frente al tumor. Al ser mucho mejor
tolerados, los minialos han permitido trasplantar a personas de mayor
edad o con patologas de base.
73
EL PROBLEMA DE LA MIELOABLACIN
Uno de los principales inconvenientes que presentan los trasplantes
hematopoyticos es que no basta con infundir las clulas a trasplantar
como si se tratara de una simple transfusin. Para que las clulas trasplantadas tengan alguna oportunidad de injertar y repoblar, hay que
eliminar, total o parcialmente, las clulas hematopoyticas endgenas
para crear espacio en la MO, para lo cual antes del trasplante hay que
someter al receptor a un tratamiento mieloablativo llamado acondicionamiento. Por desgracia, estos tratamientos se basan en el empleo de radiacin y/o agentes quimioterpicos y se asocian a una elevada morbilidad que resulta asumible para tratar una leucemia mortal, pero quizs
no ser tan aceptable en muchos pacientes con enfermedades hereditarias,
especialmente cuando existen terapias alternativas menos txicas, como
los tratamientos substitutivos (aunque sean caros y haya que administrarlos de por vida). La introduccin de nuevas pautas de acondicionamiento menos txicas y mejor toleradas por los pacientes facilitara
enormemente la aplicacin de los trasplantes hematopoyticos a muchas
enfermedades hereditarias. En el caso de la TG, el problema de la mieloablacin es especialmente limitante, como se comentar en el siguiente apartado.
TERAPIA GNICA
Una de las aplicaciones ms novedosas de las CMH es la TG. Los
motivos que hacen de estas clulas una de las diana preferidas para la
modificacin gentica incluyen en primer lugar la idea de que su correccin afectar a toda su progenie, que incluye nuevas CMH que se irn
regenerando a lo largo de toda la vida del individuo. As, cualquier
enfermedad que afecte a alguna de las series hematopoyticas, incluidas
las que constituyen el sistema inmunitario, son tericamente abordables
mediante TG en CMH. Adems, a esto hay que aadir su relativa facilidad de obtencin, de manipulacin ex vivo, y el hecho de que sean
trasplantables. Otra de sus grandes ventajas es que, en las condiciones
en las que se realizan estos tratamientos, las CMH transducidas no suelen desencadenar respuestas inmunes frente al producto transgn, como
ocurre con la mayora de otros tipos celulares. Como inconveniente, sin
74
CLULAS
embargo, hay que destacar la necesidad de someter al receptor a un

tratamiento parcial o totalmente mieloablativo.
Con todos estos antecedentes probablemente no ha sido casual que
los dos primeros ensayos de TG que pueden considerarse exitosos hayan
estado basados en CMH. Tras una dcada de fracasos (en general con
todas las modalidades de TG), en 2000 se publicaron los resultados del
primer ensayo con resultados positivos. Los pacientes eran nios con
inmunodeficiencia severa combinada ligada al cromosoma X (SCIDX1), una rara y grave enfermedad debida a mutaciones en el gen de la
subunidad gamma comn (c) de una serie de receptores para interleucinas (IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 e IL-21). Algunas de stas son
factores de crecimiento para clulas del sistema inmunitario, de forma
que los pacientes sufren una ausencia casi total de clulas T, B y NK
funcionales, lo que resulta en infecciones graves y frecuentes que suelen
ser fatales durante los primeros meses de vida.
Los investigadores introdujeron una copia sana del gen c utilizando un vector retrovrico en las clulas CD34+ de la MO de los propios
pacientes, que se reinfundieron en ausencia de tratamiento mieloablativo
(en este caso innecesario por la inmunosupresin de base y la enorme
ventaja selectiva de las clulas corregidas). Pocos meses despus de la
infusin de las clulas corregidas genticamente, los recuentos de clulas T alcanzaron cifras normales y la funcin inmunitaria mejor significativamente en prcticamente todos los nios tratados. Estos resultados fueron confirmados independientemente por investigadores
britnicos usando un protocolo anlogo en otros seis pacientes. La clave
del xito radicaba en el hecho que las clulas genticamente modificadas, ya capaces de responder a los factores de crecimiento adecuados,
podan proliferar y diferenciarse y tenan una ventaja selectiva para
repoblar los nichos virtualmente vacos de clulas T y B, mientras que
las clulas no corregidas seguan desapareciendo por apoptosis, lo que
da como resultado una repoblacin completa por clulas corregidas
genticamente (20).
El segundo xito reconocido de la TG para enfermedades monognicas se produjo en pacientes con SCID-ADA (21). El enzima ADA
cataliza la desaminacin de la desoxiadenosina a adenosina, resultando
su ausencia en un acmulo de metabolitos altamente txicos para las
75
clulas T. Como ocurre en la SCID-X1, el trasplante de MO de un

hermano compatible, si est disponible, constituye una buena alternativa
teraputica. Si no hay donante adecuado, los pacientes pueden ser tratados con ADA bovino pegilado, como tratamiento substitutivo.
El primer ensayo clnico de TG se haba realizado en 1990 en nios
con esta misma enfermedad. Consisti en la modificacin gentica de
clulas T enfermas, que fueron reinfundidas a los pacientes. Doce aos
ms tarde, los pacientes tratados, a los que se les mantuvo la terapia con
PEG-ADA, expresaban el enzima, pero a unos niveles subteraputicos.
Este ensayo clnico se consider fallido, probablemente porque la terapia substitutiva con ADA recombinante estaba anulando la ventaja selectiva para las clulas modificadas genticamente. En el nuevo ensayo,
realizado en Italia y cuyos resultados se publicaron en 2002, los investigadores utilizaron una mieloablacin a dosis bajas, y retiraron el tratamiento substitutivo con ADA pegilado, lo que favoreci la repoblacin selectiva por parte de las clulas modificadas genticamente. El
xito conseguido es tal que hoy da podra considerarse la TG el tratamiento de eleccion para los pacientes con esta enfermedad.
Estos primeros xitos aportaron renovadas esperanzas a esta joven
disciplina. El hecho que dos tipos de SCID fueran las primeras enfermedades en ser curadas mediante TG no fue una sorpresa. Ya se ha comentado la poderosa ventaja selectiva que opera en las clulas genticamente corregidas para proliferar o escapar de la apoptosis, y por tanto para
repoblar in vivo. Por desgracia, no se espera que resulte tan fcil para
la mayora de enfermedades candidatas a ser corregidas usando genes
que no proporcionan ninguna ventaja selectiva a las clulas modificadas
(que son la inmensa mayora). Una prometedora lnea de investigacin
consiste en el empleo de genes seleccionables que, una vez introducidos
junto al gen teraputico permiten seleccionar in vivo las clulas transducidas usando agentes farmacolgicos (22).
INSERCIONES RETROVIRALES Y RIESGO ONCOGNICO
Por definicin, todas las inserciones en el genoma son mutagnicas.
Sin embargo, el riesgo de oncognesis por insercin tras los procedimientos de transferencia gnica estndar usando vectores integrativos en
76
CLULAS
los modelos preclnicos se consideraba extraordinariamente remoto. Por

ello, el hallazgo que cuatro de los once nios tratados en el ensayo
clnico francs para SCID-X1 antes mencionado y uno tratado con el
protocolo ingls desarrollaran leucemias, varios aos despus de recibir
la TG, sorprendi a toda la comunidad mdica y cientfica, especialmente cuando se descubri la existencia de una zona caliente para las
inserciones retrovirales y crtica para la transformacin leucmica en el
locus del protoncogn LMO2 (23).
Previamente no se haban descrito efectos adversos similares en los
cerca de 200 pacientes tratados en ensayos clnicos anlogos que tambin usaban vectores integrativos, incluyendo la SCID-ADA o, exceptuando casos puntuales, en los miles de animales experimentales sometidos a procedimientos de transferencia gnica integrativa (aunque quizs
estos no haban sido estudiados con el suficiente detalle). Esto plante
la pregunta crucial de si la TG basada en este tipo de vectores era ms
peligrosa de lo que se pensaba, o de si estos casos estaban ms relacionados con factores dependientes del contexto (por ejemplo, asociados a
la propia enfermedad o al propio transgn teraputico), y por lo tanto no
podan ser extrapolables a otras situaciones. Es significativo que ninguno de los pacientes con SCID-ADA tratados ha desarrollado este tipo de
complicacin, a pesar de que los vectores utilizados son muy similares.
Buscando en una base de datos de varios miles de cnceres hematolgicos murinos inducidos por inserciones retrovirales experimentales
(http://RTCGD.ncifcrf.gov), Dave et al. encontraron dos casos asociados a inserciones cercanas al locus LMO2 y dos con inserciones en el
locus IL2RG (el del gen teraputico en esta enfermedad) (24). Una de
ellas contena una insercin en cada uno de ambos loci. Las probabilidades de que esos dos eventos se produjeran en la misma clula son tan
remotas que el hallazgo sugiere que la expresin no regulada del transgn c dirigida por el LTR retrovial (que contiene la secuencia promotora y el enhancer) se convirti en un inesperado cofactor para la transformacin leucmica. Un estudio posterior realizado para analizar
prospectivamente la capacidad oncognica tanto de la subunidad c
como del LMO2, utilizando vectores retrovirales codificando para ambos transgenes de manera independiente revel que ambos tenan potencial oncognico, si bien para que ste se hiciera evidente era necesario
un periodo suficientemente largo de observacin (mnimo 5-6 meses),
77
ms de los que se haban utilizado en los estudios preclnicos previos al

ensayo clnico por parte del grupo francs (25).
Estos casos de leucemia descritos por los investigadores franceses
generaron una respuesta desmedida por parte de los medios de comunicacin y la sociedad, as como escepticismo por parte de la comunidad
cientfica, y se llegaron a paralizar todos los ensayos clnicos basados en
vectores integrativos. Sin embargo, en estos momentos muchos pases
han levantado el veto a los vectores integrativos, que se han rediseado
y optimizado para minimizar sus potenciales riesgos.
INDUCCIN DE TOLERANCIA A TRAVS DEL QUIMERISMO
Los estudios pioneros de Billingham y Medawar sobre la induccin
de tolerancia a travs de la creacin de quimerismos hematopoyticos
han sido retomados por algunos investigadores. La idea es que la creacin de estos quimerismos mixtos va trasplante de CMH dara lugar a
un estado de tolerancia que podra ser til en receptores de trasplantes
de rganos, pues les hara innecesario el tratamiento inmunosupresor,
muchas veces de por vida, que estos pacientes requieren para no rechazar sus injertos. En este caso las CMH deben proceder del mismo donante del rgano que se trasplanta, pues la tolerancia es especfica de
donante. La disponibilidad de donantes ya supone una enorme limitacin, y la otra es la enorme toxicidad asociada a los trasplantes hematopoyticos alognicos, tanto por la mieloablacin como por la posibilidad de una EICH. Posibles vas de abordaje frente a estos
inconvenientes, son el uso de minialos, ya comentados, la bsqueda de
pautas de acondicionamiento mnimamente ablativas y de inmunosupresin que permitan la creacin de quimerismos mixtos estables (26), as
como otras estrategias como el empleo de dosis muy elevadas de progenitores inmaduros, un tema revisado recientemente por I. Weissman
y colaboradores (27).
En nuestro laboratorio, comprobamos que el trasplante de clulas
hematopoyticas que expresaban la protena verde fluorescente como
marcador a ratones mnimamente acondicionados (con 3 Gy de irradiacin corporal total ICT) resultaba en la expresin del transgn a
largo plazo (22 semanas), lo que sugera que se estaba induciendo tolerancia frente a la EGFP (28).
78
CLULAS
Tras estas observaciones, en colaboracin con investigadores de la

Unidad de Neuroinmunologa Clnica de nuestra institucin, investigamos
si dicha estrategia para inducir tolerancia podra ser aplicable a situaciones de mayor relevancia clnica como la encefalomielitis autoinmune
experimental (EAE), el modelo animal de esclerosis mltiple. La EAE se
induce experimentalmente inmunizando animales susceptibles con autoantgenos de la vaina de mielina, lo que desencadena una enfermedad
mediada por clulas T muy similar a la esclerosis mltiple. Observamos
que, de manera preventiva, el quimerismo e incluso el microquimerismo
molecular se asociaban a una proteccin muy robusta frente a la enfermedad inducida. En cuanto a la aplicacin de modo teraputico, es decir,
en animales con la enfermedad establecida, comprobamos que no era
indispensable crear quimerismo molecular con clulas que expresan el
autoantgeno para inducir tolerancia. Tras la infusin de clulas de MO
transducidas a receptores con EAE establecida sometidos a mieloablacin
parcial, stos experimentaban mejoras clnicas muy significativas, incluso remisiones completas, a pesar de que las clulas trasplantadas no injertaban (eran rechazadas porque la induccin de la enfermedad experimental pasa por la generacin de una respuesta inmune frente al
autoantgeno expresado en las clulas transducidas). Observamos que los
esplenocitos de los animales tratados producan ms IL-5 e IL-10 tras
exposicin al autoantgeno que los de los controles, lo que nos sugera que
la tolerancia que se induca estaba mediada por clulas T reguladoras,
probablemente del tipo inducible o Tr1. Adems, tras comprobar que el
injerto de las clulas hematopoyticas transducidas no era necesario para
obtener un beneficio teraputico, infundimos las clulas de MO transducidas a ratones con EAE en ausencia de mieloablacin y obtuvimos resultados similares (29). Esta no necesidad de mieloablacin reduce notablemente la toxicidad del procedimiento y lo acerca mucho ms a una
potencial aplicabilidad clnica.
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3.
Clulas pluripotentes inducidas

LLUS MONTOLIU
RESUMEN
Las clulas troncales pluripotentes inducidas iPS (del ingls, induced Pluripotent Stem cells) han revolucionado la biologa de las clulas
troncales y sus posibles aplicaciones teraputicas en medicina regenerativa. Los experimentos pioneros de Takahashi y Yamanaka, realizados
inicialmente con clulas de ratn, en 2006, y posteriormente refrendados,
un ao ms tarde, por el mismo laboratorio y otros, de forma independiente, en clulas humanas, describieron una tercera va para obtener clulas
troncales pluripotentes. Hasta ese momento conocamos esencialmente
dos alternativas para obtener clulas troncales pluripotentes, obtenidas
bien fuera a partir de embriones (blastocistos), las denominadas clulas
troncales pluripotentes embrionarias, bien fuera a partir de clulas somticas, presentes en tejidos de fetos, recin nacidos o adultos, las denominadas clulas troncales pluripotentes adultas. Los investigadores
japoneses demostraron que la adicin de un reducido nmero de genes
posibilitaba la transformacin, la induccin de clulas somticas a clulas troncales pluripotentes. Por ello, a las clulas troncales obtenidas por
este tercer procedimiento se las denomin pluripotentes inducidas o
iPS. En este captulo resumir las investigaciones publicadas en los tres
ltimos aos en este campo, subrayando los descubrimientos, las innovaciones cientficas y tecnolgicas y las continuas variaciones metodolgicas que se suceden en la literatura a la bsqueda de tcnicas de obtencin
y uso de clulas pluripotentes inducidas cada vez ms eficaces y robustas. Finalmente, es importante resaltar la credibilidad y relevancia de
estos trabajos, validados y refrendados por mltiples laboratorios de for83
LLUS MONTOLIU
ma independiente en todo el mundo, frente a los recientes casos de fraude que haban contaminado lamentablemente el campo de investigacin
de las clulas troncales pluripotentes humanas.
ABSTRACT
The induced pluripotent stem cells (iPS) have triggered a revolution
in the field of the biology of stem cells and their putative therapeutical
applications in regenerative medicine. The pioneer experiments of Takahashi and Yamanaka, initially carried out with mouse cells in 2006,
and confirmed one year later by the same laboratory and others, independently, with human cells, described a third method to obtain pluripotent stem cells. Up to then, we knew essentially two alternative methods to derive pluripotent stem cells, obtained either from embryos
(blastocysts), for the cells called pluripotent embryonic stem cells (ES),
or obtained from somatic cells, found in fetal, newborn or adult tissues,
for the cells called pluripotent adult stem cells. The Japanese researchers demonstrated that adding a limited number of genes triggered the
transformation, the induction of pluripotent stem cells from somatic cells.
Therefore, these stem cells obtained following this third method are
called induced pluripotent stem cells, or iPS.
In this chapter, I will summarise the reported experiments published
in the last three years in the field, highlighting the challenges, the scientific and technological innovations and the several continuous methodological variations that are appearing in the literature, searching for techniques to derive and use induced pluripotent stems cells robustly and
more efficiently. Finally, it is important to remark the credibility and
relevance of all these works, validated and confirmed by multiple laboratories independently world wide, in contrast to the recent cases of
fraud that have regrettably contaminated the research field of human
pluripotent stem cells.
INTRODUCCIN
Nada haca presagiar que el ao 2006, que haba empezado con la
peor de las noticias, el descubrimiento del descomunal fraude de Woo
Suk Hwang, acabara pasando a la historia por un hecho mucho ms
84
CLULAS
PLURIPOTENTES INDUCIDAS
importante y esperanzador, la primera descripcin de las clulas troncales pluripotentes inducidas, publicada en la revista Cell, en Agosto de
2006, en un artculo original cuyos autores eran Kazutoshi Takahashi y
Shinya Yamanaka (1).
En efecto, en los dos aos anteriores, 2004 y 2005, los cientficos y
la sociedad en general se haba quedado prendada de los sorprendentes
avances supuestamente llevados a cabo por el cientfico surcoreano y su
equipo, con el aislamiento de las primeras clulas troncales embrionarias humanas obtenidas por transferencia nuclear, en 2004, y por el
todava ms espectacular incremento de la eficiencia del proceso y la
extensin a la obtencin de estas clulas a partir de pacientes con diferentes enfermedades, publicado en 2005. Nada era cierto. Todo fue un
fraude, que acabo provocando la retirada de las publicaciones mencionadas y un histrico editorial en Science, la revista que public los
artculos de Woo Suk Hawng, publicado a finales de Enero de 2006, en
el que se admita que una parte importante de los datos presentes en
ambas publicaciones haban sido fabricados (2).
Sin embargo, mientras que la mayora de los cientficos estaban
lamentndose del suceso e intentando reparar, en lo posible, el enorme
dao que esta revelacin de conducta inapropiada haba causado a la
profesin, y a la sociedad en general, en el laboratorio de Shinya Yamanaka, de la Universidad de Kyoto, en Japn, se estaban ultimando unos
experimentos y se estaba preparando una publicacin cientfica que, sin
ningn gnero de dudas, est llamada a convertirse en una de las contribuciones ms importantes, fundamentales, de la biologa de las clulas troncales. En esencia, estos dos investigadores japoneses haban
estudiado, de forma pormenorizada, la combinacin mnima de genes
necesaria para transformar una clula somtica cualquiera, por ejemplo
un fibroblasto, en una clula troncal, indistinguible de las clulas pluripotentes troncales embrionarias (1). Su hiptesis experimental era que
deba existir un reducido nmero de funciones gnicas que, al reactivarlas, fueran capaces de reprogramar cualquier clula y retornarla, transformarla en clula pluripotente.
El artculo de Takahashi y Yamanaka, publicado en 2006, no tuvo
la repercusin social que probablemente le corresponda, al tratarse de
experimentos realizados con ratones, y hubo que esperar a finales del
85
LLUS MONTOLIU
ao siguiente, en noviembre de 2007, cuando aparecieron publicados

resultados similares con clulas humanas, llevados a cabo de forma
independiente por los equipos de Thomson (3), en EEUU, y del propio
Yamanaka (4), en Japn. Fue entonces cuando la comunidad cientfica
en su conjunto, y la sociedad en general conocieron que era posible
convertir clulas somticas en clulas troncales pluripotentes, mediante
un procedimiento de induccin gentica, mediante la expresin simultnea de un reducido grupo de genes. Estas clulas se denominaron iPS
cells (del ingls, induced pluripotent stem cells) y, desde entonces, el
nmero de publicaciones que han aparecido en la literatura ha desbordado cualquier previsin, siendo en la actualidad el estudio de las clulas iPS uno de los campos de mayor inters en biologa de clulas
troncales y en medicina regenerativa.
La traslacin social de este descubrimiento haba seguido un proceso similar, aunque afortunadamente ms rpido, que el aislamiento de
las primeras clulas troncales embrionarias pluripotentes de ratn, clulas ES (Figura 1), llevado a cabo en 1981, de forma independiente, por
FIGURA 1. Clulas troncales pluripotentes embrionarias de ratn (ES). Microfotografa al

microscopio ptico de contraste de fases en la que se observa un grupo de clulas ES de ratn
creciendo sobre un csped de fibroblastos murinos embrionarios.
86
CLULAS
dos laboratorios: Martin Evans (5) en el Reino Unido, y Gail Martin (6)
en EEUU. Sin embargo el conocimiento social de la existencia de clulas troncales pluripotentes embrionarias no se disemin socialmente ni
perme a otras disciplinas cientficas ms clnicas hasta que, 17 aos
ms tarde, en 1998, dos equipos norteamericanos liderados por Thomson y Gearhart, tambin de forma independiente, publicaran sus primeros resultados con la descripcin de las primeras clulas troncales pluripotentes embrionarias humanas obtenidas a partir de blastocistos (7) o
de primordios germinales fetales (8).
Desde 2007 hasta la actualidad no hay mes, semana en la que no se
publiquen avances relevantes en el campo de las iPS. Los primeros
genes utilizados para la induccin de la pluripotencia han ido reducindose paulatinamente, de la misma manera que los protocolos de induccin han sido cada vez ms imaginativos, evitando la utilizacin de
vectores virales de integracin en el genoma. Cada vez son ms los tipos
celulares somticos de los que es posible y est documentado obtener
clulas iPS, con procedimientos similares, aunque a veces no idnticos.
En las pginas siguientes describir la reciente revolucin metodolgica que ha permitido obtener las clulas iPS y los experimentos ms
relevantes publicados hasta el momento.
CLULAS INDUCIPLES PLURIPOTENTES (iPS) DE RATN
Los resultados publicados por Takahaski y Yamanaka (1) revolucionaron la investigacin en clulas troncales. A travs de un anlisis sistemtico de un grupo inicial de 24 genes, cuya expresin se haba asociado de forma especfica a clulas troncales embrionarias (ES), y
mediante experimentos de transfeccin en fibroblastos embrionarios de
ratn (MEF), en los que se iba eliminando, uno a uno, solamente uno de
los 24 en cada experimento, llegaron a reducir la lista de genes primero
a 10, y finalmente a solo 4, los cuatro genes Oct3/4, Sox2, Kfl4 y c-Myc,
que permitan inducir clulas con caractersticas de clulas troncales
pluripotentes a partir de clulas somticas. La transformacin celular se
haca a travs de vectores virales, retrovirus (lentivirus) portadores, de
forma individual o combinada, de las secuencia gnicas de los 4 genes.
Gran parte de su xito fue el ingenioso y elegante sistema de cribado
87
LLUS MONTOLIU
que disearon, con unos MEF obtenidos de ratones mutantes (knockout) para el gen Fbx15, dispensable pero de expresin especfica en
clulas ES, en los que este locus diriga la expresin de un cassette de
resistencia al antibitico G418. Al transformar los MEF obtenidos de
ratones deficientes en Fbx15 con diversas combinaciones gnicas y
forzar su crecimiento en presencia del antibitico, solamente aquellas
combinaciones exitosas en la conversin de clula somtica a clula
troncal pluripotente (similar a ES) permitan activar el locus Fbx15 y
expresar la resistencia al antibitico adecuadamente. En este primer trabajo, en el que se acu el trmino de clulas iPS, los autores tambin
verificaron algunas de las propiedades de este nuevo tipo celular. Desde
el punto de vista morfolgico y en relacin a marcadores especficos,
estas clulas creadas, iPS, eran del todo indistinguibles de las clulas
troncales pluripotentes embrionarias (ES), con la salvedad de que las
iPS no provenan de embriones, sino de clulas somticas. Se obtuvieron los perfiles de expresin gnica caractersticos de estas clulas iPS
y se pudo observar que eran ms parecidos, aunque no idnticos, a los
de las clulas ES, y distintos de los de las clulas somticas MEF, de
donde provenan. Adicionalmente, confirmaron que eran capaces de
derivar teratomas con clulas de las tres hojas embrionarias (mesodermo, ectodermo y endodermo) tras inyectarlas subcutneamente en ratones inmunodeficientes, y ms todava, contribuan al desarrollo embrionario al ser inyectadas en blastocistos. Sin embargo, en este primer
trabajo no se pudieron obtener quimeras ni transmisin del genotipo iPS
a travs de la lnea germinal.
De forma independiente, aproximadamente un ao ms tarde, el
grupo de Rudolf Jaenisch del MIT, no solamente logr reproducir los
resultados de Takahashi y Yamanaka sino que consigui culminar con
xito la transmisin por va germinal del genotipo de estas nuevas clulas iPS. A partir de la transformacin de MEF con los mismos 4 genes
mencionados (Oct3/4, Sox2, Kfl4 y c-Myc), us con xito las clulas iPS
generadas para microinyectarlas en blastocistos de ratn y obtuvo quimeras, que transmitieron el genotipo a la descendencia. Adicionalmente,
aport nuevas pruebas moleculares que indicaban que el estado de reprogramacin y epigentico conseguido en las clulas iPS las haca del
todo indistinguibles de las clulas ES (9). Este trabajo coincidi con un
segundo trabajo del equipo de Yamanaka en el que demostraba igual88
CLULAS
mente que las clulas iPS eran capaces de contribuir y transferir su

genotipo a travs de la lnea germinal, si se seleccionaban aquellas
clulas iPS con mayores niveles de expresin del gen Nanog, especfico
de clulas ES (10). De las quimeras generadas tambin se observ, por
vez primera, la aparicin de tumores en los ratones generados, probablemente derivados de la activacin ectpica y anmala de c-Myc, con lo
que ya apuntaron estos autores que, en el futuro, cualquier aplicacin
clnica que pretendiera usar clulas iPS debera evitar usar el gen c-Myc,
por su capacidad tumorognica (10).
Seguidamente, nuevamente el grupo de Jaenisch, demostr, por vez
primera, que basndose nicamente en criterios morfolgicos para evaluar el grado de conversin de las clulas somticas a troncales, sin
mediar modificacin gentica previa alguna que ayudara a describir y
aislar las clulas iPS (p.e. usando el locus Fbx15, o el locus Oct3/4 o el
locus Nanog, todos ellos con fuerte expresin especfica en clulas ES),
era posible obtener clulas iPS, reprogramadas a partir de fibroblastos
de ratn (11).
El procedimiento era sorprendente pero funcionaba, y era reproducible en muchos laboratorios. Por ello, apenas un ao despus de su
primera descripcin, ya se publicaba la receta completa, el protocolo
genrico que permita obtener estas clulas iPS mediante transduccin
gentica de un reducido nmero de genes, naturalmente preparado por
el grupo de Yamanaka (12). El mismo grupo se encarg de demostrar
que tambin de clulas del estmago o del intestino, somticas y diferenciadas, es posible derivar clulas troncales pluripotentes inducidas
(13). De hecho, a raz de ser posible obtener mltiples lneas de iPS de
los ms diversos tipos celulares, y de constatarse en muchos experimentos independientes la eficacia del proceso, se concluy que la explicacin del mecanismo tena que ver fundamentalmente con los genes transferidos, y no con los sitios de integracin de los vectores virales
utilizados (13).
Posteriormente se ha demostrado que el protocolo general puede
requerir alguna pequea modificacin para ser aplicado en la reprogramacin de determinados tipos celulares somticos. En este sentido, el
grupo de Jaenisch demostr que para la obtencin de clulas iPS a partir
de linfocitos B maduros no solo era necesario la adicin de los cuatro
89
LLUS MONTOLIU
genes mencionados sino la inclusin de un quinto gen, c/Ebp, y la

supresin o inactivacin de uno adicional, Pax5 (14). Tambin se ha
podido demostrar en ratones que, en determinados tipos celulares (como
las clulas troncales adultas neurales), con elevados niveles de expresin endgena de los genes c-Myc y Sox2, basta con transformar con
solamente dos genes (Oct3/4 y Kfl4) para obtener clulas iPS. Este
experimento indica que para que la reprogramacin e induccin del
fenotipo pluripotente sea correcta y completa, no es necesaria la transduccin de los cuatro genes, sino que puede complementarse el proceso
con la expresin endgena normal de alguno de ellos en algn tipo
celular (15). El mismo equipo, dirigido por Shler, ha llevado el experimento al lmite, demostrando que, en esencia, solamente hace falta
un gen, el gen Oct3/4, para convertir a una clula troncal neural adulta
en clula pluripotente inducida, siendo dispensables, en este contexto y
en estas condiciones, los otros tres (que, de hecho, ya se expresan de
forma natural en dichas clulas troncales adultas del sistema nervioso)
(16).
Esta sorprendente plasticidad, inesperada, de las clulas somticas,
que pueden ser reprogramadas a pluripotentes a travs de la expresin
de una serie de genes que codifican para factores de transcripcin ha
abierto un camino nuevo, un lenguaje nuevo, el lenguaje de la reprogramacin que, en contraste de lo que pudiera haberse supuesto, est gobernada, esencialmente, por un reducido nmero de genes, cuya expresin, adems, est interrelacionada, de ah que diferentes combinaciones,
en apariencia distintas, logren el mismo efecto (17). Tal grado de interrelacin se comprueba igualmente al haberse demostrado que puede
mimetizarse la reprogramacin mediada por alguno de estos cuatro factores mediante compuestos, mediante drogas, como inhibidores de quinasas, bloqueadores de pasos clave en las cascadas de seales de transduccin que la clula somtica puede interpretar de forma similar,
reactivando la pluripotencia y manifestando el fenotipo de clula troncal
pluripotente inducida (18).
La inclusin del gen c-Myc en el grupo de cuatro genes destinados
a inducir pluripotencia es problemtica. c-Myc es un protooncogen implicado en muchas funciones celulares, incluyendo el control del ciclo
celular. La activacin anmala y/o fuera de control puede causar tumores por lo que la re-introduccin sistemtica de c-Myc era peligrosa. Por
90
CLULAS
ello, el grupo de Yamanaka decidi explorar si era posible obtener clulas iPS con la induccin gentica provocada por Kfl4, Oct3/4 y Sox2,
pero sin aadir c-Myc. Lograron clulas iPS igual de robustas que las
anteriores (con c-Myc) pero con una menor eficiencia, y, lo que era
mucho ms importante, ninguno de los ratones derivados a partir de esas
clulas iPS desarroll tumores (19).
La utilizacin de vectores retrovirales, lentivirales, tampoco est
exenta de problemas. Los lentivirus (y retrovirus en general) son integrativos y, por lo tanto, pueden causar mutagnesis por insercin en el
genoma, dado que el proceso es al azar. Es obvio que para trasladar a
la prctica clnica los protocolos de transferencia gentica, en humanos,
estos no deberan incluir posibles modificaciones genticas causadas por
la insercin de lentivirus. En este sentido, se han publicado los primeros
trabajos documentando el uso de vectores adenovirales, y por lo tanto
episomales, no integrativos, como vehculo para la transformacin (la
transduccin) de las clulas somticas en clulas iPS (20). El propio
Yamanaka ha llevado este argumento ms all, proponiendo y demostrando que es posible transformar repetidamente las clulas somticas,
fibroblastos, con plsmidos portadores de los cuatro genes y conseguir
(a pesar de la extincin y no integracin de los plsmidos, pero debido
a la expresin transitoria conseguida de los cuatro genes) derivar clulas
iPS (21).
CLULAS INDUCIPLES PLURIPOTENTES (iPS) HUMANAS
Tal y como se ha adelantado en la introduccin, el conocimiento
universal de la existencia de clulas iPS no tuvo lugar hasta finales del
ao 2007, cuando dos equipos, de forma independiente, de nuevo Yamanaka y de nuevo Thomson (el mismo que en 1998 haba obtenido las
primeras clulas troncales embrionarias humanas) consiguieron obtener
las primeras clulas troncales pluripotentes inducidas (iPS) a partir de
fibroblastos humanos. El laboratorio de Thomson opt por transformar
los fibroblastos humanos con cuatro genes, de los cuales dos eran distintos al grupo de genes usados anteriormente por el equipo japons y
tambin de expresin especfica en las clulas ES. En concreto, usaron
los genes OCT4 (tambin llamado OCT3/4), SOX2, NANOG y LIN28
para obtener las primeras clulas iPS humanas (22). Estas clulas iPS as
91
LLUS MONTOLIU
obtenidas las inyectaron intramuscularmente en ratones inmunodeficientes para derivar teratomas, tumores en los que pudieron comprobar la
aparicin de mltiples tipos celulares, de las tres hojas embrionarias,
confirmando as su pluripotencia (Figura 2).
F IGURA 2. Clulas troncales pluripotentes embrionarias (ES) y clulas troncales

pluripotentes inducidas (iPS). En este dibujo se presentan de forma esquemtica las funciones
ms importantes de estos dos tipos celulares. Las clulas ES (arriba) son una manifestacin
de la lnea germinal, la nica que se transmite a la siguiente generacin y la que va a dar
lugar, de nuevo, en los futuros individuos, a todos y cada uno de los tipos celulares que
conforman el organismo. Las clulas iPS (abajo) pueden obtenerse en principio a partir de
cualquier tipo celular somtico, mediante la reprogramacin inducida por varias
combinaciones de un reducido nmero de genes (se muestran las dos listas ms utilizadas
actualmente), son morfolgica y funcionalmente indistinguibles de las clulas ES, y como las
primeras, pueden dar lugar a todos y cada uno de los tipos celulares presentes en un individuo
adulto.
Prcticamente de forma simultnea, apareca el trabajo del grupo de

Yamanaka en el que demostraban que tambin ellos eran capaces de
reproducir sus resultados pioneros obtenidos en clulas de ratn ahora
92
CLULAS
en clulas humanas. En concreto, Takahashi y colaboradores nos mostraron que la modificacin de fibroblastos humanos con los homlogos
de los cuatro mismos genes usados en ratn, OCT3/4, SOX2, KFL4 y cMYC era suficiente para inducir clulas troncales pluripotentes inducidas (iPS) humanas (23).
Poco tiempo despus, a principios del 2008, un tercer laboratorio
demostraba que tambin era capaz de generar clulas iPS humanas a
partir de clulas somticas mediante un procedimiento de induccin
gentica con los mismos cuatro genes utilizados por el equipo japons
(24). En este caso, la novedad resida en la utilizacin de clulas somticas obtenidas tanto de clulas fetales, neonatales como procedentes de
adultos, de cultivos de clulas primarias de individuos adultos sanos, lo
cual demostraba que era igualmente posible derivar estas mismas iPS a
partir de individuos afectos de patologas. Tras demostrarlo en clulas
de ratn, el equipo de Yamanaka tambin logr derivar iPS humanas a
partir del uso de tres genes, excluido el C-MYC, con lo cual se evitaba
la tumorognesis asociada a este gen (19).
En clulas humanas, tambin se han explorado los mecanismos de
reprogramacin para minimizar el nmero de genes que es necesario
transferir, en combinacin con drogas que inhiban o bloqueen determinadas rutas metablicas o de sealizacin celular. En este sentido,
el equipo de Melton demostr que era posible obtener clulas iPS a
partir de fibroblastos humanos mediante la introduccin de OCT3/4 y
SOX2, y la exposicin de las clulas a un inhibidor de histonas deacetilasas (25).
La diversidad de tipos clulas somticos que pueden usarse para
generar las correspondientes clulas iPS no parece tener lmites. Muy
recientemente se ha descrito la obtencin de clulas pluripotentes inducidas a partir de clulas sanguneas humanas, linfocitos (26). De nuevo
se constata que las iPS generadas son indistinguibles morfolgica y
funcionalmente de las clulas ES. Tambin se han logrado obtener clulas iPS humanas a partir de clulas obtenidas de un pelo, de queratinocitos, en los que se ha constatado que la eficiencia del proceso es
mucho mayor que el proceso de reprogramacin que se consigue en
fibroblastos humanos (27).
93
LLUS MONTOLIU
POTENCIAL TERAPUTICO DE LAS CLULAS iPS

El potencial teraputico de estas clulas iPS es enorme. Si realmente
son indistinguibles de las clulas pluripotentes embrionarias, comportndose como ellas y dando lugar, mediante procesos de diferenciacin
celular, a cualquier tipo celular existente en el cuerpo, pueden ser la
fuente celular inagotable que necesitaba la medicina regenerativa, sin
mediar ni requerir el uso de embriones. Un esquema teraputico simple
podra ser el siguiente: una persona que padeciera una patologa congnita o degenerativa, que afecta principalmente a un tipo celular, podra
donar cualquiera de sus clulas adultas sanas para, mediante un procedimiento de induccin gentica, obtener clulas troncales pluripotentes
inducidas (iPS) a partir de las cuales derivar, mediante diferenciacin,
el tipo de clulas daadas o en degeneracin que se quisiera substituir
o reparar. Por un lado el procedimiento, sobre el papel, parece sencillo,
no requiere del uso de embriones y mantiene la identidad gentica de las
clulas, por lo que no se esperaran los problemas de rechazo que suscitaban el uso de las clulas troncales embrionarias, para lo cual se
dise el procedimiento, terico (solo comprobado en ratones) de la
clonacin teraputica (28).
En efecto, el grupo de Rudolf Jaenisch, adems de ser el primero que
verific, en un experimento pionero en ratones, que la clonacin teraputica era posible (28) fue el mismo quien, cinco aos ms tarde, en el
campo de las clulas iPS, puso a punto un procedimiento teraputico que
sirvi para confirmar, por vez primera, el potencial teraputico de estas
clulas troncales pluripotentes inducidas, en ratones (29). En este trabajo,
partiendo de un modelo experimental en ratones de anemia falciforme, se
obtuvieron clulas iPS de estos ratones, en cultivo se modificaron genticamente para corregir el defecto gentico asociado al gen de las beta
globinas, causante de la anemia falciforme, se seleccionaron y amplificaron las clulas iPS as modificadas, se diferenciaron estas clulas a clulas progenitoras de la sangre y, tras eliminar las clulas de la mdula sea
del ratn, se le reintrodujeron las nuevas, que reconstituyeron todo el
sistema inmune, y en particular dieron lugar a los nuevos eritrocitos, sin
la anemia falciforme, curando la patologa del animal (29).
En humanos, todava no se ha logrado un experimento teraputico
parecido, pero los resultados preliminares que van apareciendo apuntan
94
CLULAS
a que no tardar en producirse. Por ejemplo, el mismo equipo de Thomson, acaba de demostrar que es posible obtener cardiomiocitos funcionales a partir de clulas iPS obtenidas de clulas somticas humanas
(30), por lo que su potencial aplicacin para procedimientos de medicina regenerativa y uso de implantes celulares autlogos est ciertamente
a la vuelta de la esquina.
Otro de los campos activos de investigacin en clulas pluripotentes
est siendo la exploracin sobre si son necesarias las modificaciones
genticas, permanentes o transitorias, que permiten la reprogramacin
celular. Algunos estudios apuntan a que determinados tipos celulares
(como las clulas troncales de tsticulo, o espermatogonias), fuera de su
contexto, cultivados en el laboratorio en medios de cultivo especficos,
pueden comportarse como clulas pluripotentes sin necesidad de modificacin gentica alguna (31).
El uso de estrategias de reactivacin de los cuatro genes relevantes
para la reprogramacin celular que eviten el uso de vectores virales
integrativos, por su potencial peligro mutagnico, es, en clulas humanas, fuente constante de nuevas iniciativas y descubrimientos. Adems
del uso de vectores adenovirales o de la transfeccin repetida de plsmidos han aparecido estrategias elegantes que permiten eliminar los
virus portadores de los cuatro genes, una vez integrados y una vez
cumplida su funcin reprogramadora, mediante una sencilla recombinacin y escisin mediada por la recombinasa Cre (32). En el mismo
trabajo, el grupo de Jaenisch logra obtener clulas iPS a partir de fibroblastos de pacientes afectados por la enfermedad de Parkinson (32).
Otra estrategia novedosa recientemente publicada involucra el uso de
transgenes inducibles, bien de expresin directa o controlada por doxiciclina, que expresan los factores de reprogramacin y que pueden ser
eliminados, escindidos, mediante transposicin, utilizando las herramientas del sistema piggyBac (33, 34).
En conclusin, el potencial teraputico de las clulas troncales pluripotentes inducidas es enorme. Cunto de este potencial se convertir
en una realidad lo sabremos pronto. Todava quedan muchos interrogantes por contestar, a pesar de que en plazos muy cortos de tiempo se han
ido solventando barreras que parecan insalvables hace muy poco (evitar
el uso de c-Myc, evitar el uso de vectores retrovirales, evitar la modi95
LLUS MONTOLIU
ficacin gentica mediante la induccin de la reprogramacin utilizando

procedimientos qumicos, restringir la fase de pluripotencia a la estrictamente necesaria, para luego pasar a diferenciar estas clulas al tejido
destino que se pretenda substituir o reparar, etc). En poco ms de dos
aos de existencia, el campo de las clulas iPS ha producido casi un
millar de publicaciones, muchas de ellas pioneras, innovadoras, otras
tantas de tipo descriptivo o confirmando observaciones realizadas anteriormente, pero incluso estas ltimas son de extraordinaria relevancia,
pues dan la idea acertada de lo revolucionario, rompedor, sorprendente
del descubrimiento de Takahashi y Yamanaka, y tambin de su robustez, de su alto grado de reproducibilidad, en definitiva, de la credibilidad
y relevancia de todos estos estudios. La investigacin en clulas troncales pluripotentes pas por su punto ms bajo en 2006, por las razones
expuestas anteriormente, pero tras tocar fondo, rebot con una fuerza
inusitada, explot en 2007 y 2008 y sigue en su ascenso geomtrico,
meterico del que todos esperamos que pronto puedan derivarse realidades teraputicas que puedan compensar las enormes esperanzas que
estas investigaciones han suscitado entre pacientes afectados por enfermedades incurables o degenerativas, o en la sociedad en general.
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4.
Clulas madre neurales, neurognesis

y neuroproteccin
FLORA DE PABLO DVILA
RESUMEN
La medicina regenerativa aspira a utilizar terapias innovadoras, basadas en clulas, endgenas o implantadas, o bien en factores de proteccin
y estmulo celular administrados por procedimientos avanzados, incluyendo vectores gnicos. En el Sistema Nervioso (SN), la investigacin actual
sobre la presencia e identidad de clulas madre y de precursores neurales
incluye: su localizacin en el cerebro embrionario y adulto, las formas de
aislamiento y caracterizacin, el estudio de los factores de crecimiento
que estn implicados en su expansin, mantenimiento y diferenciacin
controlada en cultivo y, el fin ltimo, su activacin en el cerebro lesionado. Aqu se resumen los recientes avances en este rea, especialmente los
que permiten definir con precisin la caracterizacin de las clulas madre
del cerebro adulto de ratn, y el estado actual de posibles abordajes de
terapia celular en casos de enfermedad degenerativa del SN en humanos.
Junto a ello, comentaremos la contribucin de nuestro laboratorio a la
caracterizacin de la neurognesis en el bulbo olfatorio y algunos progresos en la neuroproteccin de la neurorretina.
ABSTRACT
Regenerative medicines goal is to use innovative therapies, based
either on endogenous or implanted cells or on factors that stimulate or
protect cells and which are administered by advanced procedures, inclu101
FLORA
DE
PABLO DVILA
ding genetic vectors. In the Nervous System, the recent research on the
presence and identity of Neural Stem and precursor cells, includes their
localization in the embryonic and adult brain, the isolation and characterization procedures, the study of growth factors implicated in the
maintenance, expansion, controlled differentiation in culture and, the
ultimate goal, their activation in the diseased brain. Here we will present
the recent advances in this field, especially those verifying precisely the
presence of neural stem cells in the adult mouse brain and possible
approaches that could use cell therapy in the case of neurodegenerative
diseases in humans. Additionally, we will summarize the contribution of
our laboratory to the characterization of neurogenesis in the olfactory
bulb and some progress in neuroprotection of the neuroretina.
INTRODUCCIN
La esperanza de vida de la especie humana se ha duplicado en el
ltimo siglo en el mundo occidental y, segn Naciones Unidas, en el ao
2035 la poblacin mundial mayor de 65 aos habr aumentado en un
135%. Como consecuencia del envejecimiento de la poblacin, las enfermedades degenerativas han sufrido un incremento notable, y continuarn en aumento. Las terapias convencionales farmacolgicas no logran detener o recuperar muchas de las disfunciones de rganos, debidas
a la muerte celular por dao crnico o degeneracin, especialmente en
tejidos con limitada capacidad autorreparadora como el corazn, el rin, el pncreas o el cerebro. Sin embargo, mientras que en los tres
primeros se puede recurrir al trasplante del rgano, cuando el fallo funcional amenaza la vida, hoy no podemos siquiera imaginar (fuera de la
ciencia-ficcin) un trasplante completo de cerebro.
Esta situacin hace que las investigaciones en posibles recursos
teraputicos basados en clulas directamente reparadoras del sistema
nervioso, o indirectamente estimulantes de su regeneracin, hayan experimentado un impulso espectacular en los ltimos aos.
El concepto de renovacin tisular en la etapa adulta de un organismo
ha comenzado a ser comprendido recientemente en toda su amplitud, y
tejidos que se crea eran fijos de por vida tras completar el desarrollo
embrionario, han resultado ser mucho ms dinmicos. As, el grupo de
102
CLULAS
MADRE NEURALES, NEUROGNESIS Y NEUROPROTECCIN
Frisn (1, 2) ha hecho un interesante anlisis sobre la edad de las clulas

en el organismo humano (aprovechando la contaminacin radiactiva del
ambiente y tratamientos con BrdU). Llama la atencin que el intestino
recambie sus clulas completamente cada 10.7 aos, y el msculo cada
15.1 aos. Dada la sensibilidad limitada de este original estudio, no se
encontr un recambio significativo de neuronas (en el cortex occipital y
el neocortex analizados), lo que sustentara el dogma biolgico mantenido durante la mayor parte del siglo pasado, de que en el Sistema
Nervioso Central (SNC) la produccin de nuevas neuronas en mamferos se restringa a la vida embrionaria y neonatal. Estos estudios no
analizaron otras zonas del cerebro, y aqu revisaremos los descubrimientos recientes sobre la biologa de las clulas madre y los precursores/
progenitores neurales, que han confirmado la capacidad de generacin
de nuevas neuronas en mamferos adultos, incluida la especie humana
(en localizaciones precisas como la zona subventricular o el hipocampo). Vamos a centrarnos en el SNC, especialmente en el cerebro, e
incluiremos la neurorretina. Repasaremos primero algunos datos histricos relevantes y clarificaremos la terminologa a utilizar.
Santiago Ramn y Cajal obtuvo el premio Nobel de Fisiologa o
Medicina en 1906 por su extraordinaria y documentada teora neuronal
de la organizacin anatmica del Sistema Nervioso. Inici la era moderna de las neurociencias, defini claramente el concepto de neurotrofismo e incluso sospech la existencia de clulas germinales neurales ms
all del periodo fetal (3,4). Sus descripciones meticulosas e interpretaciones precisas del desarrollo embrionario del Sistema Nervioso tienen
hoy total vigencia (Figura 1). No es cierto, sin embargo, que no se
generen nuevas neuronas tras completar el desarrollo en vertebrados,
como sostuvo Cajal.
Llev ms de 50 aos abrir el camino que nos va a permitir abordar
la neurorreparacin eficaz del SN daado por patologas neurodegenerativas, como la enfermedad de Parkinson, o una lesin de la mdula
espinal. En 1965, Altman y Das (5) presentaron evidencia cientfica de
neurognesis en el cerebro adulto, en el hipocampo de la rata. En 1983,
Nottebohm (6) mostr los cambios anatmicos cclicos de los ncleos
de control del canto en canarios. En 1992 se cultivaron por primera vez
progenitores/precursores neurales como neuroesferas (7). En 2001 se
adjudic una patente a NeuralStem (Gaithesburg, Maryland, EEUU)
103
FLORA
DE
PABLO DVILA
Figura 1. Evolucin de la fibra nerviosa. A) Clula germinal. B) Fase bipolar con iniciacin
de la maza cono de crecimiento (a). C) Fase de neuroblasto. D) Aparicin de las dendritas (b). E) Modelamiento de stas y formacin de las ramas nerviosas colaterales y terminales. (Tomado de S. Ramn y Cajal, ref. 3).
104
CLULAS
para un mtodo de aislar, propagar y diferenciar eficientemente en

cultivo, clulas madre neurales (NSC) de mamferos, incluidos humanos, para generar grandes cantidades de neuronas. Afirmaban ser capaces de producir distintos tipos neuronales con el objeto de ser usados
en terapia celular, terapia gnica, cribado de factores de crecimiento y
cribado de frmacos para enfermedades del Sistema Nervioso. En el
ao 2008 se ha comprobado que es ms fcil producir clulas pluripotentes inducidas (iPS, ver captulo 3) si en vez de partir de clulas
somticas, se parte de NSC (8).
Dado que hay cierta ambigedad en el uso de algunos trminos en
la literatura, aqu los usaremos con estas definiciones (9):
Clulas madre neurales (NSC): clulas con capacidad de autorrenovarse indefinidamente (aunque en sentido absoluto no pueda ser probado) y multipotentes, con el potencial de diferenciarse a fenotipos celulares maduros, neuronas y dos tipos de clulas
gliales, astrocitos y oligodendrocitos.
Precursores neurales: Usaremos este trmino de manera equivalente con el de Progenitores; son clulas neurales con capacidad
ms limitada de autorrenovacin y expansin, y con potencialidad para diferenciarse a pocos tipos neurales, a veces unipotentes. Seran Progenitores neuronales y progenitores gliales las
clulas comprometidas a diferenciarse slo a neuronas o a gla,
respectivamente. Los progenitores neuronales determinados a un
tipo de neurona concreto, seran la herramienta de sustitucin
ideal para tratar el SNC lesionado.
Neuroesferas: grupo o colonia de clulas formado en cultivo en
suspensin, altamente proliferativas en presencia de factores mitognicos (principalemente EGF y FGF), que contienen proporciones variables de NSC y precursores bi o unipotentes.
Neurognesis: proceso de diferenciacin celular que, a partir de
clulas neuroepiteliales, genera neuronas muy activamente durante el desarrollo embrionario, y de forma restringida durante la
vida adulta. En cultivo, la neurognesis y la gliognesis (generacin de clulas gliales) se pueden estudiar a partir de neuroesferas o de rodajas de tejido nervioso fetal cultivables a largo
y corto plazo, respectivamente.
105
FLORA
DE
PABLO DVILA
El estado que permite a las NSC en los tejidos adultos mantener el

potencial de autorrenovarse constantemente, aunque no sean clulas
proliferativas in vivo, es en cierto modo un estado de resistencia a
progresar a clulas diferenciadas (Figura 2). Adems de por sus carac-
EMBO Journal
FIGURA 2. Las clulas madre a lo largo del proceso de la diferenciacin. A) En el embrin,

el desarrollo de un linaje celular puede ser dibujado como una progresin lineal con aumento
gradual de la especializacin y prdida de ciertas opciones. Clulas de distintos estadios (SC,
clulas madre; PC, progenitores; DiC, clulas diferenciadas), pueden tener cierta capacidad
de autorrenovacin (indicado por flechas circulares) y el potencial de producir muchos tipos
de progenie (puntos de ramificacin en el linaje). B) Una visin distinta enfocada en la
retencin estable de las clulas madre en un punto a lo largo del proceso de diferenciacin.
La clula madre se mantiene en un punto del linaje debido al influjo del nicho en el que se
encuentra dentro del tejido, mostrado aqu como un salvavidas que le permite flotar en la
superficie. Es decir, la clula madre de los tejidos adultos es especial por tener una situacin
estable como en un estadio temprano del desarrollo. Muchas clulas en los tejidos pueden
tener cierta capacidad de autorrenovacin y ser multipotentes pero, si no estn retenidas,
invitablemente se hunden a su destino final (10).
106
CLULAS
tersticas intrnsecas, seran las caractersticas del nicho en el que residen, las que hacen a las clulas madre mantener accesibilidad transcripcional a una batera de genes; ello permite a las NSC retener su potencialidad de generar progenie con caractersticas diferenciadas (10). En el
proceso de diferenciacin progresiva hay una reprogramacin de mltiples genes que se reprimen, en tanto que muchos otros se activan.
En lugar de usar una definicin funcional de clula madre, hay autores que han tratado de definir este programa molecular de la stemness.
Por ejemplo, la va de las protenas hedgehog (Hh), adems de desempear un importante papel en el desarrollo embrionario, lo desempea tambin en el mantenimiento de las clulas madre del adulto (11, 12). Las
diversas funciones de esta va han sido recientemente revisadas de manera detallada en la monografa XXIV de la Real Academia Nacional de
Farmacia (13). Aunque los genes Oct 4 y Nanog han sido identificados
como genes especficos de las clulas madre embrionarias en varias especies (ver captulo 1), el anlisis del transcriptoma en estudios de micromatrices no ha logrado definir un programa gentico comn que controle
las propiedades de los diferentes tipos de clulas madre de tejidos adultos. Las seales extracelulares y rutas de sealizacin intracelular, que
parecen tener funciones importantes en mltiples linajes, son miembros
TABLA 1.
Resumen de las caractersticas funcionales que pueden distinguir las Clulas

Madre de los Progenitores neurales
(Adaptada de Ref. 9)
Caracterstica
Clulas Madre
Precursor/Progenitor
Autorrenovacin in vivo
Ilimitada; durante toda

la vida del organismo
Limitada; transitoria
Autorrenovacin in vitro
Ilimitada; mximo
nmero de duplicaciones
No llega al nmero mximo

de duplicaciones celulares
antes de transformarse
Potencialidad
Multipotentes para generar

neuronas, astrocitos
y oligodendrocitos
Generalmente bi
o unipotentes
Mantenimiento de la
Autorrenovacin y la
Multipotencialidad
No
107
FLORA
DE
PABLO DVILA
de las familias WNT, hedgehog, BMP y Notch (14). Tienen importancia

as mismo el FGF2-, EGF y otros factores de crecimiento. Puede verse
un completo poster sobre mecanismos moleculares e identidad de las clulas madre en los distintos tejidos en www.abcam.com/stemcells (15).
Entre las NSC y los precursores neurales hay solapamiento de expresin
de genes, como ocurre con la nestina, pero pueden ser distinguidos por la
diferente sealizacin en la ruta de Notch y, como se ha mencionado, por
algunas caractersticas funcionales (Tabla 1).
CMO Y DNDE SE ENCUENTRAN LAS CLULAS MADRE
Y LOS PROGENITORES NEURALES EN EL CEREBRO?
Los estudios en modelos animales que han permitido el mayor avance en el conocimiento de las NSC han utilizado generalmente el ratn
y menos la rata. Para analizar las caractersticas funcionales de las clulas candidatas a NSC, se diseca la regin del SNC de inters, se
disocian las clulas individuales y se exponen a la accin de factores
mitognicos. As se determina si las clulas de esa zona son capaces de
proliferar en suspensin como neuroesferas. Los cultivos resultantes
pueden ser manipulados para determinar la autorrenovacin y multipotencialidad. La disociacin de las neuroesferas en clulas individuales y
la nueva generacin de neuroesferas secundarias o de fenotipos celulares diferenciados, tras la retirada de mitgenos, es el procedimiento
habitual. La prueba de clonalidad, que demuestra que de una sola
clula procedente de una neuroesfera derivan los tres grandes tipos
neurales, neuronas, astrocitos y oligodendrocitos, es esencial para demostrar que la clula original era una NSC.
Para recapitular y modular los eventos celulares que pueden tener
lugar en condiciones de reparacin o regeneracin, es esencial conocer
bien los procesos fisiolgicos del desarrollo embrionario. Durante el
desarrollo temprano, son NSC las clulas neuroepiteliales, con caractersticas de gla radial, que tapizan la luz del tubo neural. En las etapas
embrionarias y fetales avanzadas, en distintas zonas del SNC hay proporciones variables de NSC y precursores neurales, que progresivamente van restringiendo su capacidad de diferenciarse (16). La neurognesis
adulta recapitula en parte el proceso de desarrollo neuronal, pero en el
entorno o nicho del SNC maduro. Las dos zonas del cerebro adulto
108
CLULAS
mejor conocidas en el modelo de ratn, donde est ampliamente confirmada la produccin de nuevas neuronas en la vida adulta, son: la zona
subventricular de las paredes del tercer ventrculo (SVZ, subventricular
zone) y la capa subgranular del giro dentado del hipocampo (17-19).
Tras una larga controversia, se ha confirmado en el ratn que las
clulas que funcionan como NSC, y generan nuevas neuronas que migran al Bulbo Olfatorio (BO) para reemplazar a las interneuronas de
manera constante, corresponden a las denominadas tipo B por el grupo
de Alvarez-Buylla. Esta es una subpoblacin de clulas que se dividen
lentamente y tienen la morfologa, ultraestructura y marcadores de astrocitos (20). Las clulas B, producen las de tipo C, que ya se dividen
rpidamente para producir, a su vez, las de tipo A o neuroblastos (y en
respuesta a una lesin producir tambin oligodendrocitos). Estos neuroblastos migran tangencialmente en cadenas que convergen formando la
corriente migratoria rostral (RMS, rostral migratory stream), que llega
al BO (Figura 3). Dentro del BO, los neuroblastos o neuronas jvenes
maduran en varios subtipos de interneuronas (21). La diversidad de
estas interneuronas contribuye a la plasticidad de los especializados
circuitos olfativos postnatales (19).
El nicho neurognico de la SVZ es complejo. Recientemente se ha
observado su estructura con gran detalle, y se ha visto que las NSC de
tipo B forman una arquitectura en rueda, donde su proceso apical
central toca el ventrculo, y est rodeado de clulas ependimales (22).
Por su parte, las clulas ependimales que tapizan los ventriculos laterales son quiescentes, y finalmente parece probado que no contribuyen a
la neurognesis en el ratn adulto en condiciones normales. Dan lugar,
sin embargo, a neuroblastos que llegan al BO tras producirse un dao
isqumico, lo que les convierte en un reservorio con potencial reparador
(23). Tambin pueden ser activadas las clulas ependimales cuando la
sealizacin de Notch se interrumpe. Este hallazgo es importante porque
indica que hay clulas sin las caractersticas de NSC que pueden ser
reclutadas para fases reparadoras iniciales tras una lesin, y que hay
posibilidades de cambiar el potencial de los distintos precursores y clulas neurales mediante manipulaciones moleculares (23-26).
La demostracin de la existencia de neurognesis en el cerebro
humano a partir de una subpoblacin de astrocitos, clulas B, se ha visto
109
FLORA
DE
PABLO DVILA
FIGURA 3. Zona Subventricular (SVZ) y ruta al bulbo olfatorio (OB). Representa una de las
pocas reas neurognicas constitutivas en el cerebro adulto, que en seccin sagital de ratn,
se muestra en el centro. La flecha indica la migracin tangencial de los neuroblastos (puntos
morados) hacia el OB. Las nuevas neuronas reclutadas reemplazan continuamente a las
interneuronas locales. El panel a la derecha muestra las conexiones nerviosas dentro del OB.
La actividad de las neuronas de proyeccin en el OB tiene lugar a travs de dos poblaciones
de interneuronas: las periglomerulares (PGC) y las granulares (GC) (ambas en morado) y
clulas de axon corto (en rojo). El panel de la izquierda muestra el nicho neurognico. Aqu,
la proliferacin tiene lugar en las paredes del ventrculo lateral (LV), en donde las clulas
madre (en verde, clulas tipo B) se dividen para generar las clulas que se amplifican
transitoriamente (en marrn, tipo C), que a su vez dan los neuroblastos (en morado, clulas
tipo A) que son los que migran en la corriente migratoria rostral (RMS en el panel inferior)
hasta su destino final en el OB, donde se diferencian en interneuronas (19).
complicada porque la estructura y organizacin de los ventrculos laterales humanos difieren de las de los roedores. Desde la Universidad de
Valencia, Garca Verdugo ha contribuido notablemente a la identificacin de esta subpoblacin como NSC en humanos, utilizando la microscopia electrnica (http://www.uv.es/garciajm/). Es posible, sin embargo,
que la corriente migratoria rostral hacia el BO no tenga los lmites
definidos hallados en ratn (27).
110
CLULAS
Respecto al hipocampo, hay asimismo estudios de trazado gentico,

ablacin farmacolgica, anlisis inmunohistoqumico acoplado a microscopa confocal y de ultraestructura que sugieren que el tipo especial de
astrocitos GFAP+, SOX2+, con ciertas caractersticas de gla radial, es la
NSC adulta de la zona subgranular del giro dentado del hipocampo (18,
28, 29). Las nuevas neuronas migran localmente a la capa granular interna, posiblemente por migracin radial. Entender cmo las neuronas de
reciente generacin sobreviven, migran, generan dendritas y forman sinapsis en los circuitos existentes ha requerido complejos estudios utilizando retrovirus para datar la fecha de nacimiento de las neuronas y probar
la implicacin de distintos genes (NR1, DISC) en el proceso (30-32).
Quedan muchos aspectos an sin conocer en cuanto a la sinaptognesis
de las nuevas neuronas generadas en el adulto, y en cuanto a su capacidad de movilizacin hacia reas distantes del origen. La neurognesis en
la SVZ (33) y el hipocampo humano est siendo actualmente abordada
tambin por otras tcnicas, incluyendo estudios de neuroimagen in vivo
(34).
PAPEL DE LOS FACTORES DE CRECIMIENTO EN LA
PROLIFERACIN Y DIFERENCIACIN DE LAS NSC
La sealizacin por factores de crecimiento es el principal mecanismo para regular la proliferacin durante la neurognesis, tanto in vivo
como en los modelos de NSC estudiados en cultivo. Se ha demostrado
el efecto de los FGF, EGF, neurregulinas, factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), factor de crecimiento derivado del epitelio pigmentario (PEDF) y algunos neurotransmisores como GABA (35, 36).
Los nucletidos purinas actuan como seales proliferativas para progenitores neurales y, por tanto, regulan negativamente la diferenciacin
neuronal terminal en la SVZ de rata (37). La familia de citoquinas
neuropoyticas, particularmente LIF y CNTF, promueven el mantenimiento de las NSC en el adulto (38), y pueden ser parte de las seales
puestas en marcha en respuesta a lesiones neurales. El ratn deficiente
de reelina, protena de la matriz extracelular que se une a receptores
VLDR y ApoER expresados por neuronas, tiene disminuidas las poblaciones de NSC del hipocampo y el BO, pero la poblacin de la SVZ es
normal. Esto sugiere que la falta de reelina endgena altera la migracin
111
FLORA
DE
PABLO DVILA
de las NSC que han proliferado en la SVZ. De hecho, las NSC humanas
inyectadas en el ventrculo lateral, migran y se diferencian en un ratn
silvestre pero no lo hacen en el deficiente en reelina (39). Muchos otros
factores, neurotrofinas, neuropptidos y neurotransmisores ayudan a las
clulas madre a decidir su destino y a alcanzarlo, y este conocimiento
es esencial para poder plantearse futuros usos teraputicos (40).
En nuestro laboratorio, hemos estudiado el papel de los factores de
crecimiento insulina-like, especialmente el IGF-I, en una poblacin de
clulas que residen en el BO antes de la llegada de la corriente migratoria
rostral. Reunen las caractersticas de NSC y se encuentran en el embrin
FIGURA 4. Generacin de neuroesferas a partir de NSC del Bulbo Olfatorio de ratn

embrionario. Los bulbos olfatorios (B.O.) de embriones de ratn a los 14,5 das de desarrollo fueron disecados del cerebro (plano de seccin indicado por la lnea horizontal) y las
clulas fueron disociadas y cultivadas. El primer da del cultivo en presencia de EGF y FGF2
ya se observaron clulas dividindose (flecha blanca). En el da 3 se observaron agregados
celulares que formaban pequeas neuroesferas; estas crecan de tamao rpidamente, especialmente si a los factores mitognicos anteriores se le aada IGF-I (41). NSC, Clulas
madre neurales.
112
CLULAS
de ratn de 12.5-14.5 das (Figura 4). Las clulas aisladas, eran ms del
99% positivas para el marcador nestina y proliferaron en cultivo formando neuroesferas al menos durante 150 duplicaciones celulares. Hemos
demostrado que el IGF-I colabora con el FGF2 y el EGF para promover
la proliferacin de las NSC y precursores, as como la formacin de neuroesferas. En ausencia de IGF-I endgeno, el BO de ratn muestra un
desarrollo anormal de la capa de neuronas mitrales y de la gla radial. En
los cultivos preparados a partir de ratones IGF-I-/-, el porcentaje de neuronas, astrocitos y oligodendrocitos generados a partir de NSC fue marcadamente ms bajo que en ratones normales (41). Estos resultados mostraron que el IGF-I es un factor de crecimiento endgeno que regula la
diferenciacin de las NSC y otros precursores en el BO en desarrollo. Uno
de los genes implicados en el mantenimiento del estado indiferenciado y
el control de la autorrenovacin en NSC/precursores de BO es la ligasa
Ring1B, de la familia de genes Polycomb (42).
En el ratn postnatal, el IGF-I regula tambin la migracin de clulas
que salen de la corriente migratoria rostral y la salida de neuroblastos
desde la SVZ, y su posicionamiento en el BO (resultados no publicados,
comunicacin personal de C. Vicario Abejn, Instituto Cajal, Madrid). La
migracin y diferenciacin de las neuronas derivadas de progenitores/
NSC de bulbo olfatorio adulto est tambin estimulada por el FGF2 (43).
El IGF-I aumenta los niveles de la protena fosforilada AKT in vitro e in
vivo, ruta de diferenciacin que implica a la PI3K y que frena la fosfatasa
PTEN (44). Otros autores han aislado clulas progenitoras neurales en el
BO humano adulto (45, 46) y demostrado que la delecin condicionada
de PTEN aumenta la neurognesis constitutiva, aumentando el tamao del
BO y mejorando la funcin olfativa (47). Nuestro modelo de neurognesis en el BO se resume en la Figura 5.
113
FLORA
DE
PABLO DVILA
Figura 5. Modelo de neurognesis a partir de NSC de Bulbo Olfatorio de ratn. Despus

de pases mltiples en condiciones de proliferacin formando neuroesferas (descrito en la
Figura 4), la retirada de los factores EGFy FGF2 promovi el inicio de un programa de
diferenciacin en clulas con los marcadores caractersticos de neuronas (52%), astrocitos
(25%) y oligodendrocitos (4%). Estudios realizados con clulas de BO de un ratn carente
de IGF-I indicaron que este factor es necesario para la diferenciacin de NSC de ese origen
(41). El IGF-I sealiza este proceso por una ruta que implica a las quinasas PI3K y AKT y
que est modulada por la fosfatasa PTEN (44). NSC, Clulas madre neurales.
APROXIMACIONES REGENERATIVAS Y
AUTORREGENERATIVAS COMO POSIBLES TERAPIAS
EN EL SNC
Al tener el SNC menor potencial regenerador que otros tejidos, la
terapia reparadora de disfuncin celular por lesin, isquemia o degene114
CLULAS
racin, tiene que incluir un doble abordaje: terapia sustitutiva con precursores neurales y terapia antidegenerativa o neurotrfica.
Comenzando por la posibilidad de utilizar clulas madre embrionarias (ESC) como fuente de precursores neurales, cabe preguntarse si esta
herramienta plantea todava muchos interrogantes en cuanto a su comportamiento para poder iniciar ensayos clnicos reglados (48). El que
estas clulas se dividan tan activamente es el aspecto ms negativo para
su traslado a la clnica, por el riesgo de produccin de tumores. El efecto
de trasplantar unas clulas con demasiado potencial de expansin, como
son por definicin las ESC, podra causar una proliferacin anormal
irreversible. El clculo del riesgo de la terapia celular depende mucho
del tipo de clulas que se usen y cmo se cultiven antes del trasplante.
Para el SNC se necesitarn progenitores ms flexibles que las neuronas
diferenciadas, aunque stas sean ms fciles de separar de las NSC.
Har falta amplia evidencia de eficacia en modelos animales de enfermedades humanas (49), que en algunos casos debern incluir animales
grandes o primates, no solo roedores. El modo de administracin de las
clulas, es tambin importante porque influye en la seguridad y la eficacia. Llegar a utilizar clulas progenitoras para tratar enfermedades del
cerebro, la retina o la mdula espinal (50) con la seguridad y eficacia
que hoy se utilizan precursores/progenitores hematopoyticos para reconstituir el sistema inmune (ver captulo 2), llevar tiempo.
Entre las enfermedades neurodegenerativas, es quiz la de Parkinson
la que podra beneficiarse antes de la terapia celular en sus diferentes
aproximaciones. Esta enfermedad es una alteracin progresiva del control
motor y la funcin cognitiva que afecta aproximadamente al 2% de las
personas de ms de 65 aos. Est causada por la muerte de neuronas productoras de dopamina, por causas desconocidas, en la regin del cerebro
llamada substantia nigra. La consecuencia es que llega menos dopamina a las neuronas diana del estriado. La estrategia de reemplazar las neuronas perdidas se inici en los aos 1980 del siglo pasado, cuando se
autotrasplantaron clulas liberadoras de dopamina de las glndulas suprarrenales a pacientes con Parkinson (51-53), con modestos resultados. El
NIH (National Institutes of Health de EEUU) financi dos ensayos clnicos bien controlados, que han durado ms de una dcada, trasplantando
tejido de fetos abortados al estriado, con resultados muy desiguales. Slo
los pacientes ms jvenes y con enfermedad leve respondieron relativa115
FLORA
DE
PABLO DVILA
mente bien al trasplante; se observ por PET-scan que algunas de las

neuronas productoras de dopamina haban sobrevivido y madurado. La
composicin celular exacta en estos tejidos fetales trasplantados no se
conoce. El objetivo actual en este rea es generar NSC y precursores
que puedan crecer en grandes cantidades y diferenciarse eficientemente a
neuronas dopaminrgicas que funcionen tras el trasplante (54-56). Se han
generado ya neuronas dopaminrgicas a partir de ESC (57) y se han aislado del cuerpo carotdeo precursores (en este caso, parte del sistema
nervioso perifrico) con capacidad de producir dopamina (58).
Las nuevas clulas iPS pueden ser la alternativa ms til para tratar
de obtener neuronas dopaminrgicas, entre otras. Se acaba de demostrar
en un modelo de Parkinson de rata que, a partir de una seleccin de
clulas derivadas de iPS de ratn, excluidas las pluripotentes, y tras ser
trasplantadas, se diferenciaban a dopaminrgicas, se integraban y mejoraban los sntomas (59).
Un paso muy importante respecto a la reprogramacin a clulas iPS,
acaba de darse cuando escribimos este artculo (marzo de 2009), al lograrse transformar clulas de la piel de pacientes con Parkinson en neuronas
productoras de dopamina, habiendo sido capaces de escindir los lentivirus que se usaron para introducir los cuatro genes reprogramadores (60).
Estas clulas sern un gran modelo para estudiar su respuesta a factores
exgenos como estrs oxidativo y neurotoxinas, y as entender mejor qu
ha llevado a la neurodegeneracin en esos pacientes concretos.
La esclerosis lateral amiotrfica (ALS) es una enfermedad neurodegenerativa progresiva fatal, en la que mueren motoneuronas de la mdula espinal y tronco del encfalo, causando prdida del control muscular y parlisis que lleva a la muerte. Se han utilizado diferentes fuentes
de progenitores para intentar restaurar la actividad de las motoneuronas.
As, clulas germinales embrionarias humanas fueron inyectadas en el
lquido cefalorraquideo de ratas parcialmente paralizadas, y unas pocas
clulas maduraron a neuronas, acompandose de mejora en el movimiento (61). Se ha iniciado recientemente un ensayo clnico fase I en
nuestro pas de autotrasplante de clulas aisladas, de mdula sea, a la
mdula espinal de pacientes afectados de ALS (comunicacin personal
del Prof. Salvador Martnez, Universidad Miguel Hernndez de Alicante). Veremos otras estrategias interesantes para abordar esta enfermedad
en el apartado siguiente.
116
CLULAS
En cuanto a las lesiones medulares, parciales o totales, que dejan

frecuentemente al paciente parapljico o tetrapljico, afectan a pacientes
jvenes, dado que su causa suele ser accidentes de trfico o deportivos;
se calcula que pueden producirse anualmente de 15 a 40 millones en el
mundo (62). Muchos estudios en roedores han indicado un beneficio
tras el trasplante de variados tipos de clulas madre y precursores pero
son difciles de comparar por ser diversos los modelos, el protocolo de
trasplante y los tipos de clulas utilizadas (62). En los casos en los que
se han trasplantado NSC o precursores neurales o gliales, se ha visto que
hay efecto beneficioso, aunque las clulas identificadas como derivadas
del trasplante son en mayor nmero astrocitos que neuronas u oligodendrocitos (63, 64). Clulas madre neurales humanas sacadas de cerebros
fetales y crecidas como neuroesferas, consiguieron sobrevivir tras el
trasplante al ratn con lesin medular, y formar neuronas y oligodendrocitos. Incluso se detectaron nuevas sinapsis por ME entre nuevas neuronas y las del hospedador, sin aumentar la cicatriz glial (65).
Lamentablemente, bastantes pacientes con lesin medular han recibido trasplantes de varios tipos de clulas madre fetales y adultas, especialmente de mdula osea, y a pesar del limitado conocimiento sobre
como pueden promover la regeneracin de la mdula espinal, ya se
estn ofreciendo comercialmente en clnicas privadas (por ej. en www.
stemcellschina.com). Se han iniciado ensayos clnicos en fase I para
comprobar la seguridad (66), y un grupo de cientficos independientes
evalu en China alguno de estos tratamientos a pacientes, y no encontr
ningn efecto positivo tras la inyeccin de clulas sacadas de cerebros
de fetos abortados en ese pas (67). Recientemente, se ha planeado un
anlisis en profundidad por un consorcio internacional (68) que confiamos deje aclarados algunos aspectos esenciales de estas terapias.
La neurorretina es una parte del SNC que contiene fotorreceptores
tipo cono y tipo bastn sensibles a la luz. La prdida de estas clulas en
muchas enfermedades retinianas causa ceguera. Dada su accesibilidad
en el ojo, podra ser uno de los primeros lugares del SNC donde el
trasplante de precursores neurales pudiera abordarse en la clnica. Hasta
recientemente, no haba ejemplos que mostraran en modelos animales
que clulas madre derivadas de cerebro o retina se hubieran integrado
en la capa nuclear externa, y se hubieran diferenciado correctamente en
fotorreceptores. En 2006, sin embargo, se public un estudio en ratn
117
FLORA
DE
PABLO DVILA
que aislaba los progenitores de la propia retina entre da postnatal (P)1

y P7, en el momento del pico de produccin de conos en el ratn.
Utilizando estas clulas para trasplantes subrretinianos, tanto a ratones
normales como a los modelos de retinosis pigmentaria, se obtuvo integracin y diferenciacin a conos. No obstante, la recuperacin de la
funcin visual fue muy limitada, en los casos de degeneracin retiniana
por falta de la proteina Rho (69, 70). Hay un reciente estudio trasplantando fotorreceptores derivados de ESC humanas a un modelo de ceguera congnita de Leber en ratn, que muestra cierta mejora a la respuesta
a la luz (71).
El progreso en entender la biologa de las clulas madre, en obtenerlas de distintos orgenes y manipularlas para hacerlas tiles para trasplantes, ha sido muy importante en los ltimos aos. Sin embargo, estamos muy lejos todava de poder proponer una terapia celular, mediante
implantacin de clulas exgenas, en patologa difusas como la enfermedad de Alzheimer; o de saber dirigir las NSC a un tipo especializado
como fotorreceptores funcionales. An tenemos otros desafos importantes, como es reclutar las clulas madre neurales endgenas.
RECLUTAMIENTO Y ACTIVACIN DE CLULAS MADRE
ENDGENAS Y NEURORREPARACIN POR FACTORES
DE CRECIMIENTO
Saber cmo activar las propias clulas madre del SNC para que ste
se autorrepare en caso de patologa, es un rea de investigacin todava
en sus comienzos. Mucho menos explorada que la utilizacin de los
trasplantes, es una estrategia necesaria dentro de la terapia personalizada
y regenerativa hacia la que vamos caminando. En teora presenta menos
problemas de aplicacin clnica que el trasplante de clulas con capacidad proliferativa, tendra algo menos riesgo de producir tumores (aunque un exceso de factores de crecimiento tambin los puede propiciar)
y podra ser menos invasiva.
Las clulas madre activadas, sean trasplantadas o endgenas, son
herramientas de reparacin no slo por su capacidad de convertirse en
elementos estructurales tiles (neuronas con sinapsis maduras integradas
en el tejido afectado), sino por su capacidad de secretar factores de
118
CLULAS
crecimiento o neurotrficos, ya sea utilizando progenitores neurales u

otras clulas manipuladas genticamente para producir localmente este
tipo de factores.
Esta forma de tratamiento es, adems, complementaria a la administracin de factores neurotrficos directamente en el tejido o en los humores que le baan. En todos los casos, el objetivo de los factores
neurotrficos es evitar la muerte de clulas deterioradas y facilitar la
reconexin de circuitos neuronales.
En la enfermedad de Parkinson, en un modelo de rata, la inyeccin
de TGF- indujo la proliferacin de clulas que migraban al rea daada (72). La presencia de neurognesis en la substantia nigra adulta es
controvertida, y los estudios, en varios modelos de parkinsonismo en
ratn y rata, no dan una respuesta definitiva a si las NSC endgenas
pueden ser manipuladas y redirigidas para convertirse en neuroblastos
que migran a la zona anormal (56). En cuanto al tratamiento con factores neurotrficos aplicados directamente, en 2003 se inici en el Reino
Unido el primer ensayo clnico utilizando GDNF para tratar pacientes
con Parkinson avanzado. Se administraba directamente en el cerebro
mediante una minibomba implantada. Los resultados tras dos aos fueron esperanzadores, con mejora en la disquinesia y ausencia de efectos
secundarios importantes. Sin embargo, en 2005, Amgen Inc., que patrocinaba los ensayos clnicos con GDNF, decidi pararlos porque en uno
de los ensayos no se encontraron beneficios. Hubo protestas de algunos
investigadores por esta interrupcin del ensayo clnico, y parte de ellos
decidieron continuar los tratamientos iniciados (73-75).
Respecto al tratamiento de ALS, ya hay modelos animales utilizando NSC modificadas genticamente para liberar factores neurotrficos,
que seran como minibombas biolgicas de liberacin in situ. Suzuki
y cols. modificaron NSC humanas para liberar GDNF, y tras ser trasplantadas a un modelo de rata, se obtuvo buena migracin celular a
zonas degeneradas de la mdula espinal, junto a una adecuada liberacin
de GDNF y mayor supervivencia de motoneuronas, aunque no hubo
mayor inervacin muscular (76).
En las lesiones medulares tambin se han utilizado NSC modificadas genticamente para producir GDNF (77), y para producir Neurogenina 2, un factor de transcripcin implicado en diferenciacin a linajes
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neurales (78), con variables resultados, ya que causaban alodinia. No

esta claro todava si es posible modular las NSC in situ para promover la recuperacin, ya que hay an poca informacin sobre la presencia
de clulas madre de mdula espinal (62). En nuestro pas, se estan
aislando clulas ependimales de la mdula espinal con caractersticas de
clulas multipotentes, que si proceden de animales con la mdula lesionada proliferan mejor, y dan mejores resultados tras el trasplante en
ratn (79).
La posibilidad de poder derivar iPS del propio paciente lesionado
medular, en un futuro queda abierta, pero el tipo de lesin aguda requerira actuar ms rpido de lo que esta tcnica posibilita por ahora. Habr
que recurrir a clulas heterlogas, preferentemente progenitores neurales, manipuladas para producir factores neurotrficos y almacenarlas en
Biobancos, cuando se solucionen los problemas de eleccin de vectores
y de multiplicacin descontrolada (62).
Las tecnologas de aplicacin son tambin importantes; al cerebro se
llega mal por va sistmica. Hay la posibilidad de introducir molculas
por va nasal, va intraocular para el caso de enfermedades de retina, y
de hacer inyecciones intraventriculares o intraparnquima cerebral, pero
que son mucho ms invasivas.
LA NEURORRETINA EN DESARROLLO Y LECCIONES
TILES PARA EL TRATAMIENTO NEUROPROTECTOR
EN LA RETINOSIS PIGMENTARIA
La muerte celular es un proceso que, junto a la proliferacin y la
diferenciacin, tiene que funcionar al nivel adecuado para la construccin normal del SNC; y es tambin una caracterstica final de muchos
procesos neurodegenerativos. Conocer los mecanismos de muerte y de
neuroproteccin durante el desarrollo ha ayudado a nuestro grupo a
entender su desrregulacin en condiciones patolgicas en el adulto (80,
81). Hemos demostrado que la muerte celular programada, con caractersticas de apoptosis, est muy finamente regulada y ocurre en etapas
tempranas del desarrollo, desde la neurulacin y etapas proliferativas de
neurognesis en la retina. Hemos caracterizado el papel relevante de
molculas como c-Raf (82) o HSC 70 (83) y, especialmente, el de la
120
CLULAS
proinsulina, protena precursora de la insulina (84). Nuestro conocimiento de los efectos neuroprotectores durante el desarrollo de la proinsulina, nos llev a plantearnos la posibilidad de que fuera un factor
protector de supervivencia celular en una patologa neurodegenerativa
sin tratamiento en el momento actual.
La Retinosis Pigmentaria es una enfermedad rara (afecta al 2,5 por
10.000 de poblacin). Est causada por cualquiera de una larga serie de
mutaciones en distintos genes, y que comienza en la etapa juvenil y
conduce a la ceguera. En el modelo de ratn rd10, la degeneracin de
los bastones empieza en las primeras semanas postnatales, a los dos
meses la degeneracin ha afectado tambien a conos y el ratn presenta
electrorretinograma plano, es decir, es funcionalmente ciego. En nuestros primeros experimentos, provocamos un aumento de la proinsulina
circulante mediante el cruce del ratn rd10 con un ratn transgnico que
produca proinsulina de manera constitutiva en el msculo, la cual era
transportada por sangre y llegaba al ojo. Comprobamos que estos mayores niveles de proinsulina retrasaban significativamente la degeneracin de fotorreceptores en el ratn afectado (Figura 6), permitiendo el
mantenimiento durante varias semanas adicionales de la actividad elec-
FIGURA 6. Efecto protector de la Proinsulina sobre fotorreceptores. La degeneracin de

fotorreceptores en retina de ratn P30, en el modelo de Retinosis Pigmentaria rd10, se
observa por la disminucin de bastones (capa de ncleos azules entre lneas) y la disminucin de conos (marcados en verde), respecto al ratn silvestre. El aumento de niveles de
hPI-proinsulina humana (en este caso inducido por transgnesis) protege a los fotorreceptores y retrasa su degeneracin (85).
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trorretinogrfica (85). Este hallazgo ha dado lugar a la presentacin de

una patente y a que la EMEA (European Medicines Agency) y la FDA
(Food and Drug Administration, de EEUU) hayan concedido la denominacin de medicamento hurfano a la proinsulina, en su relacin con el
posible tratamiento en humanos de la Retinosis Pigmentaria. Adems,
hemos fundado una spin-off ProRetina Therapeutics, S.L. que tiene
por objeto desarrollar terapias neuroprotectoras, celulares o gnicas para
esta enfermedad. Muy recientemente, Punzo y cols. (86) han demostrado que la estimulacin de la ruta de sealizacin de insulina/mTOR
retrasa la muerte de conos en un modelo de Retinosis Pigmentaria.
Claramente, las terapias con factores neurotrficos pueden ser complementarias y sinrgicas con las terapias celulares utilizando precursores neurales en diversas patologas. El SN en desarrollo debe ser nuestra
fuente de conocimientos bsicos para reconstituir el sistema cuando falla
en la edad adulta.
CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS
Como la empresa biotecnolgica espaola Cellerix, enfocada a
terapias celulares, afirma, estamos hoy explorando el uso de living
medicines, en contraposicin con la farmacologa convencional que
utiliza productos qumicos. Aunque estemos an lejos del uso de clulas
como terapia rutinaria o, al menos, como complemento significativo a
la sustitucin de un rgano completo por trasplante, el avance es, confiamos, imparable. Dada la compleja naturaleza del SNC es, sin embargo, un desafio mayor que en otros tejidos, el administrar terapia celular
directamente en el cerebro. Deben incluirse entre nuestros objetivos:
Seguir investigando todas las lneas abiertas, la biologa de las
clulas madre embrionarias, las fetales o neonatales y las adultas
las residentes en el cerebro y reactivadas, y las reprogramadas
a neurales a partir de otras clulas somticas, las prometedoras
iPS.
Explorar terapias combinadas: trasplantes autlogos y heterlogos de clulas progenitoras o diferenciadas en cultivo, implantes
de vehculos celulares que liberen factores neuroprotectores,
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CLULAS
implantes con materiales biocompatibles o vectores gnicos que

aporten molculas protectoras, terapias estimuladoras (elctricas
u otros tipos de energa) de la autorregeneracin, etc.
El avance es necesario y ser fascinante recorrer el camino, pero
habr que tener una regulacin exigente para estas terapias, y no correr
riesgos injustificados en su traslado a la clnica.
AGRADECIMIENTOS
A lo largo de la ltima dcada he aprendido el significado de las
clulas madre y ampliado conceptos en el rea de la neuroproteccin,
gracias al trabajo de muchos colaboradores y colaboradoras en el laboratorio. Quiero agradecer especialmente al Dr. Carlos Vicario Abejn
por aportarnos el sistema y conocimientos bsicos a nuestro grupo, utilizando clulas madre de bulbo olfatorio, y al Dr. Enrique J. de la Rosa
su continua contribucin a la parte ms celular del trabajo del equipo,
y su liderazgo en nuestra nueva faceta de transferencia de resultados. A
ambos les doy tambin las gracias por sus acertados comentarios sobre
este manuscrito. La investigacin del grupo aqu citada ha sido financiada por el Ministerio de Ciencia e Innovacin (SAF2007-66175 a EJ de
la R y BFU2007-61055 a F de P).
ABREVIATURAS
ALS, Esclerosis Lateral Amiotrfica (Amiotrophic Lateral Sclerosis); BMP, Protena Morfogentica de Hueso; BO, Bulbo Olfatorio;
BrdU, 5-Bromo-2 deoxiuridina; CNTF, Factor Neurotrfico Ciliar;
EGF, Factor de Crecimiento Epidrmico; ESC, Clulas Madre Embrionarias (Embryonic Stem Cells); FGF, Factor de Crecimiento de Fibroblastos; GDNF, Factor Neurotrfico Derivado de Gla; IGF-I, Factor de
Crecimiento Insulina-like I; LIF, Factor Inhibidor de Leucemia; iPS,
Clulas Madre Pluripotentes Inducidas (induced Pluripotent Stem cells);
ME, Microscopa Electrnica; NSC, Clulas Madre Neurales (Neural
Stem Cells); NR1, Neurregulina I; PI3K, Fosfatidil Inositol-3-Kinasa;
PEDF, Factor de Crecimiento Derivado del Epitelio Pigmentario; PET,
123
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Tomografa de Emisin de Positrones; PTEN, Fosfatasa homloga de

Tensina; RMS, Corriente Migratoria Rostral (Rostral Migratory Stream);
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70.
71.
72.
73.
74.
75.
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77.
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130
5.
Envejecimiento de las clulas madre

MARA CASCALES ANGOSTO
RESUMEN
El envejecimiento es el resultado del descenso replicativo de las
clulas madre adultas, cuya funcin es el mantenimiento y reparacin de
los tejidos. La doble capacidad de autorrenovacin y diferenciacin de
estas clulas est controlada por interaccin directa con un microambiente especfico el nicho. Las clulas madre adultas son la fuente de
reemplazo de las clulas daadas o destruidas durante la vida del organismo. El descenso en la proliferacin y funcin de las clulas madre va
unido al incremento en la expresin de p16INK4a, un inhibidor de las
quinasas dependientes de ciclina, que se asocia con la senescencia.
Muchas de las situaciones patolgicas de la senectud, son consecuencia
del desequilibrio entre la perdida y la renovacin tisular. Por tanto, los
fenmenos asociados a la edad pueden interpretarse como signos de
senescencia de las clulas madre adultas, lo que sugiere que un organismo es tan viejo como lo son sus clulas madre.
Palabras clave: Clulas madre adultas. Envejecimiento.
ABSTRACT
Aging results from a replicative decline in adult stem cells, whose
function is the maintenance and repair of tissues. The dual ability for
self-renewal and multilineage differentiation of these cells is controlled
by direct interaction with a specific microenvironment, the stem cell
niche. Adult stem cells are the source for replacing cells damaged or
131
lost during the entire life of an organism. The decline in adult stem cell
proliferation and function correlates with the increased expression of
p16INK4a, a cyclin-dependent kinase inhibitor, linked to senescence. Many
of the pathological conditions affecting the elderly are the consequence
of an imbalance between cell loss and tissue renewal. Hence, aging
phenomena can be interpreted as signs of aging at the level of somatic
stem cells which suggests that a human body is as old as its stem cells.
Key words: Adult stem cells, aging.
INTRODUCCIN
El envejecimiento es un proceso complejo que afecta a cada clula
y cada rgano y conlleva el deterioro de las funciones del organismo. La
menor capacidad de regeneracin de los rganos y tejidos, y la mayor
propensin a infecciones y al cncer, son los rasgos prominentes de la
senectud. Entre las caractersticas tpicas de la senectud, que definen el
declinar de la funcin e integridad del organismo, est el envejecimiento
de los compartimentos de las clulas madre y de las clulas progenitoras, que va unido a una reducida capacidad replicativa y, como consecuencia, de la capacidad regeneradora de los tejidos. La evidencia que
asocia la disfuncin de las clulas madre a las condiciones fisiopatolgicas que acompaan al envejecimiento, tiene su base en los mecanismos implicados en la funcin disminuida de estas clulas, lo cual contribuye de manera importante a la patognesis de la enfermedad (1-6).
Aunque el envejecimiento es uno de los procesos ms reconocidos
de la biologa, es tambin uno de los menos conocidos, debido a su
complejidad fisiolgica y fenotpica. Esta complejidad es lo que impide
emitir una definicin simple que comprenda todos los cambios que se
asocian al transcurrir de los aos. Numerosos estudios realizados hasta
la fecha, han demostrado que la vejez va unida a una menor capacidad
de mantener la homeostasis tisular y la reparacin de los tejidos despus
de la lesin, de tal manera que cuando el control homeosttico disminuye, hasta el punto que no pueda mantenerse la integridad y funcin del
rgano/tejido, es cuando se manifiesta la senectud. Por tanto, muchas de
las condiciones fisiopatolgicas que afligen a la vejez, tales como anemia, sarcopenia y osteoporosis, etc., son una consecuencia del desequi132
ENVEJECIMIENTO
DE LAS CLULAS MADRE
librio entre la prdida celular y la renovacin tisular, debidas a la menor

replicacin y funcin de las clulas madre, que se asocian a muchos de
los fenotipos caractersticos del envejecimiento (1-3).
CLULAS MADRE ADULTAS
La funcin de clulas madre es vital en todas las etapas de la vida,
aunque los papeles especficos que juegan en cada una de ellas varan
de manera considerable. As, en las etapas tempranas de la embriognesis, las clulas madre pluripotentes se diferencian para dar origen a los
tres estratos germinales (7, 8), y as como procede el desarrollo, distintos subgrupos de clulas madre emergen para dirigir la formacin de
rganos y tejidos. Una vez que los tejidos estn establecidos, la misin
de las clulas madre sufre un cambio, desde su intervencin en el desarrollo y formacin de dichos tejidos en el estado embrionario, hacia el
mantenimiento y restauracin tisular a lo largo de la vida adulta. Las
clulas madre especficas de un tejido derivan de clulas madre preexistentes por autorrenovacin, y no por generacin de novo a partir de
progenitores ms primitivos. Segn esto, las clulas madre, tanto en la
juventud como en el estado adulto y en la vejez, derivan de clulas
madre de origen fetal a travs de su capacidad de autorrenovacin a
largo trmino, y as, el envejecimiento de un linaje de clulas madre
puede considerarse que comienza con la especificidad definitiva de tal
linaje y es posterior a cualquier incorporacin adicional de progenitores
ms primitivos (2).
Aunque la vulnerabilidad a las enfermedades infecciosas y al cncer
est causada por un decaimiento de la funcin del sistema inmune, ste
es a su vez, producto de interacciones entre las clulas madre hematopoyticas y el microambiente en la mdula sea y el timo (9), como
tambin de la mucosa que tapiza los bronquios y los sistemas digestivos.
Por tanto, todos los cambios que tienen lugar en la vejez, tales como el
deterioro tisular, y la propensin a las infecciones, pueden interpretarse
como signos de la edad a nivel de las clulas madre adultas. Como los
procesos regenerativos de un organismo vivo estn determinados por la
capacidad potencial de sus clulas madre para reemplazar el tejido daado, puede considerarse que un organismo vivo es tan viejo como sus
clulas madre (10).
133
Las clulas madre adultas aseguran la regeneracin y renovacin de

los tejidos a lo largo de la vida. Si este efecto fuera perfecto, las clulas
seran reemplazadas indefinidamente y el organismo no acusara los
efectos indeseables de la vejez. Como parece ser que el organismo
envejece como consecuencia del envejecimiento de sus clulas madre, la
investigacin sobre los cambios que sufren estas clulas madre asociados a la edad, presenta un enorme inters por dos razones: porque las
clulas madre suponen un buen modelo para estudiar el envejecimiento,
ya que ellas proporcionan la base de la regeneracin de los tejidos
envejecidos y porque encontrar el medio de reactivar las clulas madre
y controlar su destino, puede crear magnficas oportunidades para el
tratamiento de las enfermedades degenerativas de la edad avanzada.
Las clulas somticas normales cultivadas in vitro, dejan de proliferar despus de un cierto nmero de divisiones antes de entrar en el estado
de senescencia replicativa, en el cual las clulas son viables y metablicamente activas, pero han perdido la capacidad de proliferar. No hay que
confundir el estado senescente con el estado reversible de quiescencia, en
el que las clulas se encuentran en reposo proliferativo, o fase G0 del
ciclo celular. Desde la primera descripcin de senescencia replicativa, se
ha especulado mucho sobre cul es el proceso que gobierna el envejecimiento del organismo, en base a dos cuestiones fundamentales: Es el envejecimiento resultado de un programa gentico o es provocado por acontecimientos accidentales o fortuitos? (11).
En general, las clulas madre adultas tienen un recambio bajo y
residen en nichos especializados, que las protegen del medio ambiente
y las activan en determinados momentos. La mayora de ellas permanecen en la fase G0 (estado quiescente), en contraste con las clulas progenitoras amplificadoras transitorias (TA). El nicho es el que gobierna
la divisin celular asimtrica que ha de proporcionar la autorrenovacin
o la diferenciacin y juega tambin un papel importante en la regulacin
del envejecimiento (12)
CLULAS MADRE EN EL RGANO NORMAL
Aunque el concepto de clulas madre fue introducido hace un siglo
por Alexander Maximox (13), la moderna investigacin comenz en
134
ENVEJECIMIENTO
DE LAS CLULAS MADRE
1963 cuando Siminovitch, Culloch y Till (14), consiguieron detectar las

clulas madre hematopoyticas (HSC). Primero demostraron que las clulas de la mdula sea podan reconstituir la hematopoyesis y rescatar
animales irradiados con dosis letales. Segundo, usando transplantes seriados establecieron la capacidad autorrenovadora de las clulas originales de la mdula sea. Cuando clulas de colonias del bazo, obtenidas
de los primeros receptores de trasplantes de mdula sea, fueron posteriormente trasplantadas en animales que haban recibido dosis letales de
irradiacin, se encontraron colonias de leucocitos y eritrocitos en los
segundos receptores. En base a estos experimentos se definieron las
HSC como clulas que posean capacidad de autorrenovacin no restringida y diferenciacin en linaje mltiple. Este descubrimiento marc
el comienzo de los das de la investigacin de las clulas madre.
La capacidad regeneradora en cualquier rgano o tejido se desencadena por activacin de las clulas madre quiescentes que se localizan en
nichos especficos. Esta activacin est normalmente mediada por seales recibidas a travs de vas de sealizacin tales como Wnt, Hedgehog
o Notch, que promueven una secuencia de eventos estrictamente regulados, a niveles genticos y epigenticos y por el microambiente circundante. El resultado neto de este proceso es el establecimiento de una
jerarqua bien definida que comienza a partir de la clula madre poco
proliferativa (quiescente) y da lugar a la amplificacin transitoria de
precursores tempranos y tardos que poseen capacidad proliferativa elevada. Estos precursores generan progenitores comprometidos en el linaje y, en ltimo lugar, clulas diferenciadas terminales no proliferativas,
con caractersticas especializadas, necesarias para el funcionamiento del
rgano. La homeostasis se consigue entre el nmero de clulas diferenciadas terminales y una nueva activacin de la clula madre, de manera
que se asegure el recambio celular relativo para el mantenimiento del
equilibrio funcional dentro del rgano (15).
La mayora de los tejidos que se autorrenuevan caen dentro de esta
categora. Cada vez que una clula madre se divide genera dos clulas
hijas; una de ellas es una nueva clula madre y la otra es una clula
comprometida, con asimetra conseguida sobre una poblacin base, como
tambin a nivel de divisiones celulares individuales. La asimetra de la
poblacin facilita la respuesta a las necesidades fisiolgicas variables,
por ejemplo, en caso de la cicatrizacin de las heridas. Las clulas en
135
cada nivel de jerarqua responden de manera diferente a seales extrnsecas, ya que cada tipo celular requiere diferentes seales especficas,
para progresar al nivel siguiente. Esto demuestra la importancia del
microambiente en la regulacin de la supervivencia de la clula madre
y en la proteccin de su composicin gentica, que es la que imparte la
diversidad funcional de las clulas diferenciadas en el rgano.
FIGURA 1. Procesos biolgicos que afectan a las clulas madre. La biologa de las clulas
madre implica muchos procesos celulares diferentes necesarios para mantener el reservorio
de las clulas madre hematopoyticas (HSC) y su funcionalidad durante las condiciones
ambientales variables a lo largo de la vida. La dotacin de clulas madre se mantiene
cuidadosamente mediante el estricto equilibrio entre proliferacin vs. quiescencia y autorrenovacin vs. diferenciacin y la relacin dinmica entre la extravasacin en sangre y linfa
(movilizacin) vs. el mantenimiento en un nicho de la mdula sea. Defectos en cualquiera
de estos procesos supone una situacin de estrs que las conducir a la senescencia o a la
apoptosis. La disminucin del nmero de clulas madre y de sus funciones dar lugar a la
prdida del potencial renovador y afectar la longevidad. Las flechas verdes indican los
procesos celulares que favorecen el mantenimiento de la poblacin de HSC, mientras que las
flechas marrones indican aquellos factores que las comprometen para su destruccin HSC:
clulas madre hematopoyticas. HPC: clulas hematopoyticas progenitoras (Liang y Zant
2008, modificado) (16).
136
ENVEJECIMIENTO
DE LAS CLULAS MADRE
En el sistema hematopoytico, as como en otros tejidos normales,

las clulas madre tienen la capacidad de autorrenovacin, son pluripotentes y generalmente quiescentes, mantenindose la mayor parte de su
tiempo en G0. As como las clulas madre pueden reparar su DNA, al
autorrenovarse pueden tambin acumular mutaciones adquiridas tras su
exposicin a agentes carcingenos. Si los tumores surgen a partir de las
clulas madre, la acumulacin de estas mutaciones debe ser lo que se ha
reconocido como el proceso multiescalonado de la carcinognesis.
La biologa de las clulas madre implica muchos procesos celulares
diferentes, necesarios para mantener el reservorio de las HSC y su funcionalidad durante las condiciones ambientales variables a lo largo de la
vida. La dotacin de clulas madre se mantiene cuidadosamente mediante el estricto equilibrio proliferacin vs. quiescencia, autorrenovacin vs. diferenciacin y la relacin dinmica entre la extravasacin en
sangre y linfa (movilizacin) vs. el mantenimiento en un nicho de la
mdula sea. Defectos en cualquiera de estos procesos supone una situacin de estrs que las conducir a la senescencia o a la apoptosis. La
disminucin del nmero de clulas madre y de sus funciones, que implica la prdida del potencial renovador, es una de las caractersticas del
envejecimiento, que afecta la longevidad (Figura 1) (16, 17).
DETERIORO OXIDATIVO CELULAR DEPENDIENTE
DE LA EDAD
La teora basada en el deterioro oxidativo celular dependiente de la
edad fue propuesta por Harman en 1956 (18), y todava tiene absoluta
vigencia. Este deterioro tiene dos componentes principales: dao oxidativo y dao replicativo. El metabolismo normal produce especies reactivas de oxgeno (ROS) que pueden oxidar y lesionar las membranas celulares, protenas y cidos nucleicos. Un ejemplo del efecto de la toxicidad
de las especies reactivas de oxgeno (ROS) sobre proceso del envejecimiento se encuentra en casos de sobreexpresin de los enzimas que limitan la exposicin de los componentes celulares a las ROS, tales como la
catalasa y la superxido dismutasa (SOD1). El incremento en la actividad de estos enzimas causaron un incremento en la esperanza de vida (2030%) en la mosca Drosophila. Si esta sobreexpresin se dirigi a las
clulas neuronales, las moscas vivieron incluso ms, lo que indica que el
137
sistema nervioso es susceptible de lesin por las ROS y que tal lesin
afecta la longevidad. En mamferos, la conexin entre las ROS y el envejecimiento es todava incompleta, debido a que no existe evidencia de
prematuro envejecimiento en ratones que acarrean mutaciones de prdida
de funcin en enzimas que degradan las ROS. Adems, el dao ocasionado por las ROS en el genoma mitocondrial, producido por mutaciones
debidas al envejecimiento, causa defectos en la cadena de transporte electrnico que afectan la produccin de energa y producen mayor cantidad
de ROS. Estos defectos en la funcin mitocondrial asociados al envejecimiento se han detectado en muchas especies, y se ha llegado a la conclusin de que el envejecimiento est directamente relacionado con el metabolismo celular y la disminucin de la funcin mitocondrial. Adems de
la mitocondria, otros orgnulos subcelulares, tales como los lisosomas, se
lesionan debido a modificaciones ocasionadas por las ROS. La lipofuscina, pigmento tpico de la ancianidad, se compone de material intralisosmico polimrico que no puede ser degradado por las hidrolasas lisosmicas. Existe una correlacin inversa entre el acmulo de lipofuscina, la
funcin lisosmica y la expectativa de vida de la clula. La presencia de
lipofuscina en las clulas madre interfiere con las funciones celulares y
promueve patologas tales como enfermedades neurodegenerativas, fallo
cardiaco y degeneracin macular (18, 19).
Muchos mecanismos pueden estar implicados en el riesgo de oxidacin y agregacin de protenas en clulas senescentes, entre ellos el estrs oxidativo y las ROS representan los mayores contribuyentes. El acumulo de ROS durante el envejecimiento biolgico, conduce en sus
ltimas causas a una extensa oxidacin de las macromolculas, DNA,
protenas y lpidos. En el caso de las protenas, una vez modificadas por
oxidacin, se vuelven inestables y propensas a alteracin estructural, promoviendo as la formacin de agregados proteicos. Otro mecanismo implica el acmulo de mutaciones en el DNA unido a una disminucin de
los sistemas de reparacin. Cuando mutaciones no sinnimas ocurren en
las secuencias modificadoras del DNA, se pueden sustituir aminocidos,
desestabilizar el plegamiento de la estructura nativa de las protenas y
favorecer la formacin de protenas mal plegadas. Cuando las mutaciones ocurren en sitios promotores de genes asociados con el envejecimiento y la enfermedad, se puede incrementar la transcripcin y la concentracin de protenas y pptidos con propensin a la agregacin. Estos
agregados interfieren con las funciones normales de la clula en multitud
138
ENVEJECIMIENTO
DE LAS CLULAS MADRE
de vas, lo que conduce a la senescencia o a la muerte celular. Por tanto,

el estrs oxidativo, las mutaciones al DNA y los mecanismos anteriormente citados, pueden estar implicados en el declinar en el nmero y
funcin de las clulas madre por efecto del envejecimiento.
EFECTO DE LA EDAD SOBRE LA FUNCIN DE LAS CLULAS
MADRE
A nivel fisiolgico, la funcin de las clulas madre es la restauracin y regeneracin de los tejidos. Esta funcin puede ser utilizada a
nivel fisiopatolgico para el tratamiento de enfermedades degenerativas
e incluso para mejorar las disfunciones asociadas con el envejecimiento
normal. La posibilidad de que las clulas madre puedan tener aplicaciones teraputicas sobre los achaques tpicos de la edad plantea dos preguntas: Cul es el efecto de la edad sobre las propias clulas madre?
y En qu grado se puede atribuir el declinar de la funcin de un tejido
a una capacidad limitada de las clulas madre residentes del mantenimiento de la estructura y renovacin de la funcin de tal tejido?
La respuesta a la primera es sensible a casos especficos y como
punto de partida necesita identificar y aislar las clulas madre, conocer
su nmero y funcin y aplicar estos ensayos a lo largo de la vida del
individuo, para evaluar los cambios asociados a la edad, tratando de
comprender las causas y mecanismos de estos cambios. La respuesta a
la segunda pregunta es mucho ms difcil de conseguir por medios
experimentales, debido a la conexin estrecha entre las clulas madre y
los tejidos en los que residen. Como tal, no hay tejido para el cual se
haya emitido una respuesta definitiva. Adems, el problema es muy
diferente segn se trate de un tejido con potencial regenerativo celular
alto en respuesta al dao, o recambio celular bajo y potencial regenerativo insignificante (Figura 2) (5).
Un nmero de factores interfiere con la potencia de la poblacin de
clulas madre durante el envejecimiento. Si el envejecimiento se mira
como el acmulo en un organismo de clulas de usar y tirar, el ritmo y
el grado del envejecimiento de dicho organismo son un reflejo de cmo
la clula contrarresta los efectos deletreos del ambiente. Entre las
muchas teoras que se han emitido se han seleccionado dos, una basada
en la evolucin y otra basada en el dao. Muchos bilogos evolucionis139
Figura 2. Heterogeneidad tisular y funcionalidad de las clulas madre para la reparacin y el mantenimiento de la homeostasis. El grado al cual los efectos de la edad sobre
las clulas madre residentes determinan el fenotipo de un tejido se relaciona con el grado al
cual las clulas madre son responsables de la reparacin y mantenimiento de la homeostasis
de dicho tejido. Los tejidos con elevado recambio (sangre, piel y tubo digestivo,) tienen un
compartimento prominente de clulas madre y poseen una elevada capacidad regenerativa.
Los tejidos con recambio bajo, pero elevada capacidad regenerativa, pueden usar estrategias
diferentes para asegurar el recambio efectivo en respuesta a la lesin aguda. Por ejemplo,
en msculo esqueltico, las miofibrillas diferenciadas son incapaces de proliferar para regenerar nuevo tejido, de forma que el msculo ha de recurrir a las clulas madre residentes
para el recambio y reparacin. En el caso del hgado, los hepatocitos diferenciados pueden
proliferar y remodelar el tejido mediante el reemplazo de los hepatocitos perdidos. Por
ltimo, los tejidos con bajo recambio y potencial regenerativo bajo poseen clulas madre que
median una reparacin tisular limitada. Aunque existe un gran inters las clulas madre del
cerebro y corazn para su aprovechamiento en teraputica, solo se cuenta con una capacidad
limitada de reparacin endgena de estos tejidos frente a lesiones agudas (Rando 2006,
modificado) (5).
tas sugieren que los genes que favorecen la reproduccin de las especies
ejercen efectos negativos en la ltima fase de la vida, limitando la longetividad. Este fenmeno se ha denominado pleiotropa antagnica. De
acuerdo con esta teora los organismos se mantienen jvenes mientras
permanece su competencia reproductora. Despus, los genes seleccionados por sus efectos beneficiosos sobre la reproduccin no se expresan.
Un ejemplo de pleiotropa antagnica son los andrgenos, las hormonas
responsables del crecimiento y funcin de la prstata en individuos
jvenes, que juega un papel importante en la generacin del esperma
para la reproduccin, y que en la vejez contribuyen al cncer de prstata
140
ENVEJECIMIENTO
DE LAS CLULAS MADRE
(12, 20). La segunda, la teora de la acumulacin de mutaciones, propuesta por Medawar en 1952 (21), propone que las mutaciones que
conducen a los cambios perjudiciales asociados a la edad, se pueden
acumular en sucesivas generaciones en estadios posteriores al mximo
de la capacidad reproductora. Como en la naturaleza pocos individuos
alcanzan edades avanzadas, tales mutaciones pueden escapar a la presin de la seleccin negativa. Sin embargo, hoy no se duda de que las
influencias genticas ejercen un importante papel en el ritmo del envejecimiento. La evidencia ms clara la proporciona el hecho de las enormes diferencias en la longevidad mxima entre las especies.
Otra teora, la de la senescencia replicativa, fue introducida en 1961
por Hayflick (22), como proceso que limita el nmero de divisiones que
una clula especfica puede sufrir a lo largo de la vida y que posteriormente se ha asociado a la prdida del DNA telomrico. La senescencia
replicativa o parada del crecimiento, se postul al detectar que exista
una conexin directa entre las rondas de replicacin y la prdida de los
telmeros situados en los extremos de los cromosomas. Durante cada
divisin celular se pierde DNA telomrico, porque la mayora de las
clulas somticas no expresan telomerasa, la enzima responsable de
reconstituir los telmeros. Se ha demostrado que la longevidad puede
prolongarse en gusanos que sobreexpresan una protena que se une a los
telmeros e incrementa su longitud (HRP-1). Sin embargo, los mecanismos implicados en tal proceso no estn del todo claros. Posteriores
estudios han demostrado que las clulas afectadas sufren la senescencia
antes de adquirir telmeros cortos crticos, para evitar la inestabilidad
genmica que puede conducir al cncer. Por tanto, la senescencia replicativa/parada del crecimiento no depende exclusivamente de la erosin
telomrica, depende tambin de otros mecanismos.
Se ha demostrado que, con la edad, el proceso de autorrenovacin
y diferenciacin en las clulas madre muestra una menor generacin de
progenia diferenciada o dirigida hacia un linaje particular (23). La divisin celular asimtrica se ha estudiado en un nmero muy limitado de
tipos celulares y la evidencia experimental es dbil. Por el contrario,
evidencia ms convincente sugiere que existe un acmulo de cambios en
el DNA de las clulas madre a medida que transcurre la edad, que afecta
su funcionalidad. Si los cambios en el DNA alcanzan un cierto umbral,
las clulas madre sufren apoptosis o senescencia, lo cual aumenta la
141
prdida celular. Alternativamente, las clulas madre pueden evadir la

senescencia o la apoptosis y tener el riesgo de sufrir cambios clonales
que conduzcan a la formacin de un tumor (Figura 3). No est claro si
estos cambios ocurren en las clulas madre como parte de un proceso
fisiolgico o slo en circunstancias de estrs extremo, o si son el resultado de un programa intrnseco de estas clulas, o de cambios en el
microambiente en el cual ellas residen. Tambin es materia de discusin
si hay alguna va relacionada o causal para el envejecimiento de los
tejidos y la prdida de su funcin o existe alguna alternativa que puede
predisponer al desarrollo de tumores malignos (23).
FIGURA 3. Modelo de proliferacin de clulas madre jvenes y viejas. (A) Clulas madre
jvenes, representadas aqu como clulas madre hematopoyticas, sufren la autorrenovacin,
que les permite el mantenimiento del reservorio de clulas madre y la produccin de las
clulas efectoras diferenciadas requeridas por el organismo (neutrfilos, linfocitos, eritrocitos, plaquetas, etc). (B) La acumulacin de mutaciones en el DNA con la edad, produce un
estado crtico (CRISIS) en las clulas madre que las conduce a la apoptosis o senescencia,
con la consiguiente menor capacidad para autorrenovarse y diferenciarse en el linaje hematopoytico. Las clulas mutadas que escapan de la apoptosis o senescencia son un riesgo de
cncer (Bellantuomo y Keith 2007, modificado) (23).
ENVEJECIMIENTO DEL NICHO DE CLULAS MADRE

Las clulas madre adultas proporcionan el medio de regenerar los
tejidos viejos o deteriorados, debido a su doble capacidad de autorrenovacin y diferenciacin en muchos linajes. Estas dos caractersticas estn
142
ENVEJECIMIENTO
DE LAS CLULAS MADRE
controladas por interaccin directa con un microambiente especfico

denominado nicho. Las clulas madre hematopoyticas (HSC) residen
en la mdula sea. Todava no est claro, si las HSC pueden rejuvenecer
indefinidamente o si su capacidad autorrenovadora no es indefinida y
sufren la senescencia replicativa como otras clulas somticas. Por otro
lado, la cuestin que surge es la siguiente hasta qu punto los cambios
relacionados con la edad se deben a factores intrnsicos o a estmulos
externos? Existe cada vez un mayor convencimiento de que el nicho
juega un papel muy importante en la regulacin del envejecimiento de
las clulas madre adultas. Es este nicho el que realiza las funciones
siguientes (13, 24): mantiene las HSC, como tambin la senescencia
replicativa, protege las HSC de los radicales y compuestos txicos, regula las cascadas sealizadoras celulares, y modula la expresin gnica
y las modificaciones epigenticas en las HSC. De esta manera, la interaccin de las HSC con su nicho controla la funcin de estas clulas
madre, incluyendo el propio envejecimiento de la hematopoyesis.
Varios programas intrnsecos y vas sealizadoras facilitan las caractersticas nicas de las clulas madre. Estos programas regulan el mantenimiento, proliferacin y diferenciacin, pero tienen que estar estrictamente controlados por el microambiente de acuerdo con las necesidades
fisiolgicas del organismo. En 1978, Schofield (25) propuso una hiptesis en la cual las clulas madre se encuentran asociadas con otras clulas
que determinan su comportamiento y son las que forman el nicho. Se
han identificado para las HSC dos tipos de nicho en la mdula sea; el
nicho endosteal y el nicho vascular. Las HSC ms primitivas se localizan
cerca del endosteum del hueso, prximas a las clulas del estroma y de
los osteoblastos. Esta comunicacin y adhesin recprocas es lo que ha
de regular la funcin de las HSC. Las HSC se encuentran tambin en la
vecindad de las clulas endoteliales sinusoidales. Se cree que el nicho
vascular forma un medioambiente que promueve la proliferacin y diferenciacin y la transmigracin endotelial de las HSC, mientras que el
nicho endosteal promueve la quiescencia y la autorrenovacin (25). El
mecanismo preciso de esta interaccin entre las HSC y al microambiente
local no se conoce an, sin embargo, se sabe que la composicin de los
tipos celulares y los componentes de la matriz extracelular se encuentran
en continuo cambio a lo largo de la vida. Estos cambios se reflejan en una
menor formacin de hueso y prdida de masa sea, son ms pronunciados en pacientes con osteoporosis, y van acompaados por una mayor
143
adipognesis y menor osteoblastognesis. Tambin, la composicin de las

clulas hematopoyticas maduras cambia a lo largo de la vida.
El sistema inmune se afecta de manera especial en el envejecimiento, detectndose muy reducido el potencial de diferenciacin linfoide en
la mdula sea de donantes viejos. Experimentos de trasplantes han
indicado que esta desviacin hacia el potencial de diferenciacin mieloide, asociada a la edad, se debe, probablemente, a cambos intrnsecos en
las HSC viejas. Estudios recientes indican que el envejecimiento no est
solo asociado con las alteraciones funcionales de las HSC, sino tambin
con alteraciones en el microambiente que se requieren para la diferenciacin hematopoytica. Las HSC de ratones jvenes al ser trasplantadas
en ratones viejos, tienen un potencial de diferenciacin reducido hacia
el fenotipo linfocito, lo cual no ocurre en caso de receptores jvenes.
Por otra parte, las HSC de ratones viejos tambin exhiben menor potencial de diferenciacin linfoide debido a los cambios en el microambiente. De todo esto se deduce que el nicho de las clulas madre sufre
grandes variaciones durante la vida del organismo, que pueden jugar un
papel importante en el control externo del envejecimiento de las clulas
madre (12).
En teora, las HSC pueden tener un ilimitado poder de autorrenovacin, incluido el rejuvenecimiento o pueden sufrir el envejecimiento
celular al igual que otras clulas somticas, pero hasta qu grado los
cambios relacionados con la edad en estas clulas son debidos a factores
intrnsecos o son regulados por estmulos del microambiente del nicho
de las clulas madre. En los prrafos siguientes se describen cuatro
situaciones posibles y la realidad ms probable es que existan intercambios entre ellas (Figura 4).
Las HSC pueden rejuvenecer indefinidamente. La autorrenovacin
verdadera de las clulas madre indica que la clula hija posee las mismas caractersticas que la clula madre y esto debe incluir tambin el
rejuvenecimiento. Esto las capacitar para mantener de manera indefinida el reservorio de clulas madre. Si es este el caso, las clulas madre
adultas pueden proporcionar infinitas bases para la regeneracin tisular.
En este aspecto, la prdida del potencial regenerativo de los tejidos
viejos, se ha de atribuir a la reduccin en el nmero de clulas madre
primitivas. La prueba de esta tesis no es posible por la medida funcional
de las HSC, que necesitara poder discriminar entre clulas madre ver144
ENVEJECIMIENTO
DE LAS CLULAS MADRE
FIGURA 4. Mecanismos implicados en el envejecimiento de las HSC. (A) La autorrenovacin de las HSC puede estar asociada con el rejuvenecimiento, para evitar de este modo el
envejecimiento celular en clulas madre adultas. (B) Alternativamente las HSC pueden estn
ligadas a la senescencia replicativa con un nmero limitado de divisiones tal como cualquier
clula somtica. (C) El envejecimiento de las HSC puede estar tambin controlado por estmulos externos del microambiente que regulan el rejuvenecimiento de las HSC. (D) El anclaje de
las HSC a nichos especficos en la medula sea parece mantenerlas en un estado quiescente
y por tanto, la interaccin con el microambiente puede contrarrestar la senescencia replicativa de las HSC (Wagner et al., 2008, modificado) (12).
daderas y clulas progenitoras. Adems, la demostracin que la clula

hija comparte las mismas caractersticas de su madre, no es posible
debido al hecho que la madre ya no existe despus de la divisin celular.
De esta manera, la teora del rejuvenecimiento infinito de las HSC como
se observa en las clulas madre de la lnea germinal o en las clulas
madre embrionarias (ESC) no puede apenas ser verificado (12).
Las HSC sufren el envejecimiento celular. En contraposicin con
la tesis anteriormente mencionada, las HSC pueden sufrir la senescencia replicativa tal como todas las clulas de mamferos. En este caso,
no hay autorrenovacin verdadera ya que las clulas hijas pueden
tener el mismo potencial de diferenciacin multilinaje, pero despus
de un nmero limitado de ciclos celulares, la clula hija entrar en
estado senescente y saldr del ciclo proliferativo. Adems de las limitaciones ya mencionadas, los anlisis de senescencia replicativa de las
145
HSC son difciles de realizar por ausencia de protocolos fidedignos de

expansin in vitro para las primitivas HSC. Para las clulas madre
mesenquimticas (MSC), los protocolos de expansin en cultivo estn
establecidos y se ha demostrado que la senescencia replicativa en estas
clulas es un proceso continuo y organizado. Sin embargo, las MSC
son poco definidas a nivel molecular y la verificacin de su funcin
como clulas madre no est del todo demostrada. El agotamiento del
reservorio de las HSC no suele ocurrir durante la vida del organismo.
Experimentos de trasplante en modelos murinos han demostrado que
la menor capacidad de repoblacin y el agotamiento de las HSC pueden
prolongarse ms all de cinco rondas de trasplante. A pesar de su
notable capacidad proliferativa, estos resultados ponen en evidencia que
las HSC envejecen. Modelos matemticos de diferenciacin de las HSC
demuestran que la hiptesis de Hayflick es compatible con la larga
vida de la hematopoyesis. La senescencia replicativa en las HSC est
apoyada indirectamente por el hecho de que la mayora de estas clulas permanece en estado quiescente en la mdula sea. Se ha demostrado que en la cintica de la divisin celular asimtrica, una clula
hija permanece quiescente o se divide muy lentamente, mientras que
la otra se multiplica exponencialmente y genera progenitores comprometidos y colonias de linaje especfico. Si las dos clulas hijas se
separan por micromanipulacin y se analizan por separado, una de
ellas hereda la capacidad de la clula madre, mientras que la otra se
vuelve ms especfica. Analizando las diferencias cinticas de divisin para separar las clulas CD34+/CD38 en una fraccin de divisin
lenta (SDF) y una fraccin comprometida de rpida divisin (FDF), se
ha detectado que varios marcadores moleculares asociados con la funcin primitiva de las clulas madre estn ms expresados en las clulas SDF que en las FDF, lo que explica que tanto la quiescencia
como la divisin lenta son mecanismos protectores durante la replicacin del DNA, y que el ritmo de divisin rpida, quiescencia o divisin lenta, se debe a la proteccin de mutaciones durante la replicacin del DNA o a la prevencin del agotamiento replicativo de las
clulas madre (12, 24).
El envejecimiento celular est regulado por el microambiente. Una
serie de estudios han demostrado que la hematopoyesis resulta afectada por el microambiente hematopoytico. Las HSC tienen menor
capacidad de hospedarse en sus nichos despus de ser trasplantadas en
146
ENVEJECIMIENTO
DE LAS CLULAS MADRE
receptores viejos vs. receptores jvenes. La adherencia de las HSC a

su nicho se modula por alteraciones relacionadas con la edad, ya que
los ratones viejos muestran mayor movilizacin de las HSC en respuesta al factor de crecimiento estimulador de colonias de granulocitos
(G-CSF). Se ha demostrado que la disfuncin de los telmeros tambin ejerce efectos sobre el microambiente hematopoytico. En ratones
knockout para telomerasa la B-linfopoyesis se altera mientras que la
mielopoyesis se eleva. Adems, la disfuncin de los telmeros y el
envejecimiento limita el enraizamiento de las HSC de tipo silvestre
trasplantadas. Estos datos proporcionan evidencia de que la funcin de
soporte y el tamao del nicho sufren modificaciones a medida que
transcurre la edad (12).
El microambiente mantiene las HSC en estado quiescente para prevenir la senescencia replicativa. Las HSC en condiciones normales, se
mantienen en estado quiescente y tienen que ser activadas para generar
clulas sanguneas, de acuerdo con las necesidades fisiolgicas del organismo. Esto ocurre especialmente despus de la quimioterapia. La
divisin celular, la autorrenovacin y la diferenciacin de las clulas
madre estn estrictamente controladas por el nicho. Manteniendo las
clulas madre en un estado quiescente se reduce el nmero de mutaciones que podran, en sus ltimas consecuencias, conducir al desarrollo de
leucemia. Por otra parte, esto puede retrasar el agotamiento de las primitivas HSC por senescencia replicativa. Si las HSC sufren la senescencia replicativa, entonces el envejecimiento se modula indirectamente por
estmulo externo del nicho que regula su proliferacin (12).
Como ya se mencion, existen numerosos datos que demuestran que
el microambiente ejerce influencia sobre el envejecimiento de las HSC,
aunque los mecanismos moleculares precisos no se conocen en su totalidad. Se han descrito, recientemente, varios efectores del envejecimiento y alguno de ellos puede estar sometido a control externo por el nicho.
Entre los diversos cambios de la hematopoyesis relacionados con la
edad, que son el resultado de las alteraciones intrnsecas en las mismas
HSC, como tambin del microambiente hematopoytico que regula y
mantiene su funcin, cabe citar, a las especies reactivas de oxgeno y
compuestos txicos, la regulacin de la expresin gnica y del miRNA,
modificaciones epigenticas, la regulacin de la proliferacin por reposo
proliferativo (quiescencia), la regulacin de cascadas sealizadoras que
147
implican la expresin de genes supresores de tumores (p53, p16INK4a

y p19ARF) y tambin la adhesin de las HSC al tamao limitado del
nicho (12, 24).
ESTRS REPLICATIVO
La evidencia sugiere que el inevitable dao al DNA asociado a la
replicacin, conduce al agotamiento replicativo y a la degeneracin de
la homeostasis tisular tpicos de la edad. Por tanto, la replicacin del
DNA representa una fase precaria en la proliferacin celular, que influye en la renovacin del tejido. El declinar de la capacidad regenerativa
depende en parte de la respuesta apopttica y de los efectores reguladores del ciclo celular al dao al DNA tales como p16INK4a, p53 y p21.
Parece ser que los efectos del estrs replicativo son ms potentes en
aquellas clulas que llevan consigo el mayor peso en la renovacin del
tejido, que son las clulas madre adultas y las clulas progenitoras. El
reservorio de clulas madre adultas se genera y determina durante el
desarrollo, formando cada tejido y sus compartimentos subtisulares por
medio de la autorrenovacin. Sin embargo, en el curso de renovacin a
largo plazo, las mutaciones asociadas a la replicacin en esas clulas y
en aquellas que mantienen el nicho, causan alteraciones estocsticas en
la regeneracin tisular (16, 28).
La replicacin del DNA es el tendn de Aquiles en el mantenimiento del genoma. Segn la segunda ley de la termodinmica, la tendencia
de los sistemas ordenados para caer en desorden general, puede aplicarse a todas las molculas, incluyendo al DNA. Los eventos que ocurren
durante la replicacin normal del DNA crean en el transcurso del tiempo, suficiente dao al DNA, como para causar la prdida de clulas
madre y clulas progenitoras, lo cual va a disminuir la capacidad renovadora del tejido (Figura 5). El proceso de replicacin del DNA requiere
varios grupos de genes de reparacin y el continuo chequeo de los
puntos de control esenciales para salvaguardar el genoma durante la
replicacin. La inestabilidad de la horquilla de replicacin, es un evento
relativamente comn en el curso de la replicacin del DNA. Por ejemplo, la fosforilacin de H2AX, una variante de histona en respuesta a la
rotura de la doble cadena, se estimula una vez que el DNA entra en
replicacin en clulas en cultivo (28).
148
ENVEJECIMIENTO
DE LAS CLULAS MADRE
Otras protenas que responden a la rotura de la doble cadena, tales

como Rad51 y BRCA1, son tambin reclutadas hacia la cromatina durante la fase S, como ndice de dao al DNA. Se sabe que el intercambio de las cromtidas hermanas, un marcador de la recombinacin
homloga, ocurre a un ritmo de 10 intercambios cada fase S en clulas
en cultivo. Debido a la naturaleza multivariable de los intermediarios
de la resolucin de la recombinacin, 10 intercambios por fase S,
proporciona un lmite ms bajo que el ritmo de recombinacin actual
durante la sntesis del DNA. Estos eventos de intercambio son un
ndice del colapso de la horquilla de replicacin en escenarios de
reiniciacin. Finalmente es importante destacar que son esenciales un
gran nmero de genes para el desarrollo embrionario y la proliferacin a largo plazo en cultivo, lo que indica la importancia del dao
exgeno al DNA. La prdida de la integridad genmica durante la
sntesis del DNA puede afectar la capacidad regenerativa del tejido al
iniciar prolongadas respuestas en los puntos de control del ciclo celular, que causan la prdida funcional de las clulas madre y las progenitoras (28).
FIGURA 5. El dao al DNA no reparado en el curso de la replicacin, inicia respuestas en los

puntos de control que conducen a la senescencia o muerte celulares. La proliferacin y
diferenciacin de las clulas madre y las progenitoras actan como un medio de reconstituir
tejidos afectados, despus de la eliminacin y muerte de estas clulas mutantes. Sin embargo,
el dao replicativo al DNA, tanto en clulas madre como en clulas que forman el nicho,
altera las propiedades multipotentes de estas clulas o causa su prdida a partir del reservorio proliferativo. Estos deterioros cclicos proporcionan, con el tiempo, una causa potencial que produce el declinar regenerativo del envejecimiento (Ruzankina et al, 2008) (28).
149
MECANISMOS REGULADORES QUE INTERVIENEN

EN EL ENVEJECIMIENTO DE LAS CLULAS MADRE
Los mecanismos implicados en la transicin de las clulas madre
hacia el estado senescente se han estudiado en clulas madre aisladas y
purificadas de ratones jvenes y viejos. Tales estudios han implicado
genes que intervienen en la remodelacin de la cromatina.
Acompaando al envejecimiento, se registra una menor capacidad
para responder al estrs, tanto a nivel de los tejidos, como del organismo
completo. La asociacin de estas caractersticas con las funciones bsicas de las clulas madre ha sido hasta el momento indirecta y de bases
moleculares desconocidas; sin embargo, recientemente se ha demostrado que los inhibidores de las quinasas dependientes de ciclina (CDK)
juegan un papel importante en la regulacin de la funcin de las clulas
madre durante el envejecimiento, entre los que se encuentran los genes
que se integran en el locus INK4a/ARF que codifican dos protenas
supresoras tumorales (29, 31).
La evidencia ms convincente del modelo de envejecimiento producido por supresores tumorales, la proporciona la protena supresora tumoral p16INK4a, un efector muy poderoso que frena el ciclo celular y
juega un papel importante en la senescencia in vitro en distintos tipos
celulares (32). La expresin de p16INK4a se eleva de manera notable
con la edad en la mayora de los tejidos de mamferos (6). En poblaciones de clulas madre en cerebro y en mdula sea, la expresin de
p16INK4a media una disminucin en la funcin replicativa que se debe,
tanto a la deficiencia en Bmi-1 (un represor de la expresin INK4a/
ARF), como a agresiones del tipo de la radiacin ionizante. Los ratones
que carecen del gen p16Ink4A mantienen la funcin replicativa de las
clulas madre neurales, de las hematopoyticas y de las pancreticas
durante el envejecimiento (30). Se ha demostrado tambin, que la prdida de p16Ink4a atena muchos fenotipos relacionados con la edad en
una cepa progeroide de ratn que envejece prematuramente (33). Por
tanto, la expresin de este gen supresor, no slo se relaciona con el
envejecimiento en estos tejidos, sino que tambin es causa del aspecto
envejecido. La demostracin de este modelo, en humanos ha surgido de
estudios que asocian los polimorfismos de un solo nucletido (SNP),
cerca del locus INK4/ARF, con diversas condiciones asociadas a la edad,
150
ENVEJECIMIENTO
DE LAS CLULAS MADRE
como la diabetes tipo 2, aterosclerosis y el denominado sndrome de

fragilidad (6).
Se han generado diferentes cepas de ratn con alteraciones en el
locus murino Ink4/Arf que codifica p16INK4a y otras dos protenas
supresoras de tumores p15INK4b y p19ARF (32). Estos animales sorprenden por ser normales en el estado adulto joven. Los ratones que
carecen de los genes p16Ink4a, p19Arf y p15Ink4b, solos o en combinacin, son viables, frtiles y no se distinguen de sus congneres tipo
silvestre, hasta que desarrollan tumores. Esta observacin sugiere que el
locus INK4/ARF y, en particular el gen p16Ink4a no es indispensable en
el desarrollo de la mayora de los tejidos, pero juega un papel importante a lo largo de la vida en la supresin tumoral. Este poderoso locus
parece que se activa en las etapas tempranas de la progresin neoplsica. Sin embargo, en tanto en cuanto las clulas activan la expresin de
INK4/ARF, pierden su capacidad para proliferar. Por tanto, este efecto
beneficioso supresor del cncer, contribuye tambin a la prdida de
clulas madre funcionales con la edad.
Si la funcin principal del gen p16Ink4a, y quizs de los otros
miembros del locus INK4/ARF es sofocar la hiperproliferacin de clulas normales que estocsticamente se han alterado, se deduce que la
expresin de tal locus ha de estar cuidadosamente controlada. En particular, la regulacin de la expresin de INK4/ARF durante el desarrollo
embrionario ha de ser crucial. Muchos tejidos en desarrollo muestran
ritmos de proliferacin increbles, que se acoplan con migracin celular
y cambios rpidos en el medio extracelular. Cmo puede conocer una
clula que estos eventos programados del desarrollo, que comparten
muchos rasgos del crecimiento maligno aberrante, son normales y no
causan activacin del locus INK4/ARF? La evidencia sugiere que, en
mamferos adultos, este problema est dirigido por mecanismos poderosos que silencian el locus hasta que se deja de reprimir por activacin
inducida por la edad del gen p16Ink4a. Sin embargo, no est claro el
mecanismo de regulacin del locus INK4a/ARF durante la embriogenesis y los estadios tempranos del neonato.
151
HMGA2 REGULA EL LOCUS INK4A/ARF

EN CLULAS MADRE
Un reciente estudio de Nishino et al. (34) identifica a HMGA2,
protena no histona, asociada a la cromatina, como un regulador de la
autorrenovacin de las clulas madre y de la expresin de Ink4a/Arf
en ratn. Estos autores han estudiado los transcritos que se expresan
de manera destacada en clulas madre fetales, pero cuya expresin desciende despus del nacimiento y en la vejez. Se ha identificado un
transcrito, el Hmga2, que satisface este criterio y muestra una expresin disminuida en clulas madre hematopoyticas y en dos tipos de
clulas madre neurales. Existen cuatro protenas de la familia del grupo
A de elevada movilidad (HMGA): tres son isoformas de HMGA1 y
HMGA2. Estas protenas asociadas a la cromatina parece que carecen
de actividad transcripcional intrnseca, pero, en vez de eso, se unen a
secuencias de DNA ricas en AT y potencian los efectos de factores
transcripcionales alterando la estructura local de la cromatina (35). Los
ratones que sobreexpresan Hmga2 generan tumores linfoides, lipoides
y pituitarios. En humanos, las amplificaciones genticas o traslocaciones de gen Hmga2 que aumentan su expresin, se asocian con una
variedad de tumores comunes benignos mesenquimticos, y tambin
con cnceres agresivos raros (35).
Estos autores (34) muestran que la protena HMGA2 juega un papel
asociado al envejecimiento en la autorrenovacin de las clulas madre
neurales de ratn (NSC). Aunque HMGA2 no parece que se requiera
para la generacin de las NSC durante el desarrollo fetal, las NSC de
ratones deficientes en el gen Hmga2 tienen defectos de proliferacin y
autorrenovacin. La diferenciacin de los progenitores neurales de estos
ratones no exhibe deficiencias proliferativas, lo que sugiere que la prdida del gen Hmga2 no conduce a un descenso global de la replicacin
celular, pero afecta especficamente la autorrenovacin. De acuerdo con
el patrn de expresin observado del gen Hmga2, es necesario destacar
que los efectos negativos de la protena HMGA2 sobre la proliferacin
son ms pronunciados en las NSC procedentes de embriones tardos o
ratones muy jvenes y que estos efectos declinan en el envejecimiento.
De hecho, el nmero y funcin de las NSC son similares en ratones
viejos deficientes en el gen Hmga2 que en sus congneres silvestres, lo
que indica que el envejecimiento fisiolgico de los ratones normales
152
ENVEJECIMIENTO
DE LAS CLULAS MADRE
reduce la funcin de las NSC hacia un valor comparable al que se

establece durante el desarrollo en ratones deficientes en el gen Hmga2.
Las alteraciones en la funcin de las clulas madre en ratones jvenes
deficientes en Hmga2 se asocian con cambios neuroanatmicos, entre
los que cabe citar, menor proliferacin celular en la zona subventricular,
que es donde residen las NSC, y menor nmero de neuronas en los
sistemas nerviosos central y perifrico.
Cuando se analiz la expresin de los genes p16INK4a y p19Arf en
NSC de ratones carentes del gen Hmga2, se encontr que las clulas
madre de los embriones a trmino y las de ratones jvenes sobreexpresaban de manera notable ambos genes del locus Ink4a/Arf. Por tanto, el
grado de expresin de Ink4a/Arf se relaciona de manera inversa con el de
Hmga2 desde la vida fetal a trmino hasta la vejez, lo que sugiere una
conexin indirecta entre este locus y HMGA2. Por tanto, las deficiencias
en la autorrenovacin de NSC de ratones deficientes en Hmga2, pueden
ser recuperadas parcialmente por la prdida de la expresin de los genes
p16Ink4a o p19Arf. La sobreexpresin de estos genes es ms pronunciada en los embriones a trmino y en ratones muy jvenes, pero disminuye
con la edad. Como la expresin de Ink4a/Arf se eleva normalmente en las
NSC con la edad, los ratones silvestres parece que se igualan con los
ratones deficientes en Hmga2 respecto a la expresin de Ink4a/Arf. La
expresin de los genes p16INK4a y p19Arf es comparable en las NSC de
ratones mutantes viejos (2 aos) y silvestres, lo que indica que los efectos de HMGA2 son ms pronunciados desde los fetos a trmino hasta
jovenes adultos. Como no ha podido detectarse ninguna unin de
HMGA2 al locus Ink4a/Arf, Nishino et al. (34) sugieren que HMGA2
puede controlar la expresin desde este locus, reprimiendo la expresin
de JunB, un activador de la expresin de Ink4a/Arf en clulas madre.
TELOMERASA EN LAS CLULAS MADRE ADULTAS
Las clulas madre adultas o somticas son la fuente regeneradora de
los distintos tejidos del organismo. Se ponen en accin cuando se produce un dao tisular y emigran desde sus nichos hasta el lugar que
tienen que reparar o restaurar. Sin embargo, si se multiplican en exceso,
o demasiado poco, pueden ser origen de cncer o de enfermedades relacionadas con el envejecimiento, respectivamente (Figura 6).
153
Uno de los eventos intrnsecos ms conocidos de la clula, propuesto por Harley et al., en 1990 (36), que mejor describe el mecanismo
implicado en el envejecimiento celular, es el acortamiento de los telmeros en cada ronda de divisin celular. El ritmo al cual los telmeros
se acortan con la edad es muy variable y puede ser influenciado por
factores que se aceleran por la edad y son un riesgo de muerte prematura. El acortamiento de los telmeros se acelera tambin en varias
enfermedades humanas tpicas de la vejez, tales como la enfermedad
cardiovascular y la infeccin entre otras. Existe una correlacin entre la
longitud de los telmeros y el riesgo de muerte por enfermedad cardiaca. Tambin la longitud de los telmeros es un marcador predictivo de
demencia o alteraciones cognitivas (37, 39).
Recientemente, se ha descubierto que el comportamiento de las
clulas madre est determinado por sus telmeros y la cantidad de telomerasa que contienen. Los telmeros y la telomerasa son determinantes importantes de la mortalidad e inmortalidad celular y uno de
los mecanismos mejor conocidos que controlan el cncer y el envejecimiento (37). Mantener los extremos de los cromosomas o telmeros en buen estado permite que las clulas madre funcionen eficazmente. Las clulas madre epiteliales cuando tienen telmeros muy
cortos no abandonan sus nichos ni regeneran la piel y el pelo adecuadamente, por lo que provocan el envejecimiento prematuro de la piel.
Por el contrario, cuando la protena encargada de alargar los telmeros, la telomerasa, se encuentra en exceso en las clulas, lo que ocurre
en ms del 90% de los tumores, las clulas madre epiteliales abandonan en exceso sus nichos para regenerar los tejidos, con lo que la piel
y el pelo crecen ms de lo que es normal, provocando mayor susceptibilidad de formar tumores epiteliales (Figura 6) (37). Estos descubrimientos indican que la longitud telomrica y la cantidad de telomerasa
determinan el comportamiento de las clulas madre. Los defectos en
la longitud de los telmeros de las clulas madre preceden en el tiempo a la aparicin de los primeros sntomas visibles de envejecimiento
prematuro o del cncer, por lo que la medida de la longitud telomrica
o de actividad de la telomerasa en clulas madre puede considerarse
uno de los parmetros utilizables en el pronstico. Las terapias que
permitiesen controlar estas variables en las clulas madre podran ser
beneficiosas en el tratamiento de enfermedades relacionadas con el
envejecimiento, incluyendo el cncer. Desvelar los parmetros que
154
ENVEJECIMIENTO
DE LAS CLULAS MADRE
determinan los defectos en la funcin de las clulas madre es esencial

para el establecimiento de posibles terapias celulares sin causar efectos
secundarios indeseables. Tales defectos son: el acumulo de errores en
la maquinaria de replicacin, cambios en la fluidez de la membrana,
daos por la accin de las ROS, aumento de los productos de glicosilacin avanzada, resistencia a la insulina, reduccin de la longitud de
los telmeros, autoinmunidad y apoptosis (37, 38).
FIGURA 6. Papel de la telomerasa en el funcionamiento de las clulas madre, que conduce al envejecimiento o al cncer. El acortamiento de los telmeros (en clulas sin telomerasa) conduce a menor capacidad de las clulas madre a abandonar el nicho y regenerar los
tejidos, con lo cual el tejido se deteriora y envejece. Los mecanismos que intervienen en esta
menor movilizacin no estn claros, pero es probable que se deban a la senescencia y
apoptosis en respuesta a los telmeros cortos. Por el contrario, la sobreexpresin de telomerasa conduce a una aberrante movilizacin de las clulas madre fuera del nicho, la cual, en
combinacin con mutaciones oncognicas, puede contribuir a la formacin de tumor. (Blasco
2008, con modificaciones) (37).
155
Los telmeros se alargan por la accin cataltica de la telomerasa,

pero en ausencia de este enzima tiene lugar un persistente acortamiento
de los telmeros y finalmente la prdida de la funcin de dichos telmeros, que se asocia con senescencia replicativa y apoptosis. Las clulas madre normalmente expresan la telomerasa en contraste con la
mayora de las clulas somticas. Sin embargo, en las HSC, la actividad
telomerasa es baja, aunque suficiente como para mantener los telmeros
durante el envejecimiento limitando su vida proliferativa. Por otro lado,
en un modelo de trasplante seriado en ratn con sobreexpresin de telomerasa, las HSC de animales transgenicos y no transgnicos no pudieron ser trasplantados ms de cuatro veces, lo que indica que otros
mecanismos, que no son la telomerasa, limitan tambin la funcin de las
clulas madre. Adems, la disfuncin de los telmeros altera tambin el
nicho de las clulas madre. Utilizando ratones knockout en telomerasa
(Terc-/-), se ha demostrado que la falta de telomerasa induce alteraciones
en el microambiente de la mdula sea, por disminuir el compartimento
de las clulas del estroma y reducir la capacidad de las clulas de la
medula sea en su actividad de soporte de la hematopoyesis. La actividad de soporte hematopoytico depende de la edad y se relaciona con
el progresivo acortamiento de telmeros en estas clulas estromales.
Adems, la disfuncin de los telmeros altera la expresin de varias
citoquinas en plasma de los ratones viejos Terc-/-, antes citados. Estos
datos proporcionan evidencia clara, que el acortamiento de los telmeros no es el nico mecanismo intrnseco implicado en el envejecimiento
celular de las HSC, aunque la prdida de telmeros induce alteraciones
asociadas a la edad en el ambiente de las clulas madre que pueden
alterar la funcin y el enraizamiento de las HSC en casos de trasplante
(37, 39).
La longitud de los telmeros se ha demostrado que est controlada
por mecanismos epigenticos. El mantenimiento y elongacin de los
telmeros mediado por la telomerasa dependen en gran parte de la estructura del telmero, y est regulada por protenas de unin al telmero
y por modificacines de la cromatina a nivel de los propios telmeros.
Los telmeros muestran modificaciones en las histonas caractersticas
de los dominios heterocromatnicos y de cromatina silenciada, tales
como la trimetilacin de H3K9 y H3K20 y la unin de la protena de
unin a la doble cadena (HP1) (40, 41).
156
ENVEJECIMIENTO
DE LAS CLULAS MADRE
Algunos sndromes humanos se caracterizan por mutaciones en los

genes de la telomerasa que ocasionan ritmos acelerados de acortamiento
de los telmeros. Estas enfermedades son, algunos casos de disqueratosis
congnita, anemia aplsica, y fibrosis pulmonar idioptica. En particular,
los pacientes con disqueratosis congnita acarrean mutaciones en componentes del complejo de la telomerasa que producen una estabilidad disminuda de la telomerasa y telmeros ms cortos. Estas mutaciones afectan a los genes Terc y Tert (en pacientes con disqueratosis dominante
congnita) o al gen de la disqueratosis congenita 1 (DKC1) (en pacientes
con la forma ligada a X de la enfermedad), los cuales codifican una telomerasa que interacciona con protenas implicadas en la estabilidad de
Terc y en el procesamiento del RNA nuclear pequeo. Ambas mutaciones dan como resultado una actividad telomerasa muy disminuida y telmeros muy cortos. Sorprendentemente, los pacientes con disqueratosis
congnita desarrollan muchas de las patologas demostradas en el modelo de ratones deficiente en Terc-/-, tales como corta estatura, hipogonadismo e infertilidad, defectos en la piel y en el sistema hematopoytico, fallo
en la mdula sea y muerte prematura. Al igual que en ratones deficientes en Terc, los pacientes con disqueratosis congnita tambin muestran
inestabilidad cromosmica con el envejecimiento, lo cual est de acuerdo
con una velocidad mayor de prdida de los telmeros.
FISIOPATOLOGA DEL ENVEJECIMIENTO
Y TERAPIA REGENERATIVA
Muchas de las situaciones patolgicas que afligen al anciano, anemia,
sarcopenia, osteoporosis, etc, derivan de una alteracin entre la prdida y
la renovacin celular. El hecho de que el mantenimiento homeosttico y
el potencial regenerativo de los tejidos decaigan a medida que transcurre
la vida, ha implicado el declinar de las clulas madre como hecho crucial
en el complejo proceso del envejecimiento. Es un hecho reconocido que
la edad avanzada va acompaada, adems, por mayor riesgo de cncer.
Como el cncer surge despus de la adquisicin de mltiples eventos
mutagnicos, las clulas de larga vida son las que estn ms propensas
para acumular dichas mutaciones. As, las clulas madre son los objetivos ideales para el acumulo de dao precanceroso, ya que las propiedades que caracterizan a estas clulas, autorrenovacin y diferenciacin, las
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capacita para mantener y propagar las mutaciones adquiridas en el transcurso del tiempo, tanto en la progenie autorrenovable como en los progenitores ms diferenciados durante la vida del organismo (42).
El peligro del acmulo de mutaciones en las clulas madre tiene su
contrapartida en la accin de las protenas supresoras de tumores, que
suprimen los clones malignos mediante la apoptosis o parada del crecimiento. Sin embargo, como las demandas homeostticas de los tejidos
requieren la actividad de las clulas madre y de las clulas progenitoras,
estos supresores tumorales pueden, sin advertirlo, conducir al descenso
de actividad de las clulas madre, contribuyendo as al envejecimiento.
El cncer es la causa conductora de muerte en individuos de edad
avanzada, y a pesar de la pltora de nuevas terapias anticncer en los
ltimos diez aos, la muerte ha descendido solo un 1,5% por ao. Como
la multiplicidad de eventos moleculares que se corresponden con el
envejecimiento ocurren tambin en tumores, los estudios para elucidar
las aberraciones moleculares en clulas madre y progenitoras durante la
vejez, puede proporcionar la forma de aumentar el conocimiento en la
formacin del cncer y dirigirlo hacia el diseo de nuevas terapias.
Muchos cnceres, incluyendo el de colon, mama, cerebro, cabeza y
cuello del tero, pancretico y hematopoyticos, contienen poblaciones
pequeas de clulas iniciadoras de tumores o clulas madre cancerosas
(CSC) (1, 42). Las CSC comparten muchas de sus propiedades funcionales con las clulas madre normales, incluyendo el potencial ilimitado
de autorrenovacin. Al igual que las clulas madre normales, las CSC
tienen el potencial de hacer surgir la mayora de los tipos celulares
tumorales y son, en sus ltimas causas, las responsables del mantenimiento continuo del tumor. Adems las CSC, como las clulas madre
normales, expresan elevados niveles de protenas transportadoras de
multirresistencia a frmacos, ABC/MDR que median el eflujo de los
frmacos, una propiedad que las capacita a evadir el efecto de la quimioterapia, y contribuye a la recada. De hecho, la causa conductora de
la muerte en pacientes con cncer contina siendo la resistencia, intrnseca o la adquirida, de las clulas tumorales a la terapia. El grado en el
cual las CSC derivan directamente de las clulas madre normales o
transformadas, o son el resultado de eventos transformantes que imparten propiedades de clulas madre a progenitores comprometidos, es
probable que sea variable entre los diferentes cnceres, aunque estn
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ENVEJECIMIENTO
DE LAS CLULAS MADRE
implicadas las aberraciones en los mecanismos que gobiernan la autorrenovacin y la supervivencia y las decisiones del destino celular, ya
que estos son procesos normales estrictamente regulados.
Una de las enfermedades ms estudiadas que demuestra la correlacin entre el envejecimiento de las clulas madre y la adquisicin de
mutaciones requeridas para la transformacin maligna es la leucemia
mieloide crnica (CML), la cual es, en general, enfermedad de ancianos.
La CML fue el primer tumor maligno asociado con anormalidad cromosmica y su tirosina quinasa constitutivamente activa, es el producto de
la fusin BCR/ABL. La CML fue tambin el primer cncer que se demostr que derivaba de una clula madre y que fue tratado teraputicamente con un frmaco diseado para inhibir la expresin de la oncoprotena BCR/ABL (1, 43). Los mecanismos moleculares que conducen a
la progresin de la CML humana, desde su fase crnica hasta la crisis
mieloide blstica, han sido ya muy estudiados, pero solo recientemente
ha sido evaluado el papel de las clulas madre y las progenitoras. En la
fase crnica se ha demostrado que el transcrito de fusin BCR/ABL,
estaba presente a elevados niveles en las HSC fenotpicas, mientras que
el estado de crisis blstica fue caracterizado por la expresin amplificada de BCR/ABL en progenitores de granulocitos/macrfagos comprometidos (GMP). Despus de la transicin de la crisis blstica se encontr
que los GMP haban ganado la capacidad de autorrenovacin y de transferir la crisis blstica a ratones inmunodeficientes, en parte, como consecuencia de la adquisicin de la autorrenovacin que fue conseguida a
travs de la va de sealizacin de la Wnt/ catenina, lo cual demuestra
la formacin de clulas madre leucmicas (LSC) (1, 44).
Estos y otros muchos estudios refuerzan la importancia de los mecanismos intrnsecos y extrnsecos que establecen un puente entre la
regulacin de las clulas madre normales y leucmicas. Esclarecer estos
mecanismos ha de aportar ms informacin sobre estrategias de diagnstico y pronstico, as como proporcionar vas para el desarrollo de
nuevas terapias.
La consideracin de la terapia regenerativa en su aplicacin a las
enfermedades relacionadas con la edad, ha atrado la atencin hacia dos
categoras de clulas madre: las clulas madre adultas, especficas de
tejidos y las clulas madre embrionarias. El establecimiento de las clulas madre embrionarias (ESC) por Thompson en 1998 (45), ha promo159
vido el entusiasmo de los investigadores relacionados con este campo,

hacia el estudio de las clulas madre. Existen diferencias entre estos dos
tipos celulares con respecto a su potencial teraputico: las ESC tienen
un potencial ilimitado para el crecimiento y diferenciacin, mientras que
las clulas madre adultas estn dirigidas hacia la especializacin. As,
las clulas madre adultas tienen la capacidad de regenerar los tejidos en
los cuales ellas se encuentran durante la vida de un individuo, mientras
que las ESC tienen el potencial de formar la mayora de los tipos celulares del organismo adulto por un casi ilimitado perodo de tiempo.
Sobre la base de modelos animales, varios estudios han afirmado que las
clulas madre adultas pueden tambin desarrollar un potencial comparable al de las clulas madre embrionarias (46). Estudios ms recientes,
sin embargo, han cuestionado la interpretacin de los resultados iniciales que sugieren la plasticidad o transdiferenciacin de las clulas madre
adultas (47). Mientras que alguno de los experimentos que demostraban
la versatilidad de las clulas madre adultas, no fueron reproducibles,
otros estudios detectaron, tanto in vitro como in vivo, fusiones espontneas de clulas y ncleos entre clulas madre adultas y clulas diferenciadas del organismo.
La fusin celular puede, por tanto, explicar el fenmeno que se ha
interpretado como evidencia de transdiferenciacin, aunque otros estudios han demostrado que la transdiferenciacin se verifica sin fusin
celular, especialmente en condiciones fisiolgicas del feto en desarrollo,
aunque a frecuencia muy baja (48). Adems, al contrario a las ESC, que
pueden derivar de lneas celulares establecidas desde los 4 a los 7 das
del embrin, las clulas madre adultas son evasivas. Para tratar la leucemia, son necesarios ensayos in vitro para identificar si los progenitores hematopoyticos humanos se incrementan con el advenimiento del
trasplante de tejido hematopoytico. Cualquier ensayo para evaluar clulas madre adultas ha de comparar las propiedades de las clulas analizadas in vitro con aquellas de unidades de repoblacin probadas in
vivo despus de una dosis letal de irradiacin. Este modelo experimental
no es posible en humanos (46). Para poner a prueba las clulas madre
adultas, se han desarrollado ensayos de colonias, incluyendo los de
clulas iniciadas a largo plazo (LTC-IC) y ensayos de clulas iniciadas
mieloides-linfoides, que pueden servir como marcadores para la repoblacin potencial de las clulas madre en una poblacin dada (46).
Adems, se ha demostrado que los marcadores de superficie tales como
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ENVEJECIMIENTO
DE LAS CLULAS MADRE
CD34, CD133, Thy-1 y HLA-DR, se asocian con la cualidad de clulas

madre de las preparaciones celulares. A pesar de todos los esfuerzos
realizados durante los ltimos aos, ningn ensayo se considera adecuado para identificar las HSC. As que, no existe sustituto apropiado para
ensayos de repoblacin en un modelo de trasplante de ratn, despus de
una dosis letal de irradiacin. Un modelo de ratn inmunocomprometido, tal como el modelo SCID, o modelos de trasplante in utero de oveja,
usando animales tolerantes a las HSC humanas, han sido propuestos
para estimar los potenciales de repoblacin de las HCS humanas (49).
El impacto del tiempo y la edad en la cantidad y calidad de las HSC
de ratn han sido estudiados, pero la informacin sobre la senescencia
en HSC humanas es escasa. Este estudio es de gran importancia porque
estas clulas mantienen su funcin durante ms tiempo que el promedio
de la vida humana. La mayor parte del conocimiento que se ha conseguido acerca de la senescencia de las clulas madre ha sido a travs de
estudios en ratones, ya que estos animales comparten ms del 90% de
su genoma con el humano y tienen 30 veces ms corta la vida, por lo
que se espera que las observaciones en el comportamiento de las clulas
madre en ratn, puedan ser extrapoladas a las HSC de humano. Varios
estudios han indicado que incluso pensando en concentraciones similares de HSC, que se encuentran en mdula sea joven y vieja, la capacidad funcional por clula en el modelo de repoblacin es lo que muestra una reduccin significativa dependiente de la edad del donante, y
que la senescencia de las HSC se regula por varios elementos genticos
ubicados en cromosomas especficos (50). Estos elementos pueden diferir entre las especies, razas e incluso en individuos en el modelo de
ratn. En humanos, la senescencia de las HSC y sus efectos patolgicos
relacionados, pueden no ser tan obvios como en el modelo de ratn
porque los clones de HSC primitivos pueden producir progenie que
soporte la produccin de clulas sanguneas maduras a lo largo de la
vida, lo cual est claro despus del trasplante de mdula sea o de HSC.
El potencial teraputico de los tratamientos basados en clulas madre
fue demostrado por primera vez en los ltimos 1960 (51, 52), cuando se
utiliz el trasplante de mdula sea para tratar pacientes con inmunodeficiencia hereditaria o con leucemia aguda. Sin las ventajas del conocimiento actual de inmunologa y los cuidados de apoyo, las tasas de
morbilidad y mortalidad eran altas. Sin embargo, los resultados fueron
estimulantes comparados con aquellos obtenidos a partir de opciones de
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tratamiento convencional. El trasplante de mdula sea ha llegado a ser

mucho ms eficiente y se ha comprobado que es la nica posibilidad de
cura para algunos pacientes con enfermedades hereditarias y malignas.
Aunque inicialmente identificadas en la mdula, las HSC fueron posteriormente encontradas en sangre perifrica despus de estimulacin
durante la fase de recuperacin de terapia mielosupresora o de la administracin de citoquinas. Estas HSC de sangre perifrica han sido trasplantadas con xito en lugar de la mdula sea para reconstituir las
funciones hematopoyticas e inmunes en los receptores (46).
Encontrar medios para reactivar las clulas madre y controlar su destino ha de crear oportunidades impredecibles para la curacin de enfermedades degenerativas. Las clulas madre son enormemente prometedoras para terapias de reemplazo celular o reparacin de tejidos, en muchas
enfermedades degenerativas del envejecimiento, ictus, enfermedad cardiaca, diabetes y enfermedad de Parkinson. Considerando el tiempo y la
edad, la investigacin con clulas madre es importante por dos razones:
primera, porque supone un buen modelo para estudiar el envejecimiento
y segunda, porque los cambios asociados con la senescencia de clulas
derivadas de la mdula sea, puede proporcionar pistas pertinentes para
descifrar el proceso de envejecimiento celular. Por otra parte, encontrar
caminos para reactivar las clulas madre y controlar sus destinos puede
crear oportunidades imprevistas para curar enfermedades.
Todas las clulas del organismo poseen un repertorio de unos 30.000
a 40.000 genes de los cuales en cualquier momento solo una cuarta parte
se expresa. Las bases fundamentales de las diferencias en los diferentes
tipos de clulas (corazn, cerebro, hgado, piel, etc), que comprenden el
organismo, se encuentran en la decisin celular de qu genes expresa o
reprime. Durante el desarrollo fetal, las clulas madre embrionarias con
completo acceso al genoma van a dar lugar a la multitud de tipos celulares requeridos para un individuo completo, generando progenies con
acceso al genoma cada vez ms restringido, las cuales se van comprometiendo a ciertos destinos celulares.
La necesidad de progresar en las terapias de reemplazo de clulas
y rganos es acuciante, en tanto en cuanto la sociedad tiende hacia un
aumento de la poblacin con edad avanzada. Est claro, que son
muchas las enfermedades que no pueden ser curadas por los frmacos
en uso, tales como la diabetes tipo I, enfermedad de Parkinson, fallo
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ENVEJECIMIENTO
DE LAS CLULAS MADRE
heptico y deterioro de los cartlagos. Para estas enfermedades, la clave

del progreso ha de ser la terapia basada en la introduccin de clulas
de reemplazo. La meta de hoy es promover la regeneracin de los
tejidos en casos de enfermedad y de envejecimiento normal. Los progresos en la Terapia Regenerativa dependern de los progresos en la
biologa de las clulas madre y requerirn el desarrollo de tecnologas
y destreza en el aislamiento, cultivo y manipulacin de clulas con
capacidad de diferenciarse en varios tipos celulares. Las recientes
investigaciones sugieren que una sola o unas pocas clases de clulas
madre residen en muchos tejidos adultos y que las seales ambientales
determinan cmo estas clulas se diferencian. Ser importante determinar cules son esas seales. En este aspecto, ya se posee una larga
tradicin en estudios de biologa del desarrollo y diferenciacin de
clulas madre embrionarias de ratn.
Se ha demostrado que clulas de medula sea de ratn estn constantemente migrando al cerebro para producir nuevas clulas nerviosas.
Aunque esto ocurre con muy pocas clulas, esta observacin sugiere la
existencia de una va natural de regeneracin del sistema nervioso y
puede predecirse un da no lejano, en el que se desarrollen frmacos que
estimulen la produccin endgena de nuevas clulas nerviosas a partir
de clulas de la mdula sea (53). Se ha identificado tambin un gen
regulador (factor de transcripcin) que opera como un interruptor maestro en las clulas madre, conducindolas para convertirse en neuronas
(54, 55). Estudios en clulas madre del msculo han proporcionado un
modelo animal (ratn) para probar terapias de reemplazo celular en
distrofias musculares (55). Terapias de ingeniera de reemplazo celular
para la restauracin de clulas productoras de insulina, en pacientes con
diabetes tipo I, es otro de los retos en la actualidad (56).
CONCLUSIONES
El envejecimiento celular y la senescencia no representan necesariamente un destino inevitable de las clulas, porque la senescencia celular
no se ha observado en organismos primitivos como tampoco en clulas
germinales. El envejecimiento en diferentes especies se relaciona con el
tiempo de generacin y parece proporcionar una ventaja evolutiva para
el total de las especies. Es interesante destacar que este proceso est
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restringido a organismos superiores con un mesodermo y nichos de

clulas madre altamente especializados.
Hoy se sabe que el organismo adulto contiene reservorios de clulas
madre residuales, que se parecen a las clulas primitivas del embrin y
que tienen la capacidad de ser instruidas para producir una panoplia de
tipos celulares que puedan ser utilizados para beneficio teraputico. Se
estn desarrollando con gran rapidez, nuevas tecnologas que permitirn
que las clulas maduras diferenciadas readquieran su capacidad de acceso completo al genoma, y puede vislumbrarse el da, en el futuro
cercano, en el que casi cualquier clula podr reprogramarse para producir clulas con propiedades de clulas madre.
Datos recientes sugieren que envejecemos, en parte, porque nuestras
clulas madres autorrenovables envejecen como resultado de acontecimientos intrnsecos. El control extrnseco del nicho juega un papel
importantsimo en la regulacin del envejecimiento de las clulas madre
y, por tanto, en la regeneracin tisular en el organismo viejo. Varios
mecanismos moleculares diferentes pueden estar implicados en este
control, y se necesitan futuras investigaciones para profundizar en este
tema de tanta repercusin fisiolgica.
La prdida de la autorrenovacin y las deficiencias en la diferenciacin de las clulas madre son responsables del fenotipo tpico del envejecimiento. Los mecanismos moleculares que contribuyen al envejecimiento de las clulas madre son aquellos implicados en la eliminacin
por apoptosis o senescencia de las clulas con dao gentico, el cual
puede suponer un riesgo para la integridad del organismo. Ambas HSC
y MSC estn siendo usadas en clnica. Por tanto, el conocimiento del
envejecimiento de estos compartimentos de clulas madre es importante, no slo desde la perspectiva de la prevencin o mejora de las disfunciones asociadas a la edad, sino tambin para tenerlas en consideracin
frente a donantes de clulas madre selectivas para ser utilizadas en terapias celulares. Las HSC son las clulas madre mejor caracterizadas y
se posee un razonable conocimiento del efecto de la edad sobre su
capacidad proliferativa y funcional. Esto ha conducido al uso en clnica
de las HSC de neonatos, especficamente la sangre del cordn umbilical.
Estudios en MSC sugieren que tanto HSC como MSC sufren un declinar
en su capacidad de diferenciacin y expansin a medida que transcurre
la edad del organismo. Sin embargo, el grado de este declinar no est
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ENVEJECIMIENTO
DE LAS CLULAS MADRE
claro debido a la falta de consenso entre las caractersticas fenotpicas,

condiciones de crecimiento, y dependencia de los estudios in vitro que
llevan consigo extensas comparaciones.
ABREVIATURAS
ABC, ATP binding cassette, BRC/ABL, gen de fusin del cromosoma
Filadelfia; CDK, quinasas dependientes de ciclina; CDK2a, locus que
codifica dos protenas supresoras de tumores; CML, leucemia mieloide
crnica; CSC, clulas madre cancerosas; ESC, clulas madre embrionarias; FDF, fraccin de clulas que se divide rpidamente; G-CSF, factor
de crecimiento de colonias de granulocitos; H2AX, variante de histona;
H3K9, histona 3 metilada en lisina 9; H3K20, histona 3 metilada en lisima 20; HMGA protena no histona, que se asocia a la cromatina; HP1,
protena que responde a la rotura de la doble cadena; HRP, protena rica
en histidina que se une a los telmeros e incrementa su longitud gradualmente; HSC, clulas madre hematopoyticas; LSC, clulas madre leucmicas; MDR, multirresistencia a frmacos; MSC, clulas madre mesenquimaticas; NSC, clulas madre neurales; Rad51, familia de protenas
que intervienen en la reparacin de roturas de la doble cadena; ROS,
especies reactivas de oxgeno; SDF, fraccin de clulas que se divide
lentamente; SMP, polimorfismo de un solo nucletido; SOD1, superxido dismutasa 1; TA, amplificacin transitoria; TERC, componente RNA
de la telomerasa; TERT, componente proteico de la telomerasa.
AGRADECIMIENTOS
A doa Adoracin Urrea Salazar por su inestimable ayuda en la
realizacin de este manuscrito.
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6.
Clulas madre del cncer

AUGUSTO SILVA GONZLEZ
RESUMEN
Desde hace aos sabemos que los tumores son masas celulares con
un crecimiento anmalo, que causan la invasin y destruccin de rganos y tejidos y, si no se detienen a tiempo, causan la muerte del individuo. Sin embargo, la masa tumoral dentro de un tumor slido o las
clulas del cncer que componen una leucemia son heterogneos en
cuanto a las clulas que lo componen. Hoy sabemos que, entre los tipos
celulares que podemos encontrar dentro de un tumor, existe un pequeo
grupo de clulas que son responsables de poder trasplantar este tumor
en un ratn inmunodeprimido (ratn desnudo, nude mice) y formar un
nuevo tumor con las mismas caractersticas que el tumor original. La
gran mayora de las clulas tumorales, carecen de esta propiedad y tras
su trasplante, las clulas se pierden y el tumor nunca aparece. Estas
clulas que son capaces de reproducir el mismo tumor en otro animal,
y probablemente las mismas que son capaces de crear metstasis en
otras zonas del cuerpo, son denominadas Clulas Madre del Cncer
(CSC). Si estas clulas son las responsables de inducir o de mantener el
cncer su estudio nos permitir, no solamente conocer mejor las bases
celulares y moleculares del cncer, sino la posibilidad de abordar de una
manera completa su tratamiento y curacin. De estas clulas, de sus
caractersticas y de los diferentes modelos y tipos de cncer donde se
han descubierto, trata esta revisin. Para que un cncer se cure, es necesario y suficiente eliminar las CSC.
169
ABSTRACT
We have known for many years that tumors are cellular masses with
an abnormal growth that cause invasion and destruction of organs and
tissues, and that, if they are not stopped, lead to death of the individual.
Inside the tumor mass o among leukaemia tumoral cells, however, there
is heterogeneity regarding cell types. We now know that among the cell
types that we can find within a tumor, it exists a small group of cells
which are responsible for a new tumor growth if they are transplanted
to nude mice; this tumor would have the same characteristics as the
original. The majority of tumoral cells lack this property and, after a
transplant, they are lost and do not produce a new tumor.
These cells that are able of reproducing the same tumor in another
animal and, possibly, the cells that are able to generate a methastases in
another location in the body, are denominated Cancer Stem Cells (CSC).
If they are responsible of induction or maintenance of a cancer, their
study will allow us not only to better know the cellular and molecular
basis of cancer, but also the possibility of a more complete approach
towards therapy and cure. This review presents the different types and
characteristics of CSC and the models in which they have been studied.
For a cancer to be cured, is necessary and sufficient to eliminate the
CSC.
INTRODUCCIN
La hiptesis ms aceptada en este momento, es que las clulas madre
del cncer son clulas que tienen unas caractersticas que podemos
considerar similares a las clulas madre adultas especficas de tejido.
Esta hiptesis, est basada en los primeros datos que apuntaban que el
origen de cada tipo diferente de cncer se debe generar entre las poblaciones de clulas madre especificas de cada tejido. Si consideramos
algunas de las caractersticas que tienen las clulas tumorales estas son
muy similares a las que tienen las clulas madre adultas (Tabla 1).
En cualquier caso hay indicios que apuntan a que la transformacin
en las clulas iniciadoras de cada tipo de cncer, pueden estar asociadas
a clulas muy tempranas, con una alta capacidad de autorrenovacin y
170
CLULAS
TABLA 1.
MADRE DEL CNCER
Caractersticas de las clulas madre
Capacidad de autorrenovacin
Aquella actividad que permite, tras la divisin celular conservar la capacidad pluripotente en una clula hija.
Replicacin ilimitada
Aunque con distintas velocidades las diferentes clulas madre presentan divisiones durante toda la
vida.
Divisiones asimtricas
Divisin donde cada clula hija se comporta de forma diferente.
Larga vida y con diferente

tipo de envejecimiento
En discusin. Ambas tienen una larga vida y por lo

tanto ms oportunidades de acumular nuevas mutaciones.
Sensibilidad a los frmacos
La clulas madre tiene en su superficie molculas

trasportadoras que eliminan muchos colorantes y
evitan que se acumulen drogas txicas.
Marcadores celulares
Unas y otras pueden y tienen algunos marcadores

propios, lo que nos podra ser de ayuda para su
identificacin. Huella celular.
Capacidad de diferenciacin
Esta capacidad es esencial en las clulas madre,

pero sabemos que algunos tumores pueden generar
clulas con caractersticas de clulas maduras.
Capacidad clonal
La capacidad de una sola clula de replicar la colonia entera y formar un nuevo clon es una actividad compartida.
emparentadas ms directamente con las clulas madre embrionarias que

con las clulas madre adultas especficas de tejidos. Es sorprendente que
un tumor hematopoytico o un cncer de mama, en un individuo adulto,
pueda estar relacionado con mecanismos que han ocurrido en las primera etapas del desarrollo embrionario, pero hay datos que apuntan a que
muchas de las rutas y mecanismos que operan en las etapas tempranas
del desarrollo, no estn completamente anulados en las clulas de los
individuos adultos y en algunas clulas tumorales. Estos recientes descubrimientos estn planteando muchos interrogantes sobre la biologa de
las clulas madre y su papel en la tumorignesis.
171
LAS CLULAS MADRE DEL ADULTO ESPECFICAS

DE TEJIDO
Pertenecen a un conjunto de clulas que localizadas en microentornos especficos de un tejido, un nicho, permiten el mantenimiento de los
tejidos. Hoy sabemos que cada tejido tiene una vida media y que al cabo
de determinados aos las clulas que constituyen un corazn, pulmn,
msculo o hgado son diferentes a las clulas que tenan diez o quince
aos antes (1, 2). Esto sugiere la presencia en cada tejido de un conjunto
de clulas, denominadas clulas madre adultas especificas de tejido, que
sustituyen a las clulas envejecidas o daadas por nuevas clulas capaces de cumplir todas las funciones a las que estaban destinadas (3). Este
conjunto de clulas madre o troncales derivan de las clulas embrionarias que tenan la capacidad de generar a todo el resto de clulas madre
de tejidos.
Las clulas embrionarias slo son totipotentes en estadios muy tempranos de la embriognesis, de hecho slo hasta estadios embrionarios
de 8 blastmeros podemos considerarlas totipotentes, mientras que en
estadios posteriores, y sobre todo en estado de blastocisto, un grupo de
clulas se acumulan en uno de los polos, y pierden esta condicin,
considerndose a esa masa de clulas como clulas pluripotentes. El
acmulo celular en el blastocisto se denomina masa interna celular
(inner cell mass, ICM), y constituye el pre-embrin, generando todos
los tejidos del futuro individuo a partir de las tres capas embrionarias:
endodermo, ectodermo y mesodermo (Figura 1).
As, existe un gradiente de actividad pluripotente y de actividad de
autorrenovacin, que se asocia con presencia en estados muy tempranos
del desarrollo, y que las clulas van perdiendo segn se van diferenciando hasta llegar a ser una clula completamente madura (Figura 2).
Lo importante es que cada una de estas clulas embrionarias de la
ICM ser la responsable de la generacin de las futuras clulas madre
especficas de tejido. Es de la ICM de donde se obtienen las lneas
estables embrionarias o clulas ES (embryonic stem cells), que permiten
mantener en cultivo in vitro, y a lo largo de muchas generaciones, clulas con capacidad embrionaria. Es muy importante poder obtener lneas de clulas ES estables, ya que estas tendran la capacidad de convertirse en cualquier clula de un individuo adulto. El control adecuado
172
CLULAS
MADRE DEL CNCER
FIGURA 1.
Generacin de clulas madre embrionarias y tipos de adultas.
FIGURA 2.
Caractersticas de las clulas madre embrionarias, adultas y de los progenitores.
173
de la correcta diferenciacin de estas clulas ES hacia clulas especficas de tejido, o sus clulas diferenciadas, generara una fuente ilimitada
de las clulas de cada tejido, que podran ser utilizadas en futuras aproximaciones en medicina regenerativa.
Sin embargo, la situacin hoy dista mucho de estar controlada y as
las lneas celulares embrionarias ES que se han derivado, cuando se
trasplantan in vivo, en animales de experimentacin, generan con alta
frecuencia masas celulares indiferenciadas teratomas que, en algunos casos, tienen una alta capacidad metasttica, produciendo los teratocarcinomas. En seres humanos, se han utilizado inicialmente algunas
de estas clulas (hES), con no muy buenos resultados, y de momento,
solo se usan con fines de investigacin. Los mecanismos de cmo se
generan estas masas tumorales a partir de las clulas ES no estn an
bien definidos, pero esta situacin nos ha puesto en guardia sobre la
capacidad de generar tumores de muchas de las clulas que consideramos clulas madre.
La principal causa de lo anterior es que toda clula con caractersticas de madre tiene al menos dos rasgos que la distinguen del resto de
las otras clulas: estas clulas nunca pierden su capacidad de mantenerse
como clula madre a lo largo de toda la vida del organismo (concepto que
definiremos como autorrenovacin), y la segunda es su capacidad de
generar clulas diferenciadas y, en sus etapas finales, clulas maduras
completamente funcionales. Esta actividad la logran al poder sufrir una
divisin de tipo asimtrica, donde una clula da lugar en su proceso de
divisin a dos clulas hijas diferentes, una que mantiene una total capacidad de mantenerse como clula madre, y otra que se convierte en un
progenitor con menor actividad de autorrenovarse, y que ser de la que
derive la clula diferenciada propia de los tejidos (Figura 3).
Lo cierto es que el nmero de clulas madre especficas de tejido es
muy bajo, y en la gran mayora de los tejidos an desconocemos cuales
son los posibles marcadores que nos permitan obtener la informacin
necesaria para su identificacin y localizacin.
La identificacin y seleccin de estas clulas madre de cada tejido,
nos permitira, no solo conocer mejor su biologa y estudiar como son
capaces de llevar a cabo estas divisiones asimtricas a lo largo de toda la
vida del organismo, sino usarlas en modelos de reparacin tisular en zo174
CLULAS
FIGURA 3.
MADRE DEL CNCER
Diferencias entre clula madre, progenitoras y clulas diferenciadas.
nas daadas de tejidos, y probablemente diferenciarlas hacia algunos de

los linajes de clulas que debern ser sustituidas.
Aunque es verdad que desconocemos un mtodo selectivo para poder
identificar y seleccionar la clula origen de muchos tejidos, cada da
nuevos artculos cientficos nos aproximan a subpoblaciones celulares
de organismos adultos que identifican poblaciones capaces de generar
modelos in vitro de diferenciacin celular, y que nos permiten obtener
clulas funcionalmente activas, y con caractersticas de clulas madre
muy similares a las encontradas en un tejido. El trasplante de estas
poblaciones, sin embargo, no siempre funciona in vivo.
LAS CLULAS MADRE TEJIDO ESPECIFICAS Y EL CNCER
Por qu es tan importante conocer estas clulas madre especificas
de tejido y qu relacin tienen con el cncer? La respuesta es sencilla,
pensamos que el cncer proviene de estas clulas.
Desde hace aos sabemos que muchos tratamientos frente al cncer
no generan una respuesta de eliminacin total de las clulas malignas y,
por lo tanto, no conllevan su curacin. En muchas ocasiones, un pequeo grupo de clulas resiste el envite de los tratamientos de quimioterapia
y radioterapia y logra escapar. Estas clulas residuales se comportan
175
como clulas activas tumorales, aunque a veces de bajo ndice mittico,

es decir crecen lentamente, por lo que la mayora de los frmacos antitumorales clsicos les afectan en menor grado. Eso nos dice varias
cosas importantes, 1) que los tumores son masas celulares heterogneas,
constituidos por diferentes tipos celulares y con diferente grado de diferenciacin, b) que las clulas ms resistentes a los frmacos antitumorales son, en general, una porcin menor dentro de un tumor, y 3) que
estas clulas tienen caractersticas similares a las clulas madre adultas
del tejido correspondiente.
Actualmente se han podido identificar distintos tipos de clulas
presentes en distintos tipos de cnceres y que se sealan como posibles
clulas CSCs en leucemias (4-6), cncer de mama (7-10), de cerebro
(11-14), cnceres colo-rectales (15-17), cncer de cabeza y cuello (18,
19), cncer de pncreas (20) o de prstata (21-24). Los estudios de estas
clulas nos ensean la validez de esta nueva hiptesis del cncer, y sus
posibles implicaciones en el tratamiento de estas enfermedades.
EL MODELO HEMATOPOYTICO
Uno de los problemas principales en la investigacin del cncer es
que desconocemos como se inicia, y si este inicio comienza, como
parece, en una nica o en un grupo limitado de clulas, el primer paso
que deberamos de dar sera tratar de identificar esas clulas capaces de
iniciar o de mantener un tumor. Hoy la hiptesis de la presencia de las
CSC, se basa principalmente en nuestro conocimiento del sistema hematopoytico (25).
En los aos 1950 y 1960, se empezaron a dar los primeros pasos que
llevaron a descubrir que todas las clulas de la sangre provenan de un
nico tipo celular, que de forma jerrquica daba lugar a clulas precursoras sanguneas, las cuales, a su vez, generaban los componentes celulares de la sangre. Se vio que estas clulas madre hematopoyticas,
HSC, son clulas de vida muy larga, sin casi divisin celular (quiescentes) y pluripotentes, al poder generar muchos diferentes tipos celulares,
y capaces de autorrenovarse a lo largo de la vida del individuo. Este
modelo ha sido el que se ha seguido para buscar clulas madre especficas en otros tejidos, pero la situacin es, como veremos, mucho ms
176
CLULAS
MADRE DEL CNCER
TABLA 2
Mutaciones en clulas madre hematopoyticas (CD34+/CD38) originan algunos tipos
de Leucemia Mieloide Aguda. Una pequea poblacin de clulas progenitoras
CD138- inducen AML tras su inyeccin en ratones desnudos NOD/SCID.
El cncer de mama humano puede ser trasferido a un ratn desnudo NOD/SCID con
menos de 100 clulas del cncer con marcadores CD44+CD24-/lowLin-. El tumor que
generan en los ratones es de caractersticas similares al tumor de mama original.
Menos de un 1% de las clulas de tumores cerebrales peditricos son capaces de
formar neuroesferas (CD133+) de forma clonal.
Las clulas CSC que inician tumores de pncreas humanos son CD44+, CD24+,
ESA+. Pueden formar tumores en ratones NOD/SCID que son histolgicamente indistinguibles de los tumores humanos de los que provienen.
La clulas CSC del cncer colorrectal humano se han identificado con los marcadores ESA+, CD44+ ,CD166+ .
El antgeno de CSC de Prstata (PSCA), es un homologo de los antigenos de
superficie de la familia Ly-6/Thy-1, especfico de las clulas madre de la prstata, y
esta sobre-expresado en muchas clulas de carcinoma de prstata (human carcinoma
transitional cells, TCC)
compleja (26-29). El diseo de un modelo jerrquico permite, no obstante, una alta produccin de clulas sanguneas sin un agotamiento de
las reservas del pool de clulas madre mas pluripotentes (30). Adems,
y ms importante, esto genera una cierta proteccin del riesgo de que se
produzcan cambios genticos que conduzcan a leucemias y otras patologas hematopoyticas: como las mutaciones estn directamente relacionadas con la divisin celular, stas se producirn con ms frecuencia
en las clulas progenitoras que presentan una alta tasa de divisin celular, pero una menor vida media, que en las clulas madre hematopoyticas que tiene baja tasa de proliferacin, an con una larga vida. Si
consideramos que muchos cnceres son el resultado de la acumulacin
de ms de una mutacin, una vida corta siempre favorecer que las
clulas no tengan tiempo para acumular mutaciones y, por lo tanto, para
transformarse en una clula tumoral.
Los estudios sobre enfermedades hematolgicas, en particular la
leucemia mieloide crnica (LMC) y la leucemia mieloide aguda (LMA),
han servido de modelos donde se detectaron por primera vez las clulas
CSC (ver captulo 2).
177
La LMA es una enfermedad clonal debido a una hematopoyesis

aberrante y caracterizada por la acumulacin de clulas blsticas inmaduras que no se diferencian normalmente. A pesar de su homogeneidad morfolgica, las clulas blsticas son biolgicamente heterogneas (31-34); slo una pequea proporcin de clulas muy proliferativas de blastos leucmicos (AML-CFU) son capaces de generar
colonias in vitro. Para explicar la heterogeneidad de las clulas observadas en la LMA se piensa que, dentro de un tumor, las clulas
cancerosas tienen distinta capacidad de generar un nuevo tumor y ellas
y solo ellas, y no de forma aleatoria, son las nicas capaces de iniciar
un cncer.
Debemos mencionar que el concepto de CSC es doble: por un lado
podemos referirnos al grupo de clulas que son las clulas iniciadoras
de un cncer o al grupo de clulas responsables del mantenimiento y
crecimiento del cncer. No siempre sabemos si ambas poblaciones son
idnticas, o si la CSC responsable de perpetuar el cncer comprende a
las clulas responsables del inicio de ese cncer.
Lo que s sabemos es que en las LMA, un grupo de clulas madre
leucmicas, tienen un inmunofenotipo similar al de las clulas HSC
normales. Ambas son CD34+ y CD38-, y ambas tienen la maquinaria de
autorrenovacin que las hace capaces de mantenerse largo tiempo conservando la capacidad de diferenciarse a distintos fenotipos. Algunos de
los genes implicados en el desarrollo normal del sistema hematopoytico y de las clulas leucmicas son comunes y necesarios para ambos
fenmenos, como es el caso del gen Bmi-1. De hecho, hoy sabemos que
al igual que pasa con los progenitores hematopoyticos normales, los
progenitores de las leucemias son tambin quiescentes, o mantienen una
baja capacidad de proliferacin (35-39).
Por otro lado, sera de una enorme utilidad conocer cual es el origen
de las clulas que inician esta LMA. Los primeros datos apuntan a que
la transformacin celular de las clulas normales, ocurre en las clulas
madre, ms que en progenitores comprometidos con un determinado
linaje. Esta hiptesis propone que el fenotipo de los blastos leucmicos
est influido por la propia naturaleza de la transformacin celular.
Sin embargo los programas genticos que activan la autorrenovacin de las clulas CSC en las LMA, no son an conocidos y, dado que
178
CLULAS
MADRE DEL CNCER
representan el vrtice de la pirmide de donde derivarn y se mantendrn este tipo de leucemias, sera deseable buscar el origen molecular de
los cambios, y analizar los genes, los programas transcripcionales y las
rutas moleculares en donde actan. Sabemos que, en un modelo de ratn
de la leucemia humana LMA, las modificaciones tempranas de las clulas HSC se disparan por translocaciones cromosmicas del oncogn
MLL, que ocurre entre un 10-20% de LMA. La translocacin del oncogn MLL, provoca a su vez cambios en las rutas transcripcionales de
grupos de genes como Myb/Hmgb3/ y Cbx5, que son capaces de inducir
la inmortalizacin celular independiente del complejo Hoxa/Meis (4048). Este complejo regula genes que estn directamente involucrados en
los procesos de empaquetamiento de la cromatina en las clulas madre
embrionarias y no en las clulas madre adultas (40-44).
CLULAS MADRE DE TUMORES CEREBRALES
La identificacin de clulas progenitoras del cncer fue definido
por primera vez, en tumores slidos, con tumores cerebrales. Usando
un modelo de generacin de astrocitomas muy agresivos, denominados
astrocitomas tipo IV o glioblastomas multiformes, fue posible identificar subpoblaciones celulares concretas dentro del tumor, que eran capaces de transmitir este tumor cuando a nivel clonal se trasplantaban
en el cerebro de ratones inmunodeficientes. Esta situacin que hoy denominamos clulas madre de cncer de cerebro, cre en el momento
de su descubrimiento no pocas dudas sobre su existencia y sobre su
capacidad de ser la nicas responsables de la generacin de este tipo
de tumores.
Los tumores neurolgicos, incluyen todos aquellos neoplasmas que
derivan tanto del sistema nervioso central (SNC) como del perifrico
(SNP) y, en general, se clasifican por criterios morfolgicos e inmunohistoquimicos. Como las neuronas del individuo adulto estn prcticamente detenidas postmitticas, no es sorprendente que la mayora
de los tumores cerebrales sean de origen glial. Estos tumores llamados
gliomas incluyen aquellos en los predominan los astrocitos (astrocitomas), oligodendrocitos (oligodendriomas) o sus mezclas como los oligoastrocitomas, o clulas del epndimo de los ventrculos (ependimomas). Estos tumores son los principales del sistema nervioso central,
179
mientras que en el sistema nervioso perifrico, los neurofibromas o los

Schwannomas son los ms frecuentes (49-52). La aportacin de los
tumores cerebrales ha sido decisiva a la hora de aceptar la existencia de
las CSC, porque fueron las primeras que se definieron (53, 54), y porque
el avance en la identificacin y seguimiento de estos tumores ha permitido su localizacin en nichos cerca de los tejidos neovasculares formados con el crecimiento del tumor (11).
Los primeros estudios del grupo de Dirks et al. (53, 54), permitieron
identificar una poblacin celular presente en determinado tipo de astrocitomas agresivos (tipo IV, o glioblastomas multiformes, GBM), y que reuna las condiciones que luego se definieron para una clula CSC. As,
constituan una pequea fraccin del tumor y su trasplante en un ratn
induca un GBM de iguales caractersticas al original. La posibilidad de
identificacin nace al obtener un anticuerpo monoclonal que reconoca un
antgeno de superficie de las clulas madre neurales denominado CD133
(55). Clulas CD133+ fueron localizadas en el GBM y se encontr que
era la fraccin CD133+ la que mejor induca nuevos tumores cerebrales,
tras su trasplante en nuevos ratones, al compararla con la fraccin
CD133- (54).
La identificacin de clulas CD133+/nestina+ (otro marcador de
clula madre neural temprana), permiti descubrir la proximidad de estas
clulas cerca de los capilares nuevos que se forman con el crecimiento
del tumor (11). De hecho, la presencia de las clulas endoteliales de los
neo-vasos tiene un efecto sobre la actividad de autorrenovacin, y en el
mantenimiento del estado indiferenciado de las clulas tumorales cerebrales. La participacin del endotelio vascular en el mantenimiento de
las CSC, ha permitido crear una nueva estrategia antitumoral para tumores cerebrales, que se basa en terapias anti-angiognicas, las cuales retrasan o reducen la capacidad de generar nuevos epitelios vasculares.
Tratamientos con la nueva droga Tarceva (Erlotinib), un agente selectivo que inhibe el receptor de EGF y de la tirosina kinasa del oncogen
ERBB2 (56), o Avastin (Bevacizumab), un inhibidor especifico de
VEGF, tienen un gran impacto sobre el desarrollo de los glioblastomas
multiformes ms agresivos, y podran tener un potente efecto antitumoral (este tratamiento ser aprobado por la FDA en el ao 2009).
180
CLULAS
MADRE DEL CNCER
CLULAS MADRE DE CNCER DE MAMA

A diferencia de otros tejidos y rganos que son estructurados durante la embriognesis, y que preservan su arquitectura durante toda la vida
del organismo, la glndula mamaria tiene una serie de cambios en su
morfologa durante distintas etapas del desarrollo. En humanos, el epitelio mamario consiste en un intrincado entramado de ductos que se
forman despus del nacimiento y a travs del lecho de grasa de la mama.
Estos ductos los forman una membrana basal, contrctil, de clulas
mioepiteliales y una capa de clulas tipo-epiteliales denominada capa
luminal (57). Durante la pubertad, y a travs de los estmulos hormonales, los ductos proliferan rpidamente, generando nuevas ramificaciones
y aumentando de tamao y densidad. El proceso final de la diferenciacin es en el momento del embarazo y de la lactancia, cuando se crean
y crecen las estructuras lobulo-acinares, que contienen las clulas alveolares productoras de leche (58). Tras la lactancia, y cuando se reduce la
demanda de leche materna, el tejido mamario sufre una apoptosis masiva y una importante remodelacin tisular, volviendo la mama a la
forma de antes del embarazo. Esta situacin nos permite un anlisis
detallado de la presencia y localizacin de las clulas madre del tejido
mamario, su papel durante los distintos procesos de crecimiento y proliferacin del tejido y su actividad tras los cambios hormonales.
Las hormonas que regulan este proceso son los estrgenos y la progesterona (59). Algunos tumores mamarios cursan con la expresin de
receptores de estrgenos (ER+), y ello tiene enorme importancia en la
prognosis del tumor, al ser los tumores mamarios ER+ menos agresivos
y mejor tratables que los tumores ER-, ms agresivos (60). De hecho,
uno de los primeros tratamientos frente a los tumores ER+ es la terapia
hormonal, as como el uso de anticuerpos monoclonales dirigidos frente
a estos receptores, y que permite la rpida eliminacin de las clulas
ER+. An no sabemos por qu se generan tumores ER+ y ER- pero su
identificacin tiene importantes repercusiones diagnsticas y pronsticas en los futuros tratamientos a aplicar.
Cmo se relaciona la presencia de los receptores ER con la carcinognesis mamaria? Recientemente, distintos grupos han aportado importantes evidencias de que las clulas madre del cncer mamario estn
localizadas y son similares a las clulas madre de tejido mamario (7, 10,
181
61, 62). Usando marcadores celulares del tejido mamario y separando

las celulares mediante citometra de flujo, es posible identificar a la
clula madre tumoral mamaria como clulas CD44+, CD24- Linaje- (no
linfocitos T o B). Slo un pequeo porcentaje (< 2%) de las clulas de
un tumor mamario tiene este fenotipo y slo estas clulas son capaces
de transferir el cncer mamario en un ratn NOD/SCID (63). Las clulas
con receptores para estrgenos ER+, que hasta ahora se haban asociado
con clulas quiescentes, estn ms asociadas a clulas con una baja tasa
proliferativa, algo que ya podemos asociar a clulas ms primitivas y
ms indiferenciadas. Estas clulas ER+ se asocian a poblaciones side
population (SP) que, como habamos mencionado, estn ms prximas
a clulas progenitoras mamarias (64, 65). El hecho de que estas clulas
ER+ puedan formar parte del pool de clulas madre de mama, podra
sugerir que los estrgenos pueden influir en el establecimiento de compartimentos celulares durante el desarrollo.
Aunque no hay una imagen clara de cmo se desarrollan los tumores
mamarios y el papel del receptor de estrgeno ER, los tumores ER-, que
se denominan de tipo 1, derivan de clulas muy primitivas o progenitores tempranos. Son tumores muy indiferenciados, que presentan marcadores de la zona basal y luminal, agresivos y de mal pronstico. Un
segundo tipo de tumores mamarios, denominados tipo 2, son ms heterogneos en la expresin de ER, su grado de diferenciacin es menor y
tienen un pronstico intermedio. Mientras que los tumores ER+ o de
tipo 3, tienen clulas ms diferenciadas, estn ms asociados a clulas
progenitoras con un cierto grado de proliferacin (66).
En conclusin, en el modelo de tumores mamarios, la presencia de
clulas madre tempranas, ligadas a la generacin de todos los tipos de
clulas que constituyen la glndula mamaria, puede estar directamente
relacionada con la generacin de tumores altamente agresivos; aunque
tambin detectamos tumores con clulas ms diferenciadas, que presentan mejor pronstico y con receptores de estrgenos.
CLULAS MADRE DE CNCER DE PNCREAS E HGADO
El adenocarcinoma pancretico es una enfermedad altamente letal,
que se suele diagnosticar en estadios muy avanzados de la enfermedad y
182
CLULAS
MADRE DEL CNCER
para la cual no hay ninguna terapia efectiva. Tiene el peor pronstico de

entre las principales enfermedades, con una media de 3 aos de supervivencia, siendo la cuarta causa de muerte por cncer y con una incidencia
anual de ms de 30,000 muertos anuales slo en EEUU (67).
A pesar de los avances mdicos en ciruga y nuevas terapias, poco
se ha avanzado en su tratamiento. Una de las peculiaridades de esta
enfermedad es su rpida invasividad local y su temprana diseminacin
sistmica, lo que causan su alta mortalidad. A pesar de los esfuerzos
en comprender las bases moleculares y las caractersticas del cncer
de pncreas, los resultados han sido hasta ahora muy pobres. Sin
embargo, la mayora de estos estudios no han considerado la hiptesis
de las CSC y, sobre todo, no han reparado en la enorme heterogeneidad de las clulas que componen este tipo de tumores. De nuevo, como
en otro tipo de canceres humanos, se ha comprobado que slo transmiten este tipo de tumores a un ratn inmunodeprimido un reducido
grupo de clulas del tumor, lo que pone de relieve la existencia de
clulas CSC en los tumores pancreticos. Recientemente, se ha descubierto la existencia de estas clulas madre del cncer de pncreas, usando modelos de xenotrasplante en ratones NOD/SCID, identificadas
como una pequea subpoblacin tumoral con los marcadores CD44+,
CD24+ ESA+ (68, 69). Las CSC de pncreas tienen una alta tasa de
autorrenovacin, la capacidad de producir distintos tipos celulares que
componen el pncreas y una alta expresin de la molcula de sealizacin del desarrollo Sonic Hedghog (SHH) (70). La mayora de los
datos que apoyan el potencial tumorignico de estas CSC pancreticas
derivan de la formacin de tumores de novo, tras el trasplante subcutneo de estas poblaciones, un nicho que no es probablemente el mejor
microentorno celular para el desarrollo de estos tumores pero que
ponen de relieve el enorme potencial tumorignico de estas poblaciones celulares. As, slo 100 clulas CD44+, CD24+, ESA+, que representan menos del 1% (entre 0,2-0,8%) de la masa tumoral pancretica,
producen tras su trasplante subcutneo, un 50% de xito en ratones
NOD/SCID. De hecho, el nmero de tumores que se obtienen de la
inyeccin de estas clulas es superior en trasplantes subcutneos que
cuando se inyectaban directamente en el pncreas del ratn NOD/
SCID. Las CSC pancreticas tienen sobre-regulados genes importantes
de mantenimiento de su actividad autorrenovadora, incluyendo SHH y
Bmi-1 (69).
183
El pncreas y el hgado derivan de una misma poblacin de clulas

pluripotentes del endodermo, y comparten muchos aspectos en su desarrollo temprano. Aunque cada uno de estos tejidos se origina de dominios espaciales mltiples, y bajo la influencia de genes y rutas bioqumicas diferentes, lo cierto es que los progenitores hepticos y
pancreticos pueden revertir su curso de diferenciacin y convertirse en
progenitores intestinales.
De nuevo, es posible encontrar subpoblaciones especficas en algunos tumores hepticos, principalmente asociados a carcinomas hepticos
HCC (hepatocarcinomas), aunque en estas poblaciones se detecta la
importancia de las rutas de la Wnt/beta-catenina en la activacin y expansin de clulas ovales. As, las clulas tumorales del HCC son
OV6(+) y representan una subpoblacin que confiere una alta quimiorresistencia, un condicin que tambin es tpica de las CSCs de otros
tumores humanos (71).
CNCER INTESTINAL Y CLULAS MADRE INTESTINALES
La localizacin y la identificacin de las clulas madre del intestino
han sido controvertidas, debido a la falta de marcadores especficos y
modelos de estudio que nos pudieran mostrar las propiedades de estas
clulas. Recientemente, distintos grupos han identificado estas clulas
tanto en estmago como intestino delgado y en las criptas del colon
(72). Las clulas madre intestinales se pueden reconocer por la expresin de Lgr5, un gen diana de Wnt que codifica una protena G de un
receptor hurfano (orphan receptor) y Bm1, un miembro de la familia
polycomb, asociados a la remodelacin de la cromatina (73). Las clulas
madre intestinales Lgr5+ Bm1+, tienen actividad multipotente, divisin
lenta (una divisin por da) y son capaces de generar el epitelio intestinal durante ms de un ao (74-77). La identificacin de Lgr5 en otras
poblaciones de clulas madre asociadas a la activacin de la ruta Wnt,
nos indica que este gen podra ser un buen marcador de las clulas
madre vinculadas con esta ruta bioqumica. La ruta Wnt es importante
a la hora de comprender la posible presencia de clulas tumorales en el
cncer de colon, donde la activacin de la ruta induce una masiva proliferacin de progenitores de la cripta intestinal, y el disparo del cncer
de colon. De hecho, la mayora de los canceres colorrectales se inician
184
CLULAS
MADRE DEL CNCER
por mutaciones en el gen supresor Apc, actor muy importante de la ruta

Wnt, que cambia el estado activado de forma constitutiva. Tambin
Lrg5 esta asociado a la ruta Wnt y a la tumorignesis. Adems, sabemos
que esta subpoblacin de clulas progenitoras intestinales es necesaria
para iniciar el cncer colorrectal. De nuevo, la presencia de las clulas
iniciadoras del cncer est directamente asociada a la modificacin directa de las clulas madre intestinales (78-80).
CLULAS MADRE DE CNCER DE PIEL
Las clulas madre epidrmicas han sido caracterizadas como clulas
de baja actividad proliferativa, de larga vida, que residen en sitios discretos de la piel. La situacin es algo ms compleja en la piel (y desconocemos si esto se puede trasladar a otros tejidos) al descubrir que la epidermis interfolicular, los folculos del pelo y las glndulas sebceas de la
piel, tienen sus propias e independientes clulas madre epidrmicas (81).
Adems existen otras clulas madre especializadas en envoltura y papila
drmica y un tercer tipo de clulas madre correspondientes a la cresta
neural epidrmica (ver captulo 8). Todos estos tipos de clulas madre
utilizan, sin embargo, rutas bioqumicas similares donde Notch, Wnt/B
catenina; c-myc y Hedghog se combinan para mantener la homeostasis de
la piel (82). Hoy sabemos que los carcinomas de clulas escamosas
(SCCs) derivan de una pequea poblacin de CSC (83).
Esta poblacin de clulas CSC de los tumores SCC, expresan marcadores caractersticos de las clulas madre epidrmicas normales, como
son el marcador MCSP y el FREM4D, pero carecen de otros que tambin estn presentes en las clulas madre de piel, durmientes o de
proliferacin lenta, como Lrig1 y MAP4, probablemente porque en
las clulas CSCs de piel, stas pierden el carcter quiescente al ser
clulas proliferativas (84, 85).
En modelos experimentales de cncer de piel en ratones, e inducidos
mediante tratamientos con agentes que mutan el gen ras, como la 7,12,
dimetil-bencil-antraceno (DMBA), se han identificado poblaciones de
clulas madre del cncer que tiene marcadores CD34+ (alto); y otros
marcadores de las clulas madre del bulge (protuberancia) como EfrinaA4, Sox9, Runx1, Tcf3, y tenascina-C (86, 87). Tambin identifica185
mos unos altos niveles de la integrina 64, cuya presencia en tumores

de piel se relaciona con un peor pronstico. La aparicin de la 64,
parece que es dependiente de las distintas mutaciones de oncogenes que
se acumulan en estos tipos de tumores (88).
De nuevo, comprobamos que las clulas que podemos asociar con
aquellas que inician el cncer de piel, tienen marcadores en la superficie, similares a los que esperaramos de una clula madre normal.
En la bsqueda de clulas madre del cncer de piel, se ha recurrido
a la identificacin y localizacin de clulas denominadas side population (SP), que corresponden a fracciones minoritarias de clulas precursoras que estn presentes en muchos tejidos. Las clulas SP se caracterizan por su capacidad de bombear y eliminar algunos colorantes
vitales, como el Hoechst 33342 o la rodamina 123, que tien las clulas
vivas sin causarles dao. Las clulas SP, tienen en la superficie potentes
complejos, que se denominan transportadores ABC, y que les permite
no quedarse teidas con estos colorantes. As, en condiciones en las que
podemos teir una poblacin disgregada de un tejido, las clulas que se
asocian a las clulas progenitoras del tejido, no resultan teidas con el
colorantes Hoecsht 33342 y, por lo tanto, se pueden seleccionar mediante citometra de flujo (89).
La localizacin de las subpoblaciones SP, tanto en epidermis normal
como tumoral, ha creado una cierta confusin. Las poblaciones SP de
queratinocitos pueden presentar una gran capacidad de proliferacin in
vitro y son capaces de formar ms eficientemente epitelios estratificados
que las poblaciones no-SP, en poblaciones humanas definidas por los
marcadores 6 y CD71 (90). Sin embargo, las clulas SCC slo presentaban el marcador epidermoide CSPG4/MCSP y no se encontraron cambios en la expresin de la integrina 1 o la queratina 1 (ker-1); pero
mostraban mayor capacidad tumorignica en modelos de trasplantes subcutneos, lo que de nuevo sugera que la poblacin SP de la SCC tenan
caractersticas de CSC (91).
CLULAS MADRE DEL CNCER EN OTROS TUMORES
Cada vez hay ms evidencias que sugieren que este tipo de clulas,
minoritarias dentro del tejido, pueden estar asociadas a la carcinognesis
186
CLULAS
MADRE DEL CNCER
de un rgano determinado. Hasta ahora hemos mencionado algunos datos sobre tumores hematopoyticos, de cerebro, pncreas o hgado, de
tejido mamario o de piel. Pero seguramente esto no es todo, y ya sabemos que hay otros tumores, como el cncer de prstata, o algunos cnceres de pulmn, donde tambin ha sido posible seleccionar las clulas iniciadoras del tumor dentro de la masa tumoral, lo cual, a) confirma que la
mayora (si no todos) los tumores son heterogneos, y b) que slo una
pequea parte de la masa del tumor mantiene una alta capacidad pluripotente y con capacidad de reproducir, expandir y, posiblemente, mantener
el tumor.
Lo importante de toda esta informacin es que, despus de muchos
aos, estamos ahora ms capacitados para tratar de eliminar definitivamente un cncer, siempre que adecuemos nuestro pronstico y su terapia reconociendo la existencia de este tipo minoritario, pero relevante,
de clulas CSC.
IMPLICACIONES TERAPUTICAS EN EL TRATAMIENTO
DEL CNCER POR LA PRESENCIA DE CLULAS
MADRE DEL CNCER
La existencia de un grupo de clulas, dentro de un tumor, con caractersticas diferentes del resto de la masa tumoral, y responsables del
inicio o del mantenimiento del cncer, nos obliga a considerar estas
clulas como las primeras dianas a las que habra que dirigir nuestro
arsenal teraputico.
De hecho, las actuales estrategias en terapias antitumorales no tienen en cuenta la distinta sensibilidad a drogas o la posible expresin de
receptores especficos, de estas CSC al compararlas con la mayora de
las clulas de la masa tumoral. Hoy tenemos suficiente informacin para
comenzar a disear nuevas molculas innovadoras dirigidas especficamente frente a estas subpoblaciones celulares.
Tradicionalmente, los tratamiento antitumorales se basan en el ataque masivo y no discriminado frente a las poblaciones celulares con un
alto grado proliferativo, donde los efectos primarios se traducen en la
deteccin de una fuerte bajada de la masa tumoral, pero que en la gran
mayora de los casos es insuficiente para garantizar la completa remisin del tumor o la curacin. Estas drogas genotxicas, en general re187
ducen de una forma significativa la masa tumoral pero, en muchas ocasiones, dejan al descubierto el ataque frente a las clulas CSCs. Sin
embargo, sabemos que las poblaciones tumorales tumorignicas y notumorignicas tienen una diferente sensibilidad a muchas drogas genotxicas (92, 93); las clulas CD34+ y CD38- son significativamente
menos sensibles a danorubicina (93) o citarabina (94).
Este nuevo modelo de cncer cambiar nuestro concepto de resistencia a drogas y nos permitir descubrir nuevos mecanismos de esta resistencia. Hoy da conocemos el importante papel que juegan en estas
clulas algunas molculas transportadores de la superficie celular, miembros de la familia de trasportadores ABC, que sabemos estn diferencialmente expresados en las CSC, y que tienen la peculiaridad de literalmente escupir las drogas txicas que llegan a las clulas
relativizando su dao. Es el caso de las LMA, donde trasportadores
ABC reducen el efecto de la mitoxantrona o la danorubicina, dos agentes muy empleados en el tratamiento de esta enfermedad. Este mismo
caso lo encontramos con el uso de Gleevec en el tratamiento de la LMC,
cuyo efecto no elimina completamente las clulas con el transcrito BCR/
ABL, responsable en gran medida de esta enfermedad.
Un segundo aspecto a considerar bajo esta visin de la presencia de
las clulas CSC, es la posibilidad de un nuevo diagnstico del cncer y,
sobre todo, de su posible capacidad metasttica. La identificacin de las
clulas CSC y de sus posibles marcadores especficos podra determinar
un diagnstico ms temprano de la enfermedad y su capacidad real de
ser susceptible de generar metstasis. La presencia de clulas residuales
despus de un tratamiento estndar con drogas antitumorales, sera ms
que deseable y nos permitira conocer el autentico efecto del tratamiento. La identificacin de las clulas CSC, constituye por ello una pieza
clave en la investigacin del cncer, tanto para mejorar la eficacia de los
tratamientos como para garantizar una accin selectiva sobre las clulas
y, por ello, la completa eliminacin del tumor y la curacin.
CONCLUSIONES
El cncer es una anomala de las clulas madre, embrionarias o
adultas, y el estudio de stas es esencial en la bsqueda de tratamientos
188
CLULAS
MADRE DEL CNCER
para curar la enfermedad. Muchos investigadores pensamos que los

tumores derivan de clulas madre tumorales que se parecen a las clulas
madre tejido- especficas, y quiz utilizan rutas similares a las que presentan las clulas madre embrionarias.
Sin embargo, aunque admitamos la existencia de clulas madre iniciadores de un tumor, o quizs clulas madre de tumor, que mantienen la
proliferacin de este tumor, an somos incapaces de explicar claramente
el proceso de desarrollo tumoral. El paso de clulas madre tumorales
hacia poblaciones heterogneas no est en absoluto claro. Podramos
quiz asociarlo a cambios como los encontrados durante el proceso de
transicin epitelio-mesenquima (EMT, epithelial-mesenchymal transition), un paso que pueden dar las clulas varias veces antes de acabar de
convertirse en clulas diferenciadas y funcionales. Existen mltiples factores de transcripcin y citoquinas, que influyen en este proceso (95-97).
Genes de la familia snail o factores como el TGF son elemento fundamentales en esta transicin, y algunos de ellos estn directamente implicados en los procesos inflamatorios pre-cancerosos (98-100). El paso
entre la clula madre tumoral y el tumor no es probablemente un nico
paso, y cambios durante este proceso o su capacidad metasttica marcan
el futuro comportamiento del tumor.
Por ltimo, cabe volver a mencionar los problemas de nomenclatura, al poder considerar a las clulas madre del cncer como clulas
que generan el cncer, ms que como clulas capaces de mantener el
crecimiento ilimitado de un tumor. Aunque la teora nos indica que si
eliminsemos la poblacin CSC de un tumor, este se secara y se
perdera, la realidad es que todava no hemos hecho este experimento
y aun no sabemos si realmente esta mnima subpoblacin tumoral
tiene el enorme significado que creemos que tiene. Adems, tampoco
est claro si una CSC, que tiene por definicin capacidad para mantener su autorrenovacin y la capacidad de generar todos los tipos
celulares que componen este tejido o tumor, es la clula de la que
deriva el tumor o si, por el contrario, el tumor deriva de una clula
normal pero que durante los proceso de transformacin ha generado
una clula con estas caractersticas, a la que denominamos Clula
Madre del Cncer (101).
No me cabe duda de que en los prximos aos la progresiva comprensin de estos procesos nos permitir un mejor abordaje del cncer
189
pero, por ahora, el diseo de nuevas terapias y obtener drogas dirigidas

contra las poblaciones minoritarias que representan los tumores ms
agresivos, ser decisivo para mejorar nuestros arsenales contra esta
enfermedad, y quiz lograr su curacin definitiva. De nuevo la ciencia,
abierta y libre, tiene la palabra.
ABREVIATURAS
ABC, (ATP-binding cassette) transportadores de dominios de unin
al ATP; AML-CFU, clulas proliferativas de blastos leucmicos; Apc,
gen supresor; BCR/ABL, tirosina quinasa codificada por el gen de fusin bcr/abl ; Bmi-1, miembro de la familia polycmb, CG, Clulas
germinales; CSC, (cancer stem cells) clulas madre cancerosas; DMBA,
7, 12 dimetil-bencil antraceno; EMT, transicin epitelio-mesenquimal;
ER, receptores de estrgenos; GMB, glioblastomas multiformes; HCC,
carcinoma hepatocelular; HSC, Clulas madre hematopoyticas; ICM,
(inner cell mass) masa interna celular; Lgr5, gen diana de Wnt; LMA,
leucemia mieloide aguda; LMC, leucemia mieloide crnica; NOD,
modelo de ratn diabtico no obeso; PSCA, antgeno de CSC de prstata; SCC carcinoma de clulas escamosas; SCID, modelo de ratn con
inmunodeficiencia combinada severa (sin linfocitos funcionales), SHH,
sonic hedgehog; SNC, sistema nervioso central; SNP, sistema nervioso
perifrico; SP, poblacin lateral; TCC, clulas transicionales de carcinoma humano.
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7.
Clulas progenitoras multipotentes obtenidas

del tejido adiposo y su aplicacin clnica
DAMIN GARCA OLMO Y MARIANO GARCA ARRANZ
RESUMEN
La primera vez que se describi la existencia de clulas progenitoras
en el tejido adiposo subcutneo fue en el ao 2001. Se comunic la existencia de un grupo de clulas homogneas con aspecto fibroblstico,
obtenidas a partir de la fraccin vsculo-estromal de tejido adiposo extraido por liposuccin, que tenan la capacidad de diferenciarse a osteocitos, condriocitos y adipocitos. En el ao 2004 fueron definidas como
ASC (Adipose-derived Stem Cells) y se establecieron los criterios de
identificacin: 1. Clulas con morfologa fusiforme que se aslan mediante digestin enzimtica y adhesin a los plsticos. 2. Con capacidad de
autorrenovacin por largos periodos de tiempo. 3. Multipotenciales (se diferencian a adipocitos, condrocitos y osteocitos) y 4. Que tienen el siguiente perfil de expresin: marcaje positivo para CD29, CD44, CD 90 y
CD105; y un marcaje negativo para CD34, CD45 y CD133.
Se han descrito ms de doscientos ciclos de replicacin ex vivo de las
ASC sin alteraciones genticas o fenotpicas. En los ltimos aos se ha
observado la expresin de marcadores de clulas madre embrionarias en
la superficie de las ASC (Oct-4, Rex-1 y Sox-2). Tambin se han descrito
algunas vas de sealizacin, que regulan la proliferacin y/o la diferenciacin celular (Wnt, Esfingosilfosforilcolina y FGF-2). Tambin se ha
comunicado diferenciacin a msculo esqueltico y cardiaco, tejido neuronal, endotelio vascular, epitelio, tejido heptico y tejido pancretico. Lo
que propone a las ASCs como una de las clulas ms prometedoras para
su uso en terapia celular.
197
DAMIN GARCA OLMO
MARIANO GARCA ARRANZ
A pesar de todos los estudios realizados hasta ahora, los procesos

biolgicos sobre los que actan las ASC no son completamente conocidos. Adems de su capacidad de diferenciacin, se ha comprobado
que las ASC son capaces de estimular los propios mecanismos endgenos de reparacin de los tejidos. El mecanismo de accin podra
estar asociado a su capacidad inmunomoduladora, inhibiendo los procesos inflamatorios, lo cual nos llevara a mejorar el proceso de la
reparacin de los tejidos. Este efecto antiinflamatorio hace que se est
evaluando la posibilidad de utilizarlas en la enfermedad de injerto
contra husped o en patologas inflamatorias (artritis reumatoide, colitis intestinal). Existe un gran nmero de estudios que han demostrado
la capacidad de las ASC de reparar daos en tejidos in vivo. Entre
ellos hay que destacar los encaminados a reparaciones seas y cartilaginosas. Muchos de estos estudios estn sirviendo para probar nuevos biomateriales que puedan usarse en la clnica como soporte para
la reparacin de huesos.
Hemos identificado 12 ensayos clnicos que utilizan como fuente
teraputica ASC. Entre las patologas objeto de estos ensayos clnicos,
se incluyen las derivadas de patologas vasculares, tratamientos para la
diabetes y el tratamiento para la patologa fistulosa. Estos usos clnicos
estn basados en la plasticidad de las clulas mesenquimales y su potencial poder antiinflamatorio e inmunomodulador. Los mejores resultados
se estn consiguiendo en cicatrizacin. Los resultados definitivos de los
diferentes ensayos clnicos se conocern en los prximos aos y posiblemente podamos ver realidades clnicas que se intuyeron hace diez
aos en los laboratorios de investigacin bsica.
ABSTRACT
Progenitor cells in the subcutaneous fat were first described in 2001.
It was reported the existence of a homogeneous group of cells, like
fibroblasts, obtained from the stromal-vascular fraction of adipose tissue
removed by liposuction, with ability to differentiate into osteocytes,
chondrocytes and adipocytes. In 2004, these cells were defined as ASCs
(Adipose-derived Stem Cells) and the criteria for identification was set:
1. cells with spindle morphology that were isolated by enzymatic digestion and adherence to plastic. 2. capacity of self-renewel for long pe198
CLULAS
PROGENITORAS MULTIPOTENTES OBTENIDAS DEL TEJIDO ADIPOSO...
riods of time. 3. Multipotential (they could differenttiate to adipocytes,

chondrocytes and osteocytes) and 4. Showing a expression profile: CD29
CD44, CD90 and CD105 positive marking, and CD34, CD45 and CD133
negative marking.
It has been described more than two hundred cycles of ex vivo
replication of the ASCs without genetic or phenotypic alteration. In
recent years, expression of embryonic stem cells markers on the surface
of the ASCSs (Oct-4, Rex-1 and Sox-2) has been observed. Furthermore, some signaling pathways that regulate the proliferation and / or cell
differentiation (Wnt, Sphingophosphorilcoline and FGF-2) have been
described. It is reported that ASC are also able to differentiate into
cardiac and skeletal muscle, neuronal tissue, vascular endothelium, epithelium, liver tissue and pancreatic tissue. These are some of the evidences that makes this type of cells one of the most promising cells in cell
therapy.
Being conducted all these studies, the biological processes on which
the ASCs participate are not completely known so far. Besides their
capacity for differentiation, it appears that the ASCs are able to stimulate endogenous mechanisms of tissue repair. This mechanism of action
could be associated with its immunomodulatory capabilities and inhibiting inflammatory processes, which would lead us to improve the process of tissue repair. Nowdays it is being evaluated the possibility of
using these cells in the graft versus host disease or inflammatory diseases (rheumatoid arthritis, intestinal colitis) due to its anti-inflammatory
effect. There are several studies which demonstrate the ability of ASCs
to repair damaged tissues in vivo. Amongst them, it is worth highlighting those research lines which are focused on the bone and cartilage
repair. Many of these studies are testing new biomaterials that could be
used in the clinic as a support for the repair of bones.
We have identified 12 clinical trials using therapeutic ASCs. Vascular diseases, treatments for diabetes and treatment for fistulizing disease
are some of the target diseases. These clinical applications are based on
the plasticity of mesenchymal cells and their potential anti-inflammatory and immunomodulatory capability. The best results are achieved in
healing. The final results of these different trials will be announced in
the coming years and we could see as a clinical reality what was thought
in the basic research laboratories 10 years ago.
199
DAMIN GARCA OLMO
INTRODUCCIN
Durante la ltima dcada, estudios de diferentes grupos de investigacin han identificado varias fuentes de clulas progenitoras, las cuales
se reconocen por su capacidad de autorrenovacin y su potencial de
diferenciacin a diferentes estirpes celulares. Hoy en da se acepta la
existencia de clulas que cumplen ambas premisas en casi todos o todos
los rganos de los individuos adultos. La funcin de estas clulas parece
estar relacionada con la renovacin de las clulas que mueren en los
tejidos adultos (1), as como con la reparacin de pequeas lesiones que
se producen constantemente en los rganos adultos. Dentro de este grupo de clulas, las ms conocidas por la comunidad cientfica y clnica
son las clulas residentes en la mdula sea. Las clulas progenitoras de
la mdula sea ser han clasificado en relacin a su principal funcin en
precursores hematopoyticos y en clulas que anidan en el estroma de
la mdula, tambin llamadas clulas mesenquimales por su origen embrionario, ya que se derivan de la lmina mesotelial del embrin.
Durante los ltimos aos, se han encontrado clulas similares a las
mesenquimales de la mdula sea en numerosos rganos adultos como en
el tejido adiposo (3), en la pulpa dental (4), en la sangre del cordn
umbilical (5), en tejidos fetales (6-7), en tejidos placentarios (8-9) y en el
lquido amnitico (10) y un largo etctera. Las clulas mesenquimales
fueron descritas por primera vez por Friedenstein en 1976 (2) a partir de
extractos de mdula sea adulta; las describi como unas clulas que se
adheran al plstico, capaces de ser cultivadas durante tiempo indefinido
sin modificar su fenotipo y que se podan derivar a clulas de tejidos
mesenquimales como seas, cartlago, msculo, tendn, grasa y estroma
medular. Adems, numerosos autores han comprobado que, al menos in
vitro se pueden derivar a tejidos derivados de otras lminas embrionarias,
dando marcadores y morfologa tpica de cardiomioblastos (11-13), neuronas o astrocitos (14-17), msculo esqueltico (18) e incluso clulas hepticas. Si bien es cierto que muchos de estos estudios demuestran la expresin de transcritos y/o protenas especficos de cada uno de estos tipos
celulares, an no se ha podido demostrar su funcionalidad.
Debido a la amplia distribucin y plasticidad de las clulas mesenquimales, en el individuo adulto, numerosos grupos de investigacin se
han planteado utilizarlas en Terapia Celular y como vehculo para Te200
CLULAS
rapia Gnica. De esta manera se han conseguido importantes avances

teraputicos en diferentes patologas mediante ensayos clnicos para la
osteognesis imperfecta (19), leucodistrofia metacromtica y sndrome
de Hurler (20), en lo que se refiere a Terapia Gnica. En lo referente a
Terapia Celular, si miramos en la pgina del Clinical Trials.gov, actualmente existen ms de 70 ensayos clnicos que emplean clulas mesenquimales a nivel mundial.
Debido a la morfologa fusiforme de las clulas mesenquimales as
como a la ausencia de marcadores de membrana especficos, la comunidad cientfica ha decidido que para que una clula mesenquimal sea
considerada progenitora debe cumplir tres requisitos bien definidos. El
primero de ellos es la capacidad de autorrenovacin, es decir, cuando
una clula progenitora mesenquimal se divide, al menos una de las
clulas resultantes debe ser idntica a la clula de la que procede, si bien
en algunos casos ambas clulas hijas son idnticas a la clula de origen.
El segundo de ellos es la capacidad de diferenciarse a clulas de diferentes estirpes mesoteliales (hueso, condrocito, adipocito) y, por ltimo,
el tercero de ellos es la existencia y ausencia de un grupo de marcadores
de membrana: entre los que deben tener un marcaje positivo estn CD9,
CD29, CD44, CD51, CD59, CD90, CD105, HLA 1, D7-FIB, y ausencia
de: CD34, CD133, HLA-DR. Por lo tanto, una clula progenitora mesenquimal adems de adherirse a superficies plsticas debe de cumplir
los 3 requisitos anteriormente mencionados durante su cultivo in vitro.
CLULAS MESENQUIMALES DERIVADAS DEL TEJIDO
ADIPOSO
La primera demostracin de la existencia de clulas progenitoras
mesenquimales en el estroma del tejido adiposo se produjo en el ao
2000. Un grupo de investigadores liderado por Gimble, describieron la
capacidad in vitro de estas clulas de diferenciarse a tejidos osteognicos y mineralizar una matriz extracelular, cuando se las expona a diferentes factores, demostrando la capacidad multipotencial de las clulas
estromales residentes en el tejido adiposo (21).
A pesar de esto primeros estudios, la primera vez que se consider
la existencia de clulas progenitoras mesenquimales en el tejido adiposo
201
DAMIN GARCA OLMO
subcutneo fue en el ao 2001 cuando el grupo liderado por el Dr.

Hedrick (22) describi una poblacin celular multipotencial. Su descripcin expresaba la existencia de un grupo de clulas homogneas con
aspecto fibroblstico, obtenidas a partir de la fraccin vsculo-estromal
(Figura 1) del tejido adiposo y con capacidad de diferenciarse a osteocitos, condrocitos y adipocitos. A estas clulas las bautizaron con el
nombre de PLA (Processed Lipoaspirated cells, clulas procesadas del
lipoaspirado). Obtuvieron un gran nmero de clulas a partir de una
pequea muestra de lipoaspirado, que cultivaron sobre placas de Petri
durante bastante tiempo, comprobando que cumplan uno de los requisitos de clulas progenitoras, la autorrenovacin. Adems, analizaron el
fenotipo de dichas clulas mediante sus marcadores de membrana y
analizaron su cintica de crecimiento; en ambos casos comprobaron que
esta poblacin celular cumpla los criterios estipulados para ser consideradas clulas mesenquimales progenitoras, siendo su fenotipo muy
similar al descrito para las clulas mesenquimales progenitoras de la
mdula sea. No obstante, hay que considerar que la existencia de clulas estromales en el tejido adiposo, aisladas como preadipocitos a
partir de la fraccin vasculo-estromal, se decribi hace ms de 30 aos
FIGURA 1. Imagen histologica del tejido graso, donde se marcan los posibles nichos de
clulas mesenquimales en la fraccin vasculo-estromal.
202
CLULAS
(23-30). Durante los ltimos aos, este grupo de clulas estromales con
capacidad de multipotentes ha tenido numeroso nombres en la literatura
cientfica, entre los que podemos destacar: ADAS: Adipose-Derived
Adult Stem cells (31); ADSC: Adipose Derived Stem Cells (32); ATSC:
Adipose Tissue Stem Cells (33); MADS: Multipotent Adipose-Derived
Stem cells (34); ASC: Adipose Stem Cells (35-37).
En el ao 2004, en el Congreso internacional de IFATS (Internacional Federation for Adipose Therapeutics and Science) se decidi unificar las diferentes nomenclaturas, dando como acrnimo ASC a las clulas troncales derivadas de la fraccin vsculo-estromal del tejido
adiposo; a pesar de ello, algunos importantes grupos de investigacin no
han aceptado este consenso y mantienen la nomenclatura anterior (38).
Durante esta reunin se sentaron las bases para definir a este tipo de
clulas: Clulas con morfologa fusiforme que se aslan mediante digestin enzimtica y adhesin a los plsticos, de la fraccin vascular asociada a los tejidos adiposos de las diferentes especies animales, con
capacidad de autorrenovacin por largos periodos de tiempo y multipotenciales, ya que se pueden diferenciar a adipocitos, condrocitos y osteocitos. Adems, y quiz lo ms importante, se dieron un listado de
marcadores de membrana celular para identificarlas, ya que no existe
hasta ahora un marcador especfico para este tipo de clulas; dentro de
este listado de marcadores se propuso que al menos deberan tener un
marcaje positivo para CD29, CD44, CD90 y CD105; y un marcaje negativo para CD34, CD45 y CD133.
Como se puede comprobar, la definicin de estas clulas es muy
similar a la anteriormente expuesta de las clulas estromales obtenidas
a partir de mdula sea, por ello el tejido adiposo, cada vez ms, se
considera una fuente alternativa de clulas estromales multipotenciales
frente a la mdula sea u otros tejidos (22, 39). De hecho, el tejido
adiposo confiere numerosas ventajas terapeticas frente a la extraccin
de clulas multipotenciales desde la mdula sea. Por ejemplo, para
realizar una extraccin medular, el paciente debe ser anestesiado por
completo para obtener una pequea cantidad de tejido estromal; por el
contrario, para obtener la fraccin estromal del tejido adiposo basta con
una simple anestesia local y mediante una liposuccin se puede obtener
una gran cantidad de tejido; en resumen, una mayor cantidad de clulas
con una menor morbilidad para el paciente.
203
DAMIN GARCA OLMO
Las ASC se han aislado de humanos y de otras especies de mamferos mediante liposuccin (Figura 2) o mediante biopsias de tejido graso,
utilizando un protocolo muy sencillo que implica un tratamiento enzimtico y la propiedad de estas clulas de adherirse a los plsticos usados en
los cultivos celulares; en principio, un protocolo similar al empleado para
obtener clulas estromales de la mdula sea. Ms concretamente, despus de lavar con una solucin salina el tejido obtenido y separar la fraccin vsculo-estromal por centrifugacin, el tejido es digerido mediante
colagenasa para obtener clulas individuales, a continuacin se lavan las
clulas con una solucin para destruir los restos celulares hematopoyticos y las clulas resultantes se aaden a placas de cultivo; pasadas al
menos 4 horas (aunque habitualmente se suele dejar toda la noche), se
pueden retirar las clulas que no se han adherido al plstico mediante una
simple aspiracin del medio de cultivo y aadiendo medio nuevo, para
que las clulas que se han adherido al plstico puedan crecer. Estas clulas se van replicando y se dejan en la placa de cultivo hasta que se obtie-
FIGURA 2.
204
La liposuccin como fuente de tejido graso para aislar clulas progenitoras.
CLULAS
ne una densidad prxima al 80% de confluencia. Una vez obtenida esta

confluencia, las clulas se despegan de las placas de cultivo mediante tripsina-EDTA o mediante raspado en fro. Se pueden subcultivar y expandir
hasta obtener la cantidad que se necesita. Dependiendo de los autores y
de la especie animal, se suelen aadir entre 3.000- 5.000 clulas por cm2,
cambiando el medio de cultivo, para recuperar los nutrientes utilizados
por las clulas, cada 3-4 das. La composicin del medio de cultivo habitual es DMEM (Dulbeccos modified Eagles Medium) al que se le aade
un 1% de antibiticos y entre un 10-20% de suero fetal bovino, dependiendo de los autores, es decir el mismo medio que se utiliza para las clulas estromales obtenidas a partir de la mdula sea.
La cantidad de fraccin vsculo-estromal que se obtiene depende
mucho de la especie animal e incluso dentro de una especie, del donador, as como de la regin en la que se hace la liposuccin, pero la
mayora de los autores describen para la especie humana, dos millones
de clulas nucleadas por mililitro de lipoaspirado, del cual se pueden
llegar a obtener cien mil clulas adherentes en una semana por mililitro
de lipoaspirado. Por lo tanto, la frecuencia de clulas ASC en la regin
vsculo-estromal de la grasa subcutnea (5.000 CFU por gr. de tejido
adiposo) es significativamente ms alta que la cantidad de clulas estromales que se pueden obtener de la mdula sea (entre 100-1.000 CFU
por ml.) (22, 40-42).
Cuando miramos las ASC al microscopio (Figura 3), mantienen una
morfologa muy similar a otras clulas de origen mesenquimal, como
son los fibroblastos o las clulas estromales de la mdula sea. Las ASC
pueden ser crioconservadas durante largos perodos de tiempo en nitrgeno lquido y mantienen toda su viabilidad, as como sus propiedades
biolgicas (43).
Algunos autores han descrito ms de doscientos ciclos de replicacin ex vivo de las ASC sin alteraciones genticas o fenotpicas (40,4446) y es aceptado por la comunidad cientfica que estas clulas tienen
una capacidad ilimitada de crecimiento. Se ha demostrado que tardan
entre 30 y 120 horas en duplicar su poblacin, dependiendo de dos
factores: el donador y la composicin del medio de cultivo.
El fenotipo de superficie de las clulas ASC es muy homogneo y
similar al descrito en las clulas estromales de mdula sea. Son carac205
DAMIN GARCA OLMO
FIGURA 3.
Visin microscpica de las ASC en cultivo.
tersticas las marcas positivas por densitometra de flujo de: CD9, CD10,
CD13, CD29, CD44, CD54, CD90, CD105 y HLA-1; mientras que se
incluyen con marcas negativas: CD45, CD11b, CD14, CD31, HLA-2
(37, 42, 46, 49). Actualmente no existe consenso para los marcadores
CD34 y CD113 ya que, para algunos autores, son prcticamente negativos, mientras que otros afirman que son positivos por citometra de
flujo. CD106 (VCAM-1) es el principal marcador de membrana que
diferencia las clulas estromales derivadas de la mdula sea y las clulas estromales derivadas del tejido adiposo (50). Cuando uno asla
cualquiera de estos dos tipos de clulas, inicialmente los marcadores de
membrana son muy heterogneos (49), ya que la poblacin celular aislada es muy diversa, con el paso del tiempo, sobre las placas de cultivo,
la poblacin celular se vuelve ms homognea, as como sus marcadores
de membrana. Esta homogeneidad de la poblacin se ha comprobado
mediante estudios protemicos y mediante micromatrices (48, 51).
206
CLULAS
En los ltimos aos, algunos autores han demostrado la expresin de

marcadores de clulas madre embrionarias en la superficie de las ASC;
entre stos se incluye Oct-4, Rex-1 y Sox-2, durante al menos diez
ciclos de replicacin (52). Tambin se han descrito algunas vas de
sealizacin, que regulan la proliferacin y/o la diferenciacin celular
de las ASCs, entre stos estn Wnt, Esfingosilfosforilcolina y FGF-2
(52-54).
Otra importante propiedad de las ASC es su capacidad de diferenciacin a diversos tipos de clula, como se ha demostrado desde el ao
2001 (55). Entre los linajes celulares que se han obtenido a partir de
ellas, estn: grasa (47, 56), hueso (21, 22, 47, 57-64) cartlago (22, 47,
63, 65-66), msculo esqueltico (22,47,68-69), msculo cardiaco (33,
70-72), tejido neuronal (31, 47, 73), endotelio vascular (72, 73-76),
epitelio (77), tejido heptico (78) y tejido pancretico (79). Lo que propone a las ASCs como unas de las clulas ms prometedoras para su uso
en terapia celular.
Recientemente se ha descrito que las clulas ASC son tolerognicas
y tienen la capacidad de inhibir la respuesta inmune (80-81). As mismo
su capacidad antinflamatoria puede jugar un papel importante en la
reparacin de tejidos daados y en la actividad inmunorreguladora de
estos tejidos (82). En resumen, las propiedades biolgicas in vitro de las
ASC son prcticamente idnticas a las clulas estromales de la mdula
sea, lo que sugiere que pueden ser usadas en numerosas estrategias
teraputicas con una menor afectacin a los pacientes derivada de su
proceso de obtencin.
BIOSEGURIDAD DE LAS CLULAS MADRE DERIVADAS
DE LA GRASA
Desde que se empez a hablar de las clulas madre, surgieron
numerosas crticas de diferentes grupos cientficos y sociales, debido
al temor que provocaban. Estos temores siempre han estado asociados
a la posibilidad de neoformaciones de las clulas madre al inyectarlas
en organismos adultos, extrapolando lo que ocurre con las clulas
madre embrionarias, en las que una de sus caractersticas principales
es la formacin de teratomas in vivo. Aunque se han desarrollado
207
DAMIN GARCA OLMO
infinidad de esfuerzos para intentar llegar a conclusiones, slo un artculo en la bibliografa cientfica (83) ha demostrado que las clulas
estromales adultas son capaces de llegar a una fase de senescencia
celular tras dos meses en cultivo; estos autores afirman que, cuando
algunas de estas clulas superan esta fase de senescencia, son capaces
de transformarse y generar poliploidias en su cariotipo. Ningn laboratorio ha podido reproducir estos experimentos. Otros muchos grupos
han intentado protocolos ms agresivos para las clulas, sin lograr
conseguir la transformacin. Esto nos hace poner en duda estos resultados, a pesar de provenir de uno de los grupos ms relevantes dentro
de los estudios de bioseguridad sobre clulas madre adultas. Sirvan
como ejemplo los trabajos realizados por nuestro grupo en el Hospital
Universitario La Paz, an pendientes de ser publicados, en los que
mantenemos las clulas durante ms de 6 meses en cultivo, sin encontrar ninguna diferencia fenotpica ni cariotpica frente a las ASC recin
obtenidas, o los estudios de transformacin celular utilizando DNA
procedente de tumores, o la inyeccin de ASC cultivadas en ambiente
tumoral sobre ratones inmunodeficientes. En ninguno de los supuestos
anteriores hemos obtenido una sola clula transformada (datos sin
publicar). Por otro lado, la experimentacin con modelos animales muy
variados, desde ratones a humanos pasando por primates, conejos,
cerdos, ovejas y un largo etctera, nunca han descrito neoformaciones
que pudieran asociarse a la inyeccin bien local o bien sistmica (a
travs del torrente sanguneo) de clulas estromales adultas provenientes del tejido adiposo o de la mdula sea. Estos resultados derivados
de ensayos clnicos o de ciruga experimental, junto con los datos que
se van teniendo de la biologa molecular y celular, nos permiten afirmar que el uso de clulas estromales, de cualquier origen, es seguro,
a pesar de no conocerse totalmente sus mecanismos de accin una vez
inyectadas en los diferentes modelos animales.
CAPACIDAD REPARADORA DE LAS ASCs IN VIVO
Desde que se comprob la similitud entre las ASC y las clulas
estromales de la mdula sea, y teniendo en cuenta la facilidad de obtencin de las ASC, se han intensificado los grupos de investigacin
interesados por el potencial de las ASC. Existe un gran nmero de
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CLULAS
estudios que han demostrado la capacidad de las ASC, de origen murino

y humano, de reparar pequeos daos en tejidos in vivo (84). Generalmente estos estudios se realizan sobre roedores y han demostrado claramente la capacidad de las ASC de contribuir a la regeneracin de
tejidos daados sobre diferentes modelos experimentales. Como podemos suponer, gran parte de estos estudios han estado dirigidos a la
reparacin y/o regeneracin de tejidos derivados de la lmina mesotelial
embrionaria; al proceder las ASC de esta misma lmina embrional, parece lgico pensar que sera ms fcil su diferenciacin o su actuacin
sobre este tipo de tejidos. Entre ellos hay que destacar la infinidad de
artculos encaminados a reparaciones seas y cartilaginosas (85-93).
Muchos de estos estudios estn sirviendo para probar nuevos biomateriales que puedan usarse en la clnica como soporte para la reparacin
de huesos (86, 74-76).
Otros estudios relevantes sobre las posibilidades de las ASC son
los basados en su capacidad de diferenciarse a msculo esqueltico, lo
que est disparando las investigaciones para demostrar su capacidad de
reparar daos de fibras musculares tras una isquemia (74-76). En este
sentido, otro estudio ha demostrado que las ASC se incorporan a los
esfnteres urinarios daados, dando un fenotipo de msculo liso (41).
Es ms, hay diversos estudios que inyectan ASCs en animales con
dao cerebral y han comprobado que las clulas, incluso pasadas varias
semanas, se incorporan a la regin daada y muestran marcadores neuronales y morfologa de neurona, astrocito y oligodendrocito (97).
Durante este ltimo ao se est estudiando la capacidad inmunomoduladora de las ASC. En este sentido, la posibilidad de utilizarlas en la
enfermedad de injerto contra husped o en patologas inflamatorias ha
abierto una nueva lnea de investigacin. Se ha comprobado que en
modelos animales de inflamacin (artritis reumatoide, colitis intestinal)
las ASC son capaces de disminuir el proceso inflamatorio, adems de
controlar la respuesta de las clulas T (82, 98). Este hecho puede ser
muy importante a la hora de intentar conocer los mecanismos de actuacin de estas clulas, as como su potencial teraputico en el futuro.
A pesar de todos los estudios realizados hasta ahora, los procesos
biolgicos sobre los que actan las ASC son desconocidos, aunque si se
han observado sus efectos teraputicos sobre tejidos daados. Es reconocido por todo el mundo que las clulas madre (stem cells) tienen una
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doble funcin en el organismo adulto, por un lado regeneran las clulas

que van muriendo en los diferentes tejidos con el paso del tiempo y, por
otro lado, reparan pequeas lesiones de los tejidos. Como mencionamos
anteriormente, no conocemos los mecanismos biolgicos de actuacin
de las clulas madre. En este sentido, la capacidad de diferenciacin de
las ASC en respuesta a daos en diferentes tejidos, se muestra como un
evidente mecanismo de accin de estas clulas in vivo. No obstante, no
parece ser el nico mecanismo que explique algunos de sus efectos
teraputicos. Adems de esta capacidad de diferenciacin, se ha comprobado que las ASC son capaces de estimular los propios mecanismos
endgenos de reparacin de los tejidos; un ejemplo sera la capacidad de
promover neovascularizacin de los tejidos en ratones isqumicos (7476). Otro posible mecanismo de accin podra estar asociado a su capacidad inmunomoduladora, inhibiendo los procesos inflamatorios, lo cual
nos llevara al proceso normal de la reparacin de los tejidos. En resumen, son muchas las opciones que podran explicar el mecanismo de
accin de las ASC y, posiblemente, varias de las opciones propuestas
anteriormente e incluso otras que an desconocemos puedan explicar los
efectos teraputicos que se han observado utilizando clulas mesenquimales, y ms concretamente ASC en los diferentes estudios sobre modelos animales, incluyendo la especie humana.
TERAPIA CELULAR CON ASC: ENSAYOS CLNICOS
ACTUALES
Como todos los avances en el campo de la ciencia bsica, para llegar
a ser realidades clnicas es necesario que se prueben bajo las condiciones experimentales que impone la va de los ensayos clnicos.
Los ensayos clnicos en los pases occidentales estn sometidos a
una estricta regulacin y una de sus primeras premisas es dar pblico
conocimiento de que se estn realizando. Para ello se inscriben en bases
de datos oficiales. Una de las bases de datos ms importantes, en las que
se incluyen la mayora de los ensayos clnicos que se realizan en el
mundo, es el Clinical Trials.gov del Instituto Nacional de la Salud de
Estados Unidos. Si realizamos una bsqueda informtica de los ensayos
clnicos que dicha pgina tiene registrados actualmente (enero-2009)
podemos comprobar que se estn desarrollando ms de 2.000 ensayos en
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CLULAS
terapia celular, dato que nos indica la evolucin tan vertiginosa que se
est produciendo en este campo, gracias fundamentalmente a la creacin
de grupos de investigacin multidisciplinares. Hay ms de un centener
con clulas no hematopoyticas. Si an queremos concretar ms, y buscamos terapias con clulas mesenquimales, encontramos ms de 70. De
ellos la mayora utilizando clulas derivadas de la mdula sea y 12
relacionados con la grasa (Figura 4). Estos datos son an ms interesantes si los comparemos con los que se realizaban hace tan slo 7 aos:
en aquel momento, slo exista registrado un ensayos clnico que utilizaba clulas mesenquimales. Es muy comprensible que la gran mayora
de los ensayos clnicos con clulas madre mesenquimales se realicen
con clulas derivadas de la mdula sea, puesto que se utiliza toda la
infraestructura que los servicios de hematologa tienen para el trasplante
de mdula sea, no obstante, nosotros consideramos que la grasa como
fuente celular puede tener ventajas adicionales. En la tabla 1 realizamos
una comparacin sobre ambas fuentes.
FIGURA 4.
Ensayos clnicos con clulas distintas a las hematopoyticas.
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TABLA 1.
Comparacin entre MSCs y ASCs en cuanto a sus caractersticas como fuente

celular para terapia celular humana.
Si nos centramos en los ensayos con ASC, podemos comprobar que

de los 12 ensayos clnicos que se estn realizando actualmente, 5 se
realizan en Europa, 4 en Estados Unidos, 2 en Sudamrica y 2 en el
sureste asitico. Entre las patologa ms comunes incluidas en estos
ensayos clnicos estn las derivadas de patologas vasculares, tratamientos para la diabetes y el tratamiento para la patologa fistulosa.
Centrndonos en el tipo de patologas tratadas mediante Terapia
Celular utilizando como fuente celular las clulas mesenquimales, debemos clasificarlas segn el campo de aplicacin:
Campo cardiovascular, se estn realizando ensayos clnicos para
tratar el fallo cardiaco. El objetivo es conseguir un nuevo tejido
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CLULAS
cardiaco funcionante. Aunque queda mucho por conocer, parece

que se aumenta el nmero de cardiomiocitos, la angiognesis y
se produce un remodelado de la cicatriz. Tambin hay ensayos
dirigidos a tratar la enfermedad vascular perifrica (99).
Campo de la Ciruga plstica y reconstructiva, el uso de clulas
mesenquimales en grandes quemados, en lesiones cutneas secundarias a radioterapia ha demostrado una regeneracin epitelial, un aumento de los vasos y una importante hidratacin tisular (100).
Campo de ciruga ortopdica y traumatologa, se pretende obtener hueso trasplantable y actualmente son una realidad los ensayos clnicos con nios con osteognesis imperfecta, obtenindose osteoblastos funcionantes que aumentan el contenido mineral
del hueso (101).
Campo de la oftalmologa, el tratamiento de las lceras corneales es una realidad y el uso en degeneraciones retinianas empieza a dar sus resultados.
Campo de ciruga general y digestiva, el tratamiento de las fstulas de distintas localizaciones es una realidad que se lidera
desde el Hospital Universitario La Paz (47, 102-103).
Campo de ciruga torcica, el tratamiento de fstulas del tracto
respiratorio est llegando a la clnica con resultados muy prometedores (104).
Adems se estn realizando importantes avances en investigacin en el campo de la diabetes, de las enfermedades neurodegenerativas y de la regeneracin heptica (105).
Resumiendo estos usos clnicos, podramos afirmar que, dada la
plasticidad de las clulas mesenquimales y su potencial poder regenerador, se est trabajando en numerosos modelos para tratar de sustituir
tejidos daados, sobre todo los considerados clsicamente como permanentes, si bien se ha conseguido principalmente mejorar la cicatrizacin.
Como colofn final a este captulo, es importante resaltar que numerosas empresas biofarmaceticas y biotecnolgicas estn invirtiendo en
el campo de la terapia celular y especficamente en ASC. Esto sin duda
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es imprescindible para que los avances del laboratorio lleguen al enfermo y se trata de un claro ejemplo de lo que se ha denominado investigacin traslacional. Los resultados definitivos de los diferentes ensayos clnicos se conocern en los prximos aos y posiblemente podamos
ver realidades clnicas que se intuyeron hace diez aos en los laboratorios de investigacin bsica.
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8. Aspectos biotecnolgicos: Aplicaciones

preclnicas y clnicas de piel generada a partir
de clulas madre epidrmicas
JOS LUIS JORCANO NOVAL
RESUMEN
A la vista de la rapidez con que se avanza en el esclarecimiento de
las propiedades de las clulas madre, tanto embrionarias como adultas,
y en su manejo, es de prever que, en un plazo no excesivamente largo,
se llegue a generar a partir de ellas terapias innovadoras para enfermedades que en el momento presente no tienen tratamiento. Junto al sistema hematopoytico, la epidermis es uno de los tejidos cuyas clulas
madre se han caracterizado mejor en los ltimos aos, tanto in vitro
como in vivo. Este conocimiento ha dado lugar a aplicaciones clnicas
tanto de Terapia Celular como de Terapia Gnica. En este captulo se
pretende examinar la situacin en este campo basndose en la experiencia que el autor y sus colaboradores tienen en l.
ABSTRACT
Given the celerity with which essential steps toward understanding
the properties of both embryonic and adult stem cells as well as our
ability to handle these in the lab is advancing, innovative therapies will,
not too long from now, be developed for those diseases with no treatment to date. The epidermis is one of the tissues whose stem cells have
been best described in recent years, both in vitro and in vivo, along with
the haematopoietic system. Moreover, this understanding has given rise
to clinical applications for both cell and gene therapies. Based on the
223
authors and his collaborators experience, this chapter discusses the

state-of-the-art of the field.
INTRODUCCIN
La piel recubre el cuerpo en su totalidad y es el rgano ms grande
en cuanto a su peso y superficie. Cubre un rea de aproximadamente
1,5-2 m2 en un adulto y representa aproximadamente el 10% del peso
corporal. La piel tiene una estructura muy compleja que consiste, adems de la piel propiamente dicha o piel interfolicular (PIF), de varios
componentes y anexos tales como los folculos pilosos (FP), las glndulas sebceas (GS) y las glndulas sudorparas, que se desarrollan a partir
de ella. La principal funcin de la piel es la de actuar como una barrera
protectora frente a un medio ambiente exterior muy agresivo, tanto desde
el punto de vista fsico, como del qumico y biolgico. Su flexibilidad
y resistencia protegen al cuerpo de la friccin y del dao mecnico.
Asimismo, evita la prdida de agua y regula la temperatura corporal
mediante la circulacin sangunea y la evaporacin de la transpiracin.
Concentra en ella y, por lo tanto controla, los efectos de agresores tales
como agentes qumicos, bacterias, virus y la luz ultravioleta (UV; el
mutgeno causante de la mayora de los tumores cutneos, que son los
ms numerosos de todos los tumores). Ms an, la piel tiene numerosos
nervios y terminaciones nerviosas que le confieren la funcin de rgano
sensorial. En presencia de rayos solares, la piel produce Vitamina D,
una molcula crtica en el metabolismo del calcio. Finalmente, estudios
recientes estn poniendo claramente de relieve el importante papel de la
piel como rgano inmunocompetente, por su capacidad de actuar sobre
nuestro sistema inmune, y antiinfeccioso, a travs de los pptidos antimicrobianos que produce.
Por ello, la piel es un rgano organizado, tanto estructural como
funcionalmente, para llevar a cabo tan importantes misiones. Por ejemplo, tiene un especial control y compartimentalizacin de sus procesos
de proliferacin y diferenciacin celular normal (homeostasis), as como
de su respuesta reparadora ante las agresiones externas. Adems, es un
excelente sistema experimental dado que su localizacin externa permite
seguir fcilmente, y daando mnimamente al paciente o al animal de
experimentacin, los fenmenos bajo estudio.
224
ASPECTOS
BIOTECNOLGICOS: APLICACIONES PRECLNICAS Y CLNICAS DE PIEL...
A pesar de su importancia, la piel fue durante mucho tiempo un

rgano olvidado, en comparacin con otros a los que se dedic mucho
ms esfuerzo de investigacin; ste es uno de los motivos fundamentales
de la paradoja de que, figurando las enfermedades cutneas entre las de
ms alta incidencia, tengamos relativamente pocas terapias especficas
contra ellas. Esta situacin ha cambiado en la ltima dcada y la piel se
ha convertido en uno de los sistemas de estudio ms relevantes de la
Biomedicina, incluyendo el campo de la terapia regenerativa y las clulas madre.
La piel est compuesta de dos tejidos distinguibles en cuanto a su
anatoma, funcin y desarrollo: la epidermis y la dermis. A su vez, estas
capas estn compuestas por distintos tipos celulares y tienen grandes
diferencias en estructura y funcin (Figura 1).
FIGURA 1. A) Esquema de la piel humana mostrando sus tres compartimentos (epidermis,

membrana basal y dermis), las diferentes capas de la epidermis y algunos de los marcadores
cutneos ms importantes y su localizacin. B) Histologa de la piel humana normal. C)
Histologa de la piel psoritica. Ntese la alteracin en el nmero de capas as como en las
crestas interpapilares y las papilas drmicas, debido a las anomalas en los procesos de
proliferacin y diferenciacin epidrmica caractersticas de esta enfermedad.
225
Epidermis
La epidermis es la capa externa de la piel, formada mayoritariamente por un tipo particular de clulas epiteliales, los queratinocitos, aunque
contiene otras clulas residentes tales como los melanocitos y las clulas
de Merkel y Langerhans que cumplen importantes funciones especializadas (protectoras frente a UV, sensoriales e inmunolgicas).
Morfolgicamente, la epidermis est compuesta por distintas capas
o estratos. Desde la base (zona ms profunda o interna) estas capas son:
estrato basal, estrato espinoso, estrato granuloso y estrato crneo. Durante la homeostasis normal los queratinocitos se producen en la capa
basal, donde est confinada la proliferacin, y migran hacia los estratos
superficiales durante el proceso de diferenciacin epidrmica. El ciclo
de recambio es de aproximadamente 1 mes, y durante l los queratinocitos experimentan profundos cambios morfolgicos y bioqumicos,
asociados a cambios temporales y espaciales en la expresin gnica
(Figura 1). Mltiples protenas (estructurales, factores de crecimiento,
etc.) que se sintetizan especficamente en cada una de estas capas, sirven
de marcadores para caracterizar sus clulas. De entre todos ellos, los
ms usados han sido las keratinas. Adems, los elementos reguladores
de la expresin especfica de estos genes, permiten dirigir selectivamente hacia estos diferentes tipos celulares la expresin de otros genes, de
inters biolgico o teraputico, para estudiar sus efectos. Esta exquisita
capacidad de manipulacin de la expresin gnica es uno de los factores
que ha contribuido a convertir la epidermis en uno de los sistemas
experimentales ms interesantes del momento (1). As, los queratinocitos proliferativos de la capa basal se adhieren a la membrana basal,
hasta que maduran y migran hacia la capa suprabasal. Esta importante
transicin se caracteriza por la prdida de contacto con la membrana
basal, la prdida de la capacidad de proliferar, la prdida de la expresin
marcadores como las queratinas K5 y K14 y la concomitante ganancia
de otros, como las queratinas K1 y K10. Posteriormente, los queratinocitos suprabasales sufren un proceso asociado a la apoptosis, definido
como diferenciacin terminal, durante el cual las clulas migran hacia
los estratos superiores, a la vez que se aplanan y especializan su actividad para, finalmente, dar lugar a la formacin de una capa de clulas
muertas queratinizadas, la capa crnea. Esta capa constituye uno de los
componentes principales de la barrera protectora de la piel. El proceso
226
ASPECTOS
de diferenciacin terminal est asociado a la expresin de protenas

marcadoras tales como transglutaminasa, involucrina, filagrina y loricrina, entre otras. Los folculos pilosos (FP) que constituyen, junto con las
glndulas sebceas (GS) y sudorparas, los anexos epidrmicos, se forman durante la embriognesis a partir de la epidermis. De ellos, los FPs
son los ms importantes, tanto por su compleja estructura y su relevante
funcin como por residir en ellos uno de los compartimentos ms importantes de clulas madre epidrmicas.
La morfognesis de los FPs comienza relativamente pronto durante
la embriognesis (el da 14.5 en el ratn, que tiene un desarrollo embrionario de aproximadamente 19-20 das), y tiene lugar a travs de un
complejo intercambio de seales (cross-talk) entre las clulas de la
dermis y las de la epidermis, que en ese momento forman un epitelio de
una sola capa. La primera estructura en formarse (Figura 2A) es la
FIGURA 2. Esquema del desarrollo del folculo piloso durante la embrio gnesis desde
el estadio inicial de placoda (A) hasta el de folculo maduro (D). El recuadro incluye
algunos de los marcadores reportados para CMEs en funcin de la localizacin de stas.
227
placoda, que consiste en una invaginacin de la epidermis, en cuya

base se condensa un grupo de clulas drmicas, que constituye el precursor de la papila drmica (PD), que es el componente mesenquimal
permanente del FP y juega un papel crucial en el crecimiento de ste y,
por lo tanto, del pelo. Una vez formadas, estas placodas se embarcan
en un complejo programa de proliferacin, crecimiento hacia la dermis
y diferenciacin (Figuras 2B, 2C) que termina dando lugar a los FPs
(Figura 2D), con su compleja estructura de capas, capaces de generar
pelo y con las GSs formadas como un apndice. En los ltimos aos se
ha progresado mucho en el entendimiento de la complicada sealizacin
espacio-temporal que da lugar a la generacin de estas estructuras, y del
papel que una plyade de factores, entre los que destacan Wnt, BMPs
y -catenina, juegan en este proceso (como revisiones recientes, vase
referencias 2 y 3). Sin embargo, an nos queda un largo camino para
entenderlo adecuadamente. Por sus similaridades, el conocimiento que
acumulemos sobre el desarrollo de los FPs ser de aplicacin a la hora
de entender otros procesos morfogenticos de caractersticas similares,
como el desarrollo dentario o de la glndula mamaria. Concluido el
proceso de morfognesis, a lo largo de su vida los folculos pilosos
atraviesan ciclos constituidos por a) una fase de involucin (catgeno)
durante la cual se pierde la parte inferior del FP y se desplaza la PD
hacia la base de la parte permanente del folculo, justo por debajo de la
protuberancia (bulge) caracterstica del folculo; b) un perodo de latencia (telgeno); c) una fase de crecimiento (angeno) durante la cual el
cross talk entre las clulas de las papilas drmicas y las clulas progenitoras en la regin del bulge da lugar a la reconstitucin de un folculo
piloso completo y al crecimiento de un nuevo pelo.
Dermis
La dermis es el estrato vivo que acta como soporte de la epidermis.
El tipo celular principal de la dermis es el fibroblasto cuya funcin es
producir y mantener importantes elementos estructurales de la piel. Estos
elementos, que incluyen el colgeno y la elastina, se combinan con
sustancias no fibrosas tales como los glicosaminoglicanos (GAGs), para
formar la matriz extracelular (MEC) (Figura 1). La MEC tambin brinda
soporte a la membrana basal, garantizando la integridad de la unin
228
ASPECTOS
dermo-epidrmica. En condiciones normales, la tasa de recambio del

colgeno es baja pero aumenta durante la reparacin de un dao. La red
vascular, juega un rol central en el proceso de regeneracin cutnea. Un
aporte sanguneo inadecuado inhibe la reparacin. La falta de re-vascularizacin adecuada aumenta la formacin indeseada de tejido cicatrizal.
La membrana basal (MB), estructura compleja y constituida por
protenas especializadas, constituye una estructura fundamental del anclaje dermo-epidrmico y delimita las reas epitelial y mesenquimal.
Mutaciones en los genes que codifican las protenas de la membrana
basal (colgeno IV laminina 5) dan lugar a enfermedades cutneas
hereditarias, afortunadamente de baja incidencia, caracterizadas por la
extrema fragilidad de la piel ante cualquier estrs mecnico. Adems,
dado que, como veremos ms adelante, todos los tipos de clulas madre
epidrmicas (CME) estn en contacto con la MB, est cada vez ms
claro que sta juega un papel importante proveyendo el nicho o medio
ambiente necesario para, por una parte, mantener estas clulas en estado
quiescente y, por otra, permitirles activarse, primero proliferando y luego diferenciando, para mantener la homeostasis del tejido, dar lugar a
nuevo pelo o reparar una herida.
CLULAS MADRE EPIDRMICAS (CMEs)
La constante renovacin de la epidermis y del FP, unida a su capacidad para reaccionar eficientemente ante agresiones externas que conducen a su prdida (quemaduras, heridas, extirpaciones quirrgicas, etc.)
siempre constituyeron una clara indicacin de la existencia de CMEs.
Dada la importancia de estas clulas para disear futuras estrategias
teraputicas cutneas, en los ltimos aos se ha llevado a cabo una
intensa investigacin en este campo, utilizando las tcnicas biolgicas
ms refinadas (ver referencias 2-5 como revisiones recientes). Como
resultado de ella, se ha detectado la existencia de CMEs en el bulge del
FP, en la base de las GSs y en la capa basal de la PIF y se ha identificado un nmero de marcadores caractersticos de estas clulas (Figura
2), que permiten aislarlas o enriquecerlas y estudiar su potencial proliferativo y su capacidad de generar otros tipos de clulas. La mayor parte
de estos estudios ha sido hecha en ratones de laboratorio. Por razones
tcnicas y ticas obvias, los estudios en humanos han progresado menos,
229
pero han sido tambin identificadas CMEs en localizaciones similares a

las de ratn. Estas clulas poseen tambin marcadores especficos que,
con frecuencia pero no siempre, coinciden con los de ratn.
En condiciones de homeostasis normal, los FPs, la PIF y las GSs se
mantienen a partir de sus propias clulas madre. Sin embargo, en determinadas circunstancias, cada una de las tres poblaciones de clulas
madre es capaz de generar toda la epidermis, lo que demuestra su potencial pluripotencia en presencia de los estmulos necesarios. As, por
ejemplo, tras una herida extensa, la epidermis se regenera totalmente a
partir de las clulas del bulge del folculo y, puestas en contacto con
clulas de la papila drmica, clulas madre interfoliculares dan lugar a
FPs y GSs.
A pesar de todos estos avances, todava existen muchos aspectos
importantes de las CMEs poco esclarecidos. Por ejemplo, en la epidermis interfolicular no est claro ni el nmero, ni la localizacin de estas
clulas, as como tampoco su compartimento, es decir, la regin de
epidermis colonizada por los descendientes de una CME. Tampoco est
claro si todas ellas estn siempre activas o si, en funcin del tiempo y
los requerimientos de la piel, las CMEs pueden oscilar entre un estado
activo y otro inactivo.
En la piel interfolicular, el modelo clsicamente aceptado de la
unidad proliferativa epidrmica (UPE) (6) defina estas estructuras
como una unidad arquitectnica constituida en su base por 10 clulas
basales que diferencian hacia la superficie formando clulas progresivamente ms grandes y aplanadas, hasta culminar formando una nica
gran celda hexagonal cornificada. Segn este modelo, slo hay una
clula madre en el centro de cada UPE, la cual se divide asimtricamente para dar lugar al resto de las clulas de la base, llamadas clulas
progenitoras o transitoriamente amplificadoras (TA), las cuales slo tienen la capacidad de dividirse un nmero limitado de veces para, finalmente, migrar al estrato suprabasal y comenzar el proceso de diferenciacin terminal. Segn este modelo, la piel interfolicular sera mantenida
por un reducido nmero de CMEs situadas en zonas especficas de la
capa basal. Algunos autores las sitan en la cima de las crestas interpapilares (7) aunque en piel palmar podran localizarse en la base de estas
crestas (8, 9). Sin embargo, ha sido propuesto recientemente (10) un
modelo alternativo segn el cual la homeostasis de la piel interfolicular
230
ASPECTOS
sera llevada a cabo por clulas de la capa basal, que tendran el carcter
de progenitoras con capacidad de dividirse un nmero ilimitado de veces y daran lugar, a travs de divisiones asimtricas, a clulas determinadas a diferenciar terminalmente. En este modelo existe un alto nmero de estas clulas en la capa basal y no requeriran un nicho especfico,
la membrana basal sera el nicho comn a todas ellas.
Evidentemente, el tener buenos marcadores que nos permitan reconocer y aislar las CMEs y el identificar el nicho que permite a estas
clulas tener sus peculiares caractersticas biolgicas, son asuntos altamente relevantes, aunque, como vemos, todava objeto de mucha controversia, debido al potencial biomdico de las CMEs. Y una de las
aplicaciones que ms inters despierta es la posibilidad de inducir el
crecimiento de pelo humano para tratar la calvicie. Por desgracia, ste
es un problema particularmente complicado ya que, adems de las
CMEs, para que el folculo entre en fase de crecimiento (anagn) es
necesario un estmulo morfogentico proveniente de los fibroblastos de
la PD. Sin embargo, se han realizado recientemente progresos esperanzadores ya que, utilizando cmaras de silicona implantadas en la piel, en
las que se mezclan clulas del bulge portadoras de los marcadores
CD34+/K15+/6, (por lo tanto, potenciales CMEs del folculo) con fibroblastos neonatales (como substitutos de los fibroblastos de la papila
drmica del folculo) ha sido posible inducir el crecimiento de mechones
de pelo en ratones (11-13). Aunque se trata de un diseo experimental
todava muy alejado de la aplicacin prctica, no cabe duda de su relevancia. Adems, estos resultados no han podido todava ser reproducido
con clulas humanas ya que CD34, el marcador ms importante para la
seleccin de las CMEs en ratn, no se expresa en el bulge de los FPs
humanos, sino en estructuras vecinas.
A pesar de los esfuerzos por definir las clulas madre en funcin de
marcadores especficos, debemos recordar los criterios basados sobre la
capacidad proliferativa in vitro de cultivos primarios de queratinocitos
humanos, que fueron establecidos hace ms de veinte aos en el laboratorio de Howard Green (14). Segn estos criterios, se defines tres
poblaciones llamadas holoclones (clones con gran capacidad clonognica y gran potencial proliferativo), meroclones (clones con menor potencial proliferativo que los holoclones, originados en clulas progenitoras
comprometidas TA) y paraclones (clones con baja capacidad prolifera231
tiva, cercanas a la diferenciacin terminal) (Figura 3). A pesar de su

antigedad, esta clasificacin sigue vigente y considera el holoclon como
derivado estrictamente de las CMEs interfoliculares en humanos. As,
los ensayos clonognicos seran los mejores predictores de las potenciales clulas madre epidrmicas interfoliculares (14, 15). Estos estudios in
vitro han demostrado que, tanto la forma normal como la genticamente
modificada de holoclones en cultivo, poseen un extraordinario potencial
de replicacin (15). Tericamente, esta capacidad sera suficiente para
reemplazar la epidermis, no de un nico individuo durante toda su vida
(aproximadamente 1010 queratinocitos basales), sino de toda la poblacin humana (aproximadamente 1020 clulas). Esta enorme capacidad es
la base de la terapia, tanto celular como gentica, de piel.
Finalmente, es posible que la dificultad actual de contar con poblaciones puras de CMEs humanas sea resuelta a la vista de los re-
FIGURA 3. Caractersticas de los tres tipos de clulas presentes en la epidermis por

anlisis clonal (ver referencia 14). Las clulas madre dan lugar a holoclones con una
enorme capacidad proliferativa.
232
ASPECTOS
sultados publicados recientemente por Aasen y cols. (16). Estos autores han mostrado que es posible reprogramar tanto queratinocitos como
fibroblastos cutneos adultos a clulas madre pluripotentes, es decir
iPS (ver captulo 3). En el caso de los queratinocitos, el artculo demuestra que son las clulas que presentan la ms alta eficiencia y
velocidad de reprogramacin de todos los tipos celulares hasta ahora
ensayados (1% de eficiencia; 50-100 veces superior a fibroblastos
humanos). Estas interesantes caractersticas se consiguen tanto con
queratinocitos de prepucio de nios como con queratinocitos extrados
de un nico pelo adulto, es decir, sin causar dao al donante o paciente. Adems, estas iPS epidrmicas fueron capaces de diferenciar, tanto
in vitro como in vivo, hacia tipos celulares pertenecientes a las tres
capas embrionarias, incluyendo neuronas dopaminrgicas y cardiomiocitos. Obviamente, estos resultados han colocado a los queratinocitos
epidrmicos en el centro de este apasionante campo.
TERAPIA CELULAR PARA LA REGENERACIN CUTNEA:
QUEMADURAS EXTENSAS Y LCERA CRNICAS
A pesar de las incertidumbres reseadas, la biologa de la piel y sus
clulas madre es, tras el sistema hematopoytico, la mejor conocida.
Este conocimiento es el que ha permitido que sean precisamente estos
dos tejidos aquellos en los que ms rpidamente se han desarrollado
estrategias novedosas, tanto celulares como gnicas, para la correccin
de diversas enfermedades humanas.
Cultivos de piel para autoinjertos: reemplazo permanente
de la piel
La aparicin de sustitutos de piel y cultivos de clulas epidrmicas
como terapias experimentales para el tratamiento de heridas surgi principalmente a raz de la necesidad crtica de lograr una rpida cobertura
permanente de quemaduras extensas.
Por ejemplo, actualmente, en los Estados Unidos, requieren atencin
mdica unas 2.000.000 de quemaduras por ao. De stas, aproximadamente 70.000 requieren hospitalizacin y aproximadamente 15.000 son
233
referidas a centros especializados en atencin de quemaduras y necesitan algn tipo de procedimiento de injerto de piel (17).
Hasta la fecha, el tratamiento estndar para quemaduras severas se
basa en el injerto de piel obtenida de una zona no daada del cuerpo del
propio paciente (tcnica conocida como autoinjerto). Este mtodo es el
de eleccin siempre que el dao no sea demasiado extenso y el paciente
disponga de suficiente piel sana. Generalmente, la piel se toma del
mismo sitio donante varias veces y se permite que regenere entre tomas.
Este procedimiento es lento y da como resultado una piel con un efecto
cosmtico muy deficiente en el sitio de la quemadura debido a que, para
expandir su superficie 3-4 veces, la piel procedente del sitio donante se
somete a un proceso de mallado y estiramiento. Por otra parte, este
mtodo es de difcil aplicacin en paciente con quemaduras en ms del
50-60% de la superficie corporal.
A mediados de la dcada de los sesenta, Howard Green y colaboradores desarrollaron mtodos para el cultivo en serie y la expansin de
queratinocitos epidrmicos, basados en el uso de un cocktail de factores
de crecimiento especficos y la presencia de fibroblastos de ratn letalmente irradiados como feeder layer (18). Asimismo, el laboratorio de
Green (14) report posteriormente la persistencia en estos cultivos de
queratinocitos con capacidades proliferativas caractersticas de CMEs.
La tcnica para la expansin de queratinocitos in vitro propuesta por
Rheinwald y Green y el uso de la dispasa, una proteasa capaz de desprender del frasco de cultivo la lmina entera de clulas epidrmicas (en
vez de desprender clulas individuales como hace la tripsina), constituyeron un importante avance tcnico que convirti en una realidad clnica
el injerto de lminas epidrmicas obtenidas mediante el cultivo de queratinocitos primarios. As, en 1981, OConnor y colaboradores fueron
los primeros en preparar y transplantar, con xito, lminas de queratinocitos autlogos, para pacientes con quemaduras extensas (19). Estudios
posteriores de los mismos autores demostraron que las clulas injertadas
persisten indefinidamente en el paciente. Este hallazgo tiene gran relevancia ya que demuestra que es posible mantener las CMEs en las
condiciones de cultivo establecidas (20).
A pesar de que el injerto de lminas de clulas epiteliales ha contribuido a salvar la vida de paciente con quemaduras graves en todo el
mundo (19, 21, 22), esta estrategia mostr varios problemas tales como
234
ASPECTOS
la fragilidad del producto, la limitada eficacia de los injertos y la ultraestructura anormal de la unin dermo-epidrmica, que causa la formacin
de ampollas, genera contracturas y redunda en un beneficio limitado (23,
24). Se hizo evidente que era necesario un sistema de reemplazo cutneo
ms robusto. La carrera para desarrollar y comercializar estos productos
comenz en los aos ochenta y contina hoy. Buena parte de los problemas que presentaban los cultivos del tipo Rheinwald y Green eran probablemente debidos a que estos cultivos generaban una monocapa de
queratinocitos, estructura que dista mucho de la complejidad de la piel
interfolicular (Figura 1). Por ello, el siguiente paso consisti en generar
cultivos in vitro que tuvieran los dos compartimentos caractersticos de
la piel, la epidermis y la dermis, y que se denominan equivalentes o
sustitutos cutneos. Numerosos trabajos de revisin recientes han resumido la historia y el estado del arte de estos sustitutos (17, 25).
A pesar que an no se ha logrado sintetizar un sustituto cutneo
ideal, y que puede no ser realista esperar que esto ocurra, recientemente
nuestro equipo ha desarrollado un producto que tiene muchas de las
caractersticas clnicas buscadas. Este producto (Figura 4) se desarroll
basndose en el proceso de cicatrizacin de heridas y consta de: 1)
Componente celular formado por queratinocitos y fibroblastos, bien de
origen autlogo (del propio paciente) o alognico (de un donante) y, 2)
compartimento drmico formado por una matriz rica en fibrina, obtenido a partir de plasma del propio paciente o de donante (26, 27) (en este
ltimo caso, obtenida de criopreservados de bancos de sangre). La dermis artificial se prepara embebiendo los fibroblastos en el plasma, que
posteriormente se coagula por aadido de sales de calcio. De este modo,
se genera un soporte drmico en el que los fibroblastos se distribuyen
de forma tridimensional. Finalmente, sobre esta estructura se siembran
los queratinocitos a baja densidad. La matriz generada a base de plasma
tiene la particularidad de recrear el proceso fisiolgico de reparacin de
una herida, en donde un coagulo de fibrina rico en citoquinas dispara la
respuesta reparadora, que se traduce, a nivel del epitelio, en la proliferacin y migracin de los queratinocitos hasta cubrir el lecho temporal.
Una vez que los queratinocitos han tapizado la matriz drmica de epitelio, la piel artificial est lista para ser trasplantada. Empleando esta
tecnologa, a partir de una biopsia de piel nativa de 2 cm2 se puede
obtener, en tres semanas, una superficie de piel artificial de aproximadamente 1 m2 (una expansin de 5.000 veces). La alta capacidad de
235
F IGURA 4. Esquema de la generacin de sustitutos o equivalentes cutneos humanos

a partir de una pequea biopsia de piel de un paciente o donante. Este mtodo permite
producir, en tiempos relativamente cortos, grandes superficies de piel para su aplicacin
clnica. El recuadro A contiene una histologa de un equivalente en su estado final de
diferenciacin, mostrando su gran semejanza con la piel humana. El recuadro B contiene un
equivalente montado sobre una gasa, en el momento de ser extrado del cultivo
para ser trasplantado y muestra la buena resistencia mecnica de estos equivalentes,
lo que facilita su uso.
proliferacin de los queratinocitos cultivados sobre la matriz drmica de

plasma, unida a la posibilidad de prescindir de clulas ratn (empleadas
de modo habitual en prototipos previos para sostener la expansin de los
queratinocitos humanos) y a la mayor estabilidad mecnica de la piel
basada en plasma (Figura 4B), puso de manifiesto el potencial de este
diseo para la regeneracin cutnea en clnica. Adems, en el caso de
utilizarse plasma del propio paciente, todos los componentes de este
sustituto cutneo seran autlogos.
Este desarrollo ha sido patentado (28) y durante los ltimos seis
aos ha sido aplicado a ms de 70 pacientes con quemaduras extensas
236
ASPECTOS
y severas, en unidades de grandes quemados de varios hospitales espaoles, con notables porcentajes de toma (hasta del 90%) de los injertos
y con razonables resultados cosmticos (Figura 5A) (27, 29)
FIGURA 5. Aplicacin de los equivalentes cutneos al tratamiento de quemados extensos (A)

y de lceras crnicas (B). En el primer caso, los equivalentes se construyen con clulas del
propio paciente (autlogas) mientras que en el segundo procedan de donantes jvenes (alognicas).
A pesar de estos resultados alentadores, an quedan mltiples aspectos a mejorar. Dos causas relevantes para la baja toma (<20%) observada en algunos casos son: 1) las infecciones que suele presentar el lecho
receptor del injerto, que no siempre son tratables con antibiticos que no
comprometan la viabilidad del trasplante; 2) la deficiente vascularizacin del lecho. Actualmente estamos desarrollando estrategias gnicas
que dotarn en el futuro de capacidad antibitica de amplio espectro, as
como de capacidad de promover neoangiognesis, a nuestros equivalentes cutneos (30, 31)
Desde el punto de vista cosmtico, hay que recordar que todava no
es posible generar folculos pilosos a travs de estos equivalentes cutneos, aunque es razonable pensar que llegar a ser posible en el futuro,
237
a la vista de los prometedores resultados mencionados anteriormente en

este captulo. Por otra parte, la destruccin provocada frecuentemente
por las quemaduras es tan profunda que requerir la regeneracin del
tejido muscular y del adiposo subyacente, lo cual constituye un nuevo
reto en el que estamos trabajando.
Finalmente, dado su buen resultado con quemados extensos, estos
equivalentes cutneos han sido aplicados con xito en otras situaciones
graves donde se requera la sustitucin de superficies importantes de piel
autloga, tales como fascitis necrotizantes, enfermedad injerto contra
husped y extirpacin de nevus gigante (29). Nuestra impresin es que,
conforme los clnicos se vayan familiarizando con la utilidad de este tipo
de productos, se irn aplicando con mayor asiduidad y su uso se extender a casos de prdidas cutneas menos severas que las comentadas.
Aloinjertos temporales para el tratamiento de lceras crnicas
Debido a la necesidad de ser producidos a partir de clulas de cada
paciente, los sustitutos cutneos autlogos obtenidos por ingeniera tisular disponibles comercialmente tienen un coste relativamente alto y una
complicada logstica, desventajas que hacen que no se apliquen en el
tratamiento de enfermedades menos severas que las anteriormente mencionadas. Sin embargo, las heridas crnicas (ms de 6 meses sin cerrar),
caractersticas de las extremidades inferiores y refractarias a los tratamientos tradicionales, constituyen un problema hospitalario de primer orden debido al aumento del segmento anciano de la poblacin
en el mundo industrializado y a la mayor incidencia de estados de comorbilidad tales como diabetes mellitus y deterioro vascular, estimndose que afectan al 1-2 % de la poblacin total en pases desarrollados. Esta situacin ha promovido el desarrollo de varios productos comerciales para su tratamiento. El lector puede consultar un excelente y
extenso trabajo de revisin de Eisenbud y colaboradores (32)
(www.medscape.com wete) sobre la eficacia de estos productos.
En el caso de las lceras crnicas, no es necesario ni probablemente
conveniente, dada la avanzada edad y las situaciones clnicas que usualmente presentan esto pacientes, desarrollar sustitutos autlogos. Los
sustitutos utilizados en el momento presente son alognicos y contienen
238
ASPECTOS
clulas de donantes jvenes, normalmente nios que, por motivos teraputicos o estticos, se someten a una extirpacin quirrgica. Ello es
debido a que, a pesar de los avances en el conocimiento de los mecanismos moleculares involucrados en el proceso de cicatrizacin de heridas, la ciencia del tratamiento de heridas crnicas con sustitutos cutneos es todava fundamentalmente emprica. Los efectos beneficiosos
del uso de estos sustitutos podran abarcar desde el mantenimiento en el
sitio de la herida de un ambiente hmedo y bioqumicamente balanceado, hasta el aporte de citoquinas beneficiosas y factores de crecimiento
al lecho de la herida. Este ltimo efecto parece ser el ms probable ya
que los sustitutos fabricados con clulas de donantes jvenes dan mejores resultados.
Por definicin, los sustitutos alognicos aportan clulas que no persisten en el sitio receptor y as ha sido demostrado (33), por lo que,
desde este punto de vista, pueden considerarse como bioseguros. Por lo
tanto, en el caso de heridas crnicas, el objetivo es lograr una cobertura
biolgica temporal que logre estimular a las clulas cutneas del paciente para que crezcan y cierren la herida. La versin alognica de los
equivalentes cutneos ricos en fibrina descritos para el tratamiento de
quemaduras ha sido usada como un medio eficiente para inducir la
cicatrizacin de lcera crnicas (Figura 5B). Ms de cien pacientes han
sido tratado con este equivalente cutneo con un alto ndice de eficacia:
80% de tasa de cicatrizacin en un tiempo medio de 6,6 semanas (34,
Meana y cols., resultados no publicados). Aunque no se produce una
reaccin inflamatoria tpica de rechazo, los sustitutos alognicos no son
viables una vez injertados y su efecto se agota, por lo que deben ser
cambiados cada semana (5,8 injertos de promedio por paciente).
Desafortunadamente, como era esperable, un porcentaje relativamente alto (25%) de los pacientes tratados recidivan debido a que estos
equivalentes no curan la patologa isqumica o diabtica subyacente a
las lceras. Es de prever que, en el futuro, a los injertos alognicos se
les introduzcan genes capaces de mejorar temporalmente los efectos de
estas patologas a nivel local, por ejemplo, produciendo VEGF u otros
factores pro-angiognicos que mejoren la angiognesis en la zona de la
lcera. (31; Del Ro y cols., resultados no publicados). Una curacin
definitiva pasara por utilizar equivalentes autlogos modificados genticamente, es decir, una terapia gnica.
239
MODELIZACIN DE ENFERMEDADES Y PROCESOS

CUTNEOS
Para estudiar mejor las diversas enfermedades cutneas as como
para ensayar nuevos medicamentos o estrategias teraputicas, es necesario acceder a voluntarios y pacientes, lo cual est limitado por cuestiones ticas y prcticas. Aunque los modelos animales tienen gran valor
como herramientas para desvelar mecanismos crticos en enfermedades,
la piel murina frecuentemente no reproduce de manera fiel las patologas cutneas equivalentes en humanos. Los cultivos in vitro de equivalentes de piel representan una alternativa vlida a los estudios in vivo en
piel nativa. Sin embargo, estn limitados, entre otras restricciones, por
la corta vida media de estos cultivos y la ausencia o deficiencia en
determinadas respuestas mesenquimales cruciales como la angiognesis.
Para evitar estos problemas, los investigadores han realizado habitualmente transplantes xenognicos injertando biopsias cutneas de donantes o pacientes en ratones inmunodeficientes, para llevar a cabo experimentos relevantes in vivo en un contexto humano. No obstante, adems
de las dificultades en la obtencin de muestras, uno de los principales
inconvenientes que presenta este tipo de experimentos es la gran heterogeneidad que tienen las muestras de piel a injertar. De hecho, diferencias en el fondo gentico, lugar del cuerpo o el historial de exposicin
al sol del paciente, entre otros factores, pueden invalidar en gran medida
el resultado del estudio. Adems, no es fcil ni tico contar con el
nmero de pacientes o donantes que requerira la investigacin en este
campo.
Dado que, como se coment anteriormente, a partir de un donante
se pueden obtener grandes superficies de piel, a travs de cultivos, la
solucin a este problema deberan ser el injerto en ratones inmunodeficientes de equivalentes cutneos humanos. Aunque factibles, estos injertos requeran normalmente procedimientos complejos y tediosos y su
tasa de xito era baja. Adems, los injertos frecuentemente se degradaban rpidamente impidiendo que se realizasen estudios a largo plazo
sobre las funciones de las CMEs. A partir de los cultivos de equivalentes de piel humana descritos, nuestro grupo ha desarrollado un nuevo
procedimiento quirrgico optimizado que resuelve buena parte de los
problemas existentes (Figura 6). Este mtodo facilita la generacin de
un elevado nmero de ratones inmunodeficientes injertados con piel
240
ASPECTOS
FIGURA 6. Diseo de un sistema experimental de piel humana (ratones humanizados). A

partir de una biopsia de un donante o paciente, y utilizando un procedimiento quirrgico
optimizado por nuestro equipo, se puede producir un alto nmero de equivalentes cutneos
y trasplantarlos a ratones inmunodeficientes sobre los que persisten viables al menos 6 meses,
tiempo en el que pueden ser utilizados experimentalmente. Como se muestra en el recuadro
D, el trasplante en el ratn genera una piel indistinguible de la humana real (mostrada en
el pequeo recuadro insertado en D). Este mtodo ofrece una gran flexibilidad y reproducibilidad, evitandolos inconvenientes ticos y prcticos de utilizar voluntarios o pacientes
en experimentacin bsica o preclnica.
humana, en un periodo de tiempo relativamente corto. Una gran ventaja

de este sistema es que, utilizando una nica muestra de piel de un
donante, permite conseguir un alto nmero de ratones portadores de
injertos de piel genticamente homogneos. Estudios previos de nuestro
grupo, y de otros tambin, demostraron que la piel humana regenerada
de esta manera, mantiene todas las caractersticas estructurales de la piel
nativa, incluso si se gener a partir de queratinocitos humanos modificados genticamente (Figura 6D) (35). A las 6 semanas post-transplante,
la piel humana del injerto se ha normalizado y es apta para la experimentacin. La piel transplantada permanece viable por largos periodos
(al menos, 6-12 meses) e, incluso tras ese tiempo, una biopsia del trasplante puede ser recultivada in vitro y retrasplantada en un nuevo ratn,
lo cual es una buena prueba de la persistencia de las CMEs y convierte
este sistema en idneo para su estudio.
241
Modelizacin de respuestas fisiolgicas I:

Curacin de heridas cutneas
Tras conseguir una eficiente regeneracin de piel humana en los
ratones trasplantados, quisimos determinar si nuestro modelo de ratones
humanizados en su piel era capaz de recrear fielmente un proceso
fisiolgico como el de la curacin de heridas. Para esto, se realizaron
heridas de corte en la piel humana regenerada en ratones inmunodeficientes, y se sigui cuidadosamente el proceso de curacin, estudiando
la expresin de mtiples marcadores epidrmicos y mesenquimales. Este
estudio demostr que todas las caractersticas principales de la cicatrizacin de heridas cutneas, es decir, re-epitelizacin, remodelacin de la
matriz drmica y reorganizacin de la membrana basal, se reprodujeron
de manera precisa (Figura 7A; [36]). Recientemente, un anlisis de la
F IGURA 7. Versatilidad de los ratones humanizados en su piel para modelar procesos

y patologas cutneas. A) La cicatrizacin de una herida, desde su produccin (da 0) hasta
su curacin (da 6) reproduce fielmente el proceso en humanos. B) y C).
Respuesta a la irradiacin con luz UVB. Induccin de p53 (B) y de clulas sunburn (C)
48 horas post-irradiacin. D) Modelizacin de Epidermlisis Ampollosa. Ntese la presencia
de extensas roturas dermo-epidrmicas (ampollas), caractersticas de esta enfermedad. E)
modelizacin del sndrome de Gorlin. Ntese la hiperplasia y la morfologa papilomatosa de
la epidermis.
242
ASPECTOS
expresin gentica global del proceso de cicatrizacin comparando tejido obtenido de heridas producidas en donantes frente al obtenido en
heridas producidas en ratones humanizados en su piel, revel grandes
similitudes (Del Ro y cols., datos no publicados), apoyando an ms la
validez de este modelo.
Modelizacin de respuestas fisiolgicas II: Respuesta a UV
Existen pruebas convincentes de que cada uno de los tres tipos de
cncer de piel ms importantes, carcinoma de clulas basales, carcinoma
de clulas escamosas y melanoma, estn causados por exposicin al sol.
Como se ha comentado previamente, el estudio de la respuesta a la luz
UV en voluntarios o en ratones inmunodeficientes con xenoinjertos de
piel de donante, presenta importantes inconvenientes. Por ello, decidimos poner a prueba nuestro modelo de ratones humanizados para valorar si tena capacidad de responder adecuadamente a la irradiacin UV.
Para esto, examinamos la aparicin de clulas sunburn e induccin de
p53, dos marcadores bien descritos y asociados a la accin de la luz UV.
Ambos efectos se detectaron fcilmente al cabo de las 48 horas siguientes a la irradiacin (Figura 6B, C). A partir de este modelo se est
estudiando detalladamente la respuesta a la luz UV en ratones humanizados tanto con piel albina como pigmentada. Tambin se ha podido
estudiar el efecto de protectores UV, lo cual pone de manifiesto el
potencial de este modelo para el estudio de compuestos teraputicos de
diversa ndole (Del Ro y cols., datos no publicados).
Modelizacin de enfermedades cutneas humanas heredadas I:
Genodermatosis
Estudios recientes, llevados a cabo por nuestro equipo de investigacin en colaboracin con el grupo dirigido por el Dr. Meneguzzi (INSERM, Francia), han demostrado que es posible conseguir la recreacin
a largo plazo de una enfermedad cutnea hereditaria monognica (la
forma distrfica de la Epidermolisis Bullosa o Ampollosa) (EAD) (37)
en ratones humanizados. Para ello, es necesario partir de una muestra de
piel del paciente, a partir de la que se consigue aislar y amplificar sus
243
clulas (fibroblastos y queratinocitos). Esta piel humana regenerada en

el ratn mantiene las principales caractersticas fenotpicas de la piel del
paciente, es decir, la formacin de ampollas por debajo de la membrana
basal debido a la falta de colgeno VII y, por tanto, de fibrillas de
anclaje (Figura 6D). Con este mtodo, tambin ha sido posible modelizar fielmente otros tipos de Epidermolisis Ampollosa (Del Ro y cols.,
resultados no publicados). Estos estudios han abierto grandes posibilidades para la recreacin fidedigna de diferentes enfermedades cutneas
humanas in vivo.
Modelizacin de enfermedades cutneas humanas heredadas II:
Predisposicin al Cncer
Una vez demostrada la idoneidad del sistema de humanizacin de
ratones en su piel como modelo para enfermedades cutneas heredadas
como la Epidermolisis, decidimos explorar la posibilidad de recrear enfermedades relacionadas con el cncer.
El sndrome de Gorlin es una patologa de origen gentico, heredada
de manera autosmica dominante cuyos pacientes presentan una extraordinaria predisposicin a padecer carcinomas basocelulares. El gen
responsable del sndrome de Gorlin se localiza en el cromosoma 9 y se
ha identificado como PTCH, el homlogo en humanos del gen patched
(PTC) de Drosophila. En este caso, se utiliz el mismo mtodo anteriormente explicado para generar una serie de ratones humanizados con piel
procedente de enfermos de Gorlin (Figura 6E). Se usaron cultivos primarios de queratinocitos y fibroblastos obtenidos a partir de biopsias de
dos pacientes de sndrome de Gorlin, para producir equivalentes de piel
sobre una base de fibrina. Los anlisis histopatolgicos llevados a cabo
tras realizar los injertos, mostraron un epitelio alterado caracterstico
papilomatoso, similar al que se puede observar en lesiones premalignas
en humanos, lo que demuestra la eficacia de esta aproximacin experimental para recrear la enfermedad. Prximos estudios estarn dirigidos
a evaluar la respuesta crnica a la luz UV en estos ratones, en particular,
la posibilidad de obtener tumores. Adems, utilizando un mtodo similar, ha sido posible generar modelos de otras patologas genticas de
piel de predisposicin al cncer, como Xeroderma Pigmentosum (Del
244
ASPECTOS
Ro y cols., resultados no publicados). Estos modelos animales han sido

objeto de una patente internacional (38).
En conclusin, el desarrollo de sistemas a partir de piel obtenida por
bioingeniera, como el basado en el crecimiento de queratinocitos humanos sobre un equivalente drmico de fibrina con fibroblastos, en combinacin con procedimientos quirrgicos optimizados, nos ha permitido
establecer una robusta plataforma humanizada para acercar el estudio de
la fisiologa y las enfermedades cutneas al investigador. De esta manera, la regeneracin de piel humana en ratones inmunodeficientes tras
injertar piel obtenida por bio-ingeniera, parece presentar el compromiso
perfecto entre fidelidad y practicidad.
Es de prever que una mejor comprensin sobre los marcadores y
mecanismos moleculares implicados en la pluripotencialidad de las
CMEs humanas permitir no slo la generacin de equivalentes de piel
ms robustos y capaces de regenerar completamente la piel del cuerpo,
incluyendo glndulas y pelo, sino tambin modelizar enfermedades cutneas mucho ms complejas que las descritas.
De momento, estos ratones humanizados en su piel constituyen un
valioso modelo pre-clnico para poder ensayar terapias de tipo celular y
gnico, como veremos en los siguientes apartados. Un modelo an ms
complejo, pero perfectamente factible, consistira en generar ratones con
un sistema inmune tambin humanizado a travs de un transplante de
mdula sea humana.
TRATAMIENTO DE ENFERMEDADES GENTICAS CUTNEAS
(GENODERMATOSIS) POR TERAPIA CELULAR
As como el trasplante alognico de mdula sea puede resultar de
enorme beneficio teraputico para algunas enfermedades congnitas del
sistema hematopoytico, una estrategia similar mediante el trasplante de
equivalentes cutneos podra paliar situaciones patolgicas en la piel.
En este sentido, nuestro grupo ha diseado un equivalente cutneo para
ayudar a la regeneracin de las heridas asociadas a la Epidermolisis
Ampollosa Distrfica (EAD).
Como se ha comentado anteriormente, esta enfermedad rara congnita es debida a mutaciones en el gen del colgeno VII que abolen la
245
formacin de las fibrillas de anclaje dermoepidrmico (ver Figura 1),

por lo que, ante el menor estrs mecnico, se forman ampollas y heridas
en la piel de los pacientes. Con frecuencia, la penetrancia de esta mutacin es muy grande, el fenotipo muy severo y las heridas repetidas
acaban produciendo deformaciones en las manos (pseudosindactilia) o
tienden a cronificar y a degenerar en carcinomas. Estos pacientes, junto
con los de otras genodermatosis, reciben popularmente el nombre de
nios mariposa.
El diseo de una posible terapia celular para esta enfermedad basada
en el uso de fibroblastos alognicos se fundament en las siguientes
consideraciones: El colgeno VII es mayoritariamene aportado por la
capa basal de queratinocitos epidrmicos, pero los fibroblastos drmicos
aportan una cantidad suficiente como para suponer que, de ser funcional, podra suponer una importante mejora de la calidad de vida de estos
pacientes. Por otra parte, la experiencia clnica de trasplantes de piel
alognica demuestra que los fibroblastos, al contrario que los queratinocitos, son poco inmunognicos y pueden permanecer durante un lapso
de tiempo relativamente largo en el receptor. Adems, el colgeno VII
es una protena muy estable, con una vida media muy larga. Por todo
ello, es previsible que los pacientes de esta enfermedad experimenten
una notable mejora temporal en su calidad de vida si se tratan las zonas
ms afectada (manos, lcera crnicas) con equivalentes cutneos quimricos, conteniendo fibroblastos alognicos (de voluntario sano),
capaces de producir colgeno VII, y queratinocitos propios (para evitar
el fuerte rechazo que produciran queratinocitos alognicos).
Como ensayo preclnico, estos equivalentes se probaron en ratones
humanizados. Como se puede observar en las Figuras 8A y 8A, los
equivalentes quimricos (8A) no mostraron las ampollas caractersticas
de la enfermedad, que s mostraban equivalentes similares portadores de
fibroblastos del paciente (equivalentes autlogos) (8A). La estructura de
la piel quimrica era normal o, con frecuencia, mostraba microampollas,
mucho menores que las que aparecan en los trasplantes de equivalentes
autlogos.
Promovido por la empresa biotecnolgica espaola Cellerix, estos
equivalentes cutneos quimricos recibieron la designacin de Medicamento Hurfano por parte de la Agencia Europea para la Evaluacin de
Medicamentos (EMEA, abril de 2006; Comisin Europea: Enterprise
246
ASPECTOS
and Industry, http://ec.europa.eu/enterprise/pharmaceuticals/register/

alforphreg.htm) y se encuentran actualmente en un ensayo clnico de
fase I-II, controlado y multicntrico, que reclutar un nmero total de 12
pacientes espaoles.
F IGURA 8. Uso de ratones humanizados en ensayos preclnicos de terapia celular

(A, A) y gnica (B, B) de Epidermlisis Ampollosa Distrfica (EAD). A) Piel reconstruida
a partir de queratinocitos y fibroblastos de un paciente de EAD, mostrando extensas rupturas
por debajo de la membrana basal, caractersticas de esta enfermedad. A) Piel reconstruida
a partir de queratinocitos del mismo paciente y fibroblastos de un donante sano (equivalente
quimrico), mostrando la ausencia de ampollas. B) Piel reconstruida a partir de queratinocitos y fibroblastos de un donante sano, mostrando la presencia de colgeno VII humano por
debajo de la membrana basal (visualizado por histoqumica, utilizando un anticuerpo monoclonal especfico). B) Reconstitucin de la produccin de colgeno VII en un trasplante
reconstruido a partir de clulas de un paciente EAD, en el que los queratinocitos fueron
transducidos con un vector retroviral portador del gen del colgeno VII.
TERAPIA GENTICA CUTNEA

La piel es un rgano que desde el principio ha despertado grandes
expectativas para el desarrollo de estrategias teraputicas basadas en la
transferencia gnica. Su fcil acceso permite evaluar directamente el
rea modificada genticamente y estudiar las consecuencias de esta mo247
dificacin, produciendo poco malestar al paciente y, ms importante

an, extirpar el tejido genticamente modificado en caso de detectarse
efectos adversos. Como hemos visto, las clulas cutneas son relativamente fciles de obtener y de expandir in vitro a partir de una pequea
biopsia de piel, sin que se pierdan las CMEs y se han logrado avances
importantes en el desarrollo y uso clnico de equivalentes cutneos
obtenidos mediante ingeniera tisular para la regeneracin cutnea permanente. Por ltimo, se ha demostrado que el compartimento de clulas
madre epidrmicas, que es el blanco requerido para cualquier estrategia
de terapia gnica permanente en la piel, se puede modificar eficientemente utilizando tanto vectores integrativos como no integrativos (3941). Estos estudios han aportado evidencias firmes de que la transferencia gnica correctiva es factible y constituyen el punto de partida para
el desarrollo de la terapia gnica cutnea, que culmin con la puesta en
marcha en Italia, en 2005, de un ensayo de fase I-II para la correccin
de la Epidermolisis Ampollosa Juntural, genodermatosis debida a deficiencia fsica o funcional de laminina 5 (42). Este ensayo se est desarrollando, hasta este momento, con buenos resultados y ausencia de
efectos adverso.
Se pueden utilizar dos mtodos diferentes de transferencia gnica
para la modificacin gentica de la piel: ex vivo e in vivo. El abordaje
ex vivo consiste en el aislamiento y propagacin in vitro de clulas
cutneas (queratinocitos y/o fibroblastos) obtenidas de un paciente, y su
modificacin gentica mientras estn en cultivo, para posteriormente
injertarlas nuevamente en el paciente como parte de un equivalente
cutneo, obtenido mediante ingeniera tisular por la tcnica que hemos
descrito anteriormente. En el abordaje in vivo se realiza una transferencia gnica directa al paciente ya sea mediante el suministro de ADN
plasmdico por inyeccin directa, mtodos biobalsticos (gene gun),
electroporacin o mediante la utilizacin de vectores virales (tales como
lentivirus, adenovirus y virus adenoasociados).
La tcnica de eleccin depender de la naturaleza del problema a
corregir pero, a pesar de los esfuerzos por mejorar los resultados de
la terapia in vivo, estos siguen siendo, en conjunto, manifiestamente
inferiores a los obtenidos ex-vivo en estudios preclnicos, por lo que
sta es, en estos momentos, la tcnica preferida para la terapia gnica
cutnea.
248
ASPECTOS
La correccin de la mayor parte de las patologas requiere la expresin permanente del gen teraputico en la epidermis, para lo que es
necesario introducir eficientemente (transducir) este gen en clulas madre. La transferencia gnica ex vivo mediante vectores oncorretrovirales
(basados en el virus Moloney), se ha utilizado con xito en estudios
preclnicos para este fin (43). Para que estos vectores las infecten, la
proliferacin de las clulas diana es un requisito obligatorio. Se cree
que, en las condiciones normales de cultivo, existe un porcentaje de
clulas madre epidrmicas no proliferativas, lo que dificultara sustancialmente la transduccin eficiente de estos cultivos mediante vectores
oncorretrovirales. Por tanto, los vectores lentivirales (basados en el virus
VIH del SIDA), capaces de infectar queratinocitos humanos tanto en
proliferacin como quiescentes, representan una estrategia alternativa,
sobre todo cuando se pretende la correccin de genodermatosis tales
como las epidermolisis, en las que se cree que la cantidad de clulas
madre puede estar parcialmente agotada debido a la necesidad de reparar las continuas lceras que se forman en estos pacientes (41, 44).
En estos momentos, existen en el mundo varios protocolos de terapia gnica de piel en marcha, fundamentalmente en estado preclnico
(para una revisin, vase 45). Estas terapias utilizan aproximaciones
tanto ex-vivo como in-vivo, diferentes tipos de vectores e, incluso, la
inyeccin directa de la protena teraputica. Nuestro grupo est participando en algunos de ellos, orientados a la correccin de diferentes enfermedades cutneas, tales como EAD, EAJ, Paquioniquia congnita y
Xeroderma Pigmentosum, y en la mejora del proceso de cicatrizacin a
travs de factores de crecimiento, factores pro-angiognicos y pptidos
antimicrobianos. A modo de ejemplo, slo me referir aqu a nuestros
resultados en EBD dado que, como ya se coment anteriormente, en esta
enfermedad tambin participamos en un ensayo clnico basado en terapia celular. Esta terapia, en el mejor de los casos, proveer una mejora
parcial y temporal de los sntomas de la enfermedad.
Dado que la epidermis es muy inmunognica, en el protocolo de
terapia celular no es posible utilizar queratinocitos de donante sano, por
lo que la correccin real y estable de esta enfermedad pasa necesariamente por introducir una copia correcta del gen del colgeno VII en
queratinocitos del propio paciente con vectores retro o lentivirales. Con
los queratinocitos corregidos y fibroblastos del mismo paciente se cons249
truiran equivalentes cutneos que se le trasplantaran a la manera que

se hace con los quemados extensos. Aunque quizs sea poco realista, en
el momento presente, pensar que se puede sustituir toda la piel de un
paciente por piel genticamente corregida; al menos se pueden trasplantar las zonas ms crticas, como las manos o las lceras que cronifican
y que acaban generando tumores con alta probabilidad.
Como prueba preclnica de esta aproximacin, nuestro laboratorio,
en colaboracin con el Dr. Meneguzzi, gener equivalentes cutneos a
partir de clulas de pacientes de EAD. Los queratinocitos de parte de los
equivalentes eran directamente del paciente. Pero en otros equivalentes,
los queratinocitos del paciente fueron transducidos con un vector retroviral que expresaba el gen del colgeno VII (36). La piel humana regenerada en ratones inmunodeficientes mediante el trasplante de queratinocitos provenientes del paciente mostraba la dramtica fragilidad en la
adhesin dermo-epidrmica y la formacin de ampollas espontneas
como consecuencia de la ausencia del colgeno tipo VII, y por tanto de
las fibrillas del anclaje, caractersticas de esta enfermedad (ver Figura
8A). Por el contrario, el fenotipo fue corregido en el injerto de las
clulas EAD modificadas genticamente y la presencia de colgeno VII
en la zona de unin dermo-epidrmica alcanzaba niveles similares a los
encontrados en un trasplante control, portador de clulas de un donante
sano (Figura 8C, D).
HACIA UNA TERAPIA GNICA CUTNEA BIOSEGURA
Como se coment anteriormente, el campo de la terapia gnica ha
sufrido recientemente un revs en un, por otra parte exitoso, ensayo
clnico para la inmunodeficiencia severa combinada ligada al cromosoma X (IDSC-X; X-SCID por sus siglas en ingls). El vector retroviral
utilizado en la terapia se integr y activ el gen LMO-2, un protooncogn de clulas T, en tres pacientes distintos (46, 47). Aunque hasta
el momento no ha habido informes sobre efectos adversos serios relacionados con la integracin viral en otros ensayos clnicos de terapia gnica
en marcha, los resultados del ensayo francs para IDSC-X y otros estudios in vivo con animales modelo han hecho sonar la alarma sobre las
posibles consecuencias genotxicas de utilizar vectores con capacidad
integrativa en este tipo de terapias, y aconsejan tomar medidas de segu250
ASPECTOS
ridad para evitar o minimizar los riesgos (48). Hasta ahora, los desarrollos para evitar el riesgo genotxico de los vectores retrovirales se han
centrado principalmente en mejorar el diseo de los mismos (49). Una
alternativa podra consistir en pre-evaluar la seguridad de clulas madre
genticamente modificadas y de su progenie. Esto no es tcnicamente
factible actualmente en otros sistemas de terapia gnica, como puede ser
el basado en clulas madre hematopoyticas, en las que su clonacin y
propagacin en cultivo da lugar a una prdida severa de su pluripotencia, pero podra resultar eficaz para clulas madre epidrmicas en terapia gnica cutnea ex vivo.
Nuestro equipo ha sido el primero en plantear, en piel humana, un
desarrollo experimental bioseguro (Figura 9); (50) en el que un cultivo
FIGURA 9. Esquema para una terapia gnica cutnea biosegura. A) Cultivos primarios
de queratinocitos humanos son transducidos con un retrovirus portador bien de un gen
marcador (vector GFP) o de un gen marcador y otro potencialmente teraputico (vector
GFP-leptina). B) Clonacin por dilucin de queratinocitos transducidos. C) Ensayos de eficiencia formadora de colonias (CFE) de varios de los clones obtenidos en B, para seleccionar
aquellos que tengan caractersticas de holoclones (ver figura 3). D) Los holoclones seleccionados se expanden y parte de sus clulas se congelan. Con el resto de sus clulas se llevan
a cabo los anlisis que permiten suponer que son bioseguros (identificacin del sitio de
integracin del vector retroviral, anlisis de expresin gnica, cariotipo, etc) y que expresan eficientemente el (los) gen(es) portados por el retrovirus. E) A partir de holoclones
individuales potencialmente bioseguros, se desarrollan equivalentes cutneos que se transfieren (F) a ratones inmunodeficientes para analizar su viabilidad, su inocuidad y la estabilidad
de la expresin de los genes portados por el retrovirus, en particular de los potencialmente
teraputicos, como paso previo a su uso en pacientes humanos.
251
de queratinocitos primarios es transducido con vectores retrovirales de

tipo integrativo (retro o lentivirus), de manera similar a como se hara
en un ensayo clnico de terapia gnica. Estos vectores llevan y expresan
el gen de la protena verde fluorescente (GFP), que permite seleccionar
fcilmente las clulas que han incorporado el vector. En un trasplante
clsico, se recolectaran todas las clulas positivas para GFP, se expandiran en cultivo y con ellas se construira el equivalente cutneo y se
trasplantara. En nuestra propuesta, sin embargo, a travs de la clsica
tcnica de dilucin al lmite, se aslan clones generados a partir de una
nica clula de queratinocitos positivos para GFP y se expanden in
vitro. Con ellos se llevan a cabo ensayos de eficiencia formadora de
colonias (CFE) y se determina cules son holoclones y, por lo tanto,
derivan de una CME. A continuacin, y sta es la diferencia crtica, en
varios de estos holoclones se determina la posicin del genoma en la
que se insert el vector viral y se analiza que no se encuentre dentro de,
o en la vecindad de, ningn gen relevante para la homeostasis de la piel
o para la supervivencia o el crecimiento celular, cuya expresin pudiera
verse afectada por la presencia de retrovirus y, sobre todo, por los fuertes elementos estimuladores de actividad gnica (enhancers) que ste
porta en sus LTR. Esta primera impresin de la inocuidad de la insercin puede confirmarse mediante el uso de otras tcnicas, por ejemplo,
comparando a travs de microarrays el transcriptoma de las clulas del
holocln con el de los queratinocitos primarios iniciales, o analizando el
cariotipo.
Los holoclones que no presentan integraciones potencialmente peligrosas del vector retroviral ni alteraciones detectables en otros parmetros medidos, son seleccionados. Una parte de sus clulas son congeladas, para su posible uso posterior con pacientes, y con el resto se
construyen equivalentes cutneos que son trasplantados a ratones inmunodeficientes, en los que se analiza: 1) Si generan una piel normal, tanto
por su histologa como a travs del anlisis de los marcadores tpicos de
la piel humana. 2) La persistencia y viabilidad del trasplante.
Hasta el momento presente, nuestro equipo ha realizado este proceso utilizando dos vectores retrovirales: uno portador slo del gen marcador GFP (vector GFP) y otro, bicistrnico, portador tambin del gen
de la leptina (vector GFP-leptina) como paradigma de una gen potencialmente teraputico. A modo de ejemplo, en un holocln portador del
252
ASPECTOS
vector GFP leptina se detectaron 3 inserciones del retrovirus en genes

de los cromosomas 10, 20 y X. En los tres casos, la insercin ocurri
en el primer intrn de los correspondientes genes, lo que es consistente
con el tropismo mostrado por este tipo de vectores en otros tipos de
clulas. Por los datos existentes, ninguno de los genes afectados por la
integracin puede considerarse potencialmente peligroso para queratinocitos epidrmicos, aunque uno de ellos era el gen de la distrofina, causante de la distrofia muscular de Duchene. Por otra parte, el anlisis de
los equivalentes trasplantados mostr en todos los casos una histologa
normal y una correcta expresin de los marcadores de proliferacin y
diferenciacin epidrmica, as como una duracin superior a las 40 semanas, plazo en el que la piel ha sufrido muchos ciclos de renovacin,
lo que hace suponer que, como esperbamos, a pesar de las inserciones
retrovirales, las CMEs no sufrieron merma de su viabilidad.
Comprobada la factibilidad de esta tcnica, en el momento presente
se estn repitiendo estos experimentos con clulas de pacientes de varias
enfermedades cutneas, para comprobar tambin su capacidad teraputica, y se estn diseando medidas adicionales para incrementar su bioseguridad (F. Larcher y M. del Ro, datos no publicados).
AGRADECIMIENTOS
Aunque, por motivos editoriales, este artculo va firmado por un
slo autor, no hubiera podido escribirse sin la fructfera y larga colaboracin de Alvaro Meana, Fernando Larcher y Marcela del Ro (por
orden alfabtico) y sus equipos. Tambin deseo manifestar mi agradecimiento a muchos colaboradores clnicos, en particular Puri Holgun
(Hosp. de Getafe, Madrid), Eva Lpez (Hosp. La Fe, Valencia), Juan
Carlos Lpez (Hosp. La Paz, Madrid), Sebastin Mir-Mir (Hosp. Vall
dHebrn, Barcelona), Antonio Torrelo (Hosp. Nio Jess, Madrid), por
su inestimable participacin, as como a las empresas Isdn y Cellerix
por su inters en nuestros desarrollos y su ayuda. Finalmente, quiero
agradecer especialmente a la Asociacin Espaola de Epidermolisis
Bullosa (AEBE) y a todos nuestros pacientes y sus familias por el constante apoyo y motivacin que nos dan. Estos trabajos han sido financiados por la Comunidad Europea (VI Programa Marco), por el Plan Nacional de I+D y por la Fundacin M. Botn.
253
ABREVIATURAS
Clulas TA, Clulas transitoriamente amplificadoras, o progenitoras;
EAD, Epidermolisis Ampollosa Distrfica; EAJ, Epidermolisis Ampollosa Juntural; EIF, Epidermis interfolicular; FP, Folculo piloso; GFP,
(Green fluorescent protein) Protena verde fluorescente; GS, Glndula
sebcea; IDSC-X, Inmunodeficiencia severa combinada ligada al cromosoma X; MB, Membrana basal; MEC, Matriz extracelular; PD, Papila drmica; PIF, Piel interfolicular; UV, Radiacin ultravioleta.
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257
9.
Reparacin cardiaca con clulas madre
ANA SNCHEZ GARCA Y JAVIER GARCA-SANCHO
RESUMEN
A pesar de muchos retrocesos y decepciones, naturales durante el
establecimiento de cualquier terapia nueva, la cardiologa regenerativa
ofrece un enorme potencial teraputico. Las clulas de la mdula sea
(CMO) y las clulas madre mesenquimales (CMM) han sido, por ahora,
las ms utilizadas en los ensayos clnicos. Las primeras tienen la ventaja
de su archicomprobada seguridad, pero los datos recientes sugieren que
las CMM podran tener mayor plasticidad. Las clulas del estroma de la
mdula sea estn en la interseccin entre estas dos categoras. Los
ensayos clnicos con CMO han mostrado resultados teraputicos relativamente modestos y sera conveniente revisar protocolos y diseos para
aumentar la eficacia. Es esencial obtener ms informacin acerca de los
mecanismos para llevar a cabo modificaciones racionales del diseo, y
esto requiere aumentar la investigacin bsica asociada a los ensayos
clnicos. La experimentacin en animales grandes, ms prximos al
modelo humano, sera de gran ayuda para refinar los protocolos. Por
otro lado, los modelos in vitro son muy tiles para probar rpida y
simultneamente un gran nmero de modificaciones sistemticas. Las
clulas madre residentes cardiacas (CMRC) han despertado grandes
expectativas y la puesta a punto de frmacos capaces de activar, movilizar y estimular las CMRC para generar cardiomiocitos in situ, as
como la expansin de la CMRC in vitro son dos objetivos claros. Algunas poblaciones de progenitores cardiacos podran tambin rellenarse
con CMO circulantes. Las clulas madre embrionarias (CME) necesitarn ms tiempo para entrar en la teraputica, pero la investigacin con
259
ANA SNCHEZ GARCA
JAVIER GARCA-SANCHO
CME es igualmente importante y debe servir de fuente de inspiracin

para la medicina regenerativa. La produccin de clulas pluripotentes
inducidas (iPS) abre una va completamente nueva, que acerca las clulas madre adultas y embrionarias. La investigacin con distintos tipos de
clulas madre no es antittica, sino complementaria.
Palabras clave: clulas de la mdula sea, regeneracin cardiaca,
terapia celular, clulas madre, diferenciacin, transdiferenciacin.
ABSTRACT
Despite drawbacks and deceptions, which are connatural to the
implementation of any new therapy, regenerative cardiology offers a
promising therapeutic potential. Bone marrow cells (BMC) and mesenchymal stem cells (MSC) are the cells most often used in human trials.
The first ones have the advantage of biosecurity, although recent research suggests that plasticity of MSC may be larger. Stromal bone marrow
cells are at the intersection. Clinical assays with BMC have shown only
modest therapeutic results, and it may be the time to revise protocols
and designs to look for improvements. Getting insight into the mechanisms would be most important for rational modifications of the design,
and this may require more basic research associated to clinical trials.
Animal work in models closer to humans would be most helpful for
refining protocols, and simplified in vitro models should be most useful
for testing putative protocols as they allow quick and controlled screening of many variants. Recently discovered cardiac stem cells (CSC)
add new expectancies. Drugs to awake, mobilize and stimulate CSC, to
generate cardiomyocytes in situ or expansion of CSC in vitro two of the
most obvious goals. Some cardiac progenitor pools can also be refilled
by circulating BMC. Embryonic stem cells (ESC) will need more time
to enter into therapeutics, but investigation on ESC is equally important
and should inspire regenerative medicine. Recently discovered induced
pluripotent stem cells (iPS cells), in which nuclear reprogramming of
the nucleus dedifferentiates adult cells to PS cells are most promising to
circumvent some of the problems posed by ESC. Research on different
types of stem cells is not antithetical, but complementary.
260
REPARACIN
CARDIACA CON CLULAS MADRE
Despierta corazn, despierta!

Ya has dormido suficiente; Despierta!
WILLIAM SHAKESPEARE.
La Tempestad. Acto 1. Escena 2.
ES INMORTAL NUESTRO CORAZN?

Es muy importante que reconozcamos la capacidad regenerativa del
corazn pues, de lo contrario, tras una lesin destructiva del tejido cardiaco nuestros esfuerzos se limitaran a intentar preservar lo que sobrevivi despus de un accidente isqumico, sin tan siquiera pensar en
otras posibilidades teraputicas. Sabemos hoy que en el ratn, el nmero
de clulas que entran en el ciclo mittico cada da, medidas con bromodeoxiuridina, es el mismo que el de las clulas que entran en apoptosis:
entre el 0,25 y el 1 % de la poblacin total de cardiomiocitos. Esto
representa una renovacin total del tejido cardiaco del ratn en menos
de un ao (1). En el caso del corazn humano, con cifras de recambio
en torno al 0.06%, la renovacin total ocurrira en 4-5 aos (2). Otras
estimaciones del recambio cardiaco, oscilan entre 0.0005 y 3% (3).
Sin embargo, es bien conocido que despus de un infarto agudo de
miocardio (IAM) el parnquima cardaco no regenera espontneamente.
Durante el denominado remodelado cardiaco la lesin es substituida por
una cicatriz de tejido fibroso, sugiriendo que el potencial de las clulas
madre residentes cardiacas (CMRC) no es suficiente para una reposicin
significativa del tejido lesionado.
REPARACIN CARDIACA POR CLULAS
DE LA MEDULA SEA
El inters en la regeneracin cardaca y su aplicacin clnica arranc
en 2001 cuando Orlic y colaboradores (4) demostraron que clulas Linnegativas y ckit-positivas procedentes de mdula sea (MO), eran capaces de reparar infartos agudos de miocardio en ratn, reponiendo de
novo tanto el msculo como los vasos, y logrando una notable recuperacin funcional en 9 das.
261
ANA SNCHEZ GARCA
JAVIER GARCA-SANCHO
La novedosa hiptesis en la que se sustentaban tales hallazgos era

la generacin de cardiomiocitos, endotelio y msculo liso a partir de
progenitores de MO. La plasticidad de clulas madre adultas esta en
un momento de intenso debate, que a veces supera el terreno cientfico, por lo que el lector interesado debe examinar revisiones recientes
en este campo (2, 5-9). Es bien conocido que infartos de miocardio
agudos de gran extensin, conducen casi indefectiblemente a la insuficiencia cardiaca en cinco aos. Por otra parte, la eficacia y seguridad
de las clulas progenitoras de mdula sea ya ha sido extensamente
probada en el tratamiento de enfermedades hematolgicas en los ltimos 50 aos. No es de extraar, por tanto, que los intentos de tratar
el IAM en los pacientes con clulas progenitoras de mdula sea no
se hiciesen esperar. Los resultados del primer ensayo clnico fueron
publicados un ao despus del artculo de Orlic (10), y en la actualidad han sido ya tratados ms de mil pacientes. Los resultados
obtenidos en varios ensayos y metaanlisis se resumen en la Tabla 1
(10-21). Como puede verse, la factibilidad y seguridad de los ensayos
esta demostrada, pero la eficacia es modesta. Por ejemplo, en la fraccin de eyeccin algunos autores muestran una mejora del 5-6%,
mientras que otros no ven mejora alguna. La misma ligera mejora se
puede aplicar a otros parmetros estudiados. Parece claro, pues, que
existen diferencias con los magnficos resultados previamente obtenidos en roedores. Este punto debera ser tomado en consideracin antes
de iniciar nuevos ensayos (22, 23).
Por otra parte, las diferencias en el diseo, la seleccin, el origen
celular, dosis, va y momento de aplicacin hacen que los resultados
sean difciles de comparar. Pero el principal problema es que no tenemos una idea clara de la interpretacin a nivel celular de los resultados
obtenidos, ya que solamente en algunos casos se han llevado a cabo
ensayos celulares bsicos en paralelo (12, 13). Los resultados iniciales
fueron interpretados en trminos de transdiferenciacin de las clulas de
la MO a cardiomiocitos y capilares, como en el ratn. Sin embargo,
otras hiptesis como la angiognica y la paracrina han cobrado gran
fuerza en la actualidad. En el primer caso, los precursores de clulas
endoteliales produciran capilares que ayudaran a preservar ms cardiomiocitos en la zona de penumbra. En el segundo, las clulas infundidas
produciran factores trficos que evitaran la muerte celular y/o estimularan la proliferacin de las de clulas madre residentes (2, 3, 5, 8).
262
REPARACIN
TABLA 1.
Estudio
Diseo
Ensayos clnicos de regeneracin cardiaca.

Nm.
Cels.
Nm. Pacientes
(Seguimiento)
FE
Otros resultados
Disminucin tamao infarto.
Mejora volumen/contraccin,
volumen sistlico final, contractilidad y movilidad de la
pared
Strauer y
col., 2002 (10)
CMO (F)
1-3x107
10 (3 meses)
NS
TOPCAREAMI,
Assmus y col.,
2002 (11)
CMO (F)
CircPg
2.5x108
8x107
9 and 11
(4 meses)
+8% Mejora viabilidad miocrdica,

volumen sistlico final y movilidad de la pared. Resultados
similares al ao en (30+29 pacientes) (Schachinger y col,
2004 (12)
TECAM,
FernandezAviles y
col., 2004 (13)
CMO (F)
8*107
20 (6 meses)
+6% Mejora volumen sistlico final

y funcin regional. Aumento
del grosor de la pared infartada
BOOST,
CMO (T)
Wollert y col., Aleatorizado
2004 (14);
Meyer y col.,
2006 (15)
2.5x109
30 (6 meses)
+6% Recuperacin ms rpida con

NS CMO?
Janssens y
col., 2006 (16)
CMO (F)
Aleatorizado,
doble ciego
3x108
33 (3 meses)
NS
Disminucin tamao infarto.

Mejora de funcin regional
ASTAMI,
Lunde y
col., 2006 (17)
BMC (F)
Aleatorizado
7*107
47 (6 meses)
NS
No diferencias en el tamao
del infarto.
REPAIRAMI,
Schachinger
y col.,
2006 (18)
BMC (F)
Aleatorizado,
doble ciego
2.4*108
101 (4 meses) 5.5% El placebo aumento la FE 3%.

Mejores resultados en pacientes con mayor cada de la FE.
Reduccin de eventos clnicos
adversos a los 12 meses
Mejores resultados en pacientes con mayor cada de la FE

Reduccin de eventos clnicos adversos a los 12 meses
La administracin fue, en todos los casos, intracoronaria.
FE, Fraccin de eyeccin; CMO, Clulas de la mdula sea. CircPg, progenitores circulantes obtenidos
por afresis; (T), CMO totales sin fraccionar; (F), CMO separadas en ficoll. NS: No significativo
Resultados similares se obtuvieron en los meta-anlisis de Abdel-Latif y col., 2007(19), Assmus y col.,
2006 (20) y Martn-Rendon y col., 2008 (21)
263
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JAVIER GARCA-SANCHO
CLULAS MADRE RESIDENTES

Otra frontera en el campo de la regeneracin cardaca ha sido la
identificacin de clulas madre residentes cardiacas (CMRC). La caracterizacin y clonacin de las CMRC en el corazn adulto son muy
recientes (2, 5, 6, 24-26).
La Figura 1 resume algunas caractersticas de CMRC y de los progenitores. Las CMRC se encuentran en nichos especficos diseminados
en el espesor de la pared cardiaca (27). En muchos casos expresan
varios marcadores de clulas madre, como el c-Kit. (El receptor del
factor de crecimiento de clulas madre o SCF, de Stem Cell Factor), el
antgeno 1 de clula madre (Sca-1) o la glicoprotena P (tambin llamada MDR-1, de Multi-Drug Resistence), o incluso todos ellos. Las CMRC
pueden realizar divisin asimtrica, lo que asegura la auto-renovacin.
Son clulas multipotenciales, capaces de originar progenitores cardacos
(PgC) comprometidos a cada uno de los linajes cardacos, cardiomiocitos, clulas del msculo liso y clulas endoteliales (Figura 1).
Los progenitores cardacos tienen la capacidad de proliferar y convertirse en precursores (PrC) y, finalmente, en clulas diferenciadas. Se
cree que el factor que define la tasa de expansin para las CMRC de
ratn ronda el 1000x. La cantidad de cardiomiocitos nuevos producidos
diariamente en el corazn humano ha sido cuantificada en aproximadamente 5 x 106, pero podra verse incrementado unas 100 veces tras un
IAM. Este incremento se debe por un lado al crecimiento en el nmero
de CMRC y a un aumento en la frecuencia del ciclo celular. Las CMRC
tambin aumentan durante la hipertrofia cardaca inducida por la estenosis artica (28).
Recientemente se han caracterizado otras progenitoras cardacas llamadas de la poblacin colateral (SPC, de side-population cells) por su
capacidad para excluir el tinte vital Hoechst 3342 (29). Las SPC son
capaces de transformarse en cardiomiocitos si existe interaccin (que no
implica fusin celular) con cardiomiocitos adultos. Las SPC pueden ser
derivadas de las clulas de la mdula sea (CMO) (30) (ver ms adelante). Finalmente, hemos de tener en cuenta las clulas isl-1. Estas clulas,
que expresan el gen homeobox islet-1 (isl-1) estn tambin presentes en
el corazn adulto, aunque en un pequeo nmero y restringidas al lado
derecho (31). Muy recientemente han despertado gran inters las clulas
264
REPARACIN
FIGURA 1. Clulas madre cardiacas Intrnsecas y extrnsecas. CMRC, Clula Madre Residente Cardica (Positiva para c-kit, Sca-1 and MDR-1+); PgC, Progenitores Cardiacos
(Comprometidos); PrC, Precursores Cardiacos; CMO, Clulas de la Mdula sea;
CMM, Clulas Madre Mesenquimales; Las Clulas Diferenciadas incluyen cardiomiocitos,
clulas de msculo liso, clulas endoteliales.
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derivadas del proepicardio. Estas clulas, que permanecen latentes es la

cavidad pericrdica despus del nacimiento, serian una excelente fuente
de progenitores comprometidos en el adulto (32). El proepicardio embrionario es el responsable de la formacin del sistema coronario y parte
del miocardio y, por tanto, un linaje estratgico que ha merecido una
atencin muy especial el ltimo ao (33, 34).
EL ORIGEN DE LAS CLULAS MADRE RESIDENTES
CARDIACAS
Est claro que las clulas Isl-1 son restos de los cardioblastos primitivos (35), pero el origen de otras CMRC no esta resuelto en la actualidad. Podran representar restos de clulas pluripotentes del perodo
embrionario o ser la expresin de clulas madre extrnsecas que colonizaron el corazn llegando a travs de la sangre, tal y como se indica en
las flechas discontinuas de la Figura 1. Esta posibilidad fue apuntada
por primera vez tras la observacin de quimerismo en transplantes en
los que se utilizaron clulas donantes del sexo opuesto. Por ejemplo, se
constat en mujeres que recibieron transplantes de mdula sea donada
por hombres, que algunos cardiomiocitos mostraban el cromosoma Y
(36). Paralelamente, en varones transplantados con un corazn proveniente de una donante femenina se detect la presencia de cardiomiocitos, clulas del msculo liso y, ms frecuentemente, las clulas endoteliales que portaban cromosoma Y (8, 37). Estos resultados sugieren que
las CMO pueden anidar en el corazn y producir CMRC, PgC, PrC o
clulas diferenciadas (Figura 1). Por tanto, el origen de las nuevas clulas cardacas podra ser doble, intrnseco o extrnseco. El proceso por
el cual se produce la transformacin de CMO a clulas cardacas podra
ser transdiferenciacin o desdiferenciacin de una clula madre comprometida o diferenciacin de una clula madre pluripotencial proveniente de la mdula sea (1,2). En cualquier caso, se ha demostrado recientemente que algunas CMO son clonognicas y tienen la capacidad de
autorrenovarse y de llevar a cabo una diferenciacin hacia tres linajes:
cardiomiocitos, clulas del msculo liso y endoteliales (38). Con respecto a las SPC se ha demostrado que despus de un IAM, las CMO se
instalan en lugares especficos de la zona afectada del miocardio y
adquieren el fenotipo PgC (30). Por otro lado, algunos estudios indepen266
REPARACIN
dientes sobre clonacin han demostrado que las clulas estromales adultas de mdula pueden dar origen a las llamadas clulas cardiomiognicas (CMG) que se diferencian a cardiomiocitos (6,39). Entre las clulas
de MO, las clulas estromales, generalmente llamadas clulas mesenquimales tienen una mayor plasticidad para producir clulas diferenciadas
que otros tipos celulares provenientes de mdula sea (5). Las clulas
madre mesenquimales (CMM) se pueden obtener de otros tejidos adems de la mdula sea (40).
LA CUESTIN DE LA CANTIDAD
Una cuestin sumamente importante es la cantidad de clulas madre
que se necesitan para alcanzar una mejora significativa en la recuperacin de las lesiones isqumicas de corazn. Cuando extrapolamos los
datos de ratn al ser humano hay un problema de tamao, ya que el
corazn de ratn pesa aproximadamente 0,07 gramos y el humano unos
350, lo que da una relacin de 1 a 5000. Las dimensiones de los cardiomiocitos humanos adultos son 141 x 19 m (41), que corresponde a un
peso celular de 41 x 10-6 mg. Un corazn adulto contendra por tanto 8,5
x 109 cardiomiocitos y un infarto extenso podra matar aproximadamente 3 x 109. En la acelerada tasa de produccin de cardiomiocitos observada tras un IAM (aproximadamente 5 x 108 al da) el parnquima
destruido podra regenerarse en una o dos semanas (2,42). Est claro
que esto no pasa de forma espontnea despus del IAM, quizs porque
las clulas madre de la zona infartada mueren y/o porque las que se
encuentran lejos no migran de modo eficiente al rea daada (2,26). Es
importante sealar tambin que las CMRC se tornan mucho menos
activas con el paso del tiempo y habitualmente los pacientes con IAM
son de edad avanzada.
Podra ser cuantitativamente importante la contribucin de CMO
en los ensayos clnicos de regeneracin cardiaca? En la mayora de los
ensayos se han aplicado de cien a trescientos millones, de los cuales tan
slo se retienen de 1 al 3%, en la zona del infarto (43). Esto nos deja
con solo 4x106 clulas. Las clulas inyectadas deberan expandirse por lo
tanto 750 veces para reponer las 3x109 que se han perdido en un infarto
grande. Este valor est justo por debajo del lmite mximo de expansin
propuesto en la Figura 1. Este valor ideal de 1000x est extrapolado de
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ANA SNCHEZ GARCA
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los datos obtenidos en el ratn y corresponde a 10 divisiones, pero slo

tres ms incrementaran el lmite de expansin en un orden de magnitud.
CUAL ES LA LLAMADA PARA LAS CLULAS MADRE?
Debe existir algn mensajero que haga a las clulas residentes dividirse o que promueva el anidamiento de las circulantes hacia el tejido
lesionado (6,30). En el corazn de ratn, las clulas de medula sea
inyectadas se acumulan selectivamente en el rea lesionada (4, 13). En
el corazn de pollo en desarrollo, las CMO inyectadas tambin se dirigen a la lesin (44). El mensajero debera ser similar en todos los tejidos
y ser liberado por las clulas daadas. En estudios muy elegantes, Lin
y colaboradores (45) estudiaron el anidamiento a largo plazo de clulas
marcadas genticamente en ratones hembra receptores que haban sido
sometidos a experimentos de isquemia-reperfusin renal unilateral. Las
clulas de medula sea solo anidaron en el rin afectado. Citoquinas
como el factor estimulador de colonias (G-SCF) o el factor de crecimiento de clulas madre (SCF de Stem Cell Factor), movilizan progenitores de la medula sea, contribuyendo a la reparacin cardaca (2). El
factor estimulador de colonias G-CSF tambin estimula la migracin y
diferenciacin a cardiomiocitos de clulas cardiomiognicas derivadas
de clulas estromales. Los extractos de clulas embrionarias, ricos en
factores de crecimiento, podran ser tambin medios condicionados adecuados, ya que en presencia de clulas embrionarias, las clulas madre
adultas ven favorecida su plasticidad (46). Las clulas embrionarias
(CME) son una fuente muy atractiva para la generacin de cardiomiocitos, pero no existen mtodos para lograr su diferenciacin selectiva.
Por otro lado, los problemas ticos y de bioseguridad deben resolverse
antes de pasar al uso clnico (6,47). Especial mencin requieren las
recientemente descubiertas clulas madre pluripotentes inducidas (iPS).
Se obtienen induciendo la desdiferenciacin de una clula adulta, generalmente conseguida forzando la expresin de 2-4 genes utilizando virus
(48, 49). Las iPS adquieren muchas de las caractersticas de las clulas
embrionarias (50) (ver captulo 3), pero tienen exactamente el mismo
material gentico que el donante, por lo que podran reimplantarse en l
sin generar respuestas inmunolgicas. Pueden formar, sin embargo, teratomas, por lo que su bioseguridad debe ser estudiada y mejorada antes
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REPARACIN
pasar al uso clnico (51). El uso de virus es tambin un problema en este

sentido, pero se estn diseando procedimientos alternativos para inducir la expresin de los genes de inters (52), lo que facilitara la admisin de este procedimiento para su uso teraputico. Las iPS son, en
realidad, un caso particular de la reprogramacin nuclear, un concepto
introducido hace tiempo, pero que no haba sido fcil de materializar
(53). En la misma categora conceptual podran incluirse tambin los
procesos de transdiferenciacin (54). La investigacin en iPS es una de
las ms activas actualmente.
CONCLUSIONES
A pesar de muchos retrocesos y decepciones, que son naturales
durante el establecimiento de una nueva terapia, la cardiologa regenerativa ofrece un enorme potencial teraputico. Las CMO y las CMM han
sido las ms frecuentemente utilizadas en los ensayos clnicos en humanos. Las CMO tienen a su favor la experiencia previa de 50 aos de uso
teraputico para las enfermedades hematolgicas, que han probado exhaustivamente su bioseguridad. Las CMM parecen tener un mayor potencial plstico, pero su bioseguridad a largo plazo no ha sido probada
en detalle. Las clulas estromales de mdula sea estn en la interseccin de los dos tipos celulares escritos. Los resultados de los ensayos
clnicos han sido relativamente modestos. Es tiempo quiz de revisar los
protocolos y diseos para mejorar los resultados. El conocimiento de los
mecanismos de accin sera muy til para guiar modificaciones racionales del diseo teraputico, y esto requerira aumentar el componente de
investigacin bsica asociada a los ensayos clnicos. La experimentacin animal en modelos ms prximos al ser humano sera muy necesaria para refinar los protocolos clnicos. Por otro lado, el uso de modelos in vitro es muy util, ya que permite probar rpidamente
modificaciones sistemticas de diferentes variables y posibles mejoras
(44). La combinacin de la informacin obtenida en diferentes modelos,
in vitro, animales y humanos, facilitar la traslacin a la clnica. Las
clulas madre residentes del corazn, descubiertas recientemente, abren
nuevas esperanzas y expectativas. Los frmacos capaces de despertar a
las clulas madre residentes, y de movilizarlas para formar tejido contrctil in situ, o la expansin celular in vitro, seguida de la inyeccin en
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el rea daada, son dos de los objetivos ms obvios (2, 26). Debe recordarse que algunas poblaciones de progenitores cardiacos, como la de
clulas colaterales (SPC) o las clulas cardiomiognicas (CMG) pueden
rellenarse a partir de clulas circulantes procedentes de la mdula sea
(30,39). Las clulas embrionarias humanas requerirn ms tiempo para
entrar en el arsenal teraputico, pero esto no quiere decir que sean
menos interesantes como objeto de investigacin. Por el contrario, el
estudio de la proliferacin y diferenciacin de las CME debe ser la
fuente de inspiracin de la Medicina Regenerativa. La produccin de
clulas pluripotentes inducidas (iPS) (51) abre una va completamente
nueva, que acerca las clulas madre adultas y embrionarias. La investigacin con distintos tipos de clulas madre no es antittica, sino complementaria.
AGRADECIMIENTOS
Agradecemos la ayuda de la Red de Terapia Celular del Instituto de
Salud Carlos III (RD/006/10), del Fondo de Investigaciones Sanitarias
(FIS. PI060480) y del Centro en Red de Medicina Regenerativa de
Castilla y Len.
LISTA DE ABREVIATURAS (POR ORDEN ALFABTICO)
CME, Clulas Madre Embrionarias; CMG, Clulas Cardiomiognicas;
CMM, Clulas Madre Mesenquimales; CMO, Clulas de la Mdula
sea; CMRC, Clulas Madre Residentes Cardiacas; G-SCF, Factor estimulante de colonias granulocticas; IAM, Infarto Agudo de Miocardio;
iPS, Clulas madre pluripotentes inducidas; MO, Mdula sea; PgC,
Progenitores Cardiacos; PrC, Precursores Cardiacos; SCF, Factor de
creciminto de clulas madres (Stem Cell Factor); SPC, Clulas de la
poblacin colateral (Side Population Cells).
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275
10.
Terapia celular en la Diabetes mellitus

BERNAT SORIA ESCOMS
RESUMEN
La diabetes mellitus tipo 1 (DM1) es una enfermedad crnica que se
caracteriza por una deficiencia en la masa de clulas , que trae consigo
un fallo en la homeostasis de la glucosa. Ambas circunstancias dan lugar
a una variedad de complicaciones severas y a un acortamiento en la
expectativa de vida. La normalizacin de la homeostasis de la glucosa
puede conseguirse mediante trasplante del pncreas o de los islotes, pero
la escasez de donantes ha propiciado gran inters por el estudio de
fuentes alternativas de clulas , lo cual ha estimulado la investigacin
de las clulas madre apropiadas. Por tanto, la diabetes representa una
candidata atractiva para la terapia celular. Tanto las clulas madre embrionarias como las adultas han sido utilizadas para generar sustitutos
celulares, que podran potencialmente restaurar el funcionamiento de las
clulas . Diversos estudios han descrito la generacin de clulas secretoras de insulina procedentes de clulas madre embrionarias y adultas,
que normalizaron los valores de glucosa sangunea cuando se trasplantaron a modelos de animales diabticos. Debido a la complejidad de las
clulas , las clulas productoras de insulina generadas a partir de las
clulas madre no poseen todos los atributos de las clulas . Esto indica
la necesidad de desarrollar mtodos para la diferenciacin y seleccin
de clulas con funcionalidad completa. Mientras se superan estos problemas, los pacientes diabticos pueden beneficiarse de estrategias teraputicas basadas en terapias autlogas con clulas madre, dirigidas a las
complicaciones diabticas tardas. En este artculo se discuten los pro277
BERNAT SORIA ESCOMS
gresos recientes en la generacin de clulas productoras de insulina a

partir de clulas madre adultas y embrionarias, unidos a los desafos
para el futuro uso clnico de la terapia con clulas madre.
ABSTRACT
Diabetes mellitus type 1 (DM1) is a chronic disease characterized
by a deficit in -cell mass and a failure of glucose homeostasis. Both
circumstances result in a variety of severe complications and an overall
shortened life expectancy. Glucose homeostasis can be achieved through
pancreas and islet transplantation, but shortage of donor organs has
prompted an intensive search for alternative sources of cells. This
achievement has stimulated the search for appropriate stem cell sources.
Both embryonic and adult stem cells have been used to generate surrogate cells to potentially restore cell function. In this regard, several
studies have reported the generation of insulin-secreting cells from
embryonic and adult stem cells that normalized blood glucose values
when transplanted into diabetic animal models. Due to -cell complexity, insulin-producing cells generated from stem cells do not possess all
-cell attributes. This indicates the need for further development of
methods for differentiation and selection of completely functional
cells. While these problems are overcome, diabetic patients may benefit
from therapeutic strategies based on autologous stem cell therapies
addressing late diabetic complications. In this article, we discuss the
recent progress in the generation of insulin-producing cells from embryonic and adult stem cells, together with the challenges for the clinical
use of diabetes stem cell therapy.
1. INTRODUCCIN
Las clulas son un tipo de clulas del pncreas que se encuentran
en los llamados islotes de Langerhans y se encargan de sintetizar la
insulina, una hormona que una vez liberada en el torrente circulatorio,
controla los niveles de glucosa en la sangre (Figura 1). El proceso de
generacin de la insulina se realiza en diferentes etapas: primero se
sintetiza la proinsulina, precursora de la insulina, que despus se hidro278
TERAPIA
CELULAR EN LA DIABETES MILLITUS
FIGURA 1. Los islotes de Langerhans, ubicados en el pncreas, son microrganos que contienen clulas , clulas y clulas .. Las clulas son las que sintetizan insulina y la
liberan al torrente circulatorio y (en la figura) llegan al msculo. Las clulas fabrican
glucagn y las clulas fabrican somatostatina. A la derecha se muestra un islote. El nmero
de islotes en el pncreas se cifra en 1.000.000.
FIGURA 2. Causas que provocan la disminucin cronolgica de la masa de clulas en las

distintas etapas del desarrollo de la diabetes mellitus.
279
BERNAT SORIA ESCOMS
liza a insulina mediante la sustraccin del pptido C: proinsulina

insulina + pptido C. Las clulas son las primeras que desaparecen en
los pacientes que padecen la diabetes del tipo 1, una vez que el propio
sistema inmunitario del cuerpo las ha destruido por un proceso autoinmune. En la diabetes de tipo 2, la insulina que producen las clulas
del pncreas acta incorrectamente, ya que suele desarrollarse una resistencia a su accin.
2.
TERAPIA CELULAR PARA LA DIABETES MELLITUS
Al considerar que ni la prediccin ni la prevencin sirven para evitar

la aparicin de la DM1, la sustitucin de las clulas por islotes procedentes de cadveres es la nica terapia disponible que permite el
control de la glucosa sangunea sin recurrir a la terapia exgena con
insulina (Figura 3). El alotrasplante de islotes pancreticos se ha demostrado que es capaz de normalizar los niveles de glucosa sangunea y de
bloquear el progreso de las complicaciones que van asociadas a esta
enfermedad. Por tanto, es el trasplante de islotes pancreticos procedentes de donantes lo que ha establecido la terapia celular en la diabetes
FIGURA 3. Con los conocimientos actuales, ni la prediccin ni la prevencin sirven para

evitar la aparicin de la diabetes mellitus tipo 1, la sustitucin de las clulas por islotes
procedentes de cadveres es la nica terapia disponible que permite el control de la glucosa
sangunea sin recurrir a la inyeccin de insulina.
280
TERAPIA
mellitus. En un nmero pequeo de casos, en los cuales los islotes

pancreticos fueron de origen autlogo, por ejemplo, islotes aislados
despus de la eliminacin del pncreas del propio paciente, fue suficiente el trasplante de 300.000 islotes para lograr que el enfermo se independizara de la insulina. Sin embargo, en los casos de trasplante de islotes
heterlogos la cantidad necesitada fue de unos 600.000 islotes o incluso
ms. Esto supone necesitar un nmero de islotes mucho mayor cuando
se trata de trasplantes heterlogos, que son los ms comunes. Los protocolos se basan en trasplantar islotes preparados frescos (10.000 islotes/kg), en dos o ms veces, implantndolos en el rea del hgado y
utilizando un protocolo inmunosupresor libre de esteroides (tacrolimus,
sirolimus, dacliumulab) (1,2).
El progreso del trasplante de islotes depende de conseguir mtodos
eficientes y prcticos de obtencin de los mismos, para poder suministrar las cantidades necesarias y suficientes de las clulas de los islotes.
En los avances conseguidos en el desarrollo de la terapia de los trasplantes de islotes pueden identificarse dos etapas: la primera, es la relativa
a la investigacin experimental en animales y humanos, que se centra en
los procedimientos de aislamiento de los islotes en especies diferentes,
pues ya se haba comprobado que los islotes trasplantados tenan capacidad de revertir la enfermedad. La segunda etapa es la del protocolo de
Edmonton, enfocado en la estandarizacin de los mtodos de aislamiento e introduccin de nuevos frmacos inmunosupresores para mantener
el trasplante. Aunque los resultados del protocolo de Edmonton llegaron
a conseguir en los pacientes diabticos casi un 100% de independencia
de la insulina despus de 12 meses, posteriormente se demostr una
disminucin al 50% a los 3 aos y al 15% a los 5 aos (3,4). Es decir,
que la sustitucin celular (terapia celular) permite temporalmente el control de la glucosa. Sin embargo, en estas dos etapas se concluy que el
trasplante de islotes, a pesar de sus efectos positivos en revertir la enfermedad y la dependencia de la insulina, presentaba dos defectos importantes: primero, la necesidad de inmunosupresin indefinidamente y,
segundo, la escasez de islotes humanos, lo cual haca necesario buscar
una fuente alternativa de islotes para superar esta escasez. Por ejemplo,
en Espaa, donde el nmero de donantes de rganos es el mayor en el
mundo (40-50 donantes /milln/ao) y con una prevalencia de diabetes
no muy elevada, la produccin de islotes procedentes de cadveres nunca
ser suficiente para cubrir las necesidades (1).
281
BERNAT SORIA ESCOMS
Tanto la necesidad de inmunosupresin, como la insuficiente cantidad de tejido necesario para cubrir la demanda de una enfermedad con
una elevada prevalencia, nos ha llevado a investigar fuentes alternativas,
lo que significa la bsqueda de estrategias para fabricar clulas secretoras de insulina a partir de clulas madre. Con todas estas expectativas,
hasta la fecha no se ha conseguido, sin embargo, un procedimiento que
cure la diabetes mellitus tipo 1.
TABLA 1.
Estrategias para mantener y/o recuperar la masa de clulas (1)
PREDICCIN
Gentica
Factores ambientales
Anticuerpos
PREVENCIN
Vacunacin
Anti-CD3
TERAPIA CELULAR
Trasplantes de islotes
Terapia con clulas madre
REGENERACIN DEL PNCREAS
3.
LAS CLULAS SE UBICAN EN UN MICRORGANO

COMPLEJO DENOMINADO EL ISLOTE PANCRETICO
Como cualquier clula del organismo, las clulas son nicas. Las
clulas pancreticas estn diseadas para sintetizar, procesar y liberar
insulina. La liberacin de insulina inducida por nutrientes es un proceso
muy preciso mediante el cual la clula percibe la concentracin de la
glucosa en la sangre y libera la cantidad exacta de insulina necesaria
para normalizar la concentracin sangunea de glucosa. Las respuestas
de las clulas integran diferentes mecanismos intracelulares. La ma282
TERAPIA
quinaria exocittica de estas clulas es similar a la de otras clulas

secretoras (5-7, 8), pero responde a un ensamblaje integrado de seales,
tales como movimientos de calcio (5, 9-10), mensajeros inducidos por
el metabolismo de la glucosa (11) y cambios nucleares (12), unidos a
mensajes extracelulares (13). Adems, la modulacin de conductos gapjunction (14,15) entre las clulas significa que durante la activacin
por nutrientes, los grupos de clulas , no solo llegan a ser isopotenciales, sino que tambin entran en oscilaciones sincrnas de Ca2+ (6- 10).
Esto constituye la base estructural y fisiolgica de la secrecin pulstil
de la insulina (Figura 4). Al contrario que otras clulas endocrinas, la
insulina se libera mediante un proceso momento-a-momento en el cual
las seales intra y extracelulares crean una respuesta suave de tipo sigmoideo, que mantiene la glucosa sangunea en concentraciones alrededor de 5 mM. Las respuestas integradoras de las clulas y no son
incorporadas por la arquitectura funcional de los islotes pancreticos.
Los islotes pancreticos son unos microrganos profusamente vascularizados e inervados en los cuales se encuentran cuatro tipos celulares (,
, y clulas PP). Al contrario que las clulas tipo no-, la poblacin
FIGURA 4.
Acoplamiento estmulo-secrecin en la clula pancretica. (1)
283
BERNAT SORIA ESCOMS
de las clulas se organiza a s misma en un sincitio funcional. Desde

un punto de vista funcional, los agregados de clulas en el islote responden de una manera apropiada, mientras que las clulas en solitario no
lo hacen. Merece la pena intentar conseguir agregados de clulas tipo
o incluso una mezcla equilibrada de clulas y no- para formar los
sustitutos de los islotes.
4.
CLULAS SECRETORAS DE INSULINA PROCEDENTES

DE CLULAS MADRE.
Las clulas madre se caracterizan por dos propiedades bsicas: autorrenovacin y capacidad de diferenciarse en otros tipos celulares.
Potencialmente, estas clulas tienen la capacidad de colonizar y repoblar
los tejidos. La diferenciacin in vitro ha demostrado que las clulas
madre pluripotentes de diferente origen pueden ser inducidas a generar
clulas insulina-positivas (16,19,21-23). Sin embargo, no es posible
obtener clulas que puedan reemplazar de manera eficiente los islotes en
pacientes con diabetes tipo 1. De acuerdo con la literatura, las clulas
insulina-positivas pueden obtenerse de las clulas madre embrionarias
(ESC), partiendo de progenitores intrapancreticos o de clulas procedentes de las tres hojas embrionarias (Tabla 2). Desafortunadamente, en
trminos prcticos, los resultados obtenidos por algunos grupos de investigadores parece que son difciles de reproducir, y no dan lugar a una
clula totalmente diferenciada que pueda ser utilizada en terapia celular.
Adems, la existencia de progenitores pancreticos ha sido cuestionada.
El mantenimiento de la masa de clulas en el adulto sano se sostiene
mediante un reservorio de clulas diferenciadas que poseen una capacidad de replicacin lenta (17,18). El medio de promover la diferenciacin in vitro, se basa en la combinacin de varias tcnicas, por ejemplo,
la expresin de un gen maestro tal como Pax4 (19) dirige la expresin
de un gran grupo de genes y determina la aparicin de tipos celulares
diferenciados y estructuras ms complejas; el uso de factores de crecimiento y otros factores que modulan la expresin gnica (16,21-23);
y tcnicas de cultivo por las cuales algunos progenitores crecen mejor
que otros. Despus de la publicacin pionera de nuestro grupo en el ao
2000 (16), ms de 90% de las publicaciones han descrito datos originales que sugieren que las clulas productoras de insulina pueden derivar
284
TERAPIA
de las ESC (38 publicaciones, la mayora de ella utilizan ESC de ratn). Tambin se ha descrito la obtencin de clulas productoras de
insulina a partir de progenitores intrapancreticos (19 publicaciones), a
otras clulas derivadas del endodermo, tales como el hgado (11) o
el intestino (3). Adems, pueden ser utilizados los tejidos derivados
del mesodermo, tales como la mdula sea (10), cordn umbilical (3),
sangre perifrica (1) o clulas madre mesenquimales (5). Tambin,
pueden ser utilizadas clulas derivadas del endodermo (2 publicaciones)
(Tabla 2) (1).
TABLA 2.
Fuentes de clulas madre y progenitoras para obtener clulas productoras

de insulina
Nmero de
Manuscritos
De ESC
ESC de ratn
ESC de humanos
De clulas madre adultas y progenitores
(i) Progenitores intrapancreticos
(1) Tejido exocrino
(2) Clulas ductales
(3) Progenitores intra-islotes
(ii) De tejidos extra-pancreticos derivados del endodermo
(1) Hgado
(2) Intestino
(iii) De tejidos derivados del mesodermo
(1) Mdula sea
(2) Cordn umbilical
(3) Sangre perifrica
(4) Clulas madre mesenquimales
(iv) De tejidos derivados del ectodermo
38
29
9
54
19
11
3
10
3
1
5
2
(Lista completa en http://www.cabimer.es/es/docs/tcymr/prcldm.htm) (1).
5.
CLULAS PRODUCTORAS DE INSULINA PROCEDENTES

DE CLULAS MADRE EMBRIONARIAS (ESC)
Las ESC pueden ser inducidas para diferenciarse en diferentes linajes por medio de protocolos especficos para diferenciacin. Se considera que las clulas pancreticas se desarrollan a partir del endodermo
primigenio del intestino superior. Una orquesta integrada de seales
285
BERNAT SORIA ESCOMS
intra- y extracelulares crea las pautas del desarrollo y conduce las ESC
pluripotenciales a formar endodermo pancretico definitivo. Nuestro
grupo ha descrito que la formacin de agregados flotantes o cuerpos
embrioides, junto con la nicotinamida, conduce a las ESC a convertirse
en clulas productoras de insulina (16, 24). Los protocolos dirigidos a
la diferenciacin se basaron en la identificacin de seales extracelulares (tales como activina, butirato sdico, sonic hedgehog, factor de crecimiento de fibroblastos bsico, nogina, glucosa y pptido tipo glucagn) e intracelulares (Pax4), que instruyen a las clulas madre a travs
de esta va (19). Alguno de estos protocolos se han aplicado recientemente a las ESC humanas (24-26), y se han obtenido clulas que contienen insulina y pptido C. Las clulas que expresan insulina, obtenidas
por el protocolo de DAmour et al. (24) poseen buen contenido de
insulina, pero la liberacin de insulina no se detecta en respuesta a la
glucosa. Los grupos de clulas tipo islotes obtenidos por el protocolo de
Jiang et al. (25), muestran un elevado grado de diferenciacin, liberan
el pptido C y presentan respuesta a la glucosa. Estos dos protocolos
necesitan ser comprobados in vivo. La variabilidad de los resultados
obtenidos hasta la fecha sugiere que no tenemos an la receta para
crear una clula madura procedente de una clula madre y que el
proceso tiene que ser perfeccionado para que sea lo suficientemente
eficiente para generar la biomasa de clulas necesaria, que se estima
en 109 clulas con propiedades de clulas .
La Figura 5 muestra las dos rutas seguidas por las ESC a travs de
vas endo y ectodrmicas. En la va endodrmica las clulas adquieren
progresivamente los marcadores del endodermo definitivo, del endodermo pancretico y de las clulas de los islotes (16, 20, 27, 28). La va
ectodrmica se basa en la expansin de los progenitores positivos para
nestina.
Las ESC de ratn representan un buen modelo para analizar cul es
la ruta seguida. Los ratones poseen dos insulinas diferentes: la insulina
I presente solo en las clulas del islote, y la insulina II presente en los
islotes y en los tejidos neurales. El uso de protocolos para expandir los
progenitores nestina (29), han demostrado que las clulas que expresan
insulina II, pero no insulina I, son tambin positivas para marcadores
neurales, tales como GFAP, N-200, nestina y AChE. Por el contrario, la
va endodrmica puede acabar en clulas que producen insulina que
286
TERAPIA
FIGURA 5. Diferenciacin in vitro de las clulas productoras de insulina: vas endodrmica

y ectodrmica; EGF, factor de crecimiento epidrmico; bFGF, factor de crecimiento de fibroblastos bsico; IGF-II, factor insulina-like II, GLP-1, pptido similar al glucagn; ITS, medio
insulina+transferrina+selenio, Anti-SSH, anti Sonic hedgehog (1, 29)
comparten muchas propiedades con clulas totalmente diferenciadas (16,

21, 22, 27).
Utilizando un sistema atrapador de clulas cuyo gen de la insulina
est activo, hemos sido capaces de obtener clulas productoras de insulina a partir de las ESC. Las clulas productores de insulina corrigen la
hiperglucemia cuando se trasplantan a modelos de animales diabticos
(16, 21, 22). Recientemente, hemos publicado un protocolo en el cual un
factor soluble fetal presente en el rudimento pancretico, fue utilizado
287
BERNAT SORIA ESCOMS
para dirigir la diferenciacin de las ESC hacia clulas productoras de

insulina, las cuales fueron posteriormente seleccionadas con una construccin promotor-bgeo/PGKhygro de la insulina humana (21). Adems,
la expresin de algunos factores de transcripcin implicados en el desarrollo de las clulas puede promover la diferenciacin de las clulas
tipo , por ejemplo, la expresin constitutiva de Pax4 (19). Se necesita
optimizar los procedimientos de seleccin de la diferenciacin y ello
permitir lograr mejores resultados.
6.
SELECCIN DE ESTIRPES CELULARES
Un problema comn a todos los procesos de diferenciacin in vitro

es que el resultado del proceso da lugar siempre a una mezcla del tipo
celular deseado con otros tipos celulares, entre los que se incluyen las
propias clulas indiferenciadas. No existe, hasta el momento, un procedimiento que genere el 100% de clulas diferenciadas (24). Las clulas
no diferenciadas acarrean un alto riesgo de formacin de teratoma. Por
tanto, se necesita conseguir una buena seleccin de mtodos para poder
obtener poblaciones celulares puras. La seleccin de los mtodos puede
basarse en procedimientos de crecimiento celular, en la inmunoseparacin con anticuerpos especficos o en la expresin de un gen marcador
(16, 21). Las clulas madre son transfectadas con un vector que contiene
dos cassettes de seleccion; uno que controla la expresin de la resistencia a antibiticos, que permite la seleccin de las clulas transfectadas,
y el otro un gen quimrico que contiene un promotor funcionalmente
especfico que conduce la expresin de un gen estructural el cual codifica la resistencia a antibiticos, permitiendo la seleccin de las clulas
que expresan el gen seleccionado. Este mtodo se ha demostrado que
funciona con promotores de la insulina y Nkx 6.1 (16, 21-23).
7.
CLULAS SECRETORAS DE INSULINA PROCEDENTES

DE CLULAS MADRE ADULTAS
Parece ser que las clulas madre procedentes de tejidos adultos

poseen una plasticidad mayor de lo esperado. Las clulas adultas multipotentes, clulas de la medula sea, o clulas de tejido adiposo deri288
TERAPIA
vadas del estroma mesenquimal, y otras, exhiben in vitro, la capacidad

de ser transformadas en clulas con un fenotipo diferenciado. La transdiferenciacin de clulas adultas en clulas productoras de insulina,
tambin proporciona otra buena oportunidad para la expansin de las
clulas . Recientemente, nuestro grupo ha publicado un estudio en el
que se describe la obtencin de clulas a partir de leucocitos mediante
la reprogramacin de monocitos sanguneos en presencia del factor de
crecimiento estimulador de colonias de macrfagos e interleuquina 3,
incubados con factor de crecimiento epidrmico y nicotinamida. Estas
clulas mostraron in vitro secrecin de insulina dependiente de glucosa
y fueron capaces de normalizar los niveles de glucosa plasmtica en
ratones diabticos (30). Aunque estas estrategias son prometedoras, se
necesitan estudios ms profundos. Sin embargo, a pesar de la enorme
cantidad de mtodos para generar clulas productoras de insulina a partir
de clulas madre, no se ha iniciado an prueba clnica alguna en la cual
se hayan utilizado clulas productoras de insulina obtenidas in vitro.
Por qu? Para ser utilizadas en pruebas clnicas, las clulas derivadas
de las ESC tienen que ser muy cercanas a las clulas totalmente diferenciadas, para constituir una poblacin homognea, que pueda ser producida mediante prcticas de fabricacin rutinaria. Es obvio que el acuciante desafo de fabricar un sustituto de clulas clnicamente til no
se ha conseguido an.
8.
TERAPIA CELULAR DE LAS COMPLICACIONES

DIABTICAS. ISQUEMIA CRTICA DE LOS MIEMBROS
Mientras esperamos que se resuelvan estos problemas qe puede

hacer la terapia celular por los pacientes? El ejemplo ms inmediato
sera la terapia celular para una de las complicaciones: la isquemia
crtica de los miembros debida a la diabetes o el pie diabtico. La
isquemia crtica de los miembros se ha definido como isquemia crnica con dolor en reposo, lceras o gangrena, que se atribuyen a
enfermedad oclusiva probada objetivamente (31-44). Como una manifestacin severa de la aterosclerosis, los factores de riesgo de la
isquemia crtica de los miembros incluyen principalmente el tabaco y
la diabetes, pero tambin la hipercolesterlolemia, la hipertensin y la
predisposicin gentica. El pronstico para los pacientes con isquemia
289
BERNAT SORIA ESCOMS
crtica de los miembros es bastante pobre. Despus de que aparece la

manifestacin clnica, menos del 50% de los pacientes podr evitar la
muerte o la amputacin antes de un ao. La mortalidad es uno de los
mayores problemas en esta poblacin, con valores tan dramticos como
el 25% despus de un ao, 31,6% despus de 2 aos y el 60% despus
de 3 aos. La amputacin se asocia con una tasa elevada de mortalidad
perioperativa: 5-10% cuando se llev a cabo por debajo de la rodilla
y 15-20% cuando fue por encima de la rodilla (33). La meta principal
para el tratamiento de la isquemia crtica de los miembros es la revascularizacin, bien por ciruga o por angioplastia. Sin embargo, en una
gran proporcin de estos pacientes (estimada en un 20-30%), el alcance anatmico y la distribucin de la enfermedad oclusiva arterial hace
que los pacientes sean inapropiados para la ciruga o la angioplastia
(34). El tratamiento farmacolgico, como la opcin nica para los
pacientes no apropiados para la revascularizacin, no se ha demostrado que afecte de manera favorable la historia clnica de la isquemia
de los miembros (35, 36). A pesar de su morbilidad, mortalidad e
implicaciones funcionales asociadas a la amputacin, no queda ms
remedio que recomendarla a menudo como nica solucin a los sntomas de la isquemia crtica de los miembros (37). Por consiguiente,
la necesidad de estrategias alternativas para el tratamiento de los
pacientes con isquemia crtica de las extremidades es un desafo de
acuciante necesidad. El objetivo del uso de clulas madre en el tratamiento de la isquemia crtica de los miembros es la estimulacin de
la neovascularizacin en el rea de la isquemia severa. La angiognesis teraputica puede promover la formacin de vasos colaterales en
las reas con severa isquemia. El potencial de la angiognesis teraputica procede del desarrollo de nuevos capilares (vasculognesis) y del
crecimiento de vasos colaterales preexistentes (angiognesis) (38).
Se han descrito dos estrategias para promover la angiognesis teraputica: la terapia gnica y la terapia con clulas madre (39). La terapia
gnica est diseada para inducir la produccin de factores de crecimiento en aquellos pacientes que debido a la avanzada edad, la diabetes
o la hipercolesterolemia, son incapaces de regular de manera apropiada
la expresin de citoquinas en respuesta a la isquemia tisular. Sin embargo, la terapia gnica no ha estado libre de preocupaciones de seguridad,
tales como la posibilidad de inducir crecimiento patolgico de los vasos
290
TERAPIA
(retinopata, mayor neovascularizacin tumoral o mayor carga de las

placas aterosclerticas). Por otra parte, las terapias con clulas madre
ensayadas hasta la fecha, consisten en la administracin de clulas derivadas de la mdula sea o clulas mononucleares de la sangre perifrica, esta ltima despus de estimulacin con factor estimulador del
crecimiento de colonias de granulocitos. El tratamiento con clulas
mononucleares derivadas de la mdula sea implica la administracin
de clulas progenitoras endoteliales (clulas CD34+, CD133+/VEGFR2+) combinadas con una fraccin liberadora de citoquinas. Las
clulas CD34 liberan factores de crecimiento angiognicos (VEGF) y
angiopoyetina-1. Las clulas mononucleares parecen actuar de manera
sinrgica. Estos efectos combinados no solo permiten la obtencin de
nuevos vasos que suministren sangre a las reas isqumicas, sino tambin la formacin de vasos capilares muy estables (38, 40).
Desde 2003, se han realizado cinco ensayos clnicos que incluan
pacientes diabticos con isquemia crtica de miembros, para comprobar
la eficacia y seguridad de la administracin, generalmente por va intramuscular. En tres de estos estudios las clulas madre fueron clulas
mononucleares de la mdula sea y en los dos restantes, las clulas
madre procedan de clulas mononucleares de sangre perifrica. La
administracin fue por va intramuscular en todos los casos. Los resultados positivos respecto a la eficacia y seguridad fueron concordantes en
todos los estudios. La administracin de clulas madre promovi un
incremento del suministro de sangre a regiones diana afectados por la
isquemia crtica de los miembros (41-45). Estos estudios preliminares
sobre seguridad y posibilidad de ejecucin no pueden proporcionar una
respuesta clara acerca de la eficacia y seguridad a largo plazo de la
angiognesis teraputica. Diversas preguntas permanecen sin respuesta,
tales como Qu candidatos han de ser considerados los mejores para la
terapia celular?Cal es la mejor va de administracin de las clulas
madre? Ser segura la respuesta a largo plazo de estos pacientes? En
la actualidad, los estudios que se llevan a cabo con clulas madre para
el tratamiento de la isquemia crtica se encuentran en fase preliminar.
En los dos prximos aos, ms de 200 pacientes con isquemia crtica de
miembros se incluirn en estos tratamientos y alguna de las cuestiones
sin resolver hoy tendran su respuesta. Un resumen de las pruebas con
291
BERNAT SORIA ESCOMS
terapia celular que se estn llevando a cabo en este momento se muestra

en la Tabla 3.
9.
CONSIDERACIONES FINALES
La situacin actual del trasplante de islotes pancreticos puede resumirse como sigue:
Hay que considerar en primer lugar que cada paciente diabtico necesita recibir unos 10.000 islotes/Kg de peso para tener una respuesta
efectiva, es decir, para normalizar la glucemia permanentemente. Un
adulto de 60 kg necesita un aporte de unos 600.000 islotes. Actualmente
se extraen de cada pncreas de cadver unos 300.000 islotes tiles, lo que
significa que para cada paciente se necesitan, al menos, los islotes de dos
donantes. Es un hecho demostrado que el trasplante de los islotes pancreticos detiene la progresin de las complicaciones y esta es la principal
ventaja de la terapia, por encima incluso de la independencia de la insulina.
TABLA 3. Pruebas clnicas en curso usando clulas madre autlogas en enfermos con
isquemia crtica de los miembros
Ensayos Clnicos
Incorporacin
pacientes
UMC Utrecht, Holanda

Universidad Indiana, USA
Kobe, Japn
2006-2009
2004-2007
2003-2008
Universitdad de Napoles, Italia

Universidad Northwestern, Chicago, USA
Universidad Goethe, Frankfurt, Alemania
2005-2006
desde 2004
2005-2007
Tratamiento
Inyeccin
Poblacin
Punto final
primario
BMMNC
BMMNC
PBMNC,
CD34+
BMMNC
CMH
BMMNC
intraarterial
intramuscular
55-55
20
amputacin
MAE
intramuscular
15
20
12
20-20
amputacin
ABI, lcera
supervivencia
ABI
intraarterial
BMMNC, clulas mononucleares de la mdula sea; PBMNC, clulas mononucleares de sangre perifrica;
MAE, eventos adversos principales a las 12 semanas; CMH, clulas madre hematopoyticas, ABI, ndice tobillopoplteo (1)
Evitar la dependencia de la insulina y la necesidad permanente de

autocontrol al que estn sometidos los diabticos (anlisis, horarios,
restriccin de comidas, etc.), es tambin importante y se vive por los
pacientes como algo inalcanzable. Sin embargo, como anteriormente se
292
TERAPIA
FIGURA 6. Hacia la terapia celular en la diabetes mellitus. En la terapia celular hay que
considerar dos aspectos, el reemplazo celular y la induccin a la tolerancia (45).
coment, pasados 5 aos de los primeros trasplantes realizados con el

protocolo de Edmonton, solo un 10% de los pacientes permaneci totalmente liberado de la insulina. Del resto de los pacientes trasplantados,
el 80% sigui padeciendo la enfermedad, aunque de forma ms estable
gracias a que se mantiene alguna secrecin de insulina, lo que mejora
su calidad de vida y retrasa las complicaciones.
Los principales problemas del trasplante de islotes pancreticos para
su implantacin masiva son dos: la insuficiencia de donantes y la necesidad de someterse a un tratamiento inmunosupresor de por vida. Esto
hace que este tratamiento no puede ser aplicado a muchas personas (entre
ellas los nios), hasta que no se resuelvan las reacciones de rechazo. Las
siguientes consideraciones han de ser tenidas tambin en cuenta:
1. El trasplante de islotes pancreticos es una terapia an en desarrollo y, por tanto, no est incluida entre las prestaciones de la sanidad
pblica en Espaa.
2. No hay ni puede haber suficientes donantes para efectuar todos
los trasplantes de isotes pancreticos que se requieren, dadas las actuales tasas de incidencia de la diabetes.
3. En el ao 2000 nuestro grupo public una serie de experimentos
en los que se implantaron en ratones diabticos varios clones de clulas
productoras de insulina obtenidas a partir de clulas madre embriona293
BERNAT SORIA ESCOMS
rias. Con ello conseguimos la normalizacin de la glucemia en todos los

ratones en 24 horas. Aunque un 40% de los animales volvieron a padecer hiperglucemia, el 60% restante mantuvo glucemias normales durante
las 42 semanas que dur el ensayo (un ratn vive unas 120 semanas).
4. Desde entonces se est intentando obtener clulas productoras
de insulina a partir de clulas embrionarias humanas, pero tambin se
estn explorando otras posibilidades, como la de utilizar clulas madre
adultas que hagan la funcin de las clulas , tratando de engaar as
al sistema inmune para evitar el rechazo.
5. Estamos intentando solventar los problemas de rechazo, pero
tambin hay que perfeccionar los sistemas de obtencin de islotes del
cadver donante, para conseguir alcanzar la relacin 1 donante/ 1 receptor (Figura 6).
6. Aunque se ha publicado un caso de donacin parcial de pncreas inter-vivos (ver www.sodicar.com), hoy no se considera viable
esta tcnica por condicionantes ticos y cientficos.
7. Mientras las terapias se perfeccionan y se resuelven los problemas planteados, es prioritario que el paciente con diabetes tome conciencia de su situacin, y se cuide para llegar en las mejores condiciones
fsicas al momento en que el trasplante de islotes fuera el tratamiento
establecido.
10.
LTIMAS APORTACIONES PUBLICADAS ON LINE
La revista Nature Chemical Biology acaba de publicar (marzo 2009)

los experimentos de un grupo de cientficos de la Universidad de Harvard (EE UU), liderados por Melton y Schreiber. Estos autores han
descubierto un compuesto, el ILV (indolactam-V), que inoculado en el
endodermo es capaz de crear un gran nmero de clulas con el gen
Pdx1, necesario para la produccin de insulina (46). Una vez generadas
estas clulas, se implantaron a ratones en la cpsula renal y se observ
que podan crear un importante nmero de clulas vivas generadoras de
insulina. Este hallazgo supone un importante paso en la creacin de
clulas , el gran objetivo de los cientficos en el desarrollo de la cura
de esta enfermedad metablica. Este compuesto, un alcaloide indlico
294
TERAPIA
promotor tumoral, cuya estructura se muestra en la Figura 7, podra

servir para diferenciar clulas madre pluripotenciales en clulas
pancreticas secretoras de insulina. Esta va podra constituir una estrategia teraputica til y supone un hallazgo esperanzador. El mecanismo
de accin sugiere que ILV acta sobre la va de la protena quinasa C.
El laboratorio de Melton lo ha intentado de varias maneras; una de
ellas consisti en la reprogramacin de clulas pluripotenciales inducidas (iPS), para diferenciarlas directamente en clulas pancreticas, sin
necesidad de pasar por el estado intermedio de pluripotencialidad que
comporta la tcnica de reprogramacin. Sirvindose de tres factores de
transcripcin (Ngn3, Pdx1 y Mafa), consiguieron posteriormente reprogramar las clulas exocrinas del pncreas para que se convirtieran en
clulas .
FIGURA 7.
Molcula de -indolactam V (ILV)
El sistema empleado recuerda al utilizado por el profesor de la

Universidad de Kioto, Yamanaka (47), para convertir clulas adultas en
clulas iPS, pero a diferencia de la tcnica de reprogramacin, el propuesto por Melton se saltaba el paso por el que se reverta el estado de
maduracin de una clula para que sea pluripotencial, y as pasaba directamente de un tipo de clula a otro, en este caso de una clula exocrina a una del pncreas.
Con su nuevo trabajo, estos investigadores apuntan una nueva posibilidad, basada en el compuesto ILV. Los autores saban que aquel
trabajo constitua una prueba de concepto y que con esta versin de
295
BERNAT SORIA ESCOMS
reprogramacin directa se poda disponer de una fuente de clulas relativamente accesible y abundante de ciertos tipos celulares de inters
teraputico, como el de las clulas del pncreas.
11.
CONCLUSIONES
Es un hecho evidente que las clulas productoras de insulina pueden

obtenerse a partir de clulas madre. Las clulas madre pueden representar una fuente ilimitada de clulas y resolver el problema de la falta de
donantes. Sin embargo, incluso si conseguimos una clula que se comporte como una clula humana, y pueda ser utilizada para restaurar la funcin perdida, no podemos olvidar que la diabetes es una enfermedad autoinmune, y mientras la terapia celular pueda restaurar la funcin, sin
actuar sobre el proceso autoinmune, los factores y mecanismos que destruyen las clulas originales, permanecern. La dimensin del problema requiere una combinacin de expertos, condicin que no posee grupo
alguno en el mundo, y el esfuerzo de todos es absolutamente necesario.
Mientras tratamos de resolver todos estos problemas, nuestro paciente
diabtico puede conseguir algn beneficio a partir de las estrategias basadas en terapias de clulas madre autlogas que se dirigen a complicaciones diabticas, tales como la cardiopata diabtica o la isquemia de los
miembros.
ABREVIATURAS
ABI, ndice tobillo-poplteo; bFGF, factor de crecimiento de fibroblastos bsico; BMMNC, clulas mononucleares de la medula sea (bone
marrow mononuclear cells);EGF, factor de crecimiento epidrmico;
ESC, clulas madre embrionarias (embryonic stem cells); IGF-I y II,
factores de crecimiento insulna-like I y II; ILV, -indolactam; GLP-1,
Pptido tipo glucagn-1; iPS, clulas pluripotentes inducidas; MAE,
efectos adversos principales a las 12 semanas; Pax4, gen que interviene
en la generacin de insulina; PBMNC, clulas mononucleares de la
sangre perifrica (peripheral blood mononuclear cells); SHH, Sonic
hedgehog; VEGF, factor de crecimiento vascular endotelial.
296
TERAPIA
AGRADECIMIENTOS
Los resultados resumidos en este trabajo han sido financiados en
parte por proyectos del Instituto de Salud Carlos III (TERCEL RD06/
0010/0025, REDIMET RD06/0015/0013), MEC (SAF2006-06673,
SAF2006-13686), Junta de Andaluca (CTS 576) y Fundacin Progreso
y Salud (FPS/0009/06). En los ltimos cinco aos he desarrollado mi
trabajo de investigacin en el Instituto de Bioingeniera de la UMH
(Alicante), la Universidad Nacional de Singapur y el Centro Andaluz de
Biologa Molecular y Medicina Regenerativa (CABIMER) en Sevilla.
Esta revisin le debe mucho a todos mis colaboradores en dichas instituciones.
12.
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Prlogo

MARA CASCALES ANGOSTO Y FLORA DE PABLO DVILA

reemplazo de las clulas daadas de los diferentes rganos y tejidos del

destruccin tumoral. El mnimo requerido para el xito de la terapia

Y para terminar este captulo de agradecimientos, queremos dar las

De manera natural, los tejidos del organismo sufren a lo largo de la

MARA TERESA MIRAS PORTUGAL

MARA TERESA MIRAS PORTUGAL

Hasta hace poco tiempo ha existido la creencia generalizada de

MARA TERESA MIRAS PORTUGAL

A lo largo de las siguientes pginas diversos autores, expertos en la

Clulas madre y nuevas terapias.

JOS ANTONIO LPEZ GUERRERO

MADRE Y NUEVAS TERAPIAS.

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FIGURA 1. Agregados celulares formados por clulas mesenquimales aisladas de miocardio

A pesar de que la 23 edicin de la Real Academia Espaola (2005)

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En 1981, M. J. Evans (10) junto a M. H. Kaufman obtuvieron ESC

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muchos pacientes con daos medulares severos supera cualquiera mala

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con sus vertientes siniestras conocidas, no estn bien definidas. En este

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eterna juventud, en la mitologa celta para su denominacin. Por otra

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como CD133 clulas inmaduras que pueden carecer incluso de

FIGURA 2. Clulas madre mesenquimales de mdula sea humana sometidas a diferenciacin

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y gran adherencia al plstico. Pueden identificarse a partir de una serie

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bilidad genmica en ESC humanas (hESC) basadas, principalmente, en

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FIGURA 3. Los estudios en modelo de gran animal, previos a la aplicacin humana de

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estas clulas un ejemplo reciente lo constituyen las ratas parapljicas

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FIGURA 5. Clulas madre embrionarias de ratn modificadas para sobreexpresar la protena

tratadas con terapias basadas en ESC. Los intentos de generar islotes de

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fundas alteraciones epigenticas que podran dificultar esta opcin. En

INNOVACIN CON ASC

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ms que especie-especficas, las clulas utilizadas en terapias celulares

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Northwestern (Chicago, EE.UU.) han llevado a cabo una experiencia

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cien centmetros cuadrados; logro alcanzado a travs de su tejido seo

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FIGURA 8. Clulas progenitoras de mdula sea en cultivo (clulas mesenquimales). La

vamente el triste espectculo surcoreano. Varios expertos que han

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centrando en polmeros de hidroxiapatita o fosfato triclcico, fcilmente

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CLULAS MADRE DERIVADAS DE SCU

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CLONACIN VERDADERA Y TRANSFERENCIA NUCLEAR

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morfolgica y funcionalmente anlogo con el que se proceder tal y

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embargo, toda tecnologa innovadora puede desarrollar su faceta ms