PROTENAS

1. CROMATOGRAFA LQUIDA DE ALTO RENDIMIENTO (HPLC): Normalmente una cromatografa toma horas
debido a la fase de elucin que es un proceso lento, esto causa que aumente la dispersin de la muestra y, por ende,
compromete la integridad de la disolucin. La HPLC fue entonces desarrollada para permitir reducir los tiempos de
las cromatografas de horas a tan slo minutos, empleando presiones de entre 2000 y 3000 PSI (Pounds per
Squared Inch, libras por pulgada cuadrada) por esto, adems, hay que utilizar una columna metlica resistente y
una matriz resinosa no compresible. La eficiencia de la columna en la HPLC est determinada por el tamao de la
partcula de relleno y el tamao de la muestra que se utiliza.
CROMATOGRAFA DE CAPA FINA O DELGADA (DE PAPEL): Consiste en utilizar un papel
filtro (placa de celulosa) que har las veces de fase estacionaria, en un extremo se aplicarn unas gotas de la
muestra. Luego, se colocar el papel en vertical en un solvente orgnico donde las muestras se separarn, pues
escalarn la matriz debido a su capilaridad, al finalizar las muestras deberan tener colores diferenciables.
ELECTROFORESIS: Basada en el desplazamiento en un campo elctrico de las protenas cargadas, es usada para
purificar protenas en pequeas cantidades, ya que puede afectar la estructura y por ende, a la funcin de las
protenas. Algo positivo es que las protenas se pueden visualizar, lo que permite una estimacin rpida del nmero
de las mismas; tambin permite la determinacin de propiedades como el punto isoelctrico y la masa molecular
aproximada. Se lleva a cabo en un gel que retrasa su desplazamiento (generado por el potencial elctrico) en una
forma aproximadamente proporcional a su cociente carga/masa.
INMUNOTRANSFERENCIA: Mtodo para identificar antgenos. Los antgenos se adhieren a hojas de celulosa,
donde son ligados especficamente, y se identifican mediante tincin con anticuerpos marcados. As implica
separacin por electroforesis por el sistema SDS-PAGE y una transferencia a una membrana de PVDF de las
protenas de una mezcla compleja. Los antgenos que se han transferido a la membrana son reconocidos por
anticuerpos monoclonales o policlonales; stos son una inmunoglobulina o un fragmento de sta.

2. Una cromatografa es un mtodo fsico de separacin de mezclas utilizado en todas las ramas de la ciencia, con el
objetivo de obtener sus distintos componentes de manera ms pura para ser analizados. La cromatografa consiste
en una fase mvil (mezcla que se va a separar) y una fase estacionaria (matriz resinosa o porosa) que ser la
columna por la que pasar la fase mvil, obteniendo as los componentes en diferentes partes.

La cromatografa utilizada para obtener una mezcla homognea

segn su tamao (peso molecular) es la cromatografa de
exclusin de tamao, en la cual las protenas son separadas
segn el radio de la esfera que stas ocupan al entrar en la
solucin y en contacto con las cuentas porosas (fase
estacionaria). Consiste en insertar ambos tamaos de protenas
en una columna con gel, y las partculas pequeas se quedan
en la fase estacionaria, excluyndose de las molculas grandes.

La cromatografa utilizada para obtener una mezcla homognea segn sus

cargas elctricas, es la cromatografa de intercambio inico, donde se tiene
en
la
columna una
matriz
resinosa
cargada
positivamente
(intercambiador aninico) o negativamente (intercambiador catinico), a la cual
se le agrega la fase mvil para que los iones sean atrados por la matriz y las
molculas de la misma carga sean separadas. Despus para separar las
molculas de la misma carga, se usa una gradiente de sal o un cambio de pH en
la fase mvil.

La cromatografa utilizada para obtener una mezcla homognea segn

su afinidad, es la cromatografa de afinidad, utilizada principalmente
para separar una o dos protenas de un grupo mayor, consiste en usar en
la columna una fase estacionaria inerte, con ligandos unidos
covalentemente, con la que la protena interactuar unindose a
los ligandos de manera que las dems molculas sern eludas. Para
separar las protenas se eluye la columna con una solucin
amortiguadora que contenga ligandos libres o molculas que puedan
romper los enlaces.

La cromatografa utilizada para obtener una mezcla homognea segn su adsorcin es la cromatografa de
interaccin hidrofbica, que consiste en utilizar una matriz cubierta de grupos hidrofbicos, donde las protenas
que tengan una superficie hidrfoba se adherirn; las protenas no hidrofbicas se separan: primero mediante un
lavado y despus con una gradiente de sal con el que se rompen las interacciones hidrofbicas. Se puede usar
etanol si no se consigue romper la unin.

3. ELECTROFORESIS SDS-PAGE: La electroforesis de protenas en geles de poliacrilamida en condiciones

desnaturalizantes es un proceso frecuentemente utilizado para la
estimulacin de la pureza y la masa molecular emplea el
detergente dodecilsulfato sdico (SDS). Este se une a la mayora
de protenas en una cantidad similar a su masa molecular,
alrededor de una molcula por cada dos residuos aminocidos,
luego incorpora una gran carga neta negativa, lo que hace que su
carga intrnseca sea insignificante, y asi todas las protenas
tienen un cociente carga/masa similar, adems de su forma (la
nativa se altera cuando se fija el SDS). As la electroforesis
separa a las protenas casi solamente por su masa molecular ya
que los polipptidos con menor peso molecular migrarn ms
rpido y los de alto peso molecular ms lentamente. Las
protenas podrn ser visibles gracias a un colorante, as se puede
seguir el progreso de un procedimiento de purificacin, ya que el
nmero de bandas proteicas visibles debe disminuir tras cada
nuevo paso de purificacin.

ISOELECTROENFOQUE: Tambin denominada electroenfoque.

Se basa en el desplazamiento de las molculas en un gradiente de
pH. Las molculas anfotricas, como los aminocidos, se separan
en un medio en el que existe una diferencia de potencial y un
gradiente de pH. La regin del nodo es cida y la del ctodo es
alcalina. Entre ambos se establece un gradiente de pH tal que las
molculas que se han de separar tenga su punto isoelctrico
dentro del rango. Las sustancias que inicialmente se encuentran
en regiones de pH inferior a su punto isoelctrico estarn cargadas
positivamente y mgrarn hacia el ctodo, mientras aquellas que se
encuentran en medios con pH ms bajos que su punto isoelctrico
tendrn carga negativa y migrarn hacia el nodo. La migracin
les conducir a una regin dnde el pH coincidir con su punto
isolctrico, tendrn una carga neta nula y se detendrn.

EJEMPLOS

a. Electroforesis SDS-PAGE

b. Isoelectroenfoque

Esquema de
de la
un masa
proceso de
Determinacin
isoelectroenfoque.
En primer
molecular
de una protena.
lugar,
se
aplica
en
el
En esta imagen podemosgel una
mezcla de patrn
anfolitos de
de rango
ver protenas
de pH 6-8,conocida
con las protenas
masa molecular
en
de
la
muestra
(con
el carril 1 del gel revelado pH de
7.3
y
7.8,
luego 6.3,
de la electroforesis.
respectivamente).
Se
Estas protenas
marcadas se
somete
a
continuacin
al
pueden
utilizar
para
campo
elctrico,
los
determinar
la
masay
anfolitos,
en protena
funcin de su
molecular
de una
pI, migran
desconocida
(carrilhacia
2). el ctodo o
hacia
el
nodo
hasta
alcanzar
un
pH
que
corresponde con su pI. Con
este proceso se genera un
gradiente de pH, que va
desde
una
zona
cida
alrededor del nodo a una
zona bsica alrededor del
ctodo. Las protenas, que
migran ms lentamente que
los anfolitos, migran hasta la
zona de pH que corresponde
con su pI, quedando de esta
manera enfocadas.

4. PROTEMICA:
La palabra proteoma se da de la fusin entre los trminos protena y genoma. Como su nombre lo indica, es el
estudio de las protenas expresadas en un genoma, que permiten identificarlas y clasificarlas de acuerdo a la funcin y a
las interacciones establecidas entre ellas. El proteoma de una clula puede variar dependiendo del estado en que se
encuentre, ya sea en una situacin de estrs, bajo efectos de frmacos o de alguna hormona.
ELECTROFORESIS BIDIMENSIONAL: Es un mtodo potente de separacin de protenas en mezclas complejas, que se
da en dos dimensiones:
Primera dimensin: En esta se usa el isoelectroenfoque (IEF), donde las molculas se separan segn su punto
isoelctrico.
Se tiene un gel en donde se insertan anfolitos (amortiguadores inicos) y se le aplica un campo elctrico, para poder
generarse un gradiente de pH.
A esto, le es agregada la solucin de protenas que se desea separar y luego se aplica un segundo campo elctrico. De
esta forma aparecern las protenas distribuidas en el gradiente de acuerdo a sus valores del punto isomtrico (pI).
Segunda dimensin: En esta se usa la electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sdico (SDS-PAGE),
donde las molculas se separan segn su masa molecular.
Las protenas son recubiertas por el SDS con cargas negativas proporcionales a su masa, luego pasan por unos poros
encontrados en el gel de poliacrilamida, separando finalmente las protenas segn su tamao.

BIBLIOGRAFA:

Kennedy Peter J., Rodwell Victor W. Harper: Bioqumica ilustrada. Captulo 4: Protenas: determinacin de la
estructura primaria. 28a edicin.
Nelson, David L., Cox, Michael L. Lehninger: Bioqumica. Captulo 3: Aminocidos, pptidos y protenas.
4a edicin.
Alberts, Bray, Hopkin, Johnson, Lewis, Raff, Roberts, Walter. Introduccin a la biologa celular. 3a edicin.

CIBERGRAFA:

http://myeloma.org/pdfs/CR2011-Span_a3.pdf
http://ufq.unq.edu.ar/Docencia-Virtual/BQblog/Electroforesis%202D%20(IEF+SDS-PAGE).pdf
http://www.researchgate.net/publication/250774819_Anlisis_de_protenas_mediante_electroforesis_e_inmunotran
sferencia_(Western_blot)