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PRCTICA DE LABORATORIO N 9
OBJETIVOS
Determinar por el nmero ms probable de coliformes totales y fecales
por la tcnica de tubos mltiples. Recuento de bacterias hetertrofas.
Realizar un anlisis microbiolgico a una muestra de agua de la laguna
terciaria de CITRAR.
Verificar si el agua es apta para riego de de plantas.
FUNDAMENTO TEORICO
El grupo coliforme, presentan mayormente en el sistema digestivo de los
animales como tambin en vegetales (semillas) y esparcidas por el suelo,
adems, pueden utilizarse como indicadores de contaminacin del agua. El
anlisis que se realizo, determino la presencia y ausencia de coliformes fecales
y totales en las tres muestras diferentes de agua, como son: Agua residual,
agua de pozo y agua mineral; a partir de cultivar estos grupos de
microorganismos en agares especficos con implementos adecuados para su
identificacin. En la primera muestra mencionada, se obtuvo que el total de
muestras analizadas por dilucin, presenten grupos coliforme, mas no se
observo lo mismo en las otras muestras de agua mineral y de pozo. La
determinacin de grupos coliforme es una forma de identificar el grado de
contaminacin
por
excretas
existente
en
el
agua.
Grupo coliforme, coliformes fecales, coliformes totales, agar, dilucin,
inoculacin, incubacin.
El grupo coliforme, es un conjunto de bacterias con ciertas caractersticas
biolgicas - qumicas especificas, estas caractersticas, propias de cada
organismo que integra este grupo muestran que:Son organismos aerobios o
anaerobios facultativosSon gran negativosProducen gasFermentan la lactosa
a 35C a 48hEstas caractersticas son las relevantes de todos los miembros del
grupo coliforme, la bacteria principal de este grupo es la Escherichia Coli.
Dela cual deriva el nombre del grupo en general. Estos microorganismos se
encuentran de forma continua y general en el sistema digestivo animal,
especficamente en el intestino, por ende, es muy obvio encontrarlos en zonas
donde haya heces y en restos fecales de animales. A estos se les llaman:
Coliformes fecales, que al igual que los coliformes totales, forman parte del
grupo coliforme. Coliformes fecales < coliformes totales = grupo coliforme.
Estos microorganismos tienen una continua relacin con el medioambiente,
puesto que, en los lugares donde habita cualquier tipo de animal, existe
coliformes, entonces estarn expuestos a diferentes alteraciones producidas
por estas bacterias, como: intoxicaciones y enfermedades digestivas
(mayormente).Por otra parte, las bacterias coliformes que la lluvia arrastra, por
el suelo, usualmente quedan atrapadas por las rocas y a medida que el agua
pasa por las rocas llega a los sistemas de agua subterrnea, sin embargo, los
pozos que no estn bien construidos, son una puerta abierta para que estas
bacterias contaminen el agua que se bebe.
El usar este tipo de anlisis por coliformes resulta mucho mas sencillo y
econmico, a comparacin con el de buscar microorganismos especficos. Para
la deteccin de estos microorganismos, se utilizan medios de cultivos
20131
PRCTICA DE LABORATORIO N 9
Fundamento
Medio rico en nutrientes, que permite un rpido desarrollo de los
microorganismos fermentadores de la lactosa, an de los fermentadores lentos.
La triptosa es la fuente de nitrgeno, vitaminas, minerales y aminocidos, la
lactosa es el hidrato de carbono fermentable, las sales de fosfato proveen un
sistema buffer, y el cloruro de sodio mantiene el balance osmtico
Es un medio selectivo, ya que el lauril sulfato de sodio inhibe el desarrollo de la
flora
acompaante.
Por la fermentacin de la lactosa, se produce cido y gas, ste ltimo se
evidencia al utilizar las campanas Durham.
20.0
Lactosa
5.0
Cloruro de sodio
5.0
Lauril
sodio
sulfato
Fosfato dipotsico
Fosfato
monopotsico
de 0.1
Instrucciones
Suspender 35,6 g del polvo en 1
litro de agua destilada. Dejar
reposar 5 minutos. Calentar a
ebullicin hasta la disolucin
total.
Distribuir
en
tubos
conteniendo
tubos
de
fermentacin.
Esterilizar
en
autoclave durante 15 minutos a
121C.
2.75
2.75
20131
PRCTICA DE LABORATORIO N 9
a.- Para el anlisis de muestras fluidas como el agua, sembrar por triplicado: 10
ml en caldo doble concentracin y 1ml y 0,1 ml en caldo simple concentracin.
Nmero
de tubos
Volumen
de la
muestra
Volumen
de
medio
Concentraci
n
del medio
10 ml
10 ml
Doble
1 ml
10 ml
Simple
0.1 ml
10 ml
Simple
Nmero
de
tubos
Dilucin
dela
muestra
Volume
Volume
Concentraci
n de la n
de n
muestra medio
del medio
10-1
1 ml
10 ml
Simple
10-2
1 ml
10 ml
Simple
10-3
1 ml
10 ml
Simple
Incubacin
Incubar los tubos 24-48 horas a 35-37 C.
Resultados
Considerar como positivos aquellos tubos que presentan gas.
Microorganismos
Crecimiento
Enterobacter
aerogenes
Bueno
excelente
a +
a +
Salmonella
typhimurium
a -
Bueno
ATCC excelente
Produccin
de gas
20131
PRCTICA DE LABORATORIO N 9
14028
Staphylococcus
aureus ATCC 25923
Inhibido
Inhibido
Instrucciones
Suspender 40 g del polvo deshidratado
por litro de agua destilada. Disolver y
distribuir 10 ml por tubo con
campanita de Durham. Preparar
adems, el medio a doble
concentracin. Esterilizar en autoclave
a 121C durante 15 minutos.
pH final: 7.2 0.2
Siembra
a.- Para el anlisis de coliformes totales en muestras fluidas, sembrar por
triplicado: 10 ml en caldo doble concentracin y 1ml y 0,1 ml en caldo simple
concentracin.
Nmero
de tubos
3
3
3
Volumen
de la
muestra
10 ml
1 ml
0.1 ml
Volumen
de medio
10 ml
10 ml
10 ml
Concentraci
n
del medio
Doble
Simple
Simple
Nmer
o
Diluci
n dela
Volume
n de la
Volume
n de
Concentrac
in
3
20131
PRCTICA DE LABORATORIO N 9
de
tubos
3
3
3
muestr
a
10-1
10-2
10-3
muestr
a
1 ml
1 ml
1 ml
medio
del medio
10 ml
10 ml
10 ml
Simple
Simple
Simple
c.- Para anlisis de coliformes fecales, a partir de cada tubo positivo en el test
presuntivo de coliformes totales (proveniente de Verde Brillante y Bilis 2%
Caldo Mac Conkey Caldo Lauril Sulfato, utilizando la tcnica del NMP), o a
partir de colonias presentes en diferentes medios, que se presume sean
coliformes, transferir una ansada a un tubo con Verde Brillante y Bilis al 2%
caldo fresco, incubando a 45 +/- 0.5 C y otra en Agua Triptona con incubacin
a 35-37 C, para detectar la produccin de indol.
Incubacin
a- Para de coliformes totales: a 35-37 C durante 24 horas.
b- Para coliformes (fecales): a 44.5-45.5 C durante 24 horas.
Resultados
-Positivo: presencia de gas.
Con el nmero de tubos positivos, calcular el nmero ms probable. El
resultado se expresa por gramos 100 ml de producto
-Negativo: ausencia de gas.
Microorganismos
Crecimiento
Gas
Indol#
+*
+*
Enterobacter spp.
-*
+*
-*
Variable
E. C. MEDIO
Medio utilizado para el recuento de coliformes totales, coliformes fecales y
Escherichia coli en agua, alimentos y otros materiales.Fundamento
El contenido de lactosa en este medio, favorece el crecimiento de bacterias
lactosa positivas, mientras que las sales biliares inhiben el crecimiento de gran
parte de la flora acompaante. Este caldo es recomendado por el Standard
Methods for the Examination of Water and Wastewater (1975), y por Hajna y
Perry (1943), para el recuento de coliformes en alimentos.
Frmula (en gramos por litro)
Triptena
20.0
Instrucciones
Suspender 37,4 g del medio en un litro de
20131
PRCTICA DE LABORATORIO N 9
Lactosa
5.0
Sales biliares N 3
1.9
Fosfato dipotsico
4.0
Fosfato monopotsico
1.5
Cloruro de sodio
5.0
Siembra
Para recuento de coliformes totales, tcnica del Nmero Ms Probable:
a.- Para el anlisis de muestras fluidas como el agua, sembrar por triplicado: 10
ml en caldo doble concentracin y 1ml y 0,1 ml en caldo simple concentracin.
Nmero
de tubos
Volumen
de la
muestra
Volumen
de medio
Concentraci
n
del medio
10 ml
10 ml
Doble
1 ml
10 ml
Simple
0.1 ml
10 ml
Simple
Dilucin
dela
muestra
Volumen
de la
muestra
Volumen
de medio
Concentraci
n
del medio
Simple
10-1
1 ml
10 ml
10-2
1 ml
10 ml
Simple
10-3
1 ml
10 ml
Simple
Incubacin
Incubar los tubos 24-48 horas a 35-37 C
Resultados
Se consideran resultados positivos el crecimiento bacteriano y produccin de
gas.
Microorganismos
Crecimiento
Produccin de gas
20131
PRCTICA DE LABORATORIO N 9
Enterobacter aerogenes
Bueno a
excelente
Bueno a
excelente
Bueno a
excelente
Inhibido
Inhibido
METODOLOGA
Placas Petri
ensayo
Tubos de
20131
PRCTICA DE LABORATORIO N 9
Mechero Bunsen
analtica
Balanza
2013
PRCTICA DE LABORATORIO N 9
Asa de Siembra
Tripode
Malla de Asbesto
Bao Mara
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2013
PRCTICA DE LABORATORIO N 9
Pipeta
Erlemeyer
PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
ANALISIS MICROBIOLOGICO DEL AGUA: Determinacion del Nmero ms
probable de Coliformes Totales y Coliformes fecales para la tcnica de Tubos
Multiples. Recuento de Bacterias Heterotrofas
12
2013
PRCTICA DE LABORATORIO N 9
Agua de CITRAR
MUESTRA DE
Diluciones sucesivas
Agregar 10 ml a cada tubo
10-2
10-3
10-4
10
mL
10-1
Agua Peptonada
10-5
2013
PRCTICA DE LABORATORIO N 9
MUESTRA DE AGUA
Agua de CITRAR
Diluir 10 ml a cada tubo de ensayo
90ml
10-1
90ml
10-2
90ml
10-3
90ml
90ml
10-4
10-5
LUNES
Sembrar 2 asadas
Gas (-)
Prueba
Negativa
Gas (-)
Prueba
Negativa
12
Caldo EC
2013
PRCTICA DE LABORATORIO N 9
PRUEBA
CONFIRMATIVA
Tubos Positivos
(produccin de
gasy turbidez)
Tubos Positivos
(produccin de
gas)
10 mL
Caldo Brilla
Incubar
44,5 0,2
C
24 2
horas
Incubar
35 0,5
C
48 3
horas
GAS (+)
Calcular valor NMP
de los nmeros de
tubos positivos en la
TABLA
(NPM/100mL)
GAS (+)
Calcular valor NMP de
los nmeros de tubos
positivos en la TABLA
(NPM/100mL)
Recuento de
bacterias
hetertrofas de las
placas con Agar TSA.
OBSERVACIONES/RESULTADOS
12
2013
PRCTICA DE LABORATORIO N 9
Tubos positivos
o
Dilucin 10-1:
10
: Incontable
12
2013
PRCTICA DE LABORATORIO N 9
10
10
10
10
: Incontable
: 92 colonias
: 44 colonias
: 31 colonias
10-1
10-2
10-3
10-4
10-5
Incontable
Incontable
92
44
31
DISCUSION Y CONCLUSIONES
Tal y como se esperaba se pudo lograr esta vez un buen resultado en el
NMP debido a que esta vez si se realizo un buen trabajo.
No es apta para el consumo ya que presenta demasiados coliformes
totales y fecales.
No es apta para el riego de plantas ya que se pasa del lmite permisible
de coliformes.
Debe de tratarse ms estas aguas para que sean aptas tanto para el
riego como para el consumo humano.
RECOMENDACIONES
A la hora de sembrar es preferible estar cerca del mechero de bunsen
para as poder evitar alguna contaminacin a la muestra.
Realizar de forma correcta las siembras, para evitar errores en los
resultados.
12
2013
PRCTICA DE LABORATORIO N 9
Seguir las indicaciones del profesor encargado del curso para que el
experimento sea un xito.
A la hora de las diluciones se debe tener cuidado con no confundir las
pipetas utilizadas en cada dilucin.
Manejar con cuidado la muestra ya que es muy contaminada, evitar
tener contacto con ella.
BIBLIOGRAFIA
Raquel Granados Prez, Bacteriologa. Medios de cultivo y pruebas
bioqumicas. Micologa General. Parasitologa General Tomo ll,
Segunda Edicin, Paraninfo, Madrid, 2003.
Alonso Urmeneta y otros. Manual Prctico de Microbiologa.
Raquel Granados Prez, Bacteriologa. Medios de cultivo y pruebas
bioqumicas. Micologa General. Parasitologa General Tomo l,
Segunda Edicin, Paraninfo, Madrid, 2003.
ANEXOS
Galera
12
2013
PRCTICA DE LABORATORIO N 9
10
de las concentraciones.
10
12