11.

MTODOS
DE BIOLOGA
CELULAR

1. Cultivo de clulas eucariotas animales.

2. Fluorescencia, en concreto dos aplicaciones: microscopa de
fluorescencia y la citometra de flujo.
3. Transfeccin de ADN.
4. Inactivacin de genes especficos o silenciamiento gnico.

CULTIVO DE CLULAS EUCARIOTAS ANIMALES.

En muchas ocasiones no vamos a poder estudiar la clula insertada en un
organismo entero, por lo que tenemos que estudiarla aislada del organismo
mediante estudios in vitro. Los estudios estando la clula en el interior del
organismo se denominan estudios in vivo. La ventaja de los estudios in vitro
es que son ms sencillos porque tenemos un nico tipo celular, las
condiciones ambientales como la composicin del medio extracelular las
podemos controlar mejor ya que las controla el experimentador. El
inconveniente es que los resultados obtenidos in vitro se van a alejar de la
realidad ya que no se encuentran en su ambiente normal, y por tanto la
actividad de estas clulas no va a ser regulada por otras celulas, carecemos
de la sealizacin celular de primeros mensajeros.
Se denomina cultivo celular al proceso de mantenimiento de clulas aisladas
del organismo, es decir, in vitro, en unas determinadas condiciones que van
a permitir su supervivencia y, en muchos casos, su proliferacin. Las
condiciones ambientales fsicas y qumicas del cultivo han de ser lo ms
parecidas posibles a las que tena la clula cuando estaba en el organismo,
para que no haya una dependencia del medio de los resultados. 3
condiciones ambientales:
1. El medio extracelular, que es un lquido acuoso a pH fisiolgico que va a
contener glucosa acidos grasos, aas, sales minerales y vitaminas. Para
reducir las posisbilaidades de contaminacin por bacterias y hongos, ya
que se carece del sistema inmune, se aade al medio antibacterianos
para mantener esteril el medio de cultivo. Toda la manipulacin de las
clulas se har dentro de las denominadas cmaras de flujo laminar que
filtran el aire que est en contacto con las clulas.

2. Condiciones de temperatura de 37 , gases, atmosfera y humedad lo ms

parecida posible a las que tenia la clula en el organismo. Esto se
consigue mediante incubadoras.
3. Una superficie slida especial sobre la que se van a depositar las clulas.
Algunas clulas pueden mantenerse en suspensin como clulas
sanguineas o clulas tumorales pero la mayoria necesitan un soporte
slido, el cual normalemnte sera una superficie de plastico que favorece
la adhesin, esteriles y que se presentan en forma de placa de cultivo o
frascos de cultivo, donde la contaminacion se disminuye porque en la
placa est contnuamente entrando aire y el frasco est tapado por un
tapn que contiene un filtro. Cultivo de fibroblastos hepatocitos o clulas
tumorales se producen en un frasco de cultivo; las clulas acaban
contactando entre s y con la superficie del frasco, por lo que las
condiciones son muy parecidas a las que tendria en el interior del
organsmo. El medio de cultivo a de cubrir ligeramente la capa de clulas
La transferencia de clulas de una placa o frasco a otro se denomina
subcultivo celular.

TIPOS DE CULTIVO
1. El cultivo celular primario es el cultivo de las clulas recin extraidas de
un tejido. En el caso de que estas celulas se dividan. A la descendencia
se le denomina cepa celular, esta ya no es un tejido celular primario. Las
caractersticas de este tipo de cultivos son las siguientes:

- Exige la extraccin de las celulas del tejido y un tratamiento previo que

permita romper las interacciones de celula celula o celula con la matriz

extracelular. Tenemos que realizar esto cada vez que se realice un cultivo
primario.
Tiene el inconveniente de que podemos encontrarnos con diferentes tipos
celulares y no solo con el que queremos estudiar. No tenemos un cultivo
puro.
Las celulas de un cultivo primario o bien no se dividirn en el caso que
hagamos un cultivo primario de hepatocitos, o bien se dividen un numero
limitado de veces, como es el caso de los fibroblastos que se dividen
entorno a 70 veces y empiezan a morir. Por estas razones lo que
tendremos que realizar una biopsia del tejido.
Una ventaja es que las celulas se parecen mas en cuanto a estructura y
funcion a como estaban in vivo que las celulas de una linea celular.

2.
Linea celular. Muchos de los inconvenientes anteriores se salvan
utilizando lineas celulares. Una linea celular va a ser un cultivo celular que
partiendo del tejido in vivo, las celulas descendientes van a proliferar
indefinidamente, no tienen un numero limitado de divisiones y por tanto no
van a morir. Esto no significa que sean tumorales. A las lineas celulares en
general se denominan celulas inmortales. 3 tipos de celulas inmortales:
celulas madre, celulas inmortales propiamente dichas y las celulas
tumorales.
Las celulas inmortales son celulas inicialmente diferenciadas pero que
despues se han vuelto inmortales y que no son tumorales. Son celulas que
se han originado en un cultivo primario que se han originado a partir de
cambios genetico espontaneos (mutaciones) que les han otorgado la
capacidad de dividirse de manera indefinida, la transformacion tiene lugar en
el mismo cultivo, puede ocurrir en los fibroblastos 3T3, inicialmente eran

fibroblastos normales. Estas celulas inmortales adquieren esta capacidad

pero no adquieren otras caracteristicas tumorales como la capacidad de
crecer en 3 dimensiones, estn fuertemente unidas al sustrato a diferencia
de las tumotrales y cuando se inoculan en un animal no dan lugar a tumores.
Cultivo de celulas tumorales. Proceden de un tumor in vivo y que se cultivan
in vitro, tienen todas las caracteristicas tumorales. Ademas de dividirse
indefenidamente tienen tambien otras caracteristicas tumorales ( anteriores).
Un ejemplo son las celulas Hela ( primera linea celular en 1951).
El inconveniente de las lineas celulares es que han perdido alguna o algunas
de las funciones que tenian las celulas diferenciadas de las que procedian
por lo que hay que ser cautos a la hora de realizar un estudio fisiologico.

TCNICA DE FLUERESCENCIA
Se denomina fluorescencia al proceso por determinadas moleculas son
capaces de absorber energa de una determinada longitud de onda de la
radiacin electromagntica y son capaces de devolver parte de esta energa
en forma de radiacin electromagnetica de una longitud de onda superior. La
longitud de onde de la radiacin que absorben se denomina longitud de onda
de excitacin y la segunda se denomina longitud de onda de emisin.
Siempre se cumple que la de emisin es mayor a la de excitacin. La
longitud de onda es inversamente proporcional a la frecuencia de la
radiacion, la cual esta intimamente relacionada con la energia, por lo que la
energia de excitacin es mayor que la energia de emision, va a haber un
perdida de energia en forma de calor. A estas sustancias que tienen esta
capacidad se le denominan fluorofobos o fluorocromos. La intensidad de la
luz fluorescente emitida sera directamente proporcional a la catidad de
fluorofobo.

Electroforesis de DNA
en gel de agarosa.
Fluorforo = Bromuro
de etidio

Longitud de onda de
Marcaje del

Longitud de onda de
Distribucin

Cromatina

Dos ejemplos de la utilizacion de la fluorescencia apliacda al area de la

biologia celular:

1. Microscopia de fluorescencia. La fluorescencia combinada con las

tecnicas de microscopia nos van a aportar informacion sobre la
localizacion de estructuras subcelulares (nucleo, mitocondrias,
citoesqueleto), nos va a permitir conocer una proteina desconocida en
que organulo se va a localizar, y nos permite ridentificar cambios
importantes como la desorganizacion del citoesqueleto. MIRAR
EJEMPLOS EN LAS DIAPOS.

2. Citometria de flujo. Consiste en la aplicacin de la tecnica de la

fluorescencia que nos permite cuantificar la fluorescencia de las celulas, de
un gran numero de celulas y en muy poco tiempo, cosa que no hacia la
microscopia de fluorescencia,

2) CITOMETRA DE FLUJO

Control
TratamientoA

n clulas

n clulas

Esquema bsico
de un citmetro
de flujo

Fluorescencia de ROS
El tratamiento A no afecta
a los niveles de ROS

Control

TratamientoB

Fluorescencia de ROS

El tratamiento B aumenta
los niveles de ROS

TRANSFERENCIA DE ADN
La transferencia de DNA consiste en la transmisin de un determinado gen
en clulas en cultivo. Con este mtodo conseguimos estudiar dicho gen y en

concetro la funcion de la proteina codificadoa por dicho gen. Despus de la

introduccin de este gen se producir una estimulacion de la funcion celular
de la que es responsable la proteina codificada por este gen, el ras estimula
la proliferacion. 2 tipos de transfeccon:
1. Transitoria. El ADN que introducimos no se inserta en el genoma nuclear
de la celula, la consecuencia es que en las sucesivas mitosis este gen
que se encuentra en el citosol no se reparte euitativamente entre cada
una de las celulas hijas, de manera que nos podemos encontrar al cabo
de sucesisvas divisiones, con un numero variable de gen introducido.
Algunas van a estar enriquecidas de este gen, otras van a tener pocos
genes, y otras ninguno. Cada vez tenemos ms celulas con menos gen
introducido. Para volver a realizar el estudio habremos de transfectar de
nuevo.
2. Estable. El ADN si que se inserta en el genoma nuclear de la celula, por
tanto se reparte equitativamente entre las clulas hijas porque se divide
junto los cromosomas, ya no se ha de trasfectar de nuevo, tenemos
siempre la presencia del gen el cultivo. El inconveniente es que el gen se
integre en un lugar codificante del genoma y destruya otro gen. La
solucin es seleccionar varios clones.

SILENCIAMIENTO GNICO
El silenciamiento genico tiene por objetivo estudiar la funcin de la proteina
codificada por un determinado gen que es el que sera inactivado por este
mtodo, El estudio de la funcin celular alterada resultante del silenciamiento
genico nos dar la funcin de esa protena.
silenciamiento del gen 1 ..inactivacion prot 1.aumento proliferacin
conclusion: funcion de la proteina es la inhibicin o disminucion de la
proliferacion.
El silenciamiento gnico consistir en la capacidad de un ARN de doble
hebra para bloquear la traduccin a proteinas del ARN mensajero de hebra

simple al cual es complementario pero no la de un ARN mensajero de hebra

simple con una secuencia diferente, no complementaria.
Se introduce un ARN de doble hebra pequeo (20PDB) que una de las
hebras ser complementaria del ARN mensajero y codificara para la proteina
que queremos inactivar. En el interior de la celula el si ARN se va a unir a un
complejo proteico de la celula denominado RISC, el cual degrada una de las
dos hebras de ese si ARN y nos deja intacta la hebra que es complemnetaria
al ARN mensajero que se quiere inactivar. El ARN mensajero se va a unir por
complementariedad de bases a ese ARN que esta unido al RISC
produciendose la degradacin del ARN mensajero, con el tiempo se degrada
todo el ARN mensajero que codifica para esa proteina por lo que llegar un
momento en el que no estara presente la proteina y se estudia el cambio
celular producido para conocer la funcin de la proteina.

MECANISMO MOLECULAR DEL SILENCIAMIENTO

mRN