Procedimiento de Preparaciones en Fresco.

a. Lavar y desengrasar los portaobjetos y cubreobjetos. Para ello emplear jabn

lquido y agua; enjuagar varias veces con alcohol al 95 %, ponerlos a secar y
flamearlos 2 a 3 veces.
b. Flamear hasta el rojo el asa de inocular.
c. Quitar el tapn de uno de los cultivos de microorganismo proporcionado (agua o
alimento) y flamear el borde del tubo.
d. Recoger una azada del cultivo y colocarla en el centro del portaobjeto limpio (en
caso de que el cultivo sea slido suspenderlo en una gota de agua estril).
e. Flamear de nuevo el borde del tubo y volver a taparlo. Esterilizar el asa de
inocular.
f. Colocar un cubreobjetos sobre la suspensin del cultivo y presionar suavemente.
g. Observar la preparacin con el objetivo seco dbil y despus con el seco fuerte.
h. Dibujar lo observado.

Lavar y desengrasar
los portaobjetos y
cubreobjetos.

Flamear hasta el
rojo el asa de
inocular.

Quitar el tapn de
uno de los cultivos
y flamear el borde
del tubo.

Recoger una azada

del cultivo y
colocarla en el
centro del
portaobjeto limpio

Observar la
preparacin con el
objetivo seco dbil y
despus con el seco
fuerte y dibujar lo
observado.

Colocar un
cubreobjetos sobre
la suspensin del
cultivo y presionar
suavemente.

Flamear de nuevo el
borde del tubo y
volver a taparlo

Tcnica para hacer un Frotis.

a) Lavar y desengrasar los portaobjetos y cubreobjetos. Para ello emplear jabn
lquido y agua; enjuagar varias veces con alcohol al 95 %, ponerlos a secar y
flamearlos 2 a 3 veces.
b) Anotar el nmero correspondiente con lpiz graso sobre el portaobjetos, de la
muestra por observar, indicando con ms detalle la descripcin en un cuaderno de
anotacin
c) Tomar y extender en un portaobjetos con el asa una gota del producto que se va a
examinar si ste es fluido. Si es de consistencia ms slida, se diluye una pequea
porcin del mismo en una gota de agua estril colocada previamente sobre el
portaobjetos con el asa
d) Las extensiones deben ser suficientemente finas para que los microorganismos
aparezcan bien aislados al examen microscpico y lo suficientemente gruesa para
ser localizado y hacer el enfoque con facilidad
e) Secar la preparacin al aire, calentar muy suavemente en la corriente del aire
caliente del mechero para acelerar la desecacin
f) Fijar por medio del calor. Pasar el portaobjetos dos o tres veces con cierta lentitud
sobre la llama del mechero hasta una temperatura soportable al aplicarlo sobre el
dorso de la mano. Se puede provocar alteraciones en la morfologa de las bacterias
si el calentamiento es excesivo
g) Dejar enfriar y hacer las siguientes tinciones

Lavar y desengrasar
los portaobjetos y
cubreobjetos

Anotar el nmero
correspondiente con
lpiz graso sobre el
portaobjetos, de la
muestra por
observar.

Tomar y extender en
un portaobjetos con
el asa una gota del
producto que se va
a examinar si ste
es fluido.

extender las extensiones,

deben ser
suficientemente finas
para que los
microorganismos
aparezcan bien aislados y
lo suficientemente gruesa
para ser localizado y
hacer el enfoque con
facilidad

Dejar enfriar y
hacer las tinciones
correspondientes

Fijar por medio del calor.

Pasar el portaobjetos dos
o tres veces con cierta
lentitud sobre la llama del
mechero hasta una
temperatura soportable al
aplicarlo sobre el dorso de
la mano.

Secar la
preparacin al aire.

Tincin simple
a) Cubrir el frotis fijo con 3 gotas del colorante bsico (azul de metileno, safranina o
cristal violeta) y dejar actuar durante 1 minuto.
b) Sobre una charola escurrir el colorante y lavar la preparacin con agua, para ello
inclinar el portaobjetos y en la parte superior aplicar el agua con una pizeta de
manera que resbale sobre el frote.
c) Colocar el portaobjetos inclinado sobre una toalla de papel absorbente y dejar
secar a temperatura ambiente.
d) Observar al microscopio con los objetivos de 10 x, 40 x y 100 x (inmersin).
e) Esquematizar sus observaciones y describir las caractersticas de los
microorganismos observados empleando los trminos adecuados respecto a la
morfologa, agrupacin y estructuras; ejemplos: a) bacilos largos con extremos
redondos, b)c ocos agrupados en cadenas denominadas estreptococos, c) clula
mvil de forma ovoide con estructuras internas.

Cubrir el frotis fijo

con 3 gotas del
colorante bsico

lavar la
preparacin con
agua.

Esquematizar sus
observaciones y
describir las
caractersticas de
los microorganismos
observados

Colocar el
portaobjetos
inclinado sobre una
toalla de papel
absorbente y dejar
secar a temperatura
ambiente.

Observar al
microscopio con los
objetivos de 10 x,
40 x y 100 x
(inmersin).

Tincin de Gram
a) Preparar un frotis, dejar secar al aire y fijar a la flama
b) Cubra la preparacin con la solucin de cristal violeta dejar actuar el colorante
durante un minuto
c) Escurra el colorante, lave con agua de la llave, cubra la preparacin con Lugol,
dejar actuar este agente durante 15 segundos
d) Escurra el Lugol, lave con agua corriente, cubra la preparacin con alcoholacetona de 30 a 60 segundos, lave abundantemente con agua de la llave

e) Cubra la preparacin con safranina por un minuto y lave con agua de la llave,
secar la preparacin al aire, se observa con el objetivo de inmersin.
f)

Las bacterias Gram-positivas presentarn una coloracin violeta mientras que

las Gram-negativas la presentarn roja o rosa. La identificacin de las bacterias

Gram- positivas puede ser problemtica, solamente cuando las bacterias Grampositivas se encuentran en crecimiento exponencial (cultivos jvenes) la reaccin es
clara; en fase estacionaria (cultivos viejos) las bacterias Gram-positivas pueden
parecer Gram-negativas.

Cubra la
preparacin con
cristal violeta y
dejar actuar un
minuto

Preparar un frotis,
dejar secar al aire y
fijar a la flama

Cubra la
preparacin con
safranina por un
minuto y lave con
agua de la llave,
secar la preparacin
al aire,

Observar al
microscopio.

Tincin

de

Escurra el colorante
y cubra la
preparacin con
Lugol, dejar actuar
durante 15
segundos.

Escurra el Lugol,
lave con agua
corriente, cubra la
preparacin con
alcohol-acetona de
30 a 60 segundos.

Ziehl-

Neelsen
Es la coloracin de grmenes cido-alcohol
resistentes.
a) Prepare un frotis, seque al aire y fije al calor.
b) Cubra la preparacin con carbol-fucsina y caliente por el reverso hasta
emisin de vapores durante 5 a 10 minutos, cuidando de que no hierva el
colorante, aadir colorante de vez en cuando para evitar que este se seque.

c) Lave con agua y decolore con alcohol-cido, limpiar el reverso del

portaobjetos, lado contrario al frotis.
d) Lave con agua y cubra la preparacin con azul de metileno durante 60
segundos. e)

Lave con agua, dejar reposar y observe con el objetivo de

inmersin

Prepar un frotis,
secar al aire y fijar
al calor.

Cubrir la
preparacin con
carbol-fucsina y
caliente por el
reverso durante 5
a 10 minutos

Lave con agua,

dejar reposar y
observe con el
objetivo de
inmersin.

Tincin de endosporas por la tcnica de Schaeffer y

Fulton
a) Preparar una extensin a partir del cultivo bacteriano.

Lavar con agua y

decolor con alcoholcido, limpiar el
reverso del
portaobjetos, lado
contrario al frotis.

Lavar con agua y

cubrir la
preparacin con
azul de metileno
durante 60
segundos.

b) Colocar la extensin sobre un soporte y agregar suficiente solucin de

verde de malaquita al 5%.
c) Flamear la extensin pasando por debajo de sta el mechero Bunsen
lmpara de alcohol hasta observar una ligera emisin de vapores por
espacio de minuto y medio, evitando que se evapore totalmente el
colorante.
d) Lavar enrgicamente al chorro del agua, hasta eliminar exceso de
colorante. Cubrir la preparacin con solucin de contraste, Safranina al 5%,
y dejar actuar el colorante durante un minuto y medio.
e) Lavar al chorro del agua hasta eliminar el exceso de colorante. Secar al
aire o utilizando papel absorbente. Observar al microscopio con objetivo de
inmersin en aceite.

Preparar una extensin

a partir del cultivo
bacteriano.

Colocar la
extensin sobre
un soporte y
agregar
suficiente
solucin de
verde de
malaquita al 5%.

Flamear la extensin
pasando por debajo de
sta el mechero por
espacio de minuto y
medio, evitando que se
evapore colorante.

Lavar enrgicamente
al chorro del agua,
hasta eliminar exceso
de colorante

Observar al
microscopio con
objetivo de inmersin
en aceite.

Lavar al chorro del

agua hasta eliminar el
exceso de colorante.
Secar al aire o
utilizando papel
absorbente.

Cubrir la preparacin
con solucin de
contraste, Safranina al
5%, y dejar actuar el
colorante durante un
minuto y medio.

Disposicin de desechos.
1. Despus de efectuar las observaciones, los portaobjetos se sumergen durante
10 minutos en una solucin sanitizante de hipoclorito de sodio al 10 % a partir de
una solucin comercial, despus se lavan con detergente lquido, se enjuagan y
se sumergen en alcohol al 95 % durante 24 horas.
2. En caso de que las preparaciones se rompan, envolverlas en papel, esterilizar
en autoclave y desecharlas en el contenedor exclusivo para material roto de vidrio.
3. Los portaobjetos rotos o daados que se encuentren limpios se colocan
directamente en el mismo contenedor
4. Esterilizar en autoclave los cultivos bacterianos y muestras empleadas y
desecharlas
5. Los desechos de colorantes se colocan en los contenedores dispuestos para
este fin en cada laboratorio. Posteriormente se someten a adsorcin con carbn
activado y el agua libre de colorante es desechada

Sumergir los
portaobjetos en una
solucion de cloro al
2% durante 24
horas.

En caso de que las

preparaciones se
rompan,
envolverlas en
papel, esterilizar y
desecharlas.

Los desechos de
colorantes se
colocan en los
contenedores
dispuestos para
este fin en cada
laboratorio

Los portaobjetos
rotos o daados que
se encuentren
limpios se colocan
directamente en el
mismo contenedor.

Esterilizar en
autoclave los
cultivos bacterianos
y muestras
empleadas y
desecharlas