Departamento de

Cincias Fsico Naturais

2015/2016

Protocolo Experimental
12 Ano, Turma A, B e C
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Nome:
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Introduo

Os microrganismos, tal como outros organismos vivos, necessitam de obter os nutrientes apropriados do
seu meio ambiente. Assim se queremos cultivar e manter microrganismos vivos em laboratrio, necessitamos de os
colocar em meios de cultura, contendo os nutrientes apropriados para o seu crescimento. Para alm de nutrientes
igualmente necessrio que as condies de oxignio (presena ou ausncia), pH, temperatura e presso
osmtica sejam adequadas ao crescimento desses microrganismos.
Na preparao dos meios e na manuteno das culturas de microrganismos importante observar as
necessrias condies de assepsia, de modo a se evitarem contaminaes com outros microrganismos.
Os meios de cultura dividem-se primeiramente em meios slidos, aqueles que contm agar a aproximadamente 2%,
e meios lquidos, sem agar. Ambos os meios so preparados com gua destilada, aquecidos at que se dissolvam
o
completamente e posteriormente esterilizados por autoclavagem a 121 C. Existem ainda os meios semi-slidos em
que a percentagem de agar inferior aos meios slidos.
Nos meios slidos o crescimento pra por exausto de nutrientes, devendo realizar-se a transferncia de
colnias para um novo meio. No entanto estes meios permitem a individualizao das colnias. Os meios lquidos
permitem melhor difuso de nutrientes, mas no o isolamento de colnias.
Aps autoclavagem, os meios slidos, que se encontram no estado lquido, vertem-se em caixas de Petri de
o
forma a cobrir uniformemente o fundo da caixa. Aps solidificao guardam-se por 24h na estufa a 37 C para testar
a sua esterilidade e em seguida no frigorifico at altura das sementeiras. Os meios slidos podem tambm ser
vertidos em tubos de ensaio de vidro. Os meios lquidos so mantidos em tubos de ensaio de vidro.

Quanto ao grau nutritivo dos meios de cultura consideram-se:

Meios nutritivos gerais: contendo elementos minerais e nutrientes orgnicos. Ex. Agar Nutriente, Caldo
Nutriente.
Meios enriquecidos: contendo produtos biolgicos (sangue, soro), vitaminas. Ex: Agar Sangue.
Meios complexos: contm todos os ingredientes necessrios para o crescimento de um determinado
microrganismo, mas no se conhecem as quantidades exactas de todos os componentes
Meios definidos: aqueles em que se sabe a concentrao exacta dos seus componentes. A composio
destes meios varia consoante os requisitos dos organismos a cultivar.

Classificam-se ainda os meios em:

Protocolo experimental - 12Ano

Selectivos, meios para seleco de determinados grupos de bactrias, os quais contm substncias que
inibem o crescimento de outras bactrias distintas daquelas que nos interessam (meios slidos). Ex: Agar
Pseudomonas, Tiossulfato-citrato-bilis-sacarose (TCBS) para Vibrio, Agar MacConkey para coliformes.
Diferenciais, para identificao de microrganismos, meios slidos com a composio qumica adequada
para evidenciar uma caracterstica bioqumica (meios slidos). Ex: MacConkey Agar para isolamento de
o
coliformes, patognios intestinais na gua e produtos derivados do leite. Neste agar aps 24h a 35 C as
colnias de Escherichia coli so vermelhas e mucides, enquanto que as colnias de Salmonella e Shigella
so brancas.
Indicadores, meios lquidos, com a mesma funo dos diferenciais, servem para evidenciar uma
caracterstica bioqumica, mas no para separar as colnias positivas e as negativas. O pH do meio
ajustado antes de autoclavar.

O crescimento de bactrias num meio lquido identifica-se por turvao do meio, formao de uma pelcula
na sua superfcie, ou aparecimento de sedimento, enquanto que num meio slido por aparecimento de colnias.
Os meios lquidos so designados de caldos.

Material
- Gobel

- Vareta de vidro

- Balo Erlenmeyer

- Placas de Petri

- Balana

- Autoclave

- Lamparina

- Papel de filtro

- Fsforos

- Funil

- Rede metlica

- Fita indicadora de pH

- Trip

- gua destilada

- Placa de aquecimento

- Extrato de carne

- Esptula

- Peptona

- Proveta

- Cloreto de Sdio

- Vidro de relgio

- Agar

Protocolo experimental

1. Colocar 30 ml de gua destilada num gobel.

2. Pesar as seguintes substncias e coloc-las no gobel.
Extrato de carne* ............ 0,18 g
Peptona* ......................... 0,6 g
Cloreto de sdio ............ 0,3 g
Protocolo experimental - 12Ano

3. Colocar o gobel em aquecimento sobre uma rede metlica na placa elcrica ou chama de uma lamparina.
4. Dissolver os ingredientes em gua agitando continuamente com um basto de vidro ou com um agitador eltrico
(uso de barra magntica), evitando a formao de espuma. Aps a formao de uma suspenso homognea,
completar o volume do meio com mais 30 ml de gua.
5. Filtrar em papel de filtro para retirar as impurezas.
6. Verificar o pH (neutro) atravs de fita indicadora de pH.
7. Acrescentar 1,2g de gar-gar
8. Colocar o gobel sobre uma rede metlica (ajustada num trip metlico tendo por baixo a lamparina).
9. Dissolver o gar no meio, mexendo sempre com um basto de vidro, para no aderir ao gobel, at a completa
dissoluo, evidenciada pela ausncia de grnulos de gar nas paredes do recipiente, tornando-se lmpido. (Isto s
se consegue com a ebulio do meio).
10. Colocar num Erlenmeyer e rolhar.
11. Esterilizar em autoclave a 121C por 20 minutos.
12. Retirar do autoclave, deixar arrefecer a 50-70C e distribuir (cerca de 20 ml por cada placa) em placas de Petri
estreis.

Obs. Os meios de cultura aps esterilizao devem ser incubados em condies ambientais (temperatura e
atmosfera) adequadas para verificao da esterilidade (Prova da esterilidade).
O armazenamento dos meios de cultura esterilizados e arrefecidos deve ser feita acondicionando-os invertidos,
em sacos plsticos fechados, para reduzir a desidratao dos mesmos, colocando-os em refrigerao por, no
mximo 15 dias.

*Peptona um tipo de substrato, que pode ser digerido pela enzima tripsina, secretada pelo pncreas. uma protena semi-digerida que serve
como fonte de nitrognio.
*O Extrato de Carne preparado de carne fresca especialmente selecionado para fornecer um crescimento mximo de microorganismos
exigentes, Serve como fonte de nitrognio e carboino.

Bom trabalho!!!

Protocolo experimental - 12Ano