LABORATORIO BIOTECNOLOGIA

AMALIA MARTINEZ MORENO

CODIGO: 35220542
JOSE LUIS SABOGAL PRIETO
CODIGO: 80756972

TUTOR
GLAEHTER YHON FLOREZ

UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA UNAD

ESCUELA DE CIENCIAS BASICAS E INGENIERIA
PROGRAMA DE INGENIERIA DE ALIMENTOS
CEAD JAG BOGOTA
ABRIL 2011

PRACTICA 1
ELECTROFORESIS DE PROTENAS EN CONDICIONES DESNATURALIZANTES
(SDS-PAGE)

INTRODUCCIN
Esta prctica se realiz con el fin de separar las protenas de E-coli para identificar su
tamao molecular y propiedades de carga, se utilizo el mtodo SDS- PAGE aunque como
no es posible estimar el peso molecular de una protena que tenga ms de una cadena
polipectdica, pero si se pueden separar y purificar pequeas muestras de protena y
determinar la secuencia parcial de aminocidos.
Con el mtodo de SDS- PAGE solo se pueden estimar los pesos moleculares de una
protena comparndolos con pesos moleculares de otras ya conocidas llamados
marcadores de pesos molecular.

OBJETIVOS

Conocer la tcnica de electroforesis de protenas en geles SDS-PAGE

Separar diversas protenas mediante electroforesis desnaturalizante en
geles de poliacrilamida.
Determinar el peso molecular de las protenas en estudio
Analizar los resultados obtenidos.

MARCO TERICO
La electroforesis es una tcnica de separacin de molculas cargadas por migracin en
un campo elctrico. Las molculas se separan en funcin de su carga elctrica,
desplazndose al electrodo de carga contraria y a mayor velocidad cuanto mayor es la
carga de la molcula.
Cada molcula se desplaza en el campo elctrico alcanzando una velocidad constante.
En el estado estacionario, la fuerza impulsora (fuerza del campo elctrico) se equilibra con
la resistencia al avance (fuerza de friccin hidrodinmica) en el medio en que se desplaza.

Se define la movilidad electrofortica como la velocidad de desplazamiento por unidad de

campo elctrico. En unas condiciones determinadas de electroforesis, la diferente
movilidad de cada molcula define su comportamiento y separacin en el espacio.
Diferentes molculas tendrn diferente movilidad electrofortica en un medio determinado.

Hay tres tipos de electroforesis:

De frente mvil.
Zonal.
Continua.

Procedimiento de separacin de protenas basada en la carga elctrica

La separacin de protenas basada en su carga elctrica depende de sus
propiedades acido-bsicas, las cuales se hallan determinadas por el nmero y los
tipos de los grupos R ionizables de sus cadenas polipeptdicas. Debido a que las
protenas difieren en su composicin de aminocidos y secuencia, cada protena
posee propiedades cido-bsicas caractersticas. Los principios implicados en la
separacin electrofortica de las protenas son mejor comprendidos si se
considera la curva de valoracin cido-bsica de una protena globular de
contenido aminocido conocido.
La mayor parte de las protenas globulares poseen puntos isoelctricos (no hay
desplazamiento de la protena) situados entre un pH de 4,5 y 6,5. Si el pH de una
protena se halla por encima del punto isoelctrico la protena posee una carga
negativa neta y se desplazar hacia el nodo (+). Su carga negativa aumenta en
magnitud a medida que el pH aumenta; contrariamente a un pH por debajo del
punto isoelctrico la protena poseer carga positiva neta y se desplazar hacia el
ctodo (-). En conclusin el conocimiento de las propiedades cido-bsicas de una
protena determinada hace posible predecir su comportamiento en un campo
elctrico.
Electroforesis de zona

En la electroforesis de zona los componentes proteicos se separan en diferentes

zonas, en las cuales la composicin y cantidad de protenas existentes en cada
una de las zonas separadas se determina por la aplicacin de un colorante que
tie a las protenas. La electroforesis de zona puede separar una mezcla de
protenas basndose en la carga elctrica y el tamao molecular.

La electroforesis en gel de poliacrilamida puede aislar grandes cantidades de

protenas purificadas. El tamao del poro del gel de acrilamida, se puede ajustar
para optimizar la separacin de la muestra de inters, geles con un porcentaje alto
de acrilamida (10 a 15 %T), son ptimos para separar protenas de pequeo
tamao (menores de 50 KDa), geles de porcentajes menores (< 10%T), son los
indicados para separar protenas mayores
Con la electroforesis en gel de poliacrilamida SDS, que es una variacin de la
electroforesis de zona, se puede disociar en protena oligomrica en sus
subunidades y determinar sus pesos moleculares, este mtodo sirve tambin para
determinar el peso molecular de protenas de una sola cadena.
La protena se trata con el detergente dodecil sulfato de sodio (SDS), que disocia
la protena en subunidades y despliega por completo cada cadena polipeptdica
formando un complejo polipptido-SDS cilndrico y largo. En este complejo la
cadena polipeptdica se halla cubierta por una capa de molculas de SDS, de tal
manera que sus cadenas hidrocarbonadas se hallan ntimamente asociadas por
fuerzas hidrofbicas a la cadena polipeptdica, y los grupos sulfato cargados que
posee el detergente se hallan expuestos al medio acuoso. Tales complejos
contienen una relacin constante de SDS a protena y difieren solo en masa.
Cuando una protena de cadena nica tratada con SDS es sometida a
electroforesis en gel de tamiz molecular (poliacrilamida), su velocidad de
emigracin la determina principalmente la masa de la partcula SDS-polipptido
segn el principio de exclusin molecular, lo que determina el peso molecular de
las protenas. El campo elctrico slo suministra la fuerza impulsora para el
tamizado molecular. Para calibrar un sistema de gel se hacen circular protenas de
peso molecular conocido que actan como marcadores con el objeto de efectuar
la comparacin.
El tratamiento de muestras con agentes desnaturalizantes (SDS), provoca la
desnaturalizacin de las protenas, perdida de la estructura secundaria y la
disociacin de las subunidades. Las protenas quedan cargadas negativamente y
migran del polo negativo (ctodo) al positivo (nodo) durante la electroforesis.
Las protenas separadas mediante SDS-PAGE, pueden ser visualizadas en el gel
mediante diversos mtodos de tincin: fluorescencia, plata y azul comassie,
siendo el ltimo el ms utilizado. (Lehninger, 2 Edicin).

Metodologa
Adicionar las soluciones A, B, SDS y agua en un vial de 10 ml para el gel
separador.

Adicionar el persulfato de amonio y TEMED, mezclar suavemente el vial, ya

que una excesiva aireacin pude interferir con la polimerizacin

Introducir la solucin en el interior del set de vidrios usando una micropipeta

permitiendo que esta descienda a lo largo del espaciador sin formar burbujas

Cuando una apropiada cantidad de la solucin del gel separador ha sido

adicionada (alrededor de 1.5 cm por debajo de la parte superior del vidrio 0.5
cm por debajo del nivel del peine) suavemente adicionar 1.5 ml de agua para
mantener la superficie del gel plana.

Permita que el gel polimerice. Cuando el gel ha polimerizado, aparece una

interfase entre el gel separador y el agua

Adicionar las soluciones A, C, SDS y agua en un vial de 5 ml para el gel

concentrador.

Adicionar el persulfato de amonio y TEMED, mezclar suavemente el vial, ya que

una excesiva aireacin pude interferir con la polimerizacin.

Introducir la solucin sobre el gel separador hasta llenar el espacio libre y colocar
el respectivo peine de 10 pozos, asegurando de no atrapar burbujas en los
dientes de peine y permita que el gel polimerice y remueva el peine con cuidado.

Retirar el gel del sistema de fijacin y colocarlo en el interior de la cmara para

ensamblarlo, asegurando las puertas en el compartimiento y colocar el interior
de la cmara en su respectivo tanque.

Adicionar 400 ml de buffer de electroforesis en el interior y exterior de la cmara,

permitiendo humedecer los pozos, los cuales deben ser purgados con una micro
pipeta de 1000 l para evitar excesos o residuos de la polimerizacin.

Preparar las muestras en tubos eppendorf. Mezclar cada muestras de protenas

con el respectivo buffer de carga 5X (i.e 20 l de muestra + 5 l de buffer carga)
para alcanzar una dilucin (1:5) del buffer. El volumen de muestra puede ser de 5
a 20 l.

1
1
En la electroforesis SDS-PAGE las muestras deben colocadas en bao a ebullicin
(92 C) por 3 min., para lograr una completa desnaturalizacin de las protenas
por la accin del agente reductor 2-mercaptoetanol. Y centrifugar por 30 seg
para homogenizar.

En la electroforesis nativa-PAGE las muestras no se someten a un

calentamiento, ya que las protenas de inters pueden perder su actividad
enzimtica.
Introducidas cada una de las muestras en los respectivos pozos, teniendo
cuidado de no introducir burbujas, ya que pueden contaminar los pozo vecinos.

En la electroforesis nativa-PAGE las muestras no se someten a un

calentamiento, ya que las protenas de inters pueden perder su actividad
enzimtica y introducidas cada una de las muestras en los respectivos pozos,
teniendo cuidado de no introducir burbujas, ya que pueden contaminar los
pozo vecinos.

Verificar que el frente de corrida (azul de Bromofenol) comience a descender

hacia el nodo y Detener la electroforesis cuando el frente de corrido alance la
parte inferior del gel separador.

Apagar la fuente de poder y desconectar los electrodos para retirar el gel y

continuar con el proceso de teido

TEIDO CON AZUL DE COOMASSIE R-250 DIAGRAMA DE FLUJO

Utilizar guantes durante todo el procedimiento para evitar manchar el gel con
los dedos.

Recoger el gel y colocarlo en un contenedor plstico o de vidrio.Enjuagar el gel

con agua destilada, 3 veces.

1.
2. Enjuagar el gel con agua destilada, 3 veces.

Adicionar una pequea cantidad de la solucin de teido (20 ml es suficiente).

Agitar suavemente el gel por 1015 min en un shaker. Cubrir el contenedor con
vinipel durante el teido y desteido Y enjuagar el gel con agua destilada, 3
veces

Adicionar la solucin de desteido (cerca de 50 ml) hasta que las bandas

aparezcan Y Para desteir completamente el gel, cambiar la solucin de
desteido y agitar toda la noche.

Sumergir el gel en la solucin de conservacin por 30-60 min.

Sumergir dos hojas (15x15 cm) de papel celofn en agua para hidratarlo y
colocar el gel entre las dos hojas. Se puede utilizar un vidrio (14x12 cm) para fijar
el celofn en sus extremos, los cuales deben ser sujetados con dos pinzas.

Finalmente se deja secar el gel a temperatura ambiente en una incubadora (37

C) por 2-4 horas. Antes de retirar el gel verificar que est completamente seca
la superficie del gel. Luego cortarlo y almacenarlo.

RESULTADOS

1. Determine el peso molecular en KDa, de la enzima mostrada en la figura 1.

Inulin fructotransferasa

Figura 1. Electroforesis correspondiente a la purificacin de la enzima

inulinfructotransferasa, de Arthrobacterureafaciens. Los marcadores de peso
molecular estn dados en kilo daltons (Kda).
M: marcadores de pesos
moleculares, 1: muestra patron, 2: muestra de precipitacin con sulfato de amonio.
Tomado de: Kelleyt R. L. 1986. Journal Of Bacteriology, Apr. P. 269-274 166, No.
1

CLCULO DE RESULTADOS
Marcadores de peso molecular (KDa)
150
100
75
50
35
25
15

Log (KDa)
2,1761
2,0000
1,8751
1,6990
1,5441
1,3979
1,1761

Distancia de los marcadores (cm)

1,4
1,8
2.1
2,9
3,6
4,6
6,2

Ecuacin de la pendiente: Y = - 0,162 X + 2,343

Y = Logaritmo de KDa
PM = Antilogaritmo de Y

1 Muestra patrn
(X)
3,4
5,0

2 Muestra de precipitacin con

(NH4)SO
(X)

1,8
2,4
3,4

Y = - 0,162 X + 2,343
1,7922
1,5330
2,0514
1,9542
1,7922

Peso Molecular
(KDa)
61,9726
34,1129
112,5641
89,9912
61,9726

ANLISIS DE RESULTADOS
Para los pesos molecular de la enzima inulinfructotransferasa, de 112,5641 y
89,9912 KDa, se puede observar que el pH de estas protenas se encuentra por
debajo del punto isoelctrico por lo cual estas poseen carga positiva neta ya que
se desplazaron muy poco mantenindose cerca del ctodo (-); por consiguiente
poseen un alto peso molecular comparado con la protena marcador, lo cual indica
que poseen cadenas largas de poli pptidos.
Las dems molculas presentaron menor peso molecular y poseen cadenas mas
cortas de poli pptidos y se desplazaron un poco mas hacia el nodo (+), por lo
cual poseen un pH mas cercano al punto isoelctrico.

CONCLUSIONES

Aunque no se pudo realizar con xito la tcnica de electroforesis de

protenas en geles SDS-PAGE, con el ejemplo enviado por el tutor se pudo
realizar una lectura clara y comparativa de la migracin de la enzima
inulinfructotransferasa.
Mediante la
tcnica de electroforesis desnaturalizante en geles de
poliacrilamida se logran separar las muestras de protenas.
Se determinaron los
pesos
moleculares de la enzima
inulinfructotransferasa a partir de los pesos moleculares del marcador,
como tambin su cercana al punto isoelctrico.

PRACTICA 2
CINTICA DE CRECIMIENTO MICROBIANO

INTRODUCCION

Mediante la experimentacin con diferentes sustratos, como medios de cultivo se

determinarn el crecimiento de la E-coli, y se observar cul de estos medios es el
ms adecuado para su adaptacin y crecimiento equilibrado.
Con un crecimiento equilibrado se puede medir la velocidad de crecimiento de un
cultivo, como tambin el de todos los componentes de la poblacin, esta velocidad
de crecimiento en un tiempo dado es proporcional al nmero o masa de la bacteria
E-coli, presente en este tiempo, finalmente la medida de esta masa se determinara
por medidas de absorbancia para cada uno de los cultivos realizados.

MARCO TERICO

El crecimiento microbiano se puede considerar como un conjunto de reacciones

qumicas en cadena, que conducen en la sntesis de los constituyentes de la
biomasa microbiana obtenida al final de la operacin. Globalmente, el proceso
obedece al principio de la conservacin de la materia.
Cuando se introduce un microorganismo en un medio de cultivo que le conviene,
desarrolla una actividad en relacin a su composicin y las condiciones
ambientales.
El microbio se reproduce, resulta un aumento de la concentracin en biomasa
microbiana, la biosntesis de los constituyentes celulares se hace a partir de los
compuestos del medio de cultivo.
La cintica describe las velocidades a la cual las reacciones qumicas y
bioqumicas se desarrollan en diferentes condiciones y constituye una de las
operaciones ms utilizadas por la ingeniera alimentaria y la biotecnologa, por lo
tanto, es necesario conocer los diferentes mecanismos de crecimiento, as como,
la forma de cuantificacin de los mismos, sus formas de aplicacin, las ventajas y

desventajas de los diferentes mtodos, y sobre todo el monto econmico de cada

uno de ellos.
Para determinar la biomasa microbiana se utiliz el mtodo de medicin ptica.
Esta interesante tcnica se basa en el hecho de que la densidad ptica de
suspensin es proporcional a la masa en las partculas suspendidas. As se mide
la absorcin luminosa generalmente a 600nm o 700nm, de la suspensin
microbiana y por comparacin con una escala de referencia se deduce la
concentracin en biomasa. Las suspensiones de organismos filamentosos no son
apropiadas a esta tcnica. Sin embargo se puede homogenizar la muestra en
condiciones estandarizadas antes de hacer la medicin.
Para medir la curva de crecimiento se dispone de una tcnica de evaluacin
cualitativa y cuantitativa de una poblacin microbiana. Para ello se efecta un
cultivo de tipo clsico en el cual despus de sembrar se observa el crecimiento
hasta el agotamiento del medio, manteniendo constantes las condiciones
exteriores en particular el de la temperatura cuidando que sean favorables al
desarrollo.
El estudio se basa en seguir en funcin del tiempo la evolucin de X concentracin
celular o la concentracin de biomasa, segn el tipo de microorganismo y el tipo
de mtodo seleccionado para seguir el fenmeno. En todos los casos se
desenvuelve de la misma forma comportndose las diversas fases como son la de
latencia que se presenta despus de la siembra del microorganismo y es el
periodo de adaptacin, en el curso en donde la clula sintetiza, en particular, las
enzimas que le son necesarias para metabolizar el sustrato que existe, en esta
fase no hay reproduccin.
El crecimiento de poblaciones microbianas tambin puede ir acompaadas por la
formacin de productos finales txicos que causan la inhibicin del crecimiento.
Un ejemplo es la produccin de etanol por levaduras y bacterias.
Los rendimientos de biomasa y de producto, son parmetros muy importantes, ya
que representan la eficacia de la conversin del substrato en biomasa y
productos. Se definen como la biomasa o producto formado por la unidad de masa
de substrato consumido. (Alan, 1999)

METODOLOGIA
CINETICA Y CRECIMIENTO MICROBIANO

Tomamos una gradilla con 6 tubos de ensayo y

los marcamos desde el 0 hasta el 6.
Agitamos y tomamos en un tubo de ensayo, una
alcuota de 2 ml en condiciones aspticas
(utilizando un mechero) de cada medio de cultivo,
el cual se utilizar como blanco (B).

Tomamos el inoculo de E-coli ya Preparado lo

agitamos y adicionamos 1ml al tubo 0 junto con el
extracto maltosa al 5% y agitamos.

Llevamos el tubo al refrigerador a 37 0C y tomamos

el tiempo 0.

Repetimos el procedimiento anterior con la toma

de muestra en tubos de ensayo en los tiempos:
9:30, 10:30, 11:30, 1:00, 2:00, 3:00, 4:00, min,
cada tubo debidamente marcado con su respectivo
tiempo almacenarlo hasta el el crecimiento final.

Luego sacamos todos los 6 tubos del refrigerador

y tomamos la absorbancia a cada uno de ellos

Realizacin de la grafica

RESULTADOS
Ecuacin para despejar la biomasa
Y= 0,19X + 0,005
Y= Abs (600nm)

X= [biomasa]

GRAFICO DE E COLI EN VARIOS SUSTRATOS TIEMPO EN (h) VS BIOMASA EN (MG)

CINTICA Y CRECIMIENTO MICROBIANO

Grafica absorbencia vs tiempo en el extracto de levadura

Grafica absorbencia vs tiempo en sacarosa

Grafica absorbencia vs tiempo en glucosa

Grafica absorbencia vs tiempo en maltosa

Grafica absorbencia vs tiempo en fructosa

Grafica absorbencia vs tiempo en galactosa

Grafica absorbencia vs tiempo en lactosa

ANALISIS DE RESULTADOS
Se muestra en los grficos que en de todos los sustratos la E-Coli tuvo la fase de
adaptacin, de crecimiento y la fase estacionaria. Aunque se noto un mejor
crecimiento en la extracto de levadura.
En el extracto de levadura es una fuente rica en nitrgeno, protenas y
aminocidos libres, adems que es una rica contiene vitaminas especialmente las
del complejo B adecuada para el crecimiento bacteriano.
Aunque el extracto de levadura sea buen medio de cultivo, los microorganismos
necesitan de fuentes de carbono para la sntesis de molculas orgnicas y para
la obtencin de energa, una fuente de nitrgeno para la sntesis de aminocidos y
cidos nuclecos, algunos elementos esenciales como el azufre y el fosforo as
como otros nutrientes incluyendo minerales y vitaminas.
En las curvas de crecimiento que se obtuvo en la prctica en las que mejor se ve
reflejada la cintica microbiana es la glucosa, levadura y galactosa, en donde se
puede visualizar la fase de adaptacin, la fase de arranque en donde se ve el
inicio del crecimiento bacteriano que comienza con la reproduccin celular
aumentando la concentracin de biomasa; la fase logartmica cuando la rapidez de
la reproduccin llega a su valor mximo hasta que la rapidez sea constante. Se
puede ver como en el tiempo se va aumentando la poblacin. En las graficas
tambin se alcanza a percibir la fase de disminucin de velocidad lo que indica
que se llego al empobrecimiento del medio de cultivo debido a la desaparicin de

uno o varios compuestos necesarios para el crecimiento, aunque no se indica bien

la fase de muerte. (Scriban, 1985).

CONCLUSIONES

La e- coli tuvo un buen comportamiento de crecimiento en la sacarosa al igual que

en los sustratos de levadura, lactosa y glucosa, se pudo comparar los resultados
de crecimiento en los diferentes tipos de sustratos, en donde indica que en donde
menor hubo crecimiento fue en la galactosa.
Mediante las graficas de cintica de crecimiento se ve que la velocidad de
crecimiento es proporcional a la concentracin de clulas ya presentes. Durante el
crecimiento exponencial el peso seco celular aumenta. Se deduce que la
densidad celular despus del tiempo se relaciona con la densidad presente
originalmente.
Se comprueba como los factores principalmente que afectan la rapidez de
crecimiento son la concentracin de substrato, la temperatura y el pH por el
producto. (Alan, 1999)
El ciclo de crecimiento debi ser mejor en la glucosa debido a ser gran fuente de
carbono y energa pero se presento en la sacarosa el cual es un azcar
disacrido compuesto por fructosa y glucosa, el crecimiento mayor en este azcar
pudo haberse dado debido a que la sacarosa quizs estuviera hidrolizada y
hubiera mayor cantidad de glucosa que azcar compuesto por presencia de algn
acido.

ACTIVIDAD ENZIMATICA E INVOLIZACION DE LA INVERTASA

INTRODUCCIN

Mediante esta prctica se puede determinar la actividad enzimtica de la invertasa

que es una enzima con capacidad de hidrolizar la sacarosa en fructosa y glucosa,
esta enzima es proveniente de varios tipos de microorganismos. A nivel industrial
el Aspergillus Niger es el microorganismo ms utilizado para la produccin de
invertasa.
El propsito de esta prctica es el estudio del funcionamiento de la enzima
glucosa oxidasa y la relacin que existe entre la velocidad de la reaccin
enzimtica en diferentes concentraciones de sustrato utilizando 1ml de enzima,
por lo que se debe tener en cuenta que la cantidad de enzima debe ser pequea
en comparacin a la concentracin de sustrato para que la concentracin de
enzima sustrato no modifique la concentracin del sustrato.

OBJETIVOS

Determinar la actividad enzimtica de la invertasa

Inmovilizacin de la enzima libre en alginato de sodio por atrapamiento

MARCO TERICO

La palabra enzima se deriva del griego que significa (en las levaduras) y fue usada
por Kuhne en 1872. Sin embrago, el primer informe publicado acerca de la
capacidad de los extractos celulares (malta) para llevar a cabo una reaccin
caracterstica de las clulas vivas (la hidrlisis de almidn de glucosa) fue escrito
inicialmente en 1833 por Payen y Persoz. Ms tarde, Buchner (1897) demostr la
capacidad de los extractos de levadura para catalizar la conversin del azcar a
alcohol, mientras que Emil Fischer (1894) demostr la especificidad de las
enzimas para su sustrato. Subsecuentemente, Summer (1926) cristalizo la primera
enzima la ureasa la hidroliza la urea a CO2 y NH3 y mostro que las enzimas eran

protenas. Fue hasta la dcada de los aos 70 que se conoci la composicin

qumica precisa de las enzimas mediante la secuencia de la ribonucleasa, junto
con los estudios de conformacin tridimensional por cristalografa de rayos X.
Estos trabajos permitieron que se postulara el mecanismo de accin enzimtica,
junto con las proposiciones para la forma en que esta se regula.
Por ltimo en 1969 se sintetizo qumicamente la primera enzima (ribonucleasa), a
partir de los aminocidos precursores y, aunque su actividad y pureza eran
escasas se demostr que las enzimas no son cualitativamente distintas a los
catalizadores no biolgicos. (Alan, 1999)
Uno de los modelos ms tiles en la investigacin sistemtica de las velocidades
enzimticas, fue propuesto por Leonor Michaelis y Maud Menten en 1913. El
concepto del complejo enzimas- sustrato, enunciado por primera vez por Victor
Henri en 1903 es fundamental para la cintica de Michaelis Mentel. Cuando se
une el sustrato S en el sitio activo de la enzima, se forma un complejo
intermediario (ES). Durante el estado de transicin el sustrato se convierte en
producto. Tras un lapso breve, el producto se disocia de la enzima. (Mckee, 2009)
Hiptesis de Michaelis Menten: Al establecer la ecuacin de la velocidad,
Michaelis y Menten toman como principio de que la velocidad de transformacin
del complejo ES en E+P es muy lenta, con relacin a la velocidad de la ruptura del
complejo que vuelve a dar E+S. Esta hiptesis significa que K3 <k2 y que E y ES
estn en equilibrio.
Los estudios de cintica enzimtica corresponden siempre a esta parte lineal de la
curva lo que implica el trabajar a velocidades inciales. En estas condiciones al
principio de la reaccin la concentracin en producto es muy dbil; puede
despreciarse as como la reaccin inversa de la transformacin del producto en
sustrato. (Scriban, 1985)

Metodologa
3. ACTIVIDAD ENZIMTICA

En una gradilla colocar 7 tubos de ensayo

En un vaso de precipitados de 50 ml, adicionar

10 ml de buffer acetatos al 20%, pH 4.6 y 5ml de
solucin de glucosa

Atemperar en bao termostatado a 40 C durante 5

min.

Adicionar 2 ml de la solucin de la enzima invertasa, inmediatamente

cronometrar el tiempo tomando un alcuota de 10 ml con una micro pipeta y
depositarla en el tubo de ensayo marcado con 0, luego sumergir este tubo en
un vaso de precipitados en ebullicin por 5 min para inactivar la enzima.

Repetir la toma de muestra en los tubos marcados con 6, 4, 2, 1, 0.1,

0.01 e inactivar, en los tiempos 0, 2, 5, 10, 20 y 60 minutos sin
interrupcin.

Medir las Observancias de cada tubo con sus

respectivos tiempos.

Clculos y Resultados
[Glucosa]=

0,1mg / ml
xAbsorbancia
0,320

G + H2O

Acido gluconico + H2O2

1 mol de glucosa produce una mol de acido glucnico

Ecuacin de biomasa
Y= 0,19x + 0,005

y= abs (600 mn)

x= [biomasa mg/ml]

RESULTADOS
ACTIVIDAD ENZIMATICA
0,025

TIEMPO
(minutos)

0
0,08
0,15
0,22
0,26
0,38
0,47
1
1,13
1,31
1,4
1,55
2,15
2,35

ABSORVACIA

0
0,0002
0,005
0,007
0,01
0,015
0,02
0,025
0,03
0,036
0,04
0,045
0,05
0,054

[GLUCOSA]
mg/ml

0
0,0001
0,0016
0,0022
0,0031
0,0047
0,0063
0,0078
0,0094
0,0113
0,0125
0,0141
0,0156
0,0169

MOLES DE
GLUCOSA

0
0
0,000009
0,000012
0,000017
0,000026
0,000035
0,000043
0,000052
0,000062
0,000069
0,000078
0,000087
0,000094

MOLES DE
ACIDO
GLUCONICO

MASA DE
ACIDO
GLUCONICO
mg /min

0
0
0,000009
0,000012
0,000017
0,000026
0,000035
0,000043
0,000052
0,000062
0,000069
0,000078
0,000087
0,000094

0
0,0001
0,0017
0,0024
0,0034
0,0051
0,0068
0,0085
0,0102
0,0123
0,0136
0,0153
0,017
0,0184

Grafica: Actividad Enzimtica de la enzima glucosa oxidasa en sustrato al [0,25].

m= pendiente de velocidad enzimtica en los primeros momentos

m

0.0034 0.0017
0.01545 mg / ml / mn
0.26 0.15

ACTIVIDAD ENZIMATICA
0,05

TIEMPO
(minutos)

0
0,04
0,11
0,18
0,27
0,38
0,53
1,08
1,22
1,33
1,57
2,13
2,24
2,32
2,53
3,09
3,2

ABSORVACIA

0
0,003
0,008
0,015
0,023
0,035
0,047
0,059
0,07
0,076
0,084
0,09
0,1
0,106
0,11
0,12
0,13

[GLUCOSA]
mg/ml

0
0,0009
0,0025
0,0047
0,0072
0,0109
0,0147
0,0184
0,0219
0,0238
0,0263
0,0281
0,0313
0,0331
0,0344
0,0375
0,0406

MOLES DE
GLUCOSA

0
0,000005
0,000014
0,000026
0,00004
0,000061
0,000082
0,000102
0,000121
0,000132
0,000146
0,000156
0,000174
0,000184
0,000191
0,000208
0,000226

MOLES DE
ACIDO
GLUCONICO

0
0,000005
0,000014
0,000026
0,00004
0,000061
0,000082
0,000102
0,000121
0,000132
0,000146
0,000156
0,000174
0,000184
0,000191
0,000208
0,000226

MASA DE
ACIDO
GLUCONICO
mg /min

0
0,001
0,0027
0,0051
0,0078
0,0119
0,016
0,0201
0,0238
0,0259
0,0286
0,0306
0,034
0,0361
0,0374
0,0408
0,0442

Grafica: Actividad Enzimtica de la enzima glucosa oxidasa en sustrato al [0,05].

m= pendiente de velocidad enzimtica en los primeros momentos

0.0119 0.0027
0.0340 mg / ml / mn
0.38 0.11

ACTIVIDAD ENZIMATICA
2

TIEMPO
(minutos)

0
0,2
0,4
0,5
0,7
0,9
0,11
0,13
0,17
0,18
0,21
0,23
0,25
0,28
0,33
0,36
0,41
0,44
0,48
0,55
1,06
1,13
1,19
1,33
1,42

ABSORVACIA

0
0,021
0,063
0,1
0,182
0,228
0,296
0,368
0,419
0,466
0,515
0,576
0,662
0,733
0,804
0,941
1,001
1,105
1,203
1,309
1,406
1,464
1,508
1,531
1,531

[GLUCOSA]
mg/ml

0
0,0066
0,0197
0,0313
0,0569
0,0713
0,0925
0,1150
0,1309
0,1456
0,1609
0,1800
0,2069
0,2291
0,2513
0,2941
0,3128
0,3453
0,3759
0,4091
0,4394
0,4575
0,4713
0,4784
0,4784

MOLES DE
GLUCOSA

0
0,000036
0,000109
0,000174
0,000316
0,000396
0,000514
0,000639
0,000727
0,000809
0,000894
0,000999
0,001149
0,001272
0,001395
0,001633
0,001737
0,001917
0,002087
0,002271
0,002440
0,002540
0,002617
0,002657
0,002657

MOLES DE
ACIDO
GLUCONICO

0
0,000036
0,000109
0,000174
0,000316
0,000396
0,000514
0,000639
0,000727
0,000809
0,000894
0,000999
0,001149
0,001272
0,001395
0,001633
0,001737
0,001917
0,002087
0,002271
0,002440
0,002540
0,002617
0,002657
0,002657

MASA DE
ACIDO
GLUCONICO
mg /min

0
0,0071
0,0214
0,0340
0,0619
0,0776
0,1007
0,1253
0,1426
0,1586
0,1753
0,1961
0,2253
0,2495
0,2737
0,3203
0,3407
0,3761
0,4095
0,4455
0,4786
0,4983
0,5133
0,5211
0,5211

Grafica: Actividad Enzimtica de la enzima glucosa oxidasa en sustrato al [2.00].

m= pendiente de velocidad enzimtica en los primeros momentos

m

0.0619 0.0214
0.81 mg / ml / mn
0.09 0.04

ACTIVIDAD ENZIMATICA
4

TIEMPO
(minutos)

0
0,02
0,04
0,05
0,07
0,09
0,11
0,13
0,17
0,18
0,21
0,23
0,25
0,28
0,33
0,36
0,41
0,44
0,48
0,55
1,06
1,13
1,19
1,33
1,42

ABSORVACIA

0
0,026
0,063
0,1
0,14
0,182
0,228
0,296
0,368
0,419
0,46
0,515
0,574
0,662
0,733
0,804
0,914
1,001
1,105
1,203
1,309
1,406
1,464
1,568
1,531

[GLUCOSA]
mg/ml

0
0,0081
0,0197
0,0313
0,0438
0,0569
0,0713
0,0925
0,1150
0,1309
0,1438
0,1609
0,1794
0,2069
0,2291
0,2513
0,2856
0,3128
0,3453
0,3759
0,4091
0,4394
0,4575
0,4900
0,4784

MOLES DE
GLUCOSA

0
0,000045
0,000109
0,000174
0,000243
0,000316
0,000396
0,000514
0,000639
0,000727
0,000798
0,000894
0,000996
0,001149
0,001272
0,001395
0,001586
0,001737
0,001917
0,002087
0,002271
0,002440
0,002540
0,002721
0,002657

MOLES DE
ACIDO
GLUCONICO

0
0,000045
0,000109
0,000174
0,000243
0,000316
0,000396
0,000514
0,000639
0,000727
0,000798
0,000894
0,000996
0,001149
0,001272
0,001395
0,001586
0,001737
0,001917
0,002087
0,002271
0,002440
0,002540
0,002721
0,002657

MASA DE
ACIDO
GLUCONICO
mg /min

0
0,0088
0,0214
0,0340
0,0477
0,0619
0,0776
0,1007
0,1253
0,1426
0,1566
0,1753
0,1954
0,2253
0,2495
0,2737
0,3111
0,3407
0,3761
0,4095
0,4455
0,4786
0,4983
0,5337
0,5211

Grafica: Actividad Enzimtica de la enzima glucosa oxidasa en sustrato al [4.00].

m= pendiente de velocidad enzimtica en los primeros momentos

m

0.0477 0.0214
0.876 mg / ml / mn
0.07 0.04

ANLISIS DE RESULTADOS
Revisando la teora de Michaelis y Menten quienes propusieron la teora
general: y comparando los resultados obtenidos en las prcticas se pudo
determinar que a bajas concentraciones de sustrato, la velocidad de la
reaccin es proporcional a la concentracin de sustrato.
Observando los resultados de la aplicacin de la ecuacin para determinar la
velocidad de la actividad enzimtica en los primeros tiempos y la grafica de los
mismos, en las primeras concentraciones de glucosa a medida que la
concentracin de glucosa aumenta, la rapidez de la reaccin disminuye.
A concentraciones aun ms altas [2-4] en los primeros instantes la rapidez de
la reaccin vara y no es constante, es independiente de la concentracin de
glucosa.

La mxima fiabilidad en la determinacin de la actividad de una enzima la

suministra el valor de velocidad inicial o velocidad durante el tramo inicial de
progreso lineal de la reaccin (Scriban, 1985). Se tom la actividad enzimtica
en los primeros instantes, ya que la enzima est en la forma enzima-sustrato.
Cuando la velocidad de la reaccin alcanza la mitad de la velocidad mxima,

indicando la cantidad de sustrato (Km), el cual puede ser asimilado a la inversa

de la relacin de la glucosa oxidasa por la glucosa.
Se puede observar en las graficas la cada de la velocidad de reaccin que se
debe a la disminucin significativa de la concentracin de sustrato, aunque
tambin pudo haber influido otros factores como el aumento de la
concentracin de producto, cambios de pH, inactivacin de la enzima.
La actividad cataltica de la glucosa oxidasa se determino midiendo la
velocidad inicial de reaccin, que es la pendiente de la curva de progreso
(curva de producto formado sustrato transformado frente al tiempo) en el
tiempo cero como lo indican las graficas.
La disminucin del sustrato indica la liberacin de productos por la actividad de
la enzima y por ende una degradacin progresiva del sustrato (Alan, 1999).
Inicialmente, las reacciones transcurren linealmente en las [0,01-2-4]
pudindose tomar la pendiente de esta recta como velocidad inicial. A tiempos
ms largos, el progreso de la reaccin deja de ser lineal, debido al consumo de
producto por la enzima.

CONCLUSIONES
Mediante la prctica se determino que en las primeras concentraciones al
aumentar la concentracin la velocidad de la actividad enzimtica
disminuyo debido a que el tiempo de reaccin aument.
Se puede observar que en las [0,025- 0,05] el tiempo de reaccin del
sustrato enzima, al aumentar la concentracin de glucosa el tiempo de
reaccin disminuyo.

En [2-4] el tiempo de reaccin fue directamente proporcional a la

concentracin, ya que la cada de la velocidad de reaccin se obtuvo en
mayor tiempo a mayor concentracin de sustrato.

PRACTICA 3.
EXTRACCIN Y ELECTROFORESIS DEL ADN

INTRODUCCIN
Con el desarrollo de esta prctica se extraer el ADN de la bacteria E-coli, el cual
se pretende separar, cuantificar y analizara por medio de la electroforesis en
cubeta horizontal en gel de agarosa.
El termino electroforesis se usa para describir la migracin de una molcula o
partcula cargada bajo la influencia de un campo elctrico. Muchas molculas
como son aminocidos, pptidos, protenas, nucletidos, cidos nucledos, poseen
grupos ionizantes y existen en solucin como especies cargadas ya sea como
cationes o como aniones. Estas molculas inmersas en gel de agarosa y cargadas
se van a separar en funcin de su carga aplicando un voltaje a travs de
electrodos.
OBJETIVOS
Conocer la metodologa para extraer ADN de la E-coli.
Cuantificar el ADN extrado de la E-coli por medio de la tcnica de la
Electroforesis el gel de agarosa.
Determinar el peso molecular de las molculas del ADN extrado.
Analizar los resultados obtenidos.
MARCO TEORICO
Los cidos nucledos son macromolculas o polmeros formados por la repeticin
de monmeros llamados nucletidos, unidos por enlaces fosfodister: Formando
entre s cadenas largas de polinucletidos por lo cual estas molcula puede llegar
a tamaos gigantes, de millones de nucletidos.
Los nucletidos se clasifican en: ADN (cido desoxirribonuclico) y ARN (cido
ribonuclico), estos se diferencian por la pentosa (desoxirribosa y ribosa), las
bases nitrogenadas (purnica y pirimidnica), por la estructura o forma de sus
cadenas (cadena doble, monocatenaria, etc.) y por la masa molecular (la del ADN
es mayor que la del ARN).
El ADN esta conformado por dos cadenas polinucleotdicas unidas entre si, estas
cadenas pueden ser de forma lineal como el ADN de clulas eucariotas o puede

ser circular como el ADN de las clulas procariotas, el de las mitocondrial y

cloroplastos eucarioticos.
Las molculas del ADN portan la informacin para el desarrollo de las
caractersticas biolgicas de un individuo, como tambin la informacin para que
las clulas realicen sus funciones.
Segn sea la composicin del ADN, este se puede desnaturalizar o romper los
puentes de hidrgeno entre las bases, conformando ADN de cadena simple. El
ADN de algunos virus es monocatenario es decir esta formado por un solo
polinucletido, sin cadena complementaria.
El ADN contiene la informacin y el ARN expresa dicha informacin, pasando de
una secuencia lineal de nucletidos a una secuencia lineal de aminocidos en una
protena. Para expresar la informacin del ADN deben haber varias etapas para lo
cual existen varios tipos de ARN, como el ARN mensajero, el ARN de
transferencia y el ARN ribosmico.
Para extraer el ADN se requieren de varias etapas, primero se debe romper la
pared celular y la membrana plasmtica para acceder al ncleo de la clula, luego
se debe romper la membrana nuclear para que quede libre el ADN, finalmente se
debe proteger el ADN de enzimas que puedan degradarlo, para aislarlo de debe
hacer precipitar en alcohol.
La extraccin de ADN de una muestra celular se basa en el hecho de que los
iones de la solucin salina son atrados hacia las cargas negativas del ADN,
permitiendo su disolucin y posterior extraccin de la clula. Se empieza por lisar
(romper) las clulas mediante un detergente, en este caso SDS, centrifugar y
agregar una disolucin tampn (buffer TBE-5X) en la que se disuelve el ADN. En
ese momento, el tampn contiene ADN y todo un surtido de restos moleculares:
ARN, carbohidratos, protenas y otras sustancias en menor proporcin. Las
protenas asociadas al ADN, de gran longitud, se habrn fraccionado en cadenas
ms pequeas y separadas de l por accin del detergente, como tambin se han
desnaturalizado por accin del calor. Slo queda, por tanto, extraer el ADN de esa
mezcla de tampn y detergente, para lo cual se utiliza un alcohol (isopropanol).
La electroforesis en gel de agarosa (en cubetas horizontales), es la ms usada
para separar, identificar, purificar, analizar y caracterizar cidos nucledos. Este
gel se comporta como un tamiz molecular el cual permite separar molculas
cargadas en funcin de su tamao y forma, por lo general los cidos nucledos
migran desde el electrodo negativo hacia el positivo, ya que estas poseen carga
negativa en el esqueleto azcar-fosfto; las molculas de menor tamao migraran
mas rpido hacia el nodo (polo positivo) que las de mayor tamao.
Aplicando marcadores de peso molecular a la electroforesis, los cuales son
fragmentos de ADN de tamao conocido, se puede calcular el tamao aproximado
del ADN en estudio.

Los cidos nucledos separados en gel de agarosa, se pueden visualizar por

medio de tincin con colorantes fluorescentes, los cuales se pueden observar bajo
luz ultravioleta y con lo cual se puede evaluar su integridad y estimar su
concentracin mediante anlisis comparativo con patrones de concentracin
conocida.
Los colorantes fluorescentes actan mediante la insercin entre los pares de
bases que conforman el cido nucledo. El bromuro de etidio es ampliamente
utilizado para visualizacin del ADN y ARN, es altamente toxico y reactivo, con
propiedades mutagnicas, por lo cual se debe manipular con la debida proteccin
y precaucin.
Tomado de: Duina Posso Duque, Thaura Ghneim Herrera. 2008. Uso de
Marcadores Microsatlites para la Estimacin de Diversidad Gentica en Plantas.
Ediciones IVIC.

METODOLOGIA
EXTRACCIN Y ELECTROFORESIS DEL ADN

Centrifugar 4 muestras de E-coli de 213 ml c/u

a 6000 rpm por 5 min., para separar clulas y
obtener biomasa.

Lavar con solucin salina al 0.9% el precipitado obtenido o

pelet, resuspender y centrifugar de nuevo a 6000 rpm * 5
min. (Realizar esta operacin 3 veces ms).

En un tubo de ensayo tomar 5 ml de la pelet y agregar buffer

TBE-5X (1ml), diluido en agua destilada hasta completar 500
ml.

Romper las clulas con 500 micro litros al 20% de

detergente SDS, calentar en bao termostatado a 60C por
10 minutos.

Agregar 400 ml de Isopropanol sin agitar y

extraer con un gancho el ADN crudo.

Purificar el ADN crudo extrado agregndole

Isopropanol y centrifugndolo a 10.000 rpm * 5 min.

Cuantificar el ADN extrado por

ELECTROFORESIS

Preparar gel de agarosa al 0.8%, para 100ml: Tomar 0,8

ml de garosa y 100 ml de buffer TBE 0,5 X, calentar a
bao termostatado hasta dilucin completa.

Dejar enfriar hasta 37 C y agregar el bromuro de

etidio de alto metoxilo (con guantes), mezclar bien
evitando que se formen burbujas.

Agregar la solucin lentamente por un extremo de la

bandeja de corrida, retirando las burbujas que se
formen. Dejar polimerizar la agarosa y retirar el peine.

Para la corrida, llenar el tanque de la cmara de

electroforesis con buffer TBE 0,5 X hasta cubrir el gel.

A la muestra de ADN extrada, agregarle buffer de tincin

Tris borato EDTA que debe estar diluido, luego con una
micro pipeta agregar 20 micro litros de muestra en cada
pozo.

Conectar los electrodos de la cmara a la fuente de

poder a 8 voltios por hora para que corran las
muestras.

Para visualizar la separacin de las muestras en el gel, se

introduce en un transiluminador de luz ultravioleta (UV),
luego tomarle una fotografa a la placa para realizar el anlisis
del resultado.

RESULTADOS

(-) ctodo

(+) nodo

ANLISIS DE RESULTADOS
En esta imagen tomada de la electroforesis del ADN, bajo un transiluminador de
luz ultravioleta, se puede observar la migracin de las molculas de ADN de
menor peso molecular hacia el nodo y las de mayor peso molecular se mantienen
ms cerca al ctodo. Las bandas mas gruesas equivalen a mayor cantidad de
protena y las ms delgadas equivalen a menor cantidad de protena.
CONCLUSIONES
En la prctica de electroforesis de ADN no se pudo realizar en el laboratorio ya
que no se conto con los elementos suficientes para elaborarla.

PRACTICA 4
INMOVILIZACION ENZIMATICA

Justificacin
La utilizacin de la tcnica de inmovilizacin enzimtica es importante en el
campo de los alimentos porque proporcionan mejorar las condiciones
organolpticas de los mismos.
Objetivo
Describir las diferentes tcnicas de inmovilizacin enzimtica
Emplear la inmovilizacin enzimtica en alginato de sodio
atrapamiento

por

Marco terico
La inmovilizacin de enzimas es un proceso en el que se confina o localiza a la
enzima en una regin definida del espacio, para dar lugar a formas insolubles que
retienen su actividad cataltica y que pueden ser reutilizadas repetidamente.
Posteriormente esta definicin se ha ampliado a aquel proceso por el cual se
restringen, completa o parcialmente, los grados de libertad de movimiento de
enzimas, orgnulos, clulas, etc. por su unin a un soporte.
En general, los mtodos de inmovilizacin se suelen clasificar en dos grandes
categoras:
1) Retencin fsica
2) Unin qumica

Mtodos de inmovilizacin de enzimas por retencin fsica

Atrapamiento
El proceso de inmovilizacin se lleva a cabo mediante la suspensin de la enzima
en una solucin del monmero. Seguidamente se inicia la polimerizacin por un
cambio de temperatura o mediante la adicin de un reactivo qumico. El
atrapamiento, requiere poca cantidad de enzima para obtener derivados activos.
Como ventaja adicional, la enzima no sufre ninguna alteracin en su estructura.
De todas formas, el atrapamiento requiere un control riguroso de las condiciones
de polimerizacin, as como la comprobacin de que la naturaleza qumica del
proceso no altera los grupos reactivos de la protena.
Unin qumica
Se debe procurar que la inmovilizacin incremente la afinidad por el sustrato,
disminuya la inhibicin, ampli el intervalo de pH ptimo y reduzca las posibles
contaminaciones microbianas. Adems el soporte debe tener resistencia mecnica
adecuada a las condiciones de operacin del reactor y ser fcilmente separable
del medio lquido para que pueda ser reutilizado
Unin covalente
La metodologa de la unin covalente se basa en la activacin de grupos qumicos
del soporte para que reaccionen con nucle filos de las protenas De entre los 20
aminocidos diferentes que se encuentran en la estructura de las enzimas, los
ms empleados para la formacin de enlaces con el soporte son principalmente la
lisina, la cistena, la tirosina y la histidina, y en menor medida la metionina, el
triptfano, la arginina y el cido asprtico y glutmico. El resto de aminocidos,
debido a su carcter hidrfobo, no se encuentran expuestos hacia el exterior de la
superficie proteica, y no pueden intervenir en la unin covalente.
La inmovilizacin altera significativamente el comportamiento de las enzimas. En
primer lugar se producen cambios en su estabilidad. En segundo lugar, la enzima
inmovilizada es un sistema heterogneo en el cual todos los componentes que
intervienen en el proceso cataltico (pH, sustratos, productos, inhibidores,
cofactores, activadores, etc.) se encuentran en interface: en el medio de reaccin
y en la fase constituida por el soporte con la enzima.

Efectos en la actividad enzimtica

Tras una inmovilizacin, la actividad de la enzima puede disminuir e incluso
perderse por diversas razones. Si pierde totalmente la actividad enzimtica puede
ser debido a que:
1. la unin al soporte se produce de tal forma que el paso del sustrato al centro
activo est Impedido.
2. los grupos reactivos del soporte reaccionan con algn aminocido que forme
parte del centro activo o que sea esencial para la actividad cataltica de la enzima.
3. la inmovilizacin puede originar un cambio conformacional que da lugar a una
forma Inactiva.

Procedimiento

1. Preparar una solucin de 50 Ml de alginato de sodio al 3% ( p/v ) en

agua destilada, agitar lentamente hasta su disolucin, la cual
presentara una viscosidad alta.
2. Disolver el alginato, adicionar y mezclar 3 ml de solucin enzimtica
invertasa ( 0,025 % p/v en buffer de acetatos 0.1 M de pH 4,6
3. Preparar 250 ml de cloruro de calcio en agua destilada
4. Repartir la solucin de alginato- enzima en jeringas de 10 ml de
capacidad, gotear suavemente sobre la solucin de cloruro de calcio.
5. Con ayuda de un filtro de papel, separar y lavar las esferas formadas
con agua destilada.
6. Pesar 2 gramos de esferas y colocarlas en 50 ml de una solucin de
sacarosa al 10% p/v en agua destilada, incubar a 40C por 30
minutos. Antes de adicionar las esferas en la solucin de sacarosa,
tomar de esta, una alcuota de 2 ml como tiempo cero; al final de los
30 minutos, tomar otra alcuota de 2 ml y marcar como tiempo 30.
7. A las muestras tomadas determinantes concentracin de glucosa con
ayuda del kit enzimtico glucosa GOD- PAD
8. Un cambio de color rosado establece la produccin de glucosa
proveniente de la sacarosa, lo cual implica actividad hidrolitica de la
invertasa inmovilizada.

DIAGRAMA DE FLUJO
INMOVILIZACION ENZIMATICA
Preparar una solucin de 50 ml de alginato de sodio al 3 % en agua
destilada agitando lentamente hasta su disolucin

Adicionar a la solucin 3 ml de enzima invertasa en solucin

buffer al 0,1 M con ph de 4,6

Preparar 250 ml de cloruro de calcio al 3 %

Tomar de la solucin alginato enzima y gotear suavemente sobre la

solucin de cloruro de calcio

Separar y lavar las esferas con agua destilada

Pasar 2 gramos de esferas a solucin de glucosa al 2 % de 25 ml

Determinar la concentracin de glucosa en las muestras formadas

con el kit enzimtico glucosa GOD PAD esto se logra si toma un
color rosado

RESULTADOS
ANALISIS DE RESULTADOS
-

La oxidasa se inmovilizo aplicando la tcnica de atrapamiento, usando un

polmero natural como lo es el alginato el cual se puede polimerizar a
temperaturas bajas (25C). Debido a que estas condiciones son muy
suaves el alginato es uno de los polmeros ms usados.

Se usa el alginato porque atrapa la enzima en partculas moldeadas de un

polmero en un modelo. Usndose el alginato en medio como el cloruro de
calcio.
Se realizo una emulsin de una solucin acuosa de la enzima en buffer de
acetatos 0.1 M de pH 4.6, el cual actu como un disolvente orgnico
inmiscible en agua para formar microgotas acuosas. Al agregar la solucin
de alginato a la emulsin agitada, se forma una membrana sobre la
superficie de las microgotas, las cuales se dispersaron en una fase acuosa.

CONCLUCION
La inmovilizacin enzimtica esta destinada a la perdida de actividad , o
para retener ciertas caractersticas de la enzima utilizada.
Donde la invertasa entra en un sistema heterogneo en el que sus
componentes intervienen en un proceso cataltico, es decir su ph, sustratos,
productos, inhibidores se encuentran en una interfase.
Por lo que su actividad enzimtica se afecta por efectos de tipo difusional es
decir su difusin de los sustratos hacia el centro activo de la enzima se
impide por resistencias de tipo externo e interno.

CUESTIONARIO BIOTECNOLOGIA

1. Explique la metodologa para la determinacin de la actividad enzimtica de las

siguientes protenas:
1.1. Glucosa Isomerasa.
Se realiza una curva de calibracin con diluciones de 1 * 10-4 a 1 * 10 _ 6
M obtenidas de una solucin madre de p- nitrofenol ( NO2C6H4OH ) a 0,1
M, se mide la absorbancia a 400 nm en el espectrofotmetro. Para la extraer
la enzima se cortan las vainas finamente del producto y se agrega fosfato de
sodio 0,1 M de ph 7 en relacin peso volumen.

1.2. Proteasa.
Mtodo de Balls y Hoover conocido como el mtodo de coagulacin de la leche,
es, sin duda, uno de los mtodos mas expeditos para determinar actividad
enzimtica de una proteinasa. Se toma como ndice de actividad proteoltica, el
tiempo necesario para que una cantidad conocida de enzima coagule un
determinado volumen de solucin de leche. La actividad se expresa en trminos
de unidades de leche coagulada por g de preparado enzimtico. La unidad de
leche coagulada se la define coma la cantidad en peso de un preparado
enzimtico necesario para coagular 5 ml de solucin de leche estndar por minuto,
cuando la temperatura es de 40C y el pH 6. La principal desventaja de este
mtodo radica en el hecho de no medir la protelisis total, es decir, la hidrlisis de
un substrato de protena, pero, por el contrario, mide la actividad de la coagulacin
de la leche. Afortunadamente, sin embargo, la coagulacin de la leche parece ser
una propiedad caracterstica de los componentes proteolticos de este grupo de
enzimas y puede ser usada con seguridad en la medicin proteoltica.
Segn algunos autores, las preparaciones es necesario activarlas antes con
bien con exceso de cianuro.

DETERMINACIN DE PAPANA
Fundamento:
El mtodo se basa en medir el aminocido tirosina que se libera por la accin de la
enzima sobre las protenas, usando el reactivo de Folin.
Reactivos:
Solucin de cianuro de sodio 2,0 activador de la enzima
Substrato hemoglobina: 20 mg/ml de hemoglobina se
solucin tampn de borato 0,1 M, de ph 7,5
Acido tricloroacetico 0,3 M
Solucin de NaOH 0,4 N
Reactivo del fenol segn Folin- ciocalteu

disuelven en

Preparacin de extracto enzimtico:

El producto pesado y molido se extrae con solucin tampn de borato 0,1 M de pH
7,5. Luego se centrifuga separndose el sobrenadante que se usar en la
determinacin.
Procedimiento:
En primer lugar, debe activarse la enzima, para lo cual se toma una alcuota del
extracto enzimtico problema y se le agrega 0,25 ml de cianuro sdico 2,0 M,
mantenindose la mezcla a 25C por 3 minutos.
A 5 ml de solucin de hemoglobina se le agrega 1 ml del extracto activado y se
mantiene a 35,5C por 10 minutos; para agregar luego 10,0 ml de cido
tricloroactico 0,3 1\1 y centrifugar. Del sobrenadante se toman 5 ml, se agregan
10,0 ml de NaOH 0,5 N y 3 ml del reactivo de Folin (dilucin 1 + 2); se lee la
absorbancia a 750 nm.

1.3. Amilasa.
Mtodo de la Maltosa: Se basa en suspender 10 g de harina en 46 ml de
solucin tampn de pH 4,5-4,8 e incubar por 1 hora a 30C. Esto permite que la
enzima presente en la harina acte sobre el almidn y lo convierte en maltosa, la
que se determina por el mtodo del ferricianuro. El valor de maltosa se define
como los mg de maltosa producidos por 10 g de harina bajo las condiciones ya
sealadas.
Fundamento:

Los grupos reductores liberados del almidn se miden por su propiedad de reducir
el cido 3,5-dinitrosalicilico.
Reactivos:
Enzima: Diluir una suspensin cristalina 1: 500 (o el extracto problema),
determinar
la
concentracin
proteica
mg/ml =
x 0,81. Para trabajar, diluir 1 microgramo/ml.
Substrato: Solucin al 1% de almidn en fosfato de sodio 0,02 M de pH 6,9 con
NaCl 0,006 M (para alfa-amilasa) y solucin al 1 % de almidn en acetato de sodio
0,016 M, de pH 4,8 (para beta-amilasa).
Reactivo de color: 1 g de cido dinitrosaliclico se disuelve en 20 ml de NaOH2N
y 50 ml de agua, se agregan 30 g de sal de Seignette (tartrato de Na y K) y se
diluye a 100 ml, protegindola del
.
Procedimiento:
0,5 ml de solucin de la enzima o del extracto problema se mezclan con 0,5 ml de
substrato. Se incluye un blanco con 0,5 ml de agua en remplaz de la enzima o
extracto problema. Se incuba a 25C por 3 minutos, s agrega 1 ml de reactivo
de color, se calienta en agua hirviendo por 5 minutos y luego se enfra. Se
agregan 10 ml de agua y se lee a 540 nm (filtro verde) contra el blanco.
Se establece una curva con maltosa (0,3-3,0 m moles) para convertir las lecturas
colorimtricas a unidades de actividad enzimtica, o sea, que libera un micromol
de azcar reductor, calculado como maltosa por minuto y a 25C bajo las
condiciones del ensayo.
La maltosa puede tambin determinarse por el mtodo de Munson y Walker,
usando la reaccin de Fehling I, 11, o bien por titulacin yodomtrica de Cu no,
reducido a

2. Una de los mtodos ms utilizados para el rompimiento celular es la Zonicacin,

describa y explique el fundamento fsico de esta tcnica.

Consiste en la aplicacin de ultrasonidos a una suspensin celular. La intensa

agitacin producida destruye las membranas celulares. Dependiendo de la
frecuencia, intensidad y energa aplicada se pueden destruir asimismo las
estructuras subcelulares e incluso solubilizar complejos proteicos. Se suele aplicar
en frio para evitar el sobrecalentamiento de las muestras que podra provocar la
desnaturalizacin de las protenas. Se transmite una corriente elctrica a un
sistema mecnico que la convertir en vibraciones de alta intensidad generndose

ondas de ultrasonido que generan millones de burbujas microscpicas, las cuales

se expanden y colapsan contra las clulas causando la ruptura de su membrana.
El fundamento fsico de esta tcnica se llama CAVITACION es el fenmeno
por el cual la presin total lugar de la ms baja presin en todo el sistema
alcanza la presin de vapor del lquido bombeado. El agua hervir y se
formarn burbujas de vapor. Luego el agua y las burbujas son impulsadas hacia
afuera por el impulsor a la parte de mayor presin de la bomba donde las
burbujas colapsan e implotan originando desprendimiento de materiales.
3. Determine la sensibilidad de dos mtodos de determinacin de protenas, junto
con las tinciones de comassie y nitrato de plata.
Azul comassie sensibilidad hasta 50 ng
Fluorescencia

sensibilidad hasta 50 ng

Coloracion de plata sensibilidad hasta 1 o 2 ng

Tincin argentica de geles de poliacrilamida SDS

La tincin con plata fue introducida por Kernyi y Gallyas como un procedimiento
extremadamente sensible para detectar pequeas cantidades de protenas en
geles La tcnica se ha ampliado para el estudio de otras macromolculas
biolgicas que han sido separadas en una variedad de soportes. La tincin clsica
con coomassie brilliant blue, por lo usual puede detectar una banda de 50 ng de
protena, la tincin de plata aumenta la sensibilidad tpicamente unas 50 veces.
Muchas variables pueden influir en la intensidad del color y cada protena tiene
sus propias caractersticas de tincin, las claves para el xito en una tincin
argntica son, material de vidrio limpio, reactivos puros y agua de alta pureza.

4. Defina y explique y el fundamento de las siguientes cromatografas:

4.1. Cromatografa preparativa
se usa para purificar suficiente cantidad de sustancia para un uso posterior, ms
que para anlisis.
La cromatografa preparativa comprende un amplio campo de aplicaciones, desde
el aislamiento de 1 g. de muestra para identificacin espectroscpica hasta el
aislamiento de un compuesto puro de una mezcla de 100 g. La cromatografa
preparativa se diferencia de la tcnica bsica en muchos aspectos, desde la
preparacin de la papilla. sta debe hacerse con menos agua que de ordinario.
Una papilla ms espesa ayuda a estabilizar el grosor de las placas que se precisa
para una carga de mayor magnitud. El espesor ptimo oscila desde un mnimo de
1 mm. hasta un mximo de 2 mm.
Las placas utilizadas en cromatografa preparativa son placas grandes, de
aproximadamente 20x20 cm. que permiten separar aproximadamente 1 g. de
mezcla utilizando unos 35 g. de adsorbente.

4.2. Cromatografa exclusin por tamao

La cromatografa de exclusin por tamaos ( SEC ), a la que a menudo nos
referimos como cromatografa de permeacion de gel ( GPC ), es una tcnica
de caracterizacin de polmeros que proporciona la distribucin completa de
pesos moleculares de una muestra y sus distintos promedios: es una tcnica
relativa, no suministra valores absolutos, si no que requiere un calibrado con
fracciones mono dispersas del mismo polmero. Tambin es posible utilizar
en el calibrado un polmero distinto del caracterizado, pero en este caso, el
calibrado se basa en la comparacin de volmenes hidrodinmicos y se llama
calibrado universal.
4.3. Cromatografa de intercambio inico
La cromatografa de intercambio inico (o cromatografa inica) es un
proceso que permite la separacin de iones y molculas polares basado en las
propiedades de carga de las molculas. Puede ser usada en casi cualquier tipo de
molcula
cargada,
incluyendo
grandes protenas,
pequeos nucletidos y aminocidos.
La cromatografa de intercambio inico conserva los analitos basndose en las
interacciones de Coulomb. La fase estacionaria muestra en la superficie grupos
funcionales inicos que interactan con iones de carga opuesta del analito. Este
tipo de cromatografa se subdivide a su vez en la cromatografa de intercambio
catinico y cromatografa de intercambio aninico:

La cromatografa de intercambio catinico retiene cationes cargados

positivamente debido a que la fase estacionaria muestra un grupo funcional
cargado negativamente, como un acido fosfrico
La cromatografa de intercambio de aniones retiene aniones usando grupos
funcionales cargados positivamente, como un catin de amonio cuaternario.

R-A-H+ + M+ + B- <--> R-A-M+ + H+ + BLa cromatografa de intercambio inico separa las protenas de acuerdo a su
carga neta, la cual depende la composicin de la fase mvil. Ajustando el ph o la
concentracin de iones de la fase mvil, varias molculas de protena pueden ser
separadas
4.4. Cromatografa de intercambio catinico
La cromatografa de intercambio catinico retiene cationes cargados positivamente
debido a que la fase estacionaria muestra un grupo funcional cargado
negativamente, como un acido fosfrico

4.5. Cromatografa de fase reversa

La cromatografa en fase reversa (RPC) permite separar molculas en base a su
polaridad. El principio de la cromatografa en fase reversa es semejante al de la
cromatografa en capa fina. Sin embargo, aqu la fase estacionaria es de
partculas de slice qumicamente modificadas con hidrocarburos saturados,
insaturados o aromticos de diferentes tipos. Esto convierte a la fase estacionaria
en una matriz apolar. Por lo tanto, para este tipo de cromatografas se emplean
mezclas de solventes polares, tales como agua, acetonitrilo, acetato de etilo,
acetona y alcoholes alifticos.
5. Como se calcula el factor de purificacin de una enzima y el rendimiento de
esta, cual es su significado practico.

El factor de purificacin de una enzima se calcula de la siguiente forma:

se cuenta con la actividad especifica de la enzima inicial que se mide
por mg protena total siendo igual a U= mg.
As mismo se debe contar con la actividad especifica final de la misma
enzima.
Para obtener el factor de purificacin debemos dividir la actividad
especifica final entre la inicial el valor que nos da es el factor.

6. Cuales son los mtodos de concentracin de protenas escala laboratorio mas

utilizados y cual es su fundamento fsico.
No existe un sistema totalmente satisfactorio para determinar la concentracin
proteica de una muestra. La eleccin de un mtodo u otro se basa en la naturaleza
de la protena y del resto de componentes de la muestra y en la sensibilidad y
precisin requeridos.
Existen diversos mtodos que permiten la cuantificacin de protenas, entre
los mtodos mas usados tenemos:
METODO
Folin fenol o de Lowry

DESCRIPCION
Basado en la formacin de un complejo
coloreado entre el Cu ++ y los nitrgenos

de los enlaces peptdicos reaccin de Biuret,

Para resaltar el color formado en esta reaccin y
aumentar la sensibilidad, se hace reaccionar
posteriormente con el reactivo de Folin que al ser
reducido por los residuos de aminocidos
aromticos tirosina y triptofano da un color
azulado.

Ventajas
Color estable
Alta precisin y exactitud
Aplicaciones

Coomassie o de Bradford

Es el mtodo mas usado

Sirve de mtodo estndar
Excelente para protenas de membrana
Basado en la unin directa del colorante azul de
Coomasie a la estructura terciaria de las
protenas y aminocidos especficos. El colorante
cambia de color de marrn a azul al unirse a
protenas.

Ventajas
Bajo limite de deteccin
Compatible con agentes reductores
Rapidez
Aplicaciones

Mtodo espectrofotomtrico

Se emplea cuando se necesita rapidez

Para muestras con agentes reductores
Se basa en la propiedad de las protenas de
tener un mximo de absorcin a 280 nm debido
al contenido en los aminocidos tirosina y

triptfano. La variabilidad en estos aminocidos

en diferentes protenas obliga a aadir un factor
de correccin aportado por la absorbancia del
enlace peptdico a 205 nm. La concentracin se
puede obtener aplicando la siguiente expresin:

Ventajas
Alta sensibilidad
no hay perdida de la muestra
Aplicaciones
Para muestras muy escasas y valiosas

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