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Ttulo:

Estudio del efecto de Inmodulen sobre la respuesta inmune bovina:


respuesta proliferativa de linfocitos a mitgenos y expresin de antgenos
de superficie en PBLs bovinos.

Cientfico/s responsable del estudio:


Belen Alvarez

Centro/s de realizacin del estudio:


INIA

Monitor del estudio:


Eva Navarrete

Patrocinador del estudio:


Laboratorios Calier, S.A.
Les Franqueses del Valls

Objetivo del estudio:


Valorar los efectos estimulantes de Inmodulen sobre clulas del sistema inmune de bovinos

Palabras clave:
Inmodulen, linfocitos, mitgenos, antgenos de superficie, bovino

Fecha final estudio:

Septiembre 2002

1. OBJETIVO
Los estudios realizados estn dirigidos a conocer el efecto del compuesto
INMODULEN (IMD) sobre la respuesta inmune en la especie bovina. Para ello, se ha
analizado el efecto de la adicin de este compuesto sobre determinados parmetros
inmunolgicos en diferentes ensayos in vitro.
1) Respuesta proliferativa de linfocitos a mitgenos.
Esta tcnica nos permite observar la dinmica de crecimiento de linfocitos de sangre
perifrica en respuesta a distintos estmulos, al adicionar al medio de cultivo un
nucletido alternativo marcado radioactivamente que ser incorporado en le DNA
sintetizado de novo.
2) Anlisis por citometra de flujo de la expresin de antgenos de histocompatibilidad
de clase I y de clase II en linfocitos de sangre perifrica bovinos en presencia de
distintos estmulos
2. MATERIALES Y METODOS
2.1.Animales y Clulas.
La sangre utilizada proceda de vacas de la raza Frisona, de la granja de la
Facultad de Veterinaria de la Universidad Computense de Madrid.
Las clulas mononucleares bovinas se obtuvieron de sangre heparinizada,
mediante gradientes de densidad sobre Ficoll-Hypaque (Bio-Whittaker).
La sangre heparinizada se diluy con suero salino glucosado. Diez ml de la sangre
diluida se depositaron sobre 4 ml de la solucin de Ficoll-Hypaque de 1,077 g/ml de
densidad y se centrifugaron durante 30 minutos a 650 x g. Las clulas mononucleares se
recogieron de la interfase entre el Ficoll y el plasma, y se lavaron 2 veces con tampn
fosfato salino (PBS). Despus del ltimo lavado se procedi al recuento celular con
Tripn azul para ver la viabilidad.
2. 2. Respuesta proliferativa a mitgenos.
Las clulas mononucleares de sangre perifrica bovinas resuspendidas en medio
de cultivo RPMI 1640 se dispensaron, a una concentracin de 3 x 10 5 clulas/pocillo en
un volumen de 0,1 ml, en placas de cultivo de 96 pocillos de fondo plano por triplicado.
Las clulas se estimularon con el mitgeno Concanavalina A (Con A) a 1 g/ml o 0,5
g/ml, en un volumen de 50 l y en presencia de distintas concentraciones de dos lotes
del producto IMD (Lote 1= referencia 20109 y Lote 2= referencia 0030012). Se aadi
medio de cultivo en cada pocillo hasta alcanzar un volumen final de 0,2 ml. Los cultivos
se mantuvieron a 37C en atmsfera hmeda y 5 % de CO 2 durante 72 h. La
proliferacin de las clulas T se midi por la incorporacin de timidina tritiada ( 3HTimidina) (1 Ci/pocillo) durante las ltimas 6 h de cultivo. Despus del pulso las

clulas se procesaron y se determin la incorporacin de 3H-Timidina en un contador


(1450 Microbeta, Wallac, Finlandia).
En cada ensayo se utilizaron como controles negativos clulas incubadas en
ausencia de mitgeno, IMD o excipiente del producto a testar y como controles
positivos clulas incubadas con distintas concentraciones de Con A (2, 1 y 0,5 g/ml).
El producto IMD en ausencia de ConA se utiliz sin diluir y en presencia de dosis
subptimas de ConA haciendo diluciones seriadas 1/5. En el caso del excipiente del
producto, tambin se analizaron dos lotes (Excipiente 1= referencia 080702 y
Excipiente 2= referencia 101197), utilizndose puros y haciendo diluciones seriadas
1/5, siempre en ausencia del mitgeno Con A.
2.3. Anlisis de la expresin de antgenos de histocompatibilidad de clase I y de
clase II bovinos (BoLA I y BoLA II).
2.3.1. Estimulacin de PBLs bovinos con IMD.
Para determinar el efecto del IMD sobre la expresin de determinados antgenos
de superficie, las clulas mononucleares de sangre perifrica bovinas se incubaron en
placas de cultivo de 12 pocillos, a una concentracin de 5x106 clulas/pocillo, en
presencia o no de IMD (referencia 0030012) (dilucin 1/625) y Con A (1 g/ml). Como
control negativo se utilizaron clulas cultivadas en ausencia de estmulo. Las clulas se
recogieron a las 0, 24 y 72 h de cultivo y se analizaron los resultados por citometra de
flujo.
2.3.2. Anticuerpos.
Se utilizaron sobrenadantes de cultivo puros de hibridomas productores de
anticuerpos monoclonales dirigidos frente a antgenos de histocompatibilidad de clase I
y de clase II porcinos que tienen reactividad cruzada con clulas mononucleares de vaca
(Alvarez, 2000); as como un anticuerpo irrelevante como control negativo. En la
siguiente tabla se muestran dichos anticuerpos:
Molcula
BoLA I
BoLA II DR
BoLA II DQ

DISTRIBUCION CELULAR

AcMo

Leucocitos

BL6H4
1F12, 2E9/13
BL2H5, BL4H2

Clulas presentadoras de antgeno

2.3.3. Citometra de flujo


Con esta tcnica se determin el porcentaje de clulas que expresan
determinados marcadores especficos de poblaciones leucocitarias, as como el nivel de
expresin de dichos marcadores.
Las clulas mononucleares bovinas (5x105 clulas/pocillo) se incubaron en
placas de 96 pocillos de fondo en V con los distintos anticuerpos monoclonales, durante
30 min a 4 C. Despus de 2 lavados en tampn de fluorescencia (TF= PBS con

albmina srica bovina (BSA) al 0,1% y azida sdica al 0,1 %) centrifugando las placas
a 340 x g durante 4 minutos, las clulas se incubaron con una solucin de fragmentos
F(ab)2 de anticuerpos de conejo anti-inmunogloblinas de ratn conjugados con
isotiocianato de fluorescena (Dako, Denmark) diluida 1/40 en TF, durante 30 min a 4C
y en oscuridad. Finalmente las clulas se lavaron 3 veces en TF y se pasaron a tubos de
citometra para su posterior anlisis.
A las 72 h de cultivo se realiz adems una tincin con Ioduro de Propidio (1
g/ml) con objeto de descartar las clulas muertas en el anlisis.
2.3.4.Adquisicin de clulas y anlisis de resultados.
Las suspensiones celulares, marcadas con los diferentes anticuerpos fueron
adquiridas y definidas mediante un citmetro de flujo FACscan (Becton-Dickinson). En
estos ensayos las fluorescencias se evaluaron segn un control de calibracin del
citmetro y tras un ajuste mediante la utilizacin de controles positivos y negativos para
cada proceso de adquisicin.
El anlisis de datos se llev a cabo sobre un promedio de 10.000 clulas en el
programa WinMDI2.7.
Los porcentajes de clulas positivas se obtuvieron mediante el anlisis de los
histogramas en los que se represent la intensidad de fluorescencia de las clulas
marcadas frente al nmero de clulas. La expresin relativa de los antgenos celulares se
interpret mediante los valores de intensidad media de fluorescencia (IMF) recogida en
los canales de los fotomultiplicadores.

3. RESULTADOS
3.1.Respuesta proliferativa a mitgenos.
En la figura 1 se representa la respuesta proliferativa de PBLs bovinos en
presencia de IMD slo (puro)
o con dosis subptimas de Con A (1
y
0,5
g/ml) (diluciones seriadas 1/5). Como control positivo se muestra la respuesta
linfoproliferativa inducida por distintas dosis de Con A
( 2, 1 y 0.5 g/ml) y como
control negativo las cpm obtenidas con clulas cultivadas en ausencia de estmulo
180000
160000

cpm
cpm

140000
120000
100000
80000
60000
40000
20000
0
Ctrl

ConA
A
Con

MD
II MD

MD+
ConA 1
1
II MD+
ConA

*
*

*
*

B
*

MD+
ConA 0,5
0,5
IIMD+
ConA

Figura. 1: Respuesta proliferativa de PBLs bovinos en presencia de IMD. A) IMD Lote 1 y B) IMD Lote
2. 3x105 clulas fueron cultivadas durante 3 das en presencia de IMD, diferentes dosis de Con A (2, 1 y 0.5
g/ml) o bien coincubadas con una mezcla de distintas diluciones de IMD y dosis subptimas de Con A (1 y
0.5 g/ml). Los valores representan la media de las cpm de la incorporacin de 3H-Timidina Error Estandard
de 4 experimentos independientes. p 0,05 comparando con los datos de Con A 1 g/ml (*) y Con A 0.5
g/ml () mediante el test de la t de student.

En dicha grfica podemos observar que ninguno de los dos lotes de IMD
produce un efecto mitognico por si solo y que ambos aumentan, de forma significativa
(* y ), la respuesta proliferativa de linfocitos bovinos a dosis subptimas de Con A (1 y
0,5 g/ml), es decir poseen un efecto co-estimulador.
En el caso de los excipientes del producto no parecen tener ningn efecto sobre
las clulas.
3.2. Anlisis del efecto del IMD en la expresin de antgenos de MHC de clase I y
de Clase II bovinos.
En el anlisis de la expresin de molculas de clase I del Complejo Principal de
Histocompatibilidad bovino (BoLA I) observamos que tiene lugar un incremento en su
nivel de expresin en el tiempo con el estmulo IMD, cuando lo comparamos con los
niveles de expresin en clulas sin estimular (Ctrl). Este efecto se pone de manifiesto en
los histogramas de fluorescencia obtenidos con el anticuerpo BL6H4 (Fig. 2), en los que
se representan unidades relativas de fluorescencia en abscisas y nmero de clulas en
ordenadas, por un desplazamiento hacia la derecha del perfil de distribucin de las
clulas; as como en la figura 3 donde se representa la densidad de antgenos por clula
en funcin de distintos estmulos en el tiempo.
En la figura 4 se representa la expresin de las molculas de clase II DR y DQ
del Complejo Principal de Histocompatibilidad bovino, analizadas mediante el uso de
los anticuerpos monoclonales porcinos con reactividad cruzada en vaca, 2E9/13 y 1F12

y BL2H5 y BL4H2, respectivamente, en el tiempo y en funcin de distintos estmulos.


En dicha figura se observa un incremento en el nmero de clulas que expresan
antgenos de clase II con el IMD respecto a las clulas sin estimular, en funcin del
tiempo. Este efecto es mayor en la expresin de molculas de clase II DR. Datos que
tambin se muestran en los histogramas de fluorescencia de la figura 2.

24 h
BoLA I

72 h
Ctrl

BL6H4

BL6H4

IMD

BoLA II-DR
1F12

2E9/13

1F12

2E9/13

BL4H2

BL2H5

BL4H2

BoLA II-DQ
BL2H5

Figura. 2: Anlisis por citometra de flujo de la expresin de los antgenos reconocidos por los anticuerpos
BL6H4, 1F12, 2E9/13, BL2H5 y BL4H2 en clulas mononucleares sanguneas bovinas estimuladas o no con
IMD a 24 y 72 h de cultivo. Datos representativos de 4 experimentos independientes.

Con A IMD Ctrl

Figura. 3: Densidad de antgenos


BoLA I/clula.

0h

En esta grfica se representa la


intensidad media de fluorescencia

24 h

(IMF)

de

los

histocompatibilidad

antgenos
de

clase

funcin de distintos estmulos.


500

1000

1500

2000

2500

3000

IMF

Ctrl IMD Con A

1F12

100

75

50

50

25

25

%
c

lu
la
s

2E9/13

100

75

24

48

BL2H5

100

72 0

24

75

50

50

25

48

72

48

72

BL4H2

100

75

25

bovinos a 0, 24 y 72 h de cultivo en

72 h

de

24

48

72 0

24

Tiempo (horas)

Figura. 4: Expresin de antgenos BoLA II en PBLs estimulados con IMD.


Porcentaje de clulas que expresan los antgenos BoLA II DR y DQ reconocidos respectivamente
por los anticuerpos 1F12 y 2E9/13 y BL2H5 y BL4H2, en funcin de distintos estmulos en el
tiempo.

4. DISCUSION.
Los estudios in vitro sobre el efecto del IMD en la respuesta inmune bovina
ponen de manifiesto que dicho producto afecta de forma positiva a una serie de
mecanismos relevantes en la respuesta inmunitaria.
Numerosos agentes se han utilizado para inducir la activacin de clulas T, de
forma especfica o inespecfica, resultando dicho efecto en la produccin de citoquinas,
expresin de receptores de citoquinas y por ltimo en la proliferacin de las clulas T
activadas. Aunque la proliferacin no es una funcin efectora especfica de los linfocitos
T, los ensayos de proliferacin constituyen un mtodo fiable y sencillo de realizar y se
utilizan de forma amplia para determinar el estado inmunocompetente de un animal.
As, se consideran vlidos como una primera aproximacin para para evaluar la
activacin de las clulas T (Person et al., 1983).
Mediante la evaluacin de la respuesta linfoproliferativa inducida por el IMD hemos
podido observar que, aunque dicho producto no es mitognico por si mismo, incrementa
de forma significativa la blastognesis inducida por dosis subptimas de Con A. Este
efecto coestimulador con el mitgeno es dosis-dependiente.
La modulacin de los antgenos de clase II del Complejo Principal de
Histocompatibilidad bovino (BoLA II), ha sido observada por otros autores mediante el
uso de distintos activadores policlonales. As, Quade y Roth (1999), mediante citometra
de flujo de dos colores, observaron que las subpoblaciones de clulas T CD4 +, T CD8+ y
T + bovinas respondan a todos los mitgenos empleados, aumentando la expresin de
molculas de clase II y del receptor de Interleuquina 2 (marcador de activacin), y
proliferando. Ese aumento en la expresin de BoLA II tambin se ha observado en
distintos tejidos. As Hurley y cols (1994) describen dicho efecto en clulas de ganglios
linfticos bovinos estimulados con mitgenos. Estos ganglios en ausencia de estmulo
presentan proporciones similares de clulas T, de clulas B y clulas BoLA II + a las de
las clulas mononucleares de sangre perifrica (Baldwin y cols, 1988). Por otro lado
Fitzpatrick y cols (1993) analizando la distribucin de BoLA II en el tejido conectivo y
el epitelio de la glndula mamaria observaron que tras la administracin intramamaria
de Streptococcus uberis muerto tambin se produca un incremento en la expresin de
BoLA II si se comparaba con los resultados obtenidos con la adminitracin de
ovoalbmina.

El aumento en los niveles de expresin de las molculas de clase I en el porcentaje de


clulas que expresan molculas de clase II observado en presencia de IMD refleja una
cierta capacidad de activacin de los linfocitos. Adems, considerando el papel de estas
molculas en la presentacin antignica a linfocitos T, podra favorecer el desarrollo de
respuestas especficas de antgeno.

5. BIBLIOGRAFIA.
- Alvarez B. (2000). Caracterizacin de clulas mielomonocticas porcinas. Tesis
doctoral.
- Baldwin CL, Machugh ND, Ellis JA, Naessens J, Newson J, Morrison WI. (1988).
Monoclonal antibodies which react with bovine T-lymphocyte antigens and induce
blastogenesis: tissue distribution and functional characteristics of the target .
Immunology, 63 (3): 439-46.
- Fitzpatrick JL, Cripps PJ, Hill AW, Bland PW, Stokes CR. (1992). MHC class II
expression in the bovine mammary gland. Vet Immunol Immunopathol, 23 (1-2): 1323.
- Hurley DJ, Wilson RA, Baldwin CL, Liu JY, Mastro AM. (1994).
Characterization of resting and phorbol ester or concanavalin A activated bovine lymph
node cells with leukocyte specific monoclonal antibodies. Vet Immunol Immunopathol,
40 (1): 49-61.
- Person JM, F Quintin-Colonna, F Barrat, Y Le Garrec, C Pilet. (1983).
Immunocompetence of newborn calves: evaluation of the proliferative response of
lymphocytes in vitro to 3 nonspecific mitogens (concanavalin A, Phytohemagglutinin,
pokeweed mitogen) during the 1st 3 months of life. Comp Immunol Microbiol Infect
Dis, 6 (4): 345-56.
- Quade MJ, Roth JA. (1999). Dual-color flow cytometric analysis of phenotype,
activation marker expression, and proliferation of mitogen-stimulated bovine
lymphocyte subsets. Vet Immunol Immunopathol, 67 (1): 33-45.