Ensayo de Calvas

Nos permite cuantificar los virus presentes en una solucin que infectan a
una determinada cepa bacteriana. Para realizar este ensayo se parte de un
tubo en que tenemos la suspensin de virus, otro tubo que contiene las
bacterias hospedadoras de dicho virus y otro tubo que contiene agar fundido
a unos 45-50. En el agar se deposita una muestra de los dos tubos
anteriores (virus y bacterias), se agita para mezclar y se aade todo el
contenido del tubo de agar con virus y bacterias a una placa petri que ya
contena un medio de cultivo slido, y se deja enfriar para que solidifique el
agar que acabamos de aadir (tenemos 2 capas en la placa). Las bacterias y
los virus quedan extendidos, por tanto, en toda la superficie y las bacterias
comienzan a multiplicarse, formando un csped por la placa. Pero a su vez,
cada virus infecta a la bacteria que tenga ms prxima, se multiplica en ella,
salen nuevos virus que infectan a las bacterias vecinas y as, en la zona
donde haba un virus, se forman unas reas de bacterias muertas (por los
virus) que se denomina calva o placa de lisis, y por lo tanto, el recuento del
nmero de calvas o placas de lisis, nos da idea del nmero de virus
infecciosos que tenamos en la muestra original, aunque no es un mtodo del
todo exacto.

Los resultados de este ensayo se expresan como unidades formadoras de

calas o placas de lisis (ufp). Es conveniente contar las placas de cultivo que
contienen entre 30 y 300 calvas, pero a veces, como no sabemos cuntas
calvas nos van a salir, lo que conviene es realizar una serie de diluciones de
la muestra original que contena a los virus: 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, ... y de
cada dilucin se toma un inculo. P. ej. de 0,1 mL y se realiza lo que
acabamos de ver; luego se cuentan las calvas de las placas.
Y esto es lo de micro

Titulacin y transduccin:
Ensayo de calvas (cuantificar virus en suspensin UF calvas/1 unidad
volumen.
Nos dice cuantas son funcionales.
UF de calvas > unidad aprox. baja porque los virus son genticamente
iguales.
Vamos a utilizar el lisado de la prctica anterior con perxido, la cepa es
S.aureus RN4220 el fago 80 alpha lisgeno. Necesitamos 1 clula aceptora
(sensible a la infeccin del fago).
Diluir la cepa de S.aureus de un cultivo de noche en agitacin > 1:50 en
TSB abs 0,4UDO a longitud de onda de 540nm.
Alicuotamos 50 ul de aureus en tubos estriles, en todos los que queramos
titular. Aadir 50 uL del lisado. El lisado lo diluimos en el tampn PHAGE
BUFFER.
Disolucin a la -2,-4,-6 y -8.
Titulamos; -4,-6,-8 y negativo.
PHAGE TOP AGAR> semislido encima de PHAGE BASE> slido.
Sobre este vertemos 3 ml de PHAGE TOP A. y 100ml de aceptora y 100ml
de fago y se deja solidificar.
PB y PTA necesitan cloruro clcico a 10 mM que permite que se fije el fago.
La transduccin:
La cepa de 80 alpha tiene un plsmido de resistencia a eritromicina. En
procariotas es la gtransferencia de DNA de una bacteria a otra por bacteria.
Puede se que se encapside DNA que (no es propio) pero no el del
bacteriofago. Valorar aquellas clulas que han captado el plsmido.
Como vamos a evaluar las clulas pues las que crecen en eritromicina que
han captado el plsmido y un negativo para evaluar el resultado.