Validación de método analítico HPLC para cuantificar vitamina A

UNIVERSIDAD RAFAEL LANDVAR
FACULTAD DE INGENIERA
LICENCIATURA EN INGENIERA QUMICA INDUSTRIAL
VALIDACIN DE UN MTODO ANALTICO PARA LA CUANTIFICACIN DE VITAMINA A EN

ALIMENTOS, POR CROMATOGRAFA LQUIDA DE ALTA RESOLUCIN Y SU
DETERMINACIN EN GUAYABA FRESA (Psidium cattleianum sabine)
TESIS DE GRADO
LUISA MARA ARIAS GONZLEZ

CARNET 20038-07
GUATEMALA DE LA ASUNCIN, AGOSTO DE 2014

CAMPUS CENTRAL
UNIVERSIDAD RAFAEL LANDVAR

FACULTAD DE INGENIERA
LICENCIATURA EN INGENIERA QUMICA INDUSTRIAL
VALIDACIN DE UN MTODO ANALTICO PARA LA CUANTIFICACIN DE VITAMINA A EN

ALIMENTOS, POR CROMATOGRAFA LQUIDA DE ALTA RESOLUCIN Y SU
DETERMINACIN EN GUAYABA FRESA (Psidium cattleianum sabine)
TESIS DE GRADO
TRABAJO PRESENTADO AL CONSEJO DE LA FACULTAD DE

INGENIERA
POR
LUISA MARA ARIAS GONZLEZ
PREVIO A CONFERRSELE
EL TTULO DE INGENIERA QUMICA INDUSTRIAL EN EL GRADO ACADMICO DE LICENCIADA
GUATEMALA DE LA ASUNCIN, AGOSTO DE 2014

CAMPUS CENTRAL
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MARIO RENE SANTIZO CALDERON
NOMBRE DEL ASESOR DE TRABAJO DE GRADUACIN

INGRA. ISIS ARACELY LOPEZ CIFUENTES DE GALVEZ
TERNA QUE PRACTIC LA EVALUACIN

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MGTR. MIRIAM ESTELA CHAVEZ RAMIREZ
LIC. RICARDO
RICARDO ANTONIO MONTOYA SEGURA
Dedicatoria
A Dios y la Virgen por ser lo que soy, por darme la voluntad para terminar mis
estudios con xito, la fuerza para levantarme en cada cada, la paz en los
momentos difciles, y la sabidura para tomar las mejores decisiones.
A mi mami, por su amor, paciencia, apoyo incondicional, por creer en m, sobre

todo por sus oraciones que me dieron paz cuando ms lo necesitaba.
A mi papi por darme nimos y consejos a lo largo de la carrera. Por su amor, por
creer en m y ser paciente en todo momento.
A mis hermanas y cuado, Colocha, Canche, Seca, y Joe, por darme su alegra,
motivacin y ser un ejemplo para m de la perseverancia, la lucha constante y que
todo se puede lograr. A mi Fernandita bella, por darme su sonrisa y alegra,
haciendo mis das ms bonitos.
A mi Guapito, por ser parte importante de mi vida, estando a mi lado durante toda
la carrera, compartiendo desvelos, madrugadas, largas horas de estudio y
celebrando cada triunfo. Por todo su apoyo, su amor, alegra y paciencia, te amo!
Agradecimientos
A las autoridades y personal del Laboratorio CONCALIDAD, por brindarme su

confianza y apoyo para realizar mi trabajo de graduacin.
A la Ing.Isis, por su cario, confianza y apoyo incondicional durante la carrera y la

realizacin de la tesis, por sus consejos y conocimientos. Sobre todo por ser un
ejemplo para m de una persona integral en lo profesional y en el personal.
A mis compaeras de trabajo, Lic.Gaby, por su cario, motivndome todos los

das para finalizar la carrera y la tesis, gracias por sus risas que me alegraban el
da, y todo el apoyo que me brind, es un gran ejemplo para m. La Canchita, por
apoyarme en los momentos de estrs, su compaa en las tardes de arduo
trabajo, por su alegra y positivismo ante las dificultades. A Milvis, por toda la
ayuda en la realizacin de la tesis.
A todos mis amigos que me acompaaron durante la carrera, en los desvelos,

proyectos y triunfos. En especial a Andrea, Chin, y Jorge, por estar pendiente en
todo momento del proceso de la tesis, por su cario y apoyo.
A toda mi familia y amigos, que de una u otra forma estuvieron pendientes durante
la carrera, motivndome a seguir adelante, creyendo en m. En especial a la
familia Keller Gonzlez, Espinoza Gonzlez, Arias Chupina y Fajardo Galindo. Mil
gracias.
Resumen Ejecutivo
El presente trabajo titulado: Validacin de un mtodo analtico para la
cuantificacin de vitamina A en alimentos en cromatografa lquida de alta
resolucin y su determinacin en guayaba fresa (Psidium Cattleianum Sabine),
surgi por la necesidad de validar un mtodo nuevo para cuantificar la vitamina A,
y aportarlo al laboratorio CONCALIDAD. Influy por ser Guatemala un pas con
problemas de deficiencia de Vitamina A, siendo necesario tener metodologas
validadas con rapidez de obtencin de resultados, para que las industrias
alimenticias puedan evaluar el contenido de vitamina A de sus productos, y
cumplir as con los requerimientos que establece la FDA.
Para validar la metodologa se evaluaron 9 parmetros de desempeo regidos por

la Norma ISO 17025, los cuales fueron: selectividad, linealidad, lmite de
deteccin, lmite de cuantificacin, rango, robustez, exactitud, precisin e
incertidumbre. Se trabaj con dos materiales de referencia, uno certificado,
Acetato de Retinol, y el segundo una frmula infantil, el cual no se encuentra
certificado bajo ninguna norma, pero es un alimento controlado por empresas
reconocidas. Se concluy que el mtodo es vlido bajo todos los parmetros de
desempeo, determinando que el procedimiento debe ser trabajado por analistas
con destrezas tcnicas que les permitan desarrollar correctamente el mtodo.
La guayaba fresa es un fruto con potencial de crecimiento en Guatemala, por

cultivarse en climas de subtropicales a fros. La guayaba fresa es ms conocida e
incluso fruto autctono de Uruguay y Brasil, teniendo altas posibilidades de su
industrializacin en Guatemala. Como parte de la aportacin a la industria, se
determin que el contenido de vitamina A en guayaba fresa fue de
39.642.73ER/100g este contenido provino nicamente del valor detectado como
retinol, no se analizaron otras fuentes de provitamina A. Se concluy por medio del
estudio estadstico, que la Guayaba Fresa posee un contenido de vitamina A
mayor que el de Guayaba Blanca. Descriptores: validacin, parmetros de
desempeo, vitamina A, metodologa y guayaba fresa.
I.
ndice
Introduccin ..................................................................................... 1
1.1
Lo escrito sobre el tema .................................................................. 2
1.2
Resumen Crtico del marco terico ................................................. 4
1.2.1
Validacin de un mtodo analtico................................................... 4
1.2.2
Verificacin ...................................................................................... 4
1.2.3
Propsito de la validacin................................................................ 5
1.2.4
Proceso para validar ....................................................................... 7
1.2.5
Requisitos Analticos ....................................................................... 8
1.2.6
Revisin de los mtodos de ensayo ................................................ 9
1.2.7
Seleccin de los Mtodos de Ensayo ............................................ 10
1.2.8
Mtodos Normalizados .................................................................. 11
1.2.9
Mtodos No Normalizados ............................................................ 12
1.2.10
Mtodos Desarrollados por el Laboratorio .................................... 13
1.2.11
Parmetros de desempeo del mtodo ........................................ 13
1.2.12
Cromatografa Lquida de alta resolucin (HPLC) ......................... 25
1.2.13
Vitamina A ..................................................................................... 29
1.2.14
Guayaba ........................................................................................ 32
1.2.15
Guayaba Fresa.............................................................................. 35
II.
Planteamiento del problema .......................................................... 37
2.1
Objetivos ....................................................................................... 39
2.1.1
Objetivo General ........................................................................... 39
2.1.2
Objetivos Especficos .................................................................... 39
2.2
Hiptesis........................................................................................ 39
2.2.1
Nula ............................................................................................... 39
2.2.2
Alterna ........................................................................................... 39
2.3
Variables ....................................................................................... 39
2.3.1
Variables Independientes .............................................................. 39
2.3.2
Variables Dependientes ................................................................ 40
2.4
Definicin de las variables ............................................................. 40
2.4.1
Definicin Conceptual ................................................................... 40
2.4.2
Definicin Operacional .................................................................. 42
2.5
Alcances y Lmites ........................................................................ 44
2.6
Aporte ............................................................................................ 46
III.
Mtodo .......................................................................................... 47
3.1
Sujetos y Unidades de Anlisis ..................................................... 47
3.2
Instrumentos.................................................................................. 49
3.3
Procedimiento ............................................................................... 56
3.3.1
Procedimiento para la cuantificacin de Vitamina A...................... 56
3.4
Diseo y Metodologa estadstica.................................................. 59
3.4.1
Diseo Experimental ..................................................................... 59
3.4.2
Experimentos, tratamientos y repeticiones .................................... 59
3.4.3
Descripcin de las unidades experimentales ................................ 61
3.4.4
Variables respuestas ..................................................................... 61
3.4.5
Metodologa de anlisis ................................................................. 62
IV.
Presentacin y Anlisis de resultados ........................................... 70
4.1
Diagrama del proceso para el mtodo para la cuantificacin de
Vitamina A por HPLC .................................................................................... 70
4.2
Diagrama del proceso de validacin ............................................. 73
4.3
Parmetros de Desempeo........................................................... 75
V.
Discusin ....................................................................................... 80
VI.
Conclusiones ................................................................................. 88
VII.
Recomendaciones ......................................................................... 89
VIII.
Referencias bibliogrficas ............................................................. 90
IX.
Anexos .......................................................................................... 92
9.1
Muestra de Clculo ....................................................................... 94
9.2
Glosario ....................................................................................... 103
ndice de Tablas
Tabla No1. Gua de matriz para evaluacin de Test de Youden y Steiner ............ 22
Tabla No.2 Matriz para evaluacin de Test de Youden y Steiner modificada ....... 23
Tabla No.3 Formas de expresar el contenido de Vitamina A ................................ 32
Tabla No.4 Instrumentos utilizados en la metodologa .......................................... 49
Tabla No.5 Materiales utilizados en la metodologa .............................................. 51
Tabla No.6 Otros materiales.................................................................................. 55
Tabla No.7 Reactivos ............................................................................................ 55
Tabla No.8 Matriz de evaluacin para determinar robustez .................................. 66
Tabla No.9 Selectividad ........................................................................................ 75
Tabla No.10 Linealidad ......................................................................................... 75

Tabla No.11 Lmite de deteccin y cuantificacin ................................................. 76
Tabla No.12 Repetibilidad ..................................................................................... 76
Tabla No.13 Reproducibilidad ............................................................................... 77
Tabla No.14 Sesgo con un valor terico de 450 ER/100g................................... 77
Tabla No.15 Rango ............................................................................................... 77
Tabla No.16 Datos calculados para la determinacin de la robustez .................... 78
Tabla No.17 Conclusin de la robustez del mtodo .............................................. 78
Tabla No.18 Conclusin de la robustez del mtodo por medio de reproducibilidad y
repetibilidad ........................................................................................................... 78
Tabla No.19 Incertidumbre para la determinacin de vitamina A en frmula infantil
.............................................................................................................................. 78
Tabla No.20 Incertidumbre para la determinacin de vitamina A en Guayaba Fresa
.............................................................................................................................. 79
Tabla No.21 Contenido de Vitamina A en Guayaba Fresa .................................... 79
Tabla No.21 Datos originales para la determinacin de Selectividad y sesgo. ..... 92
Tabla No.22 Datos originales para la determinacin de Linealidad y Repetibilidad
por medio de Acetato de Retinol ........................................................................... 92
Tabla No.23 Datos originales para la determinacin de Reproducibilidad ............ 93
Tabla No.24 Datos originales para la determinacin de Robustez ........................ 93
Tabla No.25 Datos originales para la determinacin del contenido de vitamina A en
Guayaba Fresa. ..................................................................................................... 93
Tabla No. 26 Repetibilidad de la ecuacin de la recta por medio de la curva de
calibracin. .......................................................................................................... 100
ndice de Figuras y Grficas

Figura No.1 Eleccin, desarrollo y evaluacin de mtodos ................................... 11
Figura No.2 Esquema tiro al blanco para definir exactitud .................................... 18
Figura No.3 Componentes del cromatgrafo lquido de alta resolucin ................ 26
Figura No.4 Sistema de inyeccin manual de muestras ....................................... 27
Figura No.5 Variedades mejoradas de la guayaba ............................................... 34
Figura No.6 Guayaba Fresa .................................................................................. 35
Figura No.7 Diagrama de posibles transformaciones industriales de la Guayaba y
Guayaba Fresa...................................................................................................... 36
Figura No.7 Diagrama de Ishikawa para evaluar las posibles causas de la

incertidumbre del mtodo ...................................................................................... 69
Grfica No.1 Determinacin de la Curva de Calibracin, para evaluacin de la
linealidad del mtodo ............................................................................................ 76
Figura No.9 Cromatograma de anlisis de Guayaba Fresa .................................. 79
Figura No.10 Tabla de datos para la distribucin normal t-Student, dos colas ... 106
Figura No.11 Diagrama de Flujo para realizar el procedimiento de validacin ... 107
Figura No.12 Cromatograma para la concentracin de 10gER/ml .................... 108
Figura No.13 Cromatograma para la concentracin de 7.5gER/ml ................... 108
Figura No.14 Cromatograma para la concentracin de 5gER/ml ...................... 109
Figura No.16 Cromatograma para la concentracin de 1gER/ml ...................... 110
Figura No.18 Cromatograma para el blanco ....................................................... 111
Figura No.19 Cromatograma para frmula infantil .............................................. 111
I.
Introduccin
La validacin de un mtodo analtico cuantitativo, se realiza con el propsito de

garantizar la veracidad de los resultados que se obtengan de los anlisis. Para
garantizarlos se han establecido parmetros que aporten informacin estadstica,
ayudando a concluir si el mtodo analtico es vlido o no. En Guatemala el
proceso de normalizacin comenz en 1956, con la formacin del Instituto
Centroamericano de Investigacin (ICAITI), uno de los propsitos era controlar la
calidad de los productos finales por medio de anlisis qumicos. Luego continuo la
creacin de la Comisin Guatemalteca de Normas (COGUANOR) en el ao de
1962, con la colaboracin del Ministerio de Economa y el Ministerio de Salud En
la actualidad la normalizacin y el control de calidad de los procesos ha tenido un
auge en todos los sectores empresariales, entes autorizados certifican y avalan
sus procesos aportando a las empresas garanta en sus resultados. En los
laboratorios de ensayo se gener la necesidad de cumplir con los reglamentos
nacionales e implementar sistemas de gestin de calidad como lo dicta la Norma
ISO 17025, la cual solicita dentro de sus requisitos tcnicos el uso de mtodos
validados.
Para la validacin del mtodo cuantitativo de Vitamina A en cromatografa lquida
se analizaron diferentes parmetros, estableciendo los siguientes: linealidad,
selectividad, exactitud, precisin, lmite de cuantificacin, lmite de deteccin,
rango, robustez e incertidumbre. La Vitamina A se encuentra de forma natural en
diversos alimentos y se adiciona cuando se requiere fortificar. Parte fundamental
de la investigacin fue la determinacin de la vitamina en un alimento fortificado y
en otro que se encuentre de forma natural. Se analiz una frmula infantil como
alimento fortificado y material de referencia. Como alimento natural se utiliz la
guayaba fresa (Psidium Cattleianum), fruta de clima subtropical con facilidad de
cultivo en Guatemala, con potencial de ser industrializada por sus caractersticas
organolpticas y nutricionales. La validacin del mtodo aport a la industria
alimenticia otra opcin garantizada para el anlisis de la Vitamina A indicada en
alimentos.
1
1.1
Lo escrito sobre el tema
Ballejo (2009) en su investigacin de menciona como propsito desarrollar y

validar un mtodo analtico que cumpla con los parmetros establecidos de
cromatografa y requerimientos de la Farmacopea Estadounidense (USP) e ICH
(Conferencia Internacional Tripartita). La metodologa analtica cumple con los
parmetros de aptitud del sistema, linealidad, exactitud, precisin (repetibilidad y
precisin intermedia) para la cuantificacin de los principios activos. Concluy que
el mtodo analtico desarrollado es efectivo y reproducible, cumple con las
especificaciones necesarias para su aplicacin si se realiza a las mismas
condiciones de laboratorio y con los mismos principios activos, permitiendo que se
obtengan resultados satisfactorios y confiables.
Delgado (2009) en su artculo menciona como objetivo fundamental establecer en

forma clara y sencilla la diferencia entre validacin y verificacin de un mtodo de
ensayo. Se presenta una breve discusin de la seleccin y validacin de los
mtodos de ensayos establecidos en la norma ISO/ IEC 17025:2005. Describe el
proceso de normalizacin de un mtodo, y de forma general los parmetros de la
validacin como indicadores caractersticos del desempeo del mtodo, brindando
algunas breves orientaciones para su aplicacin. Adicionalmente presenta algunos
contenidos de mtodos normalizados, indicando las especificaciones a partir de
los datos de validacin. Por lo tanto Delgado presenta un artculo cmo gua
introductoria para la realizacin de la validacin de metodologas de acuerdo a
ISO/IEC 17025.
Garca (2009) plantea una metodologa para la cuantificacin de vitaminas en

margarina por no existir; con la metodologa planteada logr determinar
nicamente la Vitamina A, debido a que el mtodo no fue apropiado para la
Vitamina E. Se llev a cabo por medio de Cromatografa Lquida de Alta
Resolucin, y la validacin se realiz siguiendo los lineamientos de la FDA
(Federal Drug Asociation). Concluy que la metodologa en estudio es precisa,
reproducible, exacta, lineal, selectiva, robusta bajo los cambios y procesos
realizados, adems de determinar el lmite de cuantificacin de 3.01UI/g de
muestra.
1.2
Resumen Crtico del marco terico
1.2.1 Validacin de un mtodo analtico

De acuerdo a la Norma ISO 8502:1994, validacin es la confirmacin mediante
examen y suministro de evidencia objetiva que se cumplen los requisitos
particulares para un uso especfico previsto. Gua EURACHEM, (2005).
De acuerdo a la Gua EURACHEM (2005), consiste en definir una necesidad

analtica para confirmar que el mtodo utilizado tiene la capacidad de desempeo
de acuerdo a la aplicacin. En el proceso de validacin est implcito que el
equipo, reactivos y materiales se encuentran en especificaciones, adems de
estar calibrados, en el caso de los equipos. El analista que realice el estudio
deber ser tcnicamente competente y con los conocimientos suficientes para
tomar decisiones apropiadas a partir de las observaciones que realice durante el
estudio. El mtodo en estudio ser el limitante para el proceso, el desarrollo de la
validacin es dependiente del mtodo a utilizar.
1.2.2 Verificacin
De acuerdo a la Gua Tcnica No.1 del ISPCH (2010), en algunos casos se puede
realizar una validacin menor o verificacin cuando se trate de:
-
Mtodos normalizados.
Mtodos normalizados usados fuera de su alcance propuesto. Ejemplo:

uso en otra matriz.
Ampliaciones y modificaciones menores de mtodos normalizados.

Ejemplo: uso en otros analitos.
Se verifican mtodos previamente validados, que hayan sufrido alguna alteracin

significativa por lo cual deben volver a evaluarse. Estas variaciones pueden ser:
cambio de equipo; cambio de componentes de equipo como columnas y
detectores; cambio analista, y cambio de la matriz que contiene la muestra, entre
otros. Gua Tcnica No.1 del ISPCH (2010)
4
La verificacin comprueba que el laboratorio domina el mtodo de ensayo

normalizado y lo utiliza correctamente, en caso de tratarse de un mtodo
normalizado modificado para la verificacin se requiere slo realizar aquellas
pruebas que indiquen que la variacin realizada no afecta el ensayo. Gua Tcnica
No.1 del ISPCH (2010).
1.2.3 Propsito de la validacin
Segn la Gua EURACHEM (2005), de forma general hay dos propsitos

principales por los que se debe
validar un mtodo: la importancia de las
mediciones analticas y segundo el deber profesional del qumico analtico.
Importancia de las mediciones analticas
Alrededor del mundo se realizan millones de mediciones por diversos motivos,

entre ellos se pueden mencionar: evaluacin de bienes para propsitos de
comercio; como apoyo a la salud; verificar la calidad del agua o alimentos para el
consumo humano; en anlisis forenses de fluidos corporales en investigaciones
criminales, y anlisis de minerales en la industria minera, entre otras.
Implcitamente cada aspecto de la sociedad est apoyado de alguna forma por
mediciones analticas, Gua EURACHEM (2005).
Estas mediciones tienen un costo, adems surgen costos de las decisiones

tomadas en base a los resultados de dichas mediciones. Por ejemplo, las pruebas
que muestran que algn alimento no es adecuado para su consumo pueden
resultar en demandas por compensacin; pruebas que confirmen la presencia de
drogas prohibidas que podran ocasionar multas, encarcelamiento o ms an, la
ejecucin en algunos pases. Claramente es importante determinar el resultado
correcto y ser capaz de demostrar que lo es, Gua EURACHEM (2005).
El deber profesional del qumico analtico
De acuerdo a la Gua EURACHEM (2005), si el resultado de una prueba no es

confiable entonces tiene poco valor y la prueba no debi haberse realizado bajo
ese procedimiento.
Si un cliente pide un trabajo analtico a un laboratorio, se presupone que el

laboratorio es tcnicamente competente, con la experiencia y conocimientos para
realizar el trabajo. Regularmente el cliente no posee los conocimientos que el
laboratorio posee, l espera confiar en los resultados reportados y por lo general
slo los cuestiona cuando surge una controversia. Gua EURACHEM (2005).
De este modo, el laboratorio y su personal tienen una clara responsabilidad de

corresponder a la confianza del cliente proporcionando la respuesta correcta a la
parte analtica del problema y proporcionando resultados que han demostrado ser
adecuados a su propsito.
Esto lleva implcito que las pruebas realizadas son apropiadas para la parte
analtica del problema que el cliente desea resolver y que el informe final presenta
los datos analticos de tal manera que el cliente pueda entenderlos fcilmente y
sacar conclusiones apropiadas. La validacin del mtodo permite a los qumicos
demostrar que el mtodo es adecuado. Gua EURACHEM (2005).
Para que un resultado analtico concuerde con el propsito requerido, el

desempeo del mtodo debe validarse y debe estimarse la incertidumbre del
resultado a un nivel de confianza dado. La incertidumbre deber ser evaluada y
establecida de una forma que sea ampliamente reconocida, consistente de forma
interna y fcil de interpretar. La mayor parte de la informacin requerida para
evaluarla se puede obtener durante la validacin del mtodo.
Parte del conocimiento que debe tener el analista qumico y el laboratorio es la

toma adecuada de las muestras, la cual es un trabajo de gran habilidad que
requiere entender el problema con su qumica asociada. Gua EURACHEM
(2005).
Segn dicha gua, se debe validar un mtodo cuando sea necesario verificar que
sus parmetros de desempeo son adecuados para el uso en un problema
analtico especfico.
Por ejemplo:
-
Nuevo mtodo desarrollado para un problema especfico.
Mtodo ya establecido revisado para incorporar mejoras o extenderlo a un

nuevo problema.
Cuando el control de calidad indica que un mtodo ya establecido est

cambiando con el tiempo.
Mtodo establecido usado en un laboratorio diferente, diferentes analistas o

con diferente instrumentacin.
Para demostrar la equivalencia entre dos mtodos, por ejemplo, entre un

mtodo nuevo y uno de referencia.
El alcance de la validacin o la revalidacin requerida depender de la naturaleza

de los cambios hechos al aplicar un mtodo a diferentes laboratorios,
instrumentacin, operadores y circunstancias en las cuales el mtodo va a ser
utilizado.
1.2.4 Proceso para validar
El laboratorio que utiliza un mtodo es responsable de asegurar que el mtodo

est validado adecuadamente y si es necesario llevar a cabo trabajo adicional
para complementar los datos ya existentes, Gua EURACHEM (2005).
Cuando un mtodo ha sido validado por una organizacin de aprobacin de

normas, como la AOAC Internacional, por lo general, el usuario necesitar
nicamente establecer los datos de desempeo del mtodo para su propio uso.
La Gua EURACHEM (2005), menciona que el laboratorio tiene que decidir cules
de los parmetros de desempeo del mtodo necesitan caracterizarse con el fin
de validar el mtodo. La caracterizacin del desempeo del mtodo es un proceso
costoso pero puede restringirse por consideraciones de tiempo y costo.
Al empezar con una especificacin analtica considerada cuidadosamente, se

tiene una buena base sobre la cual planear el proceso de validacin, pero se sabe
que en la prctica esto no siempre es posible.
El laboratorio deber aplicarlo bajo sus condiciones con las restricciones

impuestas, tomando en cuenta las necesidades del cliente, la experiencia
existente sobre el mtodo y la necesidad de compatibilidad con otros mtodos
similares que ya estn en uso dentro del laboratorio o en otros laboratorios, Gua
EURACHEM (2005).
Una serie especfica de experimentos proporcionar informacin sobre varios

parmetros, por lo tanto con una planeacin cuidadosa puede minimizarse el
esfuerzo requerido para obtener la informacin necesaria. Gua EURACHEM
(2005).
1.2.5 Requisitos Analticos

Frente a un problema analtico particular, idealmente, el laboratorio debera
acordar con el cliente una necesidad analtica, la cual definir los requisitos de
desempeo que un mtodo debe tener para ser adecuado para resolver el
problema analtico.
En respuesta a esta necesidad, el laboratorio puede evaluar si los mtodos

existentes son adecuados, si es necesario desarrollar un nuevo mtodo, o
modificar mtodos existentes. Gua EURACHEM (2005).
1.2.6 Revisin de los mtodos de ensayo
De acuerdo a la OGA-GEC-016, (2007), para cada sector tcnico, la alta direccin

debe nombrar a una persona experimentada como responsable de la revisin de
los mtodos, con el fin de incluir modificaciones, actualizaciones o desarrollar e
implementar nuevos mtodos.
Para confirmar que el mtodo se ajusta al uso previsto en el laboratorio es

necesario determinar su desempeo conforme una combinacin de las siguientes
tcnicas, segn lo establecido en la nota 2 del numeral 5.4.5.2 de la Norma
COGUANOR NTG/ISO/IEC 17025, adoptada por la OGA como un criterio de
acreditacin para laboratorios de ensayo y calibracin:
La calibracin utilizando patrones de referencia o materiales de referencia.
La comparacin con resultados obtenidos por otros mtodos.
Las comparaciones interlaboratorios.
La evaluacin sistemtica de los factores que influyen en el resultado.
La evaluacin de la incertidumbre de los resultados basada en el

conocimiento cientfico de los principios tericos del mtodo y en la
experiencia prctica. OGA-GEC-016, (2007).
Aun cuando se haya realizado la validacin del mtodo, el laboratorio tendr que
verificar peridicamente que se cumplen los parmetros de desempeo
documentados por parte de la organizacin que lo desarroll, modific y/o public.
Para esta verificacin el laboratorio puede utilizar, por ejemplo, muestras

inoculadas o materiales de referencia incorporados a las matrices ms
representativas. Tambin tiene que tomar en cuenta los resultados obtenidos de
las auditoras internas y externas de sus sistemas de gestin, dejando registro de
las verificaciones, OGA-GEC-016, (2007).
En el documento de la OGA-GEC-016, (2007), menciona que la documentacin

referente a la modificacin, actualizacin, validacin y verificacin del mtodo
debe incluir registros de la determinacin de los parmetros de desempeo,
limitaciones de su aplicabilidad, procedimientos para control de calidad, calibracin
y control de documentos. Estos registros deben estar disponibles a solicitud de los
miembros del equipo evaluador durante las visitas en sitio, ya sea de evaluacin
para la acreditacin, seguimiento o reevaluacin.
Los procedimientos y responsabilidades para el desarrollo, validacin, verificacin

e implementacin de los mtodos deben ser descritos en detalle dentro de la
documentacin del sistema de calidad del laboratorio.
1.2.7 Seleccin de los Mtodos de Ensayo
Es responsabilidad del laboratorio utilizar los mtodos apropiados para el

propsito, segn el alcance requerido. Estos mtodos pueden ser normalizados,
no normalizados o desarrollados por el propio laboratorio.
El laboratorio, de comn acuerdo con el cliente, puede seleccionar los mtodos

utilizando su propio criterio o utilizar aquellos mtodos normalizados vigentes en el
pas. Si el mtodo es normalizado debe demostrar que ste corresponde a la
ltima edicin, a menos que sea apropiado o posible el uso de una versin anterior
del mtodo. Gua EURACHEM,(2005).
10
Adicionalmente se debe establecer un sistema para evaluar la factibilidad de

implementar los posibles cambios introducidos en las nuevas versiones del
mtodo, determinando las diferencias en cuanto a equipo, formacin del personal,
instalaciones, y dems aspectos necesarios para la ejecucin del ensayo.
Figura No.1 Eleccin, desarrollo y evaluacin de mtodos
Fuente: Gua EURACHEM,(2005)
1.2.8 Mtodos Normalizados

Las normas de calidad y regulaciones frecuentemente requieren el uso de
mtodos normalizados. A la vez, el uso de mtodos normalizados es deseable en
situaciones en las que el mtodo ser ampliamente utilizado; sin embargo,
algunas veces el laboratorio puede contar con un mtodo propio ms adecuado
para el propsito. Los mtodos normalizados deben ser utilizados por el
laboratorio exactamente como estn descritos.
11
1.2.9 Mtodos No Normalizados

Los mtodos no normalizados deben estar apropiadamente validados para poder
utilizarlos, ya sean stos desarrollados por un tercero o resultado de la
modificacin de un mtodo normalizado. En el caso de modificaciones, es
necesario demostrar que stas no tienen una repercusin sobre la calidad de los
resultados.
De acuerdo a la gua OGA-GEC-016, (2007), el laboratorio debe desarrollar un
procedimiento de ensayo que incluya al menos la siguiente informacin, previo a la
utilizacin de un nuevo mtodo:
-
La identificacin apropiada.
El alcance.
La descripcin del tipo de objeto a ensayar o a calibrar.
Los parmetros o magnitudes a ser determinados y los rangos

correspondientes.
Los aparatos y equipos, incluyendo los requisitos de desempeo tcnico.
Los patrones de referencia y materiales de referencia requeridos.
Las
condiciones
ambientales
requeridas
cualquier
perodo
de
estabilizacin necesario.
-
La descripcin del procedimiento, incluyendo: La colocacin de marcas de

identificacin, manejo, transporte, almacenamiento y preparacin de tems
la verificacin a realizar antes de comenzar el trabajo, la verificacin que el
equipo est trabajando apropiadamente y, cuando sea necesario, ajustar y
calibrar el equipo antes de cada uso, el mtodo de registro de las
observaciones y los resultados, las medidas de seguridad a observar.
Los criterios o requisitos para la aprobacin o el rechazo.
Los datos a ser registrados y el mtodo de anlisis y presentacin.
La incertidumbre o el procedimiento para estimarla.
Adems, la documentacin del mtodo debe incluir las especificaciones

principales resultantes de la validacin. OGA-GEC-016, (2007).
12
1.2.10 Mtodos Desarrollados por el Laboratorio

Cuando sea el caso, el laboratorio debe demostrar que tiene un plan en el que se
incluye la evaluacin de su capacidad en cuanto a personal, equipo y dems
recursos que le permitan desarrollar mtodos propios. Los mtodos desarrollados
por el laboratorio deben estar adecuadamente validados, documentados y
autorizados antes de su uso. Cuando sea posible, se debe emplear material de
referencia con una matriz equivalente a la de la muestra, o bien debe utilizarse un
mtodo de ensayo normalizado alterno, preferiblemente de diferente principio de
medicin, para comparar los resultados. OGA-GEC-016, (2007).
1.2.11 Parmetros de desempeo del mtodo

Son las propiedades, caractersticas o capacidades cuantificables del mtodo que
indican su grado de calidad, se pueden incluir:
exactitud,
exactitud relativa,
desviacin, desviacin positiva, desviacin negativa, efecto matricial, repetibilidad,

precisin intermedia, reproducibilidad, especificidad, lmite de deteccin, lmite de
cuantificacin, linealidad, rango, sensibilidad, robustez y otras caractersticas
relacionadas con los resultados obtenibles por el mtodo, OGA-GEC-016, (2007).
Selectividad o Especificidad
De acuerdo al Instituto Nacional de Chile (2010), La selectividad es el grado en

que un mtodo puede cuantificar o cualificar al analito en presencia de
interferentes. Generalmente los interferentes se encuentran en la matriz de
anlisis. La prueba de selectividad puede disearse de acuerdo al mtodo, en el
caso de cromatografa la resolucin entrega informacin sobre la selectividad del
mtodo, en el caso de espectrofotometra el espectro de absorcin o un espectro
de masas entrega informacin al respecto, en especial cuando es comparado en
presencia de una interferencia.
13
Una prueba de Selectividad comnmente utilizada, consiste en analizar un mnimo

de tres reactivos, tres blancos de matriz y tres muestras o estndares de
concentracin conocida del analito de inters. Gua Tcnica No.1 del ISPCH
(2010).
Se deben comparar las lecturas obtenidas para cada caso, y observar si existen
variaciones entre los testigos reactivos, blancos de matrices y estndares o
muestras con analito. Si se encuentran diferencias significativas debern ser
identificadas y en lo posible eliminadas. Gua Tcnica No.1 del ISPCH (2010).
Linealidad
De acuerdo en la Gua Tcnica No.1 del ISPCH (2010), La linealidad es la

capacidad de un mtodo de anlisis, dentro de un determinado intervalo, de dar
una respuesta o resultados instrumentales que sean proporcionales a la cantidad
del analito que se habr de determinar en la muestra de laboratorio.
Para determinar el rango lineal se puede realizar mediante una grfica de

concentracin versus respuesta, donde la respuesta en el caso de cromatografa
corresponde al rea identificada. La funcin determinada por la regresin de la
grfica se conoce como Funcin Respuesta o Recta de calibrado, luego de
establecido el rango, se determina la Curva de calibracin, que incluir los valores
analizados desde el valor cero.
La curva de calibracin se debe realizar cada vez que se trabaje el mtodo, con
diferentes puntos, incluyendo blanco y el material de referencia de concentracin
conocida. Se recomienda abarcar valores cercanos al cero y valores superiores al
valor de inters. El nmero de puntos a analizar deber ser establecido por el
analista de acuerdo a la Gua Tcnica No.1 del ISPCH (2010).
14
Generalmente el criterio de aceptacin cualitativo que se usa para determinar la

linealidad es el coeficiente de correlacin: El coeficiente de correlacin indica el
grado de relacin entre la variable concentracin X y la variable respuesta Y de la
curva de calibracin. El valor mximo de 1 indica una correlacin positiva perfecta
entre X,Y con una pendiente positiva. Cuando r = 0, no existe correlacin alguna,
independencia total de los valores X,Y.
De acuerdo a la Gua Tcnica No. 1 del ISPCH (2010), en la prctica si r tiene un

valor cercano a uno 1, esto significa que existe correlacin con una probabilidad
elevada. Para una curva de calibracin o trabajo, es recomendable que el
coeficiente de correlacin obtenido sea mayor o igual a 0.999, aunque para el
caso de trazas se admite un valor igual o mayor que 0.99.
Adicionalmente como un mejor indicador se puede realizar una evaluacin de

curva de calibracin global, haciendo repeticiones de la curva en las mismas
condiciones, realizando una evaluacin estadstica de prueba t-Student.
Se calcula un valor de t con n-2 grados de libertad, de t para el nivel de confianza

requerido del 95% ( = 0.05), dos-colas, en este caso para un n que depende de
los niveles de calibracin.
Se desea probar si existe entonces una correlacin significativa: La hiptesis nula

H0 es que no existe correlacin entre X,Y. Si el valor observado de tr es mayor que
tcrtica, se rechaza la hiptesis nula H0, siendo la correlacin lineal significativa con
la probabilidad calculada. Fuente Gua Tcnica No.1 del ISPCH (2010).
H0: r=0, El coeficiente de correlacin obtenido procede de una poblacin cuya

correlacin es cero.
H1: r0, El coeficiente de correlacin obtenido procede de una poblacin cuya
correlacin es distinto de cero.
15
Se rechaza la hiptesis nula, las variables estn relacionadas.

Se acepta la hiptesis nula, las variables no estn relacionadas.
tcrtica se determina por medio de las tablas para un nivel de confianza del 95%
para grados de libertad n-2, por conocer el valor de la media y de la desviacin
estndar.
| |
1
Fuente: Gua Tcnica No.1 del ISPCH (2010).
Dnde:
tr = Valor del estimador t Student obtenido para el coeficiente de correlacin
| r | = Valor absoluto del coeficiente de correlacin
n2 = Nmero de grados de libertad
r2 = Valor del coeficiente de determinacin
Lmite de deteccin (LDD)
De acuerdo a la Gua EURACHEM (2005), bajo la AOAC, el lmite de deteccin

es: El menor contenido que puede medirse con una certeza estadstica razonable.
O bien el menor contenido de analito, si est presente, que ser detectado y que
puede ser identificado.
Este parmetro de desempeo ha sido utilizado cuando el mtodo estudiado

abarca concentraciones pequeas a niveles de trazas, aunque tambin es un
parmetro necesario para determinar el lmite de deteccin. Dado a su
funcionalidad existen confusiones debido a que no existe actualmente un acuerdo
universal sobre la terminologa aplicada.
16
El trmino lmite de deteccin no es aceptado ampliamente aunque se usa en

varios documentos sectoriales. La ISO utiliza como un trmino general valor
mnimo detectable de la variable de estado definida. Fuente: Gua EURACHEM
(2005). De acuerdo a la Gua EURACHEM (2005). El lmite de deteccin no existe
criterio de aceptacin, ya que depende del propsito de la metodologa empleada,
pero se puede determinar con la muestra en concentracin cercana al blanco.
El primer paso para determinar el lmite de deteccin es calcular el valor crtico, el

cual se determina con un nivel de confianza del 95%, con grado de libertad infinito,
el cual es de 1.645.
!"2"
LC=Valor crtico
3.29 "
LOD=Lmite de deteccin
S=Desviacin estndar
&=Media
' =Datos obtenidos de cada lectura

-
Lmite de cuantificacin
El lmite de cuantificacin(LDC) estrictamente es la concentracin ms baja del

analito que puede ser determinada con un nivel aceptable de precisin de
repetibilidad y veracidad. Tambin se define por diversas convenciones como la
concentracin del analito correspondiente al valor del blanco de muestra ms 5, 6
10 desviaciones estndar de la media del blanco. Fuente: Gua EUROCHEM
(2005).
17
Exactitud
De acuerdo a la Gua Tcnica No.1 del ISPCH (2010) (Pg. 39), Bajo el manual
del Codex Alimentarius, define la exactitud como el grado de concordancia entre el
resultado de un ensayo y el valor de referencia. El trmino exactitud est
aplicado a un conjunto de resultados de un ensayo, y supone una combinacin de
componentes aleatorios y un componente comn de error sistemtico o sesgo.
Al ser aplicado a un mtodo de ensayo, la exactitud se refiere a la combinacin de

veracidad y precisin. Se puede ejemplificar de acuerdo a la Fig.No.2, los crculos
equivalen al rango en que se espera el valor de referencia, y los puntos a los
resultados analticos. Mientras ms veraz y preciso sea, el mtodo tendr una
exactitud alta. EURACHEM (2005).
Figura No.2 Esquema tiro al blanco para definir exactitud
18
Dado que la exactitud depende de dos variables, dentro del plan de validacin
debe establecerse la forma de evaluacin. Para analizar la veracidad se puede
determinar el sesgo o el porcentaje de recuperacin, mientras que la precisin por
medio de repetitibilidad y reproducibilidad.
Sesgo
De acuerdo a Gua Tcnica No.1 del ISPCH (2010) es la diferencia entre la

expectativa relativa a los resultados de un ensayo o una medicin y el valor
verdadero. En la prctica el valor convencional de cantidad puede sustituir el valor
verdadero. El sesgo es el error sistemtico total en contraposicin al error
aleatorio.
Para determinar el sesgo puede utilizarse material de referencia, material

fortificado o material control. Se debe medir un analito de concentracin conocida
y se determina la diferencia en valor absoluto entre el valor conocido y la media
del valor obtenido.
-
Recuperacin
De acuerdo a la Gua Tcnica No.1 del ISPCH (2010), es la fraccin de la

sustancia agregada a la muestra (muestra fortificada) antes del anlisis, al ser
analizadas muestras fortificadas y sin fortificar. La recuperacin permite ver el
rendimiento de un mtodo analtico en cuanto al proceso de extraccin y la
cantidad del analito existente en la muestra original. Por lo cual, la recuperacin
esta intrnsecamente relacionada a las caractersticas de la matriz de la muestra.
Se recomienda realizar a lo menos 6 mediciones de cada uno en lo posible en tres

niveles. Se debe considerar al elegir estos niveles el rango de la curva de
calibracin del mtodo, el LDD y el LMP (Lmite mximo permitido) establecido. De
manera que los niveles seleccionados permitan entregar la mejor informacin
posible respecto a la capacidad de recuperacin del mtodo, en cuanto a estos
valores crticos.
19
Precisin
La precisin podr establecerse en trminos de repetibilidad y reproducibilidad. El

grado de precisin se expresa habitualmente en trminos de imprecisin y se
calcula como desviacin estndar de los resultados (Referencia: Manual Codex
Alimentarius 18 Ed.)
a) Repetibilidad:
Es la precisin bajo las condiciones de repetibilidad, es decir, condiciones donde
los resultados de anlisis independientes se obtienen con el mismo mtodo en
tems de anlisis idnticos en el mismo laboratorio por el mismo operador
utilizando el mismo equipamiento dentro de intervalos cortos de tiempo. Se puede
determinar registrando a lo menos 6 mediciones bajo las mismas condiciones
(mismo operador, mismo aparato, mismo laboratorio y en corto intervalo de
tiempo) de un analito en un Material de Referencia. Calcular la desviacin
estndar (S) y el porcentaje de coeficiente de variacin (CV%). Gua Tcnica No.1
del ISPCH (2010).
b) Reproducibilidad:
Es la precisin bajo las condiciones de reproducibilidad, es decir, condiciones
donde los resultados de los anlisis se obtienen con el mismo mtodo en tem
idnticos de anlisis en condiciones diferentes ya sea de laboratorio, diferentes
operadores, usando distintos equipos, entre otros. Se puede determinar por medio
del coeficiente de Horwitz, o el valor de HorRat. El valor de HorRat es la razn del
coeficiente de variacin de las rplicas dentro del coeficiente de variacin de
Horwitz. Gua Tcnica No.1 del ISPCH (2010)
-
Rango
De acuerdo a la Gua EURACHEM (2005), es necesario determinar el intervalo de

concentraciones del analito o los valores de la propiedad relacionada, sobre los
cuales el mtodo puede aplicarse. Esto se refiere al intervalo de concentraciones o
a los valores de la propiedad relacionada, de las disoluciones medidas.
20
En el extremo inferior del intervalo de concentracin, los factores limitantes son los
valores del lmite de deteccin y/o cuantificacin, depende del mtodo para que
estos sean el extremo inferior del rango.
Otra forma de establecer el rango es la siguiente: en el extremo superior del

intervalo de concentracin, las limitaciones sern impuestas por varios efectos que
dependen del sistema de respuesta del instrumento. El rango se puede determinar
por medio de la curva de calibracin, la cual contendr los puntos necesarios para
evaluar la linealidad del mtodo, adems de evaluar la menor concentracin a la
que se pueda obtener resultados precisos, y la concentracin mayor que se tome
como valor lmite mximo. Gua EURACHEM (2005).
-
Robustez
La Gua Tcnica No.1 del ISPCH (2010), menciona que la robustez es una medida
de la capacidad del mtodo analtico de no ser afectado por variaciones pequeas
pero deliberadas de los factores del mtodo.
Este parmetro de desempeo proporciona una indicacin de la fiabilidad del

procedimiento en un uso normal, optimiza el mtodo analtico desarrollado o
implementado por el laboratorio, para describir bajo qu condiciones analticas se
pueden obtener a travs de este mtodo resultados confiables.
Un mtodo de ensayo es ms robusto entre menos se vean afectados sus

resultados frente a una modificacin de las condiciones analticas. Entre las
condiciones analticas que podran afectar a un mtodo se encuentran: analistas,
equipos, reactivos, pH, temperatura, tiempo de reaccin, estabilidad de la muestra
y otros, Gua Tcnica No.1 del ISPCH (2010).
Para poder determinar qu factores afectan al mtodo se aplica el Test de Youden

y Steiner, el cual permite evaluar el efecto de siete variables con slo ocho anlisis
de una muestra.
21
Inicialmente se deben identificar aquellos factores del mtodo que posiblemente

afectaran los resultados finales obtenidos a travs de este, Gua Tcnica No.1 del
ISPCH (2010).
Ejemplo de factores que pueden afectar: temperatura, composicin de fase mvil o

soluciones reactivas, pH de solucin, tamao de celda espectrofotomtrica, flujo
gas acarreador, split, y otros. Para estudiar la robustez se procede a exponer a
cada factor a un estudio variable, cada variable se estudia mediante un valor alto
(A, B, C) y otro bajo (a,b,c). Los factores a estudiar no deben ser necesariamente
siete; puede considerarse un nmero menor de variables.
Tabla No1. Gua de matriz para evaluacin de Test de Youden y Steiner

Valor de la
A,a
B,b
C,c
D,d
E,e
F,f
G,g
Resultado
Y1
Y2
Y3
Y4
Y5
Y6
Y7
Y8
variable
Se deben establecer las siete comparaciones posibles, es decir las diferencias

entre la variable de mayor valor versus la de menor valor:
(
+ , + , +- , +.
+/ , +0 , +1 , +2
Gua Tcnica No.1 del ISPCH (2010).

22
De este modo se puede conocer el efecto de cada variable. En este sentido,

cuanto mayor sea la diferencia de los resultados entre el valor mayor y el valor
menor, mayor influencia tendr dicha variable en el mtodo analtico.
Como criterio de aceptacin para la robustez del mtodo se considera que la

diferencia entre el valor alto y el valor bajo sea superior a la raz cuadrada de dos
de la desviacin estndar del mtodo (S), es decir:
3
Gua Tcnica No.1 del ISPCH (2010).
Test Youden y Steiner modificado para tres variables
Cuando no se puedan evaluar 7 variables se puede realizar con menos variables,

en el caso de esta investigacin se realizaron con 3 variables.
Tabla No.2 Matriz para evaluacin de Test de Youden y Steiner modificada

Experimento
Factores
Resultados
Y1
Y2
Y3
Y4
Fuente: Zagal.E, Sadzawka. A. (2009).
Para calcular la diferencia entre cada factor se realiza de la misma manera,

nicamente que con n=2.
+ , +2
23
Incertidumbre
De acuerdo a la Gua Tcnica No.1 del ISPCH (2010), es el parmetro asociado al

resultado que caracteriza la dispersin de los valores que razonablemente pueden
ser atribuidos al mesurando. Es importante para un mtodo validado o verificado
por el laboratorio, se realice la determinacin de las diferentes fuentes o
componentes de la incertidumbre de la medicin presentes:
Muestreo
Efectos de la muestra: tipo de matriz, almacenamiento, entre otros.
Sesgos Instrumentales: Las debidas a las caractersticas de los equipos

utilizados para realizar las medidas tales como: resolucin, magnitudes de
influencia.
Analista:
las
debidas
la
serie
de
mediciones:
variaciones
en
observaciones repetidas bajo condiciones iguales.

-
Condiciones de medicin: las debidas al certificado de calibracin: en l se

establecen las correcciones y las incertidumbres asociadas a ellas, para un
valor de k (factor de cobertura) determinado, en las condiciones de
calibracin.
Mtodo (por ejemplo, al interpolar en una recta), tablas (por ejemplo, las
constantes), pesada, alcuota, efectos computacionales. Gua Tcnica No.1
del ISPCH (2010
Para este fin se deber realizar una evaluacin de las incertidumbres tipo A y B
que estn presentes en el mtodo:
Evaluacin de incertidumbre tipo A: evaluacin de un componente por un

anlisis estadstico de los valores de mediciones obtenidos en condiciones
de medicin definidas. Ejemplo: realizar varias mediciones en condiciones
de repetibilidad.
24
Evaluacin de incertidumbre tipo B: evaluacin de un componente

incertidumbre de la medicin realizada por otros medios distinto a los del
tipo A. Ejemplos: La evaluacin basada en la informacin, obtenidos a partir
de un certificado de calibracin. Gua Tcnica No.1 del ISPCH (2010).
1.2.12 Cromatografa Lquida de alta resolucin (HPLC)

De acuerdo a Skoog (2007), la cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC) es
el tipo de cromatografa de elucin ms verstil y ampliamente utilizado. Los
qumicos la emplean para separar y determinar especies qumicas de diversos
materiales orgnicos, inorgnicos y biolgicos. En cromatografa lquida, la fase
mvil es un disolvente lquido que contiene la muestra como mezcla de solutos.
Hay diferentes tipos de cromatografa lquida, que suelen clasificarse segn el

mecanismo de separacin o el tipo de fase estacionaria:
1. Cromatografa de reparto o de lquido-lquido.

2. Cromatografa de adsorcin o de lquido-slido.
3. Cromatografa de intercambio de iones o inica.
4. Cromatografa de exclusin molecular.
5. Cromatografa de afinidad.
6. Cromatografa quiral.
25
Figura No.3 Componentes del cromatgrafo lquido de alta resolucin
Fuente: Skoog. (2007)
Instrumentacin
a) Bomba
De acuerdo a Skoog (2007), la bomba debe cumplir ciertos requisitos: capacidad
para generar presiones de hasta 6000 psi, salida libre de pulsos, velocidad de flujo
de 0.1-10ml/min, reproducibilidad relativa de los flujos de 0.5% o menor y
resistencia a la corrosin por diversos disolventes.
Skoog (2007), menciona que existen tres tipos de bombas: de tipo jeringa
impulsada con tornillo, las bombas de vaivn u oscilantes y las bombas
neumticas o de presin constante. Las de tipo jeringa producen una salida no
pulsada cuya velocidad de flujo se controla con facilidad, de baja capacidad de
250ml, por lo tanto no son apropiadas con cambios en los disolventes.
26
Las bombas de vaivn son las ms utilizadas. Consisten en una pequea cmara
cilndrica que se llena y se vaca con el movimiento oscilante de un pistn. El
movimiento de la bomba produce un flujo pulsado que debe atenuarse despus.
Una de sus ventajas es que tiene un volumen interno pequeo, una presin de
salida alta hasta de 10,000psi, fcil adaptacin a la elucin en gradiente y una
velocidad de flujo constante, Skoog (2007).
La bomba neumtica tiene una forma ms sencilla y cosiste en un recipiente

plegable que contiene un disolvente que puede presurizarse con un gas
comprimido; son sencillas, de bajo costo y no generan pulsos, pero tienen una
capacidad y una salida de presin limitadas, su velocidad de bombeo si depende
de la viscosidad del disolvente, y no son adaptables a la elucin en gradiente,
Skoog (2007).
-
Sistema de inyeccin manual de muestras
El ms utilizado se basa en un bucle de muestras, existen intercambiables con

diferentes tamaos que varan de 5 a 500L.
Figura No.4 Sistema de inyeccin manual de muestras
Fuente: Skoog (2007)

-
Columnas
Usualmente se elaboran con tubos de acero inoxidable, o tubos de vidrio o Tygon

para aplicaciones de baja presin. La mayora tienen una longitud de 10-30 cm y
dimetro interno de 2-5 mm, y con empaques de partculas de 3-10 m.
27
El empaquetamiento ms comn se prepara con partculas de slice, que se

sintetizan por aglomeracin de partculas submicrnicas de slice en condiciones
que producen partculas ms grandes y de dimetro muy uniforme.
Las partculas resultantes suelen cubrirse con pelculas orgnicas finas, que se
enlazan qumica o fsicamente con la superficie. Tambin existen columnas
empacadas de almina, de polmeros porosos o resinas de intercambio inico,
Skoog (2007).
Para asegurar que los lquidos que ingresen a la columna estn libres de
contaminantes o partculas que desgasten la columna, se colocan precolumnas,
en las cuales su composicin de empaquetamiento es similar a la de la columna
analtica, pero con un tamao de partcula mayor para minimizar la cada de
presin. Skoog (2007).
Adems, para asegurar y obtener mejores cromatogramas se puede mantener

constante la temperatura de la columna a unas dcimas de grado Celsius. Para
esto los cromatgrafos tienen incluidos calentadores para asegurar la temperatura.
-
Detectores
Caractersticas de un detector: debe ser pequeo y compatible con el flujo de

lquido, el tipo de detector depende de la naturaleza de la muestra. Existen
diferentes tipos de detectores: estn los detectores por absorbancia, fluorescencia,
electroqumico, ndice de refraccin, conductividad, espectrometra de masas,
FTIR, dispersin de luz, actividad ptica entre otros. Skoog (2007). En
cromatografa lquida los ms utilizados son por absorcin de radiacin ultravioleta
o visible, siendo algunos con lmpara de deuterio o de filamentos de tungsteno
con filtros de interferencia.
28
Existen dos tipos de cromatografa muy importantes, los cuales dependen de la

polaridad de la fase mvil y de la fase estacionaria. Se encuentra la cromatografa
en fase normal, donde la fase estacionaria es polar y la fase estacionara es no
polar. En la cromatografa en fase reversa ocurre lo contrario, la fase estacionaria
es no polar, en muchos casos hidrocarburos, mientras que la fase mvil es un
disolvente
relativamente
polar
como
el
agua,
metanol,
acetonitrilo
tetrahidrofurano. Skoog (2007).
1.2.13 Vitamina A
De acuerdo a Gil (2010), la vitamina A es un nutriente de gran importancia. Su
deficiencia es la causa ms comn de enfermedades oculares como la
xeroftalma, que puede llevar a la ceguera, principalmente a nios de pases en
vas de desarrollo. Debido a esto y al mayor riesgo de padecer infecciones, la
deficiencia de esta vitamina es responsable del aumento de la morbilidad y la
mortalidad infantiles.
Adems, es antioxidante provocando un efecto protector frente a los procesos de

oxidacin celular mediados por radicales libres implicados en la aparicin de
enfermedades crnicas como el cncer, aterosclerosis, cataratas e incluso
envejecimiento.
La vitamina A est implicada en un gran nmero de procesos fisiolgicos, por lo

que es necesario que sus requerimientos se cubran adecuadamente, Gil (2010).
De acuerdo a la FDA, el valor diario recomendado es de 5,000 UI, o bien 1,500
gER, para la poblacin a partir de los 3 aos de edad. RTCA 67.01.60:10.
Segn Gil (2010), la vitamina A es un trmino genrico que se utiliza para describir
a los compuestos que presentan la actividad biolgica del retinol, como los
retinoides y los carotenoides con actividad provitamnica A.
29
La vitamina A fue la primera vitamina en ser definida; en 1915 la vitamina fue

denominada por McCollum y Davis factor liposoluble A, atribuyndole como
propiedad principal la estimulacin del crecimiento. En 1920 Drummond le asign
el trmino Vitamina A, aunque no fue aislada hasta 1937 por Morton.
De acuerdo a Gil (2010), en 1930 Moore mostr que la molcula del beta caroteno
presentaba actividad vitamnica A y desde entonces hasta ahora han sido
numerosas las funciones fisiolgicas que se le han atribuido, tanto al beta
caroteno como al resto de compuestos englobados en la denominacin de
vitamina A.
Los retinoides con actividad vitamnica A se encuentran en la naturaleza en tres

formas: alcohol (retinol), aldehdo (retinal o retinaldehdo) y el cido (cido
retinico). Adems del todo trans-retinol, otros cinco ismeros (7-cis, 9-cis, 11-cis,
13-cis y 9,13-cis-retinal) tienen actividad vitamnica A pero menor a los ismeros
trans, Gil (2010).
Las formas con mayor actividad fisiolgica son el retinal y el cido retinoico. En los
vegetales no existe como tal, pero s sus provitaminas o precursores carotenoides,
de los cuales existen ms de 500, siendo el ms importante el -caroteno. En la
conversin del -caroteno en vitamina A, ocurren reacciones de oxidacinreduccin, transformndose en retinal, luego en retinol, para finalmente
almacenarse en el hgado como palmitato. En teora, la ruptura enzimtica de los
dos carbonos centrales en la mucosa intestinal liberara dos molculas de retinal,
sin embargo en la prctica esta transformacin no se logra totalmente y slo se
alcanza el 50% de efectividad, Badui (2006).
Otros carotenoides con actividad provitamnica A son el alfa caroteno, el gama

caroteno y la beta criptoxantina., Gil (2010). Los carotenoides pueden ser
clasificados en dos grandes grupos, segn su estructura:
30
Carotenoides con estructura de hidrocarburos o carotenos, que no

contienen oxgeno.
Xantofilas u oxicarotenoides, que contienen grupos carboxilo y/o hidroxilo

en sus grupos constituyentes. Gil (2010).
Gil (2010), menciona que tanto los retinoides como los carotenoides son
liposolubles, y por lo tanto solubles en la mayor parte de solventes orgnicos.
En cuanto a las propiedades fsicas, la mayora de las formas de vitamina A son

compuestos cristalinos con un punto de fusin relativamente bajo y debido a su
estructura presentan un espectro de absorcin caracterstico que se utiliza para su
identificacin.
Por sus propiedades fisicoqumicas, esta vitamina es estable al tratamiento

trmico moderado as como a los agentes reductores y al medio alcalino. Sin
embargo, es muy sensible a la luz, la oxidacin, la isomerizacin y la
polimerizacin, debido a su estructura de dobles enlaces conjugados. En general,
los steres son ms estables que las formas alcohlicas y los carotenoides son
menos estables que los retinoides, Gil (2010).
-
Fuentes de alimentacin
La vitamina preformada se encuentra nicamente en alimentos de origen animal,

ya sea en sitios de almacenamiento, como el hgado, o relacionada con la grasa
de la leche y los huevos; en concentraciones altas se puede encontrar en el aceite
de bacalao y de pez hipogloso. Mahan y Escott.(2001).
Los carotenoides de provitamina A se encuentran en verduras oscuras, o de hojas

amarillas naranja y en frutas, los colores ms intensos se relacionan con mayores
concentraciones de carotenoides.
31
En el mundo la mayor pare de vitamina A alimentaria la aportan carotenoides. Las

zanahorias, sopas de verduras, vegetales de hojas verdes y mixtas, espinaca,
ensalada verde, jugo de naranja, camote, estofado de res y el meln constituyen
las 10 fuentes mximas de provitamina A. Mahan y Escott (2001).
Tabla No.3 Formas de expresar el contenido de Vitamina A

Compuesto
Peso molar g
ER/g
g/ER
Retinol
286.5
Acetato de retinol
328.5
0.873
1.15
Palmitato de retinol
524.8
0.546
1.83
Fuente: Bonifaz (2004)

1.2.14 Guayaba
De acuerdo a Geilfus (1994), su nombre cientfico es Psidium guajava, de la
familia de las Mirtceas. La guayaba es originaria de los trpicos americanos,
donde es muy comn encontrarla cultivada o en forma silvestre; se ha difundido a
todos los pases tropicales y subtropicales, donde es uno de los frutos ms
comunes; existen plantaciones comerciales en India, Brasil, Florida, Sudfrica y
California, entre otros.
El rbol de este fruto es pequeo, de 8 a 9 m de alto como mximo, su tronco

crece de forma irregular con corteza lisa, color marrn que se desprende en
placas. Las hojas son alargadas de 8-18 cm de largo, con nervaduras
pronunciadas.
La flor es blanca, de 2.5 cm de ancho; el fruto redondo, alargado o en forma de

pera; mide entre 2.5-10 cm de largo, es amarillo-verde cuando madura. La pulpa
firme, generalmente de color amarillo, encierra una masa jugosa, amarilla o rosada
con numerosas semillas, segn Geilfus (1994).
32
Segn indica Geilfus (1994), la guayaba se utiliza comercialmente en forma de

jaleas, mermeladas, dulces y dems conservas. La pulpa adquiere a veces un
color rojo al cocinarse. Tambin se preparan bebidas enlatadas, sorbetes, helados
o tartas. La madera de su rbol es adecuada para herramientas, adems de ser
utilizada como lea y en preparacin para carbn. Las hojas tienen propiedades
medicinales en particular contra la diarrea y la gastroenteritis.
Geilfus (1994), menciona que la guayaba es una de las frutas tropicales ms

importantes en la nutricin; su contenido en vitamina C vara entre 23mg/100g y
500mg/100g, las variedades comunes contienen en promedio 2 a 5 veces ms
vitamina C que la naranja. Tambin es rica en calcio, fsforo, hierro, vitamina A y
niacina; contiene entre 9 y 29% de carbohidratos segn las variedades.
Las variedades silvestres reproducidas por semillas tienen generalmente frutos

pequeos, cidos, y son los ms apreciados para mermeladas, por su alto
contenido en pectina. Existen numerosas variedades mejoradas, reproducidas por
acodo o injerto. Se agrupan a menudo en guayabas rosadas y guayabas blancas.
La guayaba se adapta a una gran variedad de climas, desde tropical hmedo

hasta mediterrneo. Necesita entre 1000 y 4500 mm de lluvia anual para un
crecimiento normal; resiste hasta 6 meses de sequa.
Un clima hmedo todo el ao favorece las enfermedades y reduce la produccin,

es preferible el clima hmedo con estacin seca, segn Geilfus (1994). Se puede
encontrar hasta cerca de 2000 metros sobre el nivel del mar, pero la produccin
comercial se limita a 1000 metros.
Se adapta a toda clase de suelos, desde arcilloso y compacto hasta arenoso;

prefiere los suelos ligeramente cidos. Los suelos calizos no convienen. Gracias a
su sistema de races profundas se desarrolla bien en suelos pobres, soporta
sequas prolongadas y resiste inundaciones peridicas.
33
Se propaga por semillas, las cuales conservan su poder germinativo durante un

ao. O bien por acodos, el cual es el mtodo ms fcil y ms utilizado para
reproducir variedades mejoradas, donde se escogen ramas de 1cm de dimetro o
ms, y se retira un anillo de corteza de 2.5cm de ancho, y luego se sigue un
proceso de germinacin adecuado. Geilfus (1994).
Los rboles de semilla

milla empiezan a producir en 2 3 aos, los acodos
acod o injertos en
3 aos. Las variedades mejoradas pueden producir de 20
20 a 60 kilos de fruta por
rbol (60 a 500 unidades), mientras los rboles de semilla llegan a una produccin
inferior.
erior. Hay una o dos cosechas al ao dependiendo del clima, segn menciona
Geilfus (1994).
Figura No.5 Variedades mejoradas de la guayaba
Fuente: Geilfus (1994)

34
1.2.15 Guayaba Fresa

Le corresponde el nombre cientfico Psidium Cattleianum,
Cattleianum, pertenece a la familia de
las Mirtceas, conocida bajo otros nombres como: Guayaba japonesa, Guayaba
Peruana. Es originaria de Uruguay y Brasil, se cree que los portugueses la
llevaron a China, luego emigr a Europa, donde fue otorgado el nombre de
Guayaba
aba china. Se cultiva en el Mediterrneo, Hawaii, Florida, California, Mxico
y Centroamrica, segn Geilfus (1994).
Adems Geilfus (1994), menciona que la guayaba fresa crece en forma de
arbusto, el cual puede llegar a ser decorativo en los jardines deb
debido a su altura de
25 pies de alto. Posee hojas brillosas y verde oscuro, generalmente el fruto llega a
medir 3cm de dimetro, de color rojo o incluso amarillas.
La Guayaba Fresa es una especie subtropical, ms resistente al fro que la

guayaba comn. Se adapta
adapta bien a las zonas montaosas a partir de 700 metros
sobre el nivel del mar, se cultiva de preferencia en clima seco, no se adapta a
suelos superficiales, y crece mejor en suelos arcillosos.
Figura No.6 Guayaba Fresa
Fuente: Propia (2014)
35
Se determinaron 204 compuestos en el concentrado del aroma de la guayaba

fresa, en mayor cantidad: etanol, alfa-pineno, (Z)-3-hexenol, (E)-beta-cariofileno y
cido hexadecanico. Investigaciones han determinado que el extracto de la hoja
contiene metabolitos secundarios que tienen propiedades antimicrobianas.
En un estudio con el extracto de la hoja se comprob al aplicar el extracto en

concentracin elevada, que el Streptococcus mutans que creci en biofilm ya no
estaban con vida, segn Lim (2012).
La madera es compacta, pesada, durable y resistente. Se utiliza para trabajos de

torno, mangos de herramientas, carbn y lea. El rbol es indispensable para la
siembra mixta en la reforestacin de las zonas recuperadas y protegidas en Brasil
de acuerdo a Lim (2012).
Figura No.7 Diagrama de posibles transformaciones industriales de la Guayaba y

Guayaba Fresa
Fuente:FAO (2006)
36
II.
Planteamiento del problema
En Guatemala luego del surgimiento de la Ley del Sistema de la Calidad en el ao

2005 con el apoyo del Ministerio de Economa y Salud, aunado a las exigencias
del comercio internacional, los laboratorios de ensayo vieron la necesidad de ser
acreditados bajo la Norma ISO 17025, Requisitos Generales para la competencia
de los laboratorios de ensayo y calibracin, norma para la cual se encuentra en
proceso de acreditarse el Laboratorio CONCALIDAD. En Guatemala actualmente
hay 18 laboratorios acreditados bajo esta norma, de los cuales solamente uno
tiene una metodologa de vitamina A validada para azcar, OGA (2014).
Dentro de sus requisitos la norma solicita que los mtodos utilizados sean
validados, la validacin es necesaria al implementar una nueva metodologa
dentro de un laboratorio de ensayo. Dependiendo de la procedencia de la
metodologa as ser el grado de validacin. Una metodologa desarrollada por el
laboratorio, deber cumplir con una validacin completa, evaluando todos los
parmetros de desempeo que el mtodo requiera.
La Norma establece evaluar nueve parmetros de desempeo para su validacin,

siendo stos: selectividad, linealidad, lmite de deteccin, lmite de cuantificacin,
precisin, exactitud, rango, robustez, e incertidumbre garantizando que los
resultados del mtodo sean confiables. Estos podran variar de acuerdo al grado
de validacin y tambin de lo que la metodologa requiera. Para este proceso se
pueden utilizar diferentes materiales de referencia, los cuales garantizarn que la
metodologa empleada es apta para el propsito final, una vez estos materiales
sean confiables y de preferencia certificados. Esta investigacin aportar una gua
de referencia en la elaboracin de validaciones de mtodos cuantitativos para
alimentos, siendo funcional para diferentes procesos, ya sea gravimtricos o
cromatogrficos.
37
Luego de validar el mtodo, se procedi a determinar el contenido de Vitamina A

en Guayaba Fresa (Psidium Cattleianum), debido a que no existen antecedentes
nutricionales en el pas. Por ser un fruto poco conocido, no existen datos de
consumo y produccin en el pas, esta investigacin es una iniciativa para la
explotacin e investigacin de la Guayaba Fresa.
Adems, la deficiencia en vitamina A ha sido uno de los problemas de mal

nutricin en Guatemala, por lo tanto se han implementado planes de fortificacin,
como la Ley General de Fortificacin de Alimentos, para contrarrestar la falta
vitaminas, como es el caso de la vitamina A. Dada esta necesidad de fortificar los
alimentos, es necesario tambin realizar anlisis confiables que comprueben el
contenido final de vitamina.
Por lo tanto Es vlido en los nueve parmetros establecidos en el plan de

validacin, el mtodo planteado para el anlisis cuantitativo de la Vitamina A
(Retinol) en alimentos? De ser vlido Cul es el valor de Vitamina A presente en
la Guayaba Fresa?
38
2.1
Objetivos
2.1.1 Objetivo General

-
Validar un mtodo analtico por Cromatografa Lquida de Alta Resolucin

con detector Ultra Violeta (HPLC/UV).
2.1.2 Objetivos Especficos

-
Montar un mtodo analtico para la cuantificacin de la Vitamina A (Retinol)

en alimentos.
Determinar la validez del mtodo analtico propuesto por medio de los

siguientes
parmetros
estadsticos:
selectividad,
linealidad,
lmite
de
deteccin, lmite de cuantificacin, precisin, exactitud, rango, robustez e

incertidumbre.
-
Determinar el contenido de Vitamina A en Guayaba Fresa.
Comparar el contenido de Vitamina A en Guayaba Fresa y Blanca.
2.2
Hiptesis
2.2.1 Nula
-
La Guayaba Fresa posee un contenido de Vitamina A mayor o igual que la

Guayaba Blanca.
2.2.2 Alterna
-
La Guayaba Fresa posee un contenido de Vitamina A menor que la

Guayaba Blanca.
2.3
Variables
2.3.1 Variables Independientes

-
Tiempo de saponificacin
Tiempo de desgasificacin
Composicin de fase mvil
Analista
Diluciones del estndar de referencia

39
2.3.2 Variables Dependientes

Parmetros estadsticos para validar el mtodo analtico:
- Selectividad
-
Linealidad
Lmite de deteccin
Lmite de cuantificacin
Precisin
Exactitud
Rango
Robustez
Incertidumbre
Contenido de Vitamina A en el material de referencia
reas de respuesta del estndar de referencia
2.4
Definicin de las variables
2.4.1 Definicin Conceptual

-
Tiempo de saponificacin: magnitud fsica que permite ordenar la secuencia

de los sucesos, estableciendo un pasado, un presente y un futuro. Su
unidad en el Sistema Internacional es el segundo. Real Academia Espaola
(2014).
Tiempo de desgasificacin: magnitud fsica que permite ordenar la

secuencia de los sucesos, estableciendo un pasado, un presente y un
futuro. Su unidad en el Sistema Internacional es el segundo. Real Academia
Espaola (2014).
Composicin de fase mvil: magnitud que expresa la cantidad de una

sustancia por unidad de volumen. Su unidad en el Sistema Internacional es
el mol por metro cbico (mol/m3). Real Academia Espaola (2014.)
Analista: persona calificada con capacidades tcnicas para realizar anlisis

del rea que este especializado. Persona que hace anlisis qumicos o
mdicos. Real Academia Espaola (2014).
40
Diluciones del estndar de referencia: accin de diluir con el fin de disminuir

la concentracin de una disolucin aadiendo disolvente. Real Academia
Espaola.
Parmetros estadsticos para validar un mtodo analtico:

-
Selectividad: la selectividad es el grado en que un mtodo puede cuantificar

o cualificar al analito en presencia de interferentes. Gua No.1 del ISPCH
(2010).
Precisin: grado de concordancia entre resultados obtenidos en mediciones

repetidas de un mismo objeto o de objetos similares, bajo condiciones
especificadas. Gua No.1 del ISPCH (2010).
Exactitud: grado de concordancia entre el promedio de un nmero infinito

de resultados y un valor de referencia. Gua No.1 del ISPCH (2010).
Linealidad: la linealidad es la capacidad de un mtodo de anlisis, dentro de

un determinado intervalo, de dar una respuesta o resultados instrumentales
que sean proporcionales a la cantidad del analito que se habr de
determinar en la muestra de laboratorio. Gua No.1 del ISPCH (2010).
Rango: intervalo de concentraciones de analito dentro del cual se puede

considerar al mtodo validado. EUROCHEM (2005).
Lmite de deteccin (LDD): el menor contenido que puede medirse con una
certeza estadstica razonable. O bien el menor contenido de analito, si est
presente, que ser detectado y que puede ser identificado. Gua
EURACHEM (2005).
Lmite de cuantificacin (LDC): el lmite de cuantificacin (LDC)

estrictamente es la concentracin ms baja del analito que puede ser
determinada con un nivel aceptable de precisin de repetibilidad y
veracidad. EUROCHEM (2005).
Robustez: es una medida de la capacidad de un mtodo para mantenerse

sin cambios ante pequeas pero deliberadas variaciones en sus
parmetros. EUROCHEM (2005).
41
Incertidumbre: parmetro que caracteriza la dispersin de los valores que

podran ser razonablemente atribuidos al mensurando. EUROCHEM (2005).
Contenido de Vitamina A en Material de Referencia: unidades equivalentes

de Retinol presentes por gramo del material de referencia. Gil. (2010.)
reas de respuesta del estndar de referencia: integracin electrnica en

donde un dispositivo digitaliza la seal analgica proporcionada por el
detector, detecta el comienzo y el final de cada pico cromatogrfico, integra
digitalmente el rea bajo la curva y corrige automticamente la lnea base.
Conceptos fundamentales de cromatografa (2014).
2.4.2 Definicin Operacional

-
Tiempo de saponificacin: tiempo que se llev a cabo la reaccin de

saponificacin de las muestras, por medio de una solucin de etanol e
hidrxido de potasio, se vari para el anlisis de robustez.
Tiempo de desgasificacin: tiempo en el cual se colocaron los frascos de

fase mvil en el bao ultrasnico para permitir la extraccin del oxgeno
disuelto en la solucin, variando para el anlisis de robustez.
Composicin de fase mvil: cantidad en mililitros de metanol, propanol, y

agua para la realizacin de la fase mvil, la cual se vari para el anlisis de
robustez.
Analista: tcnico competente que realiz las repeticiones necesarias junto

con el tcnico titular para determinar la reproducibilidad del mtodo,
variable tomada para evaluacin de robustez.
Parmetros estadsticos para validar mtodo analtico.

-
Diluciones del estndar de referencia: seis diferentes diluciones que se

realizaron para determinar la linealidad del mtodo.
Selectividad: interferencias que puede tener el mtodo de anlisis de

Vitamina A, utilizando una muestra de referencia.
Linealidad: capacidad del mtodo analtico para producir resultados que

sean directamente proporcionales a la concentracin de Vitamina A en la
muestra.
42
Lmite de deteccin (LDD): concentracin ms baja de Retinol que se puede

detectar con el mtodo utilizado.
Lmite de cuantificacin (LDC): concentracin ms baja de Retinol que se

puede identificar y calcular.
Precisin: representa la dispersin de los datos en una serie de

repeticiones, la cual puede ser determinada por medio de repetibilidad y
reproducibilidad.
Exactitud: dispersin de datos respecto a un mismo analista y comparando

con un valor de referencia, analizando una serie de repeticiones para la
frmula infantil.
Rango: la concentracin ms baja y alta que se lograr cuantificar por

medio del mtodo de cuantificacin de Vitamina A.
Robustez: dispersin de los datos, luego de realizar interferencias

deliberadas para evaluar posibles cambios en el resultado final del anlisis
de Vitamina A.
Incertidumbre: errores aleatorios que se puedan medir dentro de todo el

proceso de cuantificacin de Vitamina A, desde el pesado de la muestra
hasta la lectura final.
Contenido de Vitamina A en material de referencia: cantidad medida en

*ugER/100g de Vitamina A en el material de referencia que se analiz por
medio del mtodo cuantitativo.
reas de respuesta del estndar de referencia: reas obtenidas a partir de

las diferentes diluciones del estndar, y de las muestras problema, las
cuales son proporcionales al analito presente en las muestras analizada.
43
2.5
Alcances y Lmites
Alcances
Se desarroll un mtodo analtico en cromatografa lquida de alta resolucin

para la determinacin de vitamina A en alimentos, siendo establecido por un
laboratorio privado teniendo los derechos sobre el mtodo validado para su
posterior utilizacin. En la validacin del mtodo se utilizaron dos materiales de
referencia, una frmula infantil por tener datos de referencia del contenido de
vitamina A, y adicionalmente por ser una matriz alimenticia. Y Acetato de Retinol,
este ltimo certificado por ISO 17025 y la GUA ISO 34. Para la determinacin de
las concentraciones para la curva de calibracin, se evalu el valor de vitamina A
ms alto y ms bajo que poda contener una muestra alimenticia.
El estudio abarc el anlisis de los nueve parmetros indicados dentro de los

objetivos de la investigacin, dentro de las instalaciones del laboratorio, con un
analista de apoyo, el cual realiz el mtodo desde el inicio evaluando las
interferencias que podan afectar al mtodo, especficamente en el parmetro de
reproducibilidad.
Cada uno de los parmetros se evaluaron bajo la Gua Tcnica para la

validacin de mtodos del Instituto de Salud Pblica de Chile, debido a que se
adecua al mtodo desarrollado. Apoyndose de la Poltica de validacin de
mtodos de ensayo de la Oficina Guatemalteca de Acreditacin.
Realizada y comprobada la validacin, se determin el contenido de Vitamina A

en la Guayaba Fresa, comparando con datos tericos de la Guayaba Blanca.
44
Lmites
Para la Guayaba Fresa solamente se analiz contenido de Vitamina A, no se

evaluaron todos los parmetros nutrimentales de la fruta, adems se utiliz la
parte comestible, sin tomar en cuenta las semillas. Para el estudio se utilizaron
frutos del municipio de Fraijanes y San Jos Pinula, debido a que la investigacin
no se enfoc a la caracterizacin de la fruta en todo el pas.
No se utiliz como matriz alimenticia la Guayaba Fresa por no existir datos

histricos del contenido de vitamina A para comprobar la confiabilidad del mtodo.
La muestra de frmula infantil fue seleccionada aleatoriamente, optando por una

marca reconocida y avalada internacionalmente; esta muestra de referencia no es
tomada como matriz del mtodo, debido a que la metodologa se pretende utilizar
para diferentes alimentos; para el propsito de esta investigacin. La frmula
infantil fue solamente una muestra de referencia, y se recomienda realizar
posteriores verificaciones con otros alimentos.
El equipo no cuenta con inyector automtico, por lo que la inyeccin de muestras

se realiz de forma manual por dos analistas diferentes para comprobar la validez
del mtodo. No se realiz la inter-comparacin con otro laboratorio por el tiempo y
costo que conllevara la investigacin.
La metodologa fue aplicada nicamente para el anlisis de alimentos no para

productos farmacuticos, por ello se utiliz la Gua Tcnica de Validacin del
Instituto de Salud Pblica de Chile, por tener un enfoque en metodologas de
anlisis de alimentos, pero se fortaleci con la Poltica de validacin de mtodos
de ensayo de la Oficina Guatemalteca de Acreditacin.
45
2.6
Aporte
Al laboratorio privado, un mtodo validado y verificado para la cuantificacin de

Vitamina A en alimentos, cumpliendo con los requisitos solicitados por la OGA
para ser un ensayo apto para acreditacin en un futuro.
A los laboratorios de anlisis de alimentos en Guatemala, un nuevo mtodo con el

propsito de ampliar la diversidad de opciones de mtodos de anlisis de Vitamina
A.
A la industria alimenticia, garanta de los resultados de sus formulaciones y de los

registros
nutricionales
regidos
por
la
FDA,
el
Reglamento
Tcnico
Centroamericano (RTCA). Adems, a la industria alimenticia se dar a conocer

sobre la Guayaba Fresa, fruto potencial de ser industrializado.
A Guatemala, dando a conocer a la Guayaba fresa, cultivada en dos regiones del

departamento
de
Guatemala,
difundiendo
ms
el
consumo
entre
los
guatemaltecos. Adems de poder verificar el contenido de Vitamina A en los

alimentos, mejorando el nivel de deficiencia de dicha vitamina en los
guatemaltecos.
A los estudiantes, fuente de investigacin para continuar la caracterizacin sobre

la Guayaba Fresa.
A la Universidad Rafael Landvar, aportando una herramienta para el diseo de

metodologas de anlisis de alimentos en cromatografa lquida de alta resolucin.
Y una gua para realizar el proceso de validacin para metodologas analticas
cuantitativas.
46
III.
3.1
Mtodo
Sujetos y Unidades de Anlisis
Para la realizacin de la investigacin se recolect informacin de diversas

fuentes, a continuacin se describen.
Sujetos
-
Personas que tienen experiencia en el campo de estudio: Lic. Ana Luisa

Mendizbal (Investigador Laboratorio de Instrumentacin Qumica Analtica,
Centro de Ingeniera, Bioqumica, Instituto de Investigaciones, Universidad
del Valle de Guatemala. Lic. Gabriela Zelada (Proyectos de documentacin
para la acreditacin bajo la Norma ISO 17025).
Unidades de Anlisis
-
Instituto de Salud Pblica de Chile

Gua Tcnica para la Validacin de mtodos y clculo de incertidumbre,
elaborada con la supervisin del Sr. Leonardo Merino de la National Food
Administration de Suecia.
OGA
Oficina Guatemalteca Acreditacin, en su poltica: OGA-GEC-016 Poltica
de Seleccin y Validacin de Mtodos de Ensayo.
Norma ISO 17025, Requisitos generales para la competencia de

laboratorios de ensayo y calibracin
Norma bajo la cual se tomaron los nueve parmetros para validar el
mtodo, para cumplir con los requisitos de acreditacin.
AOAC
Metodologas internacionales y normalizadas como gua para el diseo del
mtodo de cuantificacin de Vitamina A.
Metodologa para la cuantificacin de Vitamina A, por cromatografa lquida

de alta resolucin con detector UV, la cual fue evaluada para confirmar su
validez.
47
Valores Nutritivos de los Alimentos de Centroamrica, Primera y Segunda

Seccin 1996, Oficina Panamericana de la Salud (OPS), Instituto de
Nutricin de Centro Amrica y Panam (INCAP).
Acetato de Retinol, material de referencia certificado para la cuantificacin

de Vitamina A, se utiliz como estndar de referencia para el estudio de
linealidad, selectividad, repetibilidad, reproducibilidad, lmite de deteccin y
cuantificacin, y rango.
Frmula infantil, muestra de referencia para la cuantificacin de Vitamina A,

utilizada para la evaluacin de los parmetros de selectividad, sesgo y
robustez.
Guayaba fresa, muestra problema con ausencia de datos histricos de su

contenido de vitamina A.
Guayaba Blanca, dato de referencia para comparar el contenido de

vitamina A con la guayaba fresa.
Cromatogramas, de los cuales se obtuvieron los valores de rea y tiempo

de retencin para identificar y cuantificar el retinol en las muestras
analizadas.
48
3.2
Instrumentos
Tabla No.4 Instrumentos utilizados en la metodologa

Equipo
Estufa con
agitacin
Descripcin
Imagen
Heating Magnetic Stirrer

Velp Scientifica. Max
400C, 1200rpm.
Mettler Toledo. Modelo:

Balanza
analtica
AB204
Maxx 210g Min= 10mg
Incertidumbre=0.000
Incertidumbre=0.00005g
Bao
Labline, Modelo: 9303
Ultrasnico
Transsonic
460/H.
Temporizador:
15min.
Temperatura:
mxima
80C.
49
Licuadora
Oster,
Modelo:blender
clasic
Bomba
al Gast.
vaco
Modelo
DOADOA
P104-AA.
AA.
Volts 115, Amp 4.2, Hz
60
Cromatgrafo
Agilent 1100 Series Hp,
UV
lquido de alta con detector UV-Visible,
resolucin
Bomba
Isocrtica,
Columna Zorvax Eclipse

Plus C18, 3x150mm de
3.5-micrones.
micrones.
50
Sistema
de Hp
Computo
Compac,L1506.
Software
ChemStation.
ChemStation.(19992003)
Tabla No.5 Materiales utilizados en la metodologa
Cristalera
Erlenmeyer
A. 100ml1ml
Erlemneyers
utilizados
B. 50ml1ml
de
para
ra
vidrio
el
tipo
pyrex,
proceso
de
saponificacin y para recibir la muestra

extrada.
Pipetas
C. 100.02ml
Pipetas de vidrio tipo pyrex, utilizadas

para medir los volmenes para las
D. 5ml0.01ml
diluciones y adicionar reactivos.

reactivos
E. 1ml0.01ml
51
Balones aforados
F. 250.3ml
G. 200.04ml
Balones de material tipo pyrex, para

realizar
H. 100.025ml
todas
las
diluciones
del
estndar de referencia.
I. 50.025ml
Probetas
Probetas
J. 1000.1ml
de
material
tipo
pyrex,
utilizadas para medir los diferentes

K. 500.01ml
volmenes de los solventes.
Viales
Viales mbar para almacenar la
L. 5ml
muestra extrada de vitamina A.
52
Ampolla de decantacin
250ml
Ampolla de vidrio tipo pyrex utilizada

para separar la fase orgnica en el
proceso de extraccin de la vitamina A.
Mortero y Pistilo
De
porcelana,
utilizado
para
homogenizar las muestras antes de

pesar.
53
Frascos de dilucin
500ml
Frascos de vidrio tipo pyrex que se

utilizaron para almacenar la fase mvil.
Sistema de Filtracin al vaco
500ml
Sistema de filtracin de vidrio tipo pyrex,

utilizado para filtrar la fase mvil.
54
Tabla No.6 Otros materiales

Otros materiales
A. Pesa muestras
B. Esptula
C. Filtro Albet-NY-045-47-BL
D. Econofilter, Regen,Cellulose 25/0.45m
E. Jeringas estriles plsticas
F. Jeringa para HPLC, de 50L
Tabla No.7 Reactivos

Reactivo
Descripcin
Acetato de Retinol
Material Certificado ISO 17025, Gua

No. 34
Pyrogallol
Grado analtico
Agua desmineralizada
Grado HPLC y analtico
Etanol absoluto
Grado analtico
Hidrxido de potasio
Grado analtico
Hexano
Grado analtico
2-Propanol
Grado HPLC
Metanol
Grado HPLC
Sulfato de sodio anhidro
Grado analtico
55
3.3
Procedimiento
3.3.1 Procedimiento para la cuantificacin de Vitamina A
Homogenizacin de muestras
Muestra de Guayaba Fresa

-
Homogenizar la muestra de Guayaba Fresa, por medio de la trituracin con

el mortero y pistilo, luego licuar hasta obtener una mezcla homognea, y
por medio de un colador separar las semillas.
Realizar la homogenizacin inmediatamente antes de utilizarla para el

anlisis, cubrir con papel aluminio la cristalera que se utilice para que no
est expuesta a la luz.
Preparacin de soluciones
Pyrogallol: pesar el reactivo en un baln aforado de 5ml. Adicionar hasta el

aforo etanol absoluto.
Hidrxido de potasio: pesar el Hidrxido de potasio en lentejas, trasvasar a

un baln de diluciones del volumen que se quiera utilizar y adicionar poco a
poco agua desmineralizada, hasta aforar.
Fase mvil: la composicin de la fase mvil ser: 50:45:5, Metanol:2Propanol:Agua. Todos los reactivos deben ser grado cromatogrfico.
Mezclar los solventes en un frasco de dilucin de 500ml. Filtrar al vaco con
el filtro Albet-NY-045-47-BL , desgasificar por 30min en el bao ultrasnico.
Soluciones de Limpieza: medir 250ml de Metanol, y adicionarlo a un frasco

de dilucin del mismo volumen. Por aparte medir 250ml de agua, y
adicionarlo a un frasco de dilucin. Filtrar por separado, con un filtro AlbetNY-045-47-BL diferente para cada reactivo, y des-gasificar con bao
ultrasnico por 30min.
56
Preparacin de estndar
-
Pesar en un erlenmeyer de acetato de retinol, con una exactitud de 0.001g
Adicionar etanol, Pyrogallol, y por ltimo la solucin de Hidrxido de

Potasio.
Mezclar la solucin, cubrir con papel aluminio todo el erlenmeyer.
Ebullir durante 30min, cuidando que no se evapore la solucin. Luego

enfriar a temperatura ambiente.
Trasvasar la solucin saponificada a una ampolla de decantacin, tambin

cubierta con papel aluminio, lavar el erlenmeyer con agua destilada. Luego
adicionar
hexano,
cerrar
cuidadosamente
la
ampolla,
liberar
constantemente el gas con la perilla,

-
Luego de la extraccin, dejar separar la fase acuosa y orgnica. Descartar

la mayor parte de la fase acuosa.
Colocar en un Erlenmeyer de 50ml sulfato de sodio anhidro. Trasvasar la

fase orgnica al recipiente con el agente secante.
La solucin que se reciba filtrarla en una jeringa estril, con un filtro

Econofilter,Regen.Cellulose 25/0.45um , y recibir en un vial mbar. Guardar
en refrigeracin si no se va utilizar inmediatamente.
Preparar las soluciones del estndar para la curva de calibracin, con las
concentraciones de 10gER/ml, 7.5gER/ml, 5gER/ml, 2.5gER/ml,
1gER/ml, 0.1gER/ml.
Preparacin de muestras
Material de referencia
-
Pesar 4.3g de la muestra ya homogenizada a temperatura ambiente, en un

erlenmeyer de 250ml. Adicionar agua desmineralizada.
Muestra problema
-
Pesar 10g de la muestra ya homogenizada a temperatura ambiente, en un

Erlenmeyer de 250ml. Adicionar agua desmineralizada.
Adicionar etanol, Pyrogallol, y por ltimo la solucin de Hidrxido de

Potasio.
57
Mezclar la solucin, cubrir con papel aluminio todo el erlenmeyer.
Ebullir durante 30min, cuidando que no se evapore la solucin. Luego

enfriar a temperatura ambiente.
Trasvasar la solucin saponificada a una ampolla de decantacin, tambin

cubierta con papel aluminio, lavar el erlenmeyer con agua destilada. Luego
adicionar
hexano,
cerrar
cuidadosamente
la
ampolla,
liberar
constantemente el gas con la perilla,

-
Luego de la extraccin, dejar separar la fase acuosa y orgnica. Descartar

la mayor parte de la fase acuosa.
Colocar en un Erlenmeyer de 50ml sulfato de sodio anhidro. Trasvasar la

fase orgnica al recipiente con el agente secante.
La solucin que se reciba filtrarla en una jeringa estril, con un filtro

Econofilter,Regen.Cellulose 25/0.45um , y recibir en un vial mbar. Guardar
en refrigeracin si no se va utilizar inmediatamente.
3.3.2 Procedimiento de lectura en el cromatgrafo lquido de alta resolucin, a

longitud de onda de 325nm
-
Estabilizar el equipo durante 60min, corriendo la fase mvil.
Realizar las inyecciones de las muestras con 15L, alternando, 6

inyecciones de muestra, y una de fase mvil. Utilizar una jeringa para la
muestra y otra para la fase mvil.
Tomar las lecturas que se encuentren entre 3.5-3.7min.
Ajustar a la lnea base el rea con la funcin del programa ChemStation.
Descartar las reas que no formen parte del Retinol.
Determinar el promedio de las lecturas que se realicen para cada muestra.
Luego de realizar todas las inyecciones, colocar las soluciones de limpieza

en la bandeja de solventes y conectar al cromatgrafo, 15min en Agua
desmineralizada, grado HPLC, 15 min de solucin Metanol:Agua, y 30min
Metanol HPLC. Terminado el proceso de limpieza, apagar el equipo.
Realizar con los datos obtenidos los clculos correspondientes para

determinar el contenido de vitamina A en las muestras.
58
3.4
Diseo y Metodologa estadstica
3.4.1 Diseo Experimental

3.4.2 Experimentos, tratamientos y repeticiones
Experimento No.1, Determinacin de Selectividad del mtodo:

Se determin utilizando el blanco, material de referencia y material de referencia
certificado.
Para
determinar
posibles
interferencias,
analizando
los
cromatogramas, analizando tiempo de retencin y el rea.
Experimento No.2, Determinacin de lmite de deteccin:

Se determinaron 6 repeticiones con la concentracin ms baja que se pueda medir
del material de referencia certificado.
Experimento No.3, Determinacin de lmite de cuantificacin:

Se analiz de acuerdo al Experimento No.2 con el valor de las 6 repeticiones.
Experimento No.4, Determinacin de linealidad:

Se realizaron 6 corridas con el material de referencia certificado, con 6
concentraciones diferentes. (10, 7.5, 5, 2.5, 1, 0.1) gER/ml.
Experimento No.5, Determinacin del rango:

Por medio del experimento No.3 y 4, se determin la concentracin ms baja y
alta que se puede cuantificar.
Experimento No.6: Determinacin de la Exactitud:

Se evaluaron dos parmetros para poder determinar la exactitud, estos son:
veracidad y precisin. La precisin se midi por medio de repetibilidad y
reproducibilidad.
59
Veracidad: se realizaron 6 corridas con el material de referencia y se

determin el sesgo entre el valor reportado y el valor determinado por
medio del mtodo analtico.
Repetibilidad del mtodo: se realizaron 6 repeticiones bajo las mismas

condiciones, concentracin de estndar, analista, equipo, realizando los
anlisis durante la misma semana.
Reproducibilidad: se realizaron 6 repeticiones con la muestra de referencia,

en dos das diferentes con diferente analista cada da. La concentracin del
material de referencia fue constante para los dos das, analizando la
muestra desde el inicio de la saponificacin y extraccin, hasta la lectura en
el cromatgrafo lquido de alta resolucin.
Experimento No.7, Determinacin de Robustez

Para este anlisis se midi por medio de la variacin del factor del tiempo de
saponificacin, desgasificacin y el cambio de analista.
Tiempo de Saponificacin: 30 y 15 minutos, se realizaron dos corridas por

cada variante.
Tiempo de desgasificacin: 30 y 15 minutos, se realizaron dos corridas por

cada variante.
Cambio de analista: Se realizaron 6 repeticiones realizando el anlisis

desde el inicio con la misma concentracin de estndar.
Experimento No.8, Determinacin de Incertidumbre

Se evaluaron los errores sistemticos y aleatorios que se midieron a lo largo de los
experimentos No.4 y No.6.
Experimento No.9, Determinacin de vitamina A en guayaba fresa

Se recolectaron 1000g de muestra de la cual se homogeniz 100g, de la muestra
homogenizada se tomaron 10g para el anlisis, realizando el procedimiento
mencionado para su extraccin y cuantificacin, el anlisis se realiz por triplicado.
60
3.4.3 Descripcin de las unidades experimentales

-
Concentracin del material de referencia certificado, Acetato de Retinol, que

se variar dependiendo del parmetro que se quiera analizar.
Frmula infantil, con la cual se comprob el mtodo al poseer datos

histricos del valor de vitamina A, el cual se encuentra reportado en la
etiqueta.
Guayaba fresa, se determin el valor de vitamina A, expresada en micro

gramos de equivalentes de retinol, gER/100g.
3.4.4 Variables respuestas

Para cada uno de los experimentos se obtuvo resultados de tiempo de retencin y
rea de los picos los cuales se determinaron por medio del cromatograma. Cada
valor corresponde a una concentracin especfica del contenido del analito en las
muestras.
61
3.4.5 Metodologa de anlisis
Experimento No.1, Selectividad

Clculo de la media de los datos obtenidos y comparacin del blanco, frmula
infantil y material de referencia, analizando cualquier interferencia.
'
&
Dnde:
&=Media
' =Sumatoria de los datos obtenidos.
n= Nmero de lecturas o valores observados.
Experimento No.2, Lmite de deteccin

Para su clculo debe de determinarse en primera instancia el valor crtico el cual
se determina con un nivel de confianza del 95%, con grado de libertad infinito, el
cual es de 1.645. Luego se calcul la media y desviacin estndar, utilizando la
concentracin de material de referencia ms baja que se pudo medir.
'
&
!"2"
LC=Valor crtico
3.29 "
LDD=Lmite de deteccin
S=Desviacin estndar
&=Media
' =Datos obtenidos de cada lectura
n= Nmero de lecturas o valores observados.
62
Experimento No.3, Lmite de cuantificacin

Se determin calculando el producto de la desviacin estndar del experimento
No.2 por 10. Canadian Health Protection Branch (CHPB), Establece que el lmite
de cuantificacin es el mejor estimado de una concentracin baja, que derive en
una desviacin estndar relativa de aproximadamente 10%, en, al menos, seis
rplicas.
LDC = 10 S
Experimento No.4, Linealidad

Se realiz una grfica donde se evalu el comportamiento de la curva y estableci
la curva de calibracin. Se graficaron los datos de las concentraciones del material
de referencia estimadas (x), versus la lectura de las reas observadas (y). El
primer criterio de aceptacin fue con el coeficiente de correlacin r0.99 y r20.99.
Para confirmar la linealidad del mtodo, se realiz una evaluacin estadstica de
prueba t-Student. Se calcul un valor de t con n-2 grados de libertad y se compara
con el valor tabulado de t para el nivel de confianza requerido ( = 0.05), doscolas, en este caso para un n que depende de los niveles de calibracin.
Se desea probar si existe una correlacin significativa: La hiptesis nula H0 es que

no existe correlacin entre X e Y. Si el valor observado de tr es mayor que tcritica,
se rechaza la hiptesis nula H0, siendo la correlacin lineal significativa con la
probabilidad calculada. Fuente: Gua Tcnica No.1, ISPCH (2010).
| |
1
Dnde:
tcritica= Valor del estimador t Student crtico, para = 0.05 y n-2
|r| = Valor absoluto del coeficiente de correlacin
63
n 2 = Nmero de grados de libertad, Se estable n-2 debido a que se conoce la

media y desviacin, perdiendo dos grados de libertad.
r2 = Valor del coeficiente de determinacin.
Experimento No.5, Rango

El rango se determin por medio de la curva de calibracin.
Experimento No.6, Exactitud

Se determin por medio de los dos parmetros establecidos Sesgo y Precisin.
Sesgo
En este caso existe una diferencia sistemtica importante cuando el sesgo es

mayor, cuanto ms pequeo es el sesgo, mayor veracidad indica el mtodo
&=Valor obtenido en cada corrida
&
&
& =Valor terico del material de referencia
Se calcula de la siguiente manera:
&
&
Dnde:
tcalc= t calculado
Xa=Valor medio asignado al material de referencia
X=Valor medio de todas las lecturas realizadas
S= Desviacin estndar de las lecturas obtenidas
n= Nmero de lecturas o valores observados
64
Para evaluar el sesgo, se realiz la prueba t, en la cual el tcalc < tcrit. Buscar tStudent terico en la Figura de Anexos No.9 para un nivel de confianza de 95%,
con (n-1) grados de libertad debido a que se conoce la media, perdiendo un grado
de libertad.
Precisin
Con los
datos
obtenidos
de las
rplicas para evaluar repetibilidad y
reproducibilidad, se realiz el anlisis de Horwitz, para una concentracin de

10ppm. El valor de aceptacin se fij como CV<5%, para el factor de repetibilidad.
Para reproducibilidad el valor de aceptacin se determin por medio del factor de
HorRat, el cual es:
!89:
; <
@A B)
=./ 6:>?
!8
!89:
; <
Fuente: CODEX 2009
Dnde:
CVHorwitz=Coeficiente de variacin de Horwitz.
CV=Coeficiente de variacin de las mediciones realizadas.
C=Concentracin del analito expresada en decimales.
Experimento No.7, Robustez
Se utiliz el mtodo de Youden y Steiner, modificado para dos variables con 4

repeticiones. Como criterio de aceptacin para la robustez del mtodo se
considera que la diferencia entre el valor alto y el valor bajo sea superior a 2 de
la desviacin estndar de la precisin del mtodo (S), es decir:

C
+ , +-
+ , +.
65
La matriz para las repeticiones ser la siguiente, donde + representa los valores
altos, y los valores bajos.
Tabla No.8 Matriz de evaluacin para determinar robustez

Experimento
Factores
Resultados
Y1
Y2
Y3
Y4
A=Tiempo de saponificacin
B=Tiempo de desgasificacin
Adems de la evaluacin del tiempo de saponificacin y desgasificacin, se

determin la diferencia significativa de las medias al realizar el mtodo con dos
analistas.
Se establecieron las siguientes hiptesis, para dos colas:

Hiptesis alterna, el valor de las medias no son iguales: Ha: X1X2
Hiptesis nula, el valor las medias son iguales: H0, se rechaza si ttcrtica o t-tcrtica
&
:EF
&
J
G H I
I

Dnde:
X1=Media del analista No.1
Scombinada=Desviacin estndar combinada
n1=Nmero de rplicas por el analista No.1
66

La tcrtica se determin con un nivel de confianza del 95%, para dos colas con n-2
grados de libertad dejando fijos los valores de desviacin y media.
Experimento No.8, Incertidumbre
Error tipo A, o aleatorio: Se determin por medio de las repeticiones de las

lecturas realizadas, para la metodologa se determinaron dos errores aleatorios.
-
Error aportado de las 6 repeticiones para la determinacin de la curva de

calibracin, y posteriormente de la ecuacin de la recta.
Error aportado de las 6 repeticiones para la determinacin del contenido de

vitamina A en la frmula infantil.
Ecuacin a utilizar para determinar la incertidumbre estndar:

K
CENAM (2010)
S=Desviacin estndar de las mediciones realizadas.

n=Nmero de repeticiones.
Error tipo B, o sistemtico: Se determin por medio de la incertidumbre aportada

por los equipos y material volumtrico.
-
Balanza analtica
Pipeta volumtrica de 10ml
Se fij el error de la balanza por ser importante el peso de la muestra para realizar
los clculos posteriores, y la pipeta debido a que la cantidad de analito recuperado
puede variar con la cantidad de solvente hexano que se agregue.
67
Distribucin triangular para determinar la incertidumbre estndar de la medicin

del volumen de 10ml:
K
)/2
6
CENAM (2010)
Distribucin rectangular para la determinar la incertidumbre estndar de la
medicin de la cantidad de gramos de muestra:
)
2
Dnde a es el margen de error que indica el fabricante.

Luego de determinar las incertidumbres estndar, se determina la incertidumbre
combinada.
:EF
K
K
KK.
8 MC D , C D , C D , C D
8
8
88.
CENAM (2010)
Con el valor de incertidumbre combinada se procedi a determinar la

incertidumbre expandida con un nivel de confianza del 95%, para un factor de
cobertura de k=2
KN
GG
P"K
:EF
CENAM (2010)
68
Figura No.7 Diagrama de Ishikawa para evaluar las posibles causas de la

incertidumbre del mtodo
69
IV.
Presentacin y Anlisis de resultados

4.1
Diagrama del proceso para el mtodo para la cuantificacin de Vitamina

A por HPLC
Homogenizar
muestra
Preparacin de
pyrogallol en etanol
Pesar 10g de muestra,

agregar etanol,
pyrogallol y KOH
Saponificar la solucin
por 30 min a 70C
Preparacin de fase
mvil. Metanol, 2Propanol-Agua
Enfriar a temperatura
ambiente, trasvasar a
una ampolla de
decantacin
Lavar el recipiente con

agua, adicionar hexano,
y agitar por 5 min
Descartar la fase
acuosa. Recibir en un
recipiente con sulfato de
sodio anhidro la fase
orgnica
La fase orgnica,
filtrarla en una jeringa
con filtro 0.45m, y
guardar en vial mbar,
listo para inyectar.
70
Filtrar y desgasificar en
bao ultrasnico por
30min.
Lectura en el
equipo HPLC
Colocar los frascos de

dilucin de fase mvil
conectado a la sonda al
HPLC
Encender todos los

mdulos del equipo, y
luego la computadora.
Abrir el programa
ChemStation, colocar
en el mtodo de
Vitamina A
Abrir la vlvula de purga
Activar la bomba
durante 15 min.
Desactivar la bomba, y
cerrar la vlvula de
purga.
Activar todos los

mdulos, bomba,
termostato, luz uv, y
detector en el software
Estabilizar el equipo
durante 30-45min, hasta
que la lnea base sea
estable.
Ingresar los datos de la

muestra cada nueva
inyeccin. Inyectar 15L
de muestra.
71
Limpieza del
equipo
Desactivar la bomba, y
cambiar el frasco de
fase mvil por el de
limpieza
Activar la bomba y dejar

fluir por 15min, Agua. Y
luego 30min
Agua,Metanol
Apagar el equipo desde

la computadora, y luego
desde cada uno de los
paneles.
72
4.2
Diagrama del proceso de validacin
Validacin del
mtodo analtico
Determinar el mtodo
para validar, verificar el
procedimiento
Verificar que todos los

reactivos sean de las
condiciones
especificadas
Realizar diagnstico del

estado del equipo a
utilizar.
Determinar los
parmetros para evaluar
Seleccionar la matriz y
el material de referencia
Determinar la
selectividad con un
blanco, material
certificado y referencia.
73
Evaluar la linealidad con

6 repeticiones y 6
puntos para realizar la
curva
Determinar rango, lmite

de deteccin y lmite de
cuantificacin, luego de
determinar la linealidad
Medir la exactitud por

medio del sesgo, con el
material de referencia,
6 repeticiones
Medir reproducibilidad y
repetibilidad con el
material certificado 6
veces con dos analistas
Determinar la robustez
del mtodo cambiando
3 variables
Evaluar los datos

analizados y realizar
modificaciones de ser
necesario
74
4.3
Parmetros de Desempeo
Tabla No.9 Selectividad
Muestra
Media del tiempo de

retencin (min)
----3.64
Media del rea*
Blanco
----Frmula infantil
241.79
Acetato de Retinol
1262.65
(10gER/ml)
*Los valores de rea son adimensionales
3.66
Tabla No.10 Linealidad

Corrida
1
2
3
4
5
6
Media
CV%
Coeficiente de
correlacin
Prueba de t
10ppm
1249.28
1258.20
1262.03
1262.70
1257.30
1287.07
1262.76
1.02
reas*
5ppm
2.5ppm
628.30
323.25
627.54
315.40
627.67
315.80
627.67
316.20
624.25
315.80
643.53
322.49
629.83
318.16
1.09
1.15
7.5ppm
932.96
942.30
937.65
935.60
936.43
931.30
936.04
0.41
0.999
tcrit=2.57, tcalc=63.23
Se acepta la correlacin lineal
*Los valores de rea son adimensionales
75
1ppm
125.70
125.50
125.10
125.20
125.36
132.64
126.58
2.35
0.1ppm
14.25
14.20
14.38
14.23
14.17
13.69
14.15
1.69
Grfica No.1 Determinacin de la Curva de Calibracin, para evaluacin de la

linealidad del mtodo
Concentracin de Acetato de
Retinol vrs rea
1400.00
rea(mAU)
1200.00
1000.00
800.00
y = 125.64x + 1.3933
R = 0.9999
600.00
400.00
200.00
0.00
0
10
12
Concentracin de Acetato de Retinol (ppm)
Tabla No.11 Lmite de deteccin y cuantificacin

Lmite de deteccin (LDD)
Lmite de cuantificacin (LDC)
0.007ER/ml
0.02 ER/ml
Tabla No.12 Repetibilidad

Corrida
1
2
3
4
5
6
Media
Desviacin estndar
CV%
Concentracin de Acetato de Retinol

(gER/ml)
9.93
10.00
10.03
10.04
10.00
10.23
10.04
0.10
1.02
76
Tabla No.13 Reproducibilidad

Corrida
1
2
3
4
5
6
Media
Desviacin estndar
CV%
CV Horwitz
Factor HorRat
Concentracin de Acetato de Retinol

(gER/ml)
10.07
9.93
10.00
10.04
9.97
10.30
10.05
0.13
1.30
11.31
0.12
Tabla No.14 Sesgo con un valor terico de 450 ER/100g
Corrida
1
2
3
4
5
6
Media
Desviacin estndar
Prueba de t
tcritica,( =2%)
Concentracin de
Vitamina A en frmula
infantil
ER/100g
441.97
448.32
445.10
438.30
449.34
446.34
Diferencia
(Valor experimental-Valor
terico)
-8.03
-1.68
-4.90
-11.70
-0.66
-3.66
444.89
4.14
-3.02
-3.36
Se acepta la prueba de t
Tabla No.15 Rango

Lmite Inferior
0.1gER/ml
Lmite Superior
10 gER/ml
77
Tabla No.16 Datos calculados para la determinacin de la robustez

Contenido de Vitamina A
en frmula para
lactantes gER/100g
446.34
438.23
405.89
401.45
422.98
22.61
Corrida
1
2
3
4
Media
Desviacin estndar
2
5.85
Tabla No.17 Conclusin de la robustez del mtodo

Variables para la
evaluacin de
robustez
Valor
& '
Criterio de Aceptacin
& '
2
R2
5.85U
Tiempo de
saponificacin
gER/100g
38.62
Tiempo de
Desgasificacin
gER/100g
1.83
Sensible
No sensible
Tabla No.18 Conclusin de la robustez del mtodo por medio de reproducibilidad y

repetibilidad
Variables para la
Analista No.1
Analista No.2
evaluacin de
Estndar
Estndar
robustez
10 gER/ml
10 gER/ml
Media
10.04
10.05
Prueba t
-0.15
tcrtica(=5%)
-2.78
Se acepta la prueba de t
Tabla No.19 Incertidumbre para la determinacin de vitamina A en frmula infantil
Media
Desviacin estndar
Incertidumbre
combinada
Incertidumbre expandida
78
244.80 gER/100g
4.14 gER/100g
2.50 gER/100g
4.99 gER/100g
Tabla No.20 Incertidumbre para la determinacin de vitamina A en Guayaba Fresa

Media
Desviacin estndar
Incertidumbre
combinada
Incertidumbre expandida
39.60 gER/100g
2.14 gER/100g
1.37 gER/100g
2.73 gER/100g
Tabla No.21 Contenido de Vitamina A en Guayaba Fresa

Contenido de vitamina A en Guayaba
Fresa ER/100g
1
37.21
2
41.35
3
40.23
Media
39.60
Desviacin estndar
2.14
Prueba de hiptesis
tcalc=6.14
tcrtica=4.30
Se acepta hiptesis nula
Corrida
Figura No.9 Cromatograma de anlisis de Guayaba Fresa
79
V.
Discusin
-Montaje de la metodologa para anlisis de vitamina A

El desarrollo de la metodologa para la cuantificacin de vitamina A en alimentos
por cromatografa lquida, se realiz utilizando dos materiales de referencia, uno
certificado y otro no. Como material certificado se utiliz Acetato de Retinol, el cual
es uno de los ismeros con actividad de vitamina A, este se utiliza tanto para
anlisis instrumental como para fortificar alimentos. Luego se utiliz una frmula
infantil de una marca reconocida, esta muestra fue seleccionada aleatoriamente, y
se realiz con este tipo de alimento pues es controlado por el uso final que tiene
dicho producto, adicionalmente existen valores conocidos del contenido de vitamina
A.
La metodologa se realiz de acuerdo a un procedimiento ya existente,

modificndolo en base a metodologas de la AOAC y de normas mexicanas. Las
modificaciones se realizaron con el fin de adecuar el mtodo a las condiciones del
laboratorio. Los tres pilares importantes en el procedimiento de dicha metodologa,
constan de: saponificacin, extraccin, y lectura del analito. Dado que la vitamina A
es una vitamina liposoluble (insaponificable), es necesario saponificar para lograr
romper los enlaces de la grasa dentro del alimento y as extraer eficazmente la
vitamina. La saponificacin se realiza por medio de una solucin de hidrxido de
potasio y de etanol, la cual al reaccionar con las molculas de grasa, rompe los
enlaces formando glicerol y sales de potasio; tambin es fundamental la
homogenizacin correcta de la muestra, en el caso de la frmula infantil, se disolvi
con agua desmineralizada para facilitar que las partculas de grasa estuvieran ms
expuestas y as permitir una mejor saponificacin.
Luego de disolver la muestra se adicionaron los siguientes reactivos: pyrogallol,

etanol e hidrxido de potasio. El pyrogallol es adicionado como antioxidante el cual
reacciona con el hidrxido de potasio y el oxgeno, formando quinonas y nitrgeno,
esto permite que la vitamina no est expuesta al oxgeno previniendo su oxidacin.
80
El tiempo y temperatura de saponificacin tambin fueron vitales, si no se realizaba

en 30 min y a 70C se poda incurrir en prdidas del analito, ya que la vitamina se
encuentra disuelta en los lpidos del alimento, al no saponificar completamente, la
vitamina no se encuentra libre para ser extrada con el solvente apropiado. La
vitamina ms los lpidos saponificables fueron extrados por medio de una
extraccin lquido-lquido con hexano el cual es un solvente apolar, afn a la
vitamina, esta fue la segunda etapa importante dentro de la cuantificacin de
vitamina A.
Otro factor importante en los dos procedimientos antes mencionados, fue la

proteccin de las muestras contra la luz, en la literatura se especifica claramente
que cualquier anlisis de vitaminas debe realizarse con cristalera mbar y bajo
condiciones de luz especficas, pues son altamente sensibles a la luz,
degradndose rpidamente. Este factor hace que el costo del mtodo se eleve, ya
que la cristalera de este tipo es de mayor valor que la cristalera normal. Por lo
tanto para poder proteger las muestras en el proceso de extraccin, se cubri la
cristalera con papel aluminio, el cual fue efectivo para el fin propuesto,
comprobndose al obtener un valor promedio del contenido de vitamina A en la
frmula infantil de 444.89gER/100g cercanos al valor terico de 450gER/100g.
Como ltimo punto importante dentro de toda la metodologa, se encuentra la

realizacin de la fase mvil. Los mtodos de cromatografa lquida de alta
resolucin, son altamente sensibles, y es por este motivo que se han utilizado para
diversos anlisis; la metodologa se realiz en fase reversa, donde la fase mvil es
ligeramente polar, y la fase estacionaria es apolar. Frecuentemente el solvente que
se utiliza para inyectar la muestra debe ser de la misma polaridad de la fase mvil,
en este caso no, se utiliz el solvente donde se extrajo la vitamina, esto porque no
se cuenta con un equipo especial para mantener una evaporacin a temperatura
controlada bajo corriente de nitrgeno, para evitar que se degrade la vitamina. La
polaridad no afect en la resolucin y en el tiempo de retencin del analito, esto se
pudo determinar por medio del anlisis de selectividad.
81
Tambin se debe resaltar que tanto el estndar como la frmula infantil se

saponificaron para determinar el contenido de Vitamina A bajo las mismas
condiciones y como se mencion anteriormente, la saponificacin y extraccin son
parte fundamental del anlisis, es por esto que se realiz todo el procedimiento de
la misma forma.
-Validez por medio de los parmetros de desempeo

Por medio de la evaluacin de los siguientes parmetros de desempeo:
selectividad, linealidad, lmite de deteccin, lmite de cuantificacin, exactitud,
precisin, rango, robustez e incertidumbre, se comprob la validez del mtodo
analtico para cuantificar vitamina A en alimentos por HPLC.
El mtodo es selectivo para Vitamina A, expresado en gER de acetato de retinol,

con un tiempo de retencin promedio de 3.6min, durante la experimentacin se
determin que no existen interferencias significativas dando lecturas correctas. La
evaluacin del blanco se realiz con agua desmineralizada, siendo la seal del
cromatograma cercana a la lnea base, al ser el blanco no se mostr un pico
definido, comprobando la no deteccin del analito. Para la frmula infantil el tiempo
de retencin se encontr dentro de la media, y se observ un pico definido. En este
anlisis si se observaron otros picos pero alejados del tiempo de retencin
establecido por el estndar, por lo tanto se descartaron para el estudio, y dado que
es una muestra compuesta por diversas vitaminas, es posible que alguno de los
picos representara trazas de vitamina E, que en ocasiones se ha podido determinar
simultneamente con la vitamina A, por ser tambin una vitamina liposoluble.
Cada analito tiene un tiempo de retencin especfico en combinacin con la fase

mvil, fase estacionaria, bajo una longitud de onda especfica. El estndar utilizado,
Acetato de Retinol, present actividad en el tiempo de 3.65min, con una longitud de
onda de 325nm, bajo las condiciones del mtodo.
82
Dentro del comportamiento y limitantes del equipo cromatogrfico, los picos que se
mostraron fueron definidos sin interferencias, variando levemente en cada corrida
por la fase mvil, o la forma de inyeccin. Para establecer el tiempo de retencin se
realizaron 6 corridas de la curva de calibracin, la cual se hizo con 6
concentraciones diferentes para lograr determinar la linealidad del mtodo. Las
repeticiones se realizaron en tres das diferentes ya que el equipo no cuenta con
inyector automtico, limitando el tiempo la cantidad de repeticiones por da.
Con los datos obtenidos se determinaron las reas promedio para cada
concentracin (10 gER/ml, 7.5 gER/ml, 5 gER/ml, 2.5 gER/ml, 1 gER/ml, y
0.1 gER/ml), y con ellos se grafic la curva de calibracin (Ver Grfica No.1),
determinando la ecuacin de la recta por medio de Excel, y=125.64x+1.3933, con
un coeficiente de correlacin de 0.999, el cual se encuentra dentro del rango
aceptable para establecer que es lineal, de acuerdo a lo mencionado en la Gua
No.1 del ISPCH (2010). Adems de comprobar la linealidad con la ecuacin y el
coeficiente de correlacin, se determin la prueba de t de Student, se plante como
hiptesis nula que no existe correlacin entre x,y, si el valor de t calculado era
mayor al t crtico se rechazaba la hiptesis, afirmando la correlacin significativa.
Como se observa en la Tabla No.10, la t calculada fue mayor que la crtica,
rechazando la hiptesis nula, aceptando la correlacin de x,y.
El lmite de cuantificacin y de deteccin como se muestran en la Tabla No.11

fueron de 0.02 ER/ml y 0.007ER/ml, respectivamente; ambos valores se
determinaron por medio de los 6 valores obtenidos para la concentracin de 0.1
ER/ml. Sin embargo el rango de anlisis se estableci por medio de la curva de
calibracin con concentraciones de 0.1-10 ER/ml. Al analizar muestras que se
obtengan reas menores al de la concentracin de 0.1, se proceder a realizar el
anlisis con mayor cantidad de muestra para poder realizar la lectura dentro de este
rango. Al igual si una muestra obtiene reas mayores a la de la concentracin de
10, se proceder a diluir la solucin final para inyectar, tomando en cuenta el factor
de dilucin y del peso de muestra en el clculo final.
83
El mtodo tambin es preciso y exacto, la precisin se determin por medio de la

evaluacin de la reproducibilidad y repetibilidad. Para la determinacin de
repetibilidad se realizaron 6 corridas con el estndar de referencia, para una misma
concentracin de 10 ER/ml, con un mismo analista.
De acuerdo a la Tabla No.12 el valor promedio de concentracin fue de 10.04

ER/ml, con una desviacin estndar de 0.10 y un Coeficiente de Variacin de 1.02,
el valor de aceptacin se determin como CV<5, CODEX (CAC/GL 72-2009), por lo
tanto se acept el valor, al obtener un coeficiente de variacin menor de 5.
Tambin se evalu la reproducibilidad la cual se realiz con el estndar de

referencia para una concentracin de 10 ER/ml, y al igual que para la repetibilidad
con 6 corridas, nicamente se cambi el analista, el cual realiz la metodologa
completa. Para este parmetro se determin su aceptacin por medio del
coeficiente de variacin de Horwitz y luego se determin el ndice de HorRat, el cual
de acuerdo al CODEX (CAC/GL 72-2009), establece que el valor de HorRat no
debe ser mayor de 2, por lo tanto se fij como valor de aceptacin el valor calculado
de HorRat<2. Como se observa en la Tabla No.13, el valor fue de 0.12, por lo tanto
se acepta el valor de reproducibiliad.
La exactitud se determin por medio del sesgo, evaluando la frmula infantil, la cual
reporta en su etiqueta un valor de referencia para vitamina A de 450 ER/100g, de
acuerdo a la Tabla No.14, se obtuvo un valor medio de 444.89 ER/100g, con una
desviacin de 4.14. Se determin el valor de t comparando con el valor de
referencia, para este caso se acept el valor medio, al obtener una t mayor a la t
crtica, esto lo indica en Skoog (2007). Se debe resaltar que el valor medio del
contenido de vitamina A en la frmula infantil fue menor al de referencia, pero de
acuerdo al Reglamento Tcnico Centroamericano (67.01.60:10), el valor reportado
en el etiquetado nutricional para micronutrientes, debe al menos contener el 80% de
este valor, por lo que se acepta el valor obtenido pues representa el 98.86% del
84
valor reportado en la etiqueta. Adems se investig el valor de recuperacin que

maneja la empresa productora de la frmula infantil, la cual es del 85%,
comprobndose con dicho valor que el mtodo es apropiado para este tipo de
matriz, al obtener un porcentaje de recuperacin mayor.
Al analizar los valores obtenidos de repetibilidad, reproducibilidad y sesgo, siendo

todos los valores aceptados, se comprob y concluy que el mtodo es exacto y
preciso.
La evaluacin de robustez, se evaluaron dos factores importantes de la

metodologa: tiempo de saponificacin y tiempo de desgasificacin. Adems se
incluy como variable el cambio de analista. La evaluacin se realiz con la frmula
infantil y el estndar de Acetato de Retinol con concentracin de 10ER/ml. De
acuerdo a la Gua No.1 ISPCH (2010), la robustez se determina por medio del test
de Youden y Steiner, en donde los factores que se establecen, se varan con un
valor alto y uno bajo. La dispersin de los datos que poda ocasionar el cambio de
analista se determin por medio de los datos obtenidos para la reproducibilidad y
repetibilidad, analizando si exista diferencia significativa entre los valores de cada
analista.
Para el tiempo de saponificacin se trabaj con 30 minutos y 15 minutos, para el

tiempo de desgasificacin, 30 minutos y 15 minutos. Como se observa en la Tabla
No.17, la variable que mostr sensibilidad fue el tiempo de saponificacin. Al
analizar los datos obtenidos se determin que con un menor tiempo de
saponificacin, se obtuvo menor contenido de Vitamina A en la frmula infantil, por
lo tanto se deber de realizar con tiempo cronometrado y asegurando que la
temperatura sea de 70C para no tener prdida de etanol por evaporacin o bien de
la vitamina, al no completar la saponificacin.
85
El tiempo de desgasificacin no mostr sensibilidad como se observa en la Tabla

No.17, siendo el tiempo de desgasificacin un factor que no influye en el mtodo.
En la Tabla No.18 se indica el resultado final de la comparacin de dos las medias

experimentales, con el Analista No.1 y No.2, el cual se obtuvo un valor de t de 0.15, de acuerdo a la tcrtica=2.78 con un nivel de confianza del 95% y 4 grados de
libertad, se acept la hiptesis nula, comprobando que no hay diferencia
significativa entre las dos medias, siendo el mtodo robusto al cambiar analista.
La incertidumbre del mtodo se determin por medio de dos tipos de errores, tipo A
y tipo B, el tipo A es aleatorio y se puede medir por medio de repeticiones y
estudios estadsticos, el tipo B se determina por medio de datos puntuales que el
fabricante aporta por medio de calibraciones de los equipos e instrumentos. Para el
caso de esta metodologa el tipo de error A se determin con las 6 repeticiones de
las ecuaciones de la curva de calibracin y con las 6 repeticiones para la medicin
de vitamina A en la frmula infantil. El error B se determin por medio del error
aportado por la balanza y la pipeta empleadas. En total se determinaron 4
incertidumbres las cuales al combinarse dio un resultado de 2.50 gER/100g y una
incertidumbre expandida de 4.99 gER/100g, esto para la medicin de la vitamina A
en la formula infantil. Para la guayaba fresa la incertidumbre combinada fue de 1.37
gER/100g y la incertidumbre expandida de 2.73 gER/100g. La incertidumbre
expandida se determin con un factor de cobertura de k=2, para obtener un nivel de
confianza del 95%.
-Contenido de Vitamina A en Guayaba Fresa
Al ser vlido el mtodo se procedi a analizar el contenido de vitamina A en la

Guayaba Fresa, determinando y evaluando la respuesta del analito en el tiempo de
retencin establecido con el estudio de validacin realizado, ver Figura No.9. Luego
de evaluar el tipo de matriz de la Guayaba Fresa se concluy que la lectura del
analito en el tiempo de retencin correspondi a retinol, sin embargo por ser una
86
matriz vegetal la cual contiene diversos carotenoides, algunos con actividad de

vitamina A. El presente mtodo no incluye la deteccin de carotenoides, debido a
que por su estructura pueden tener otro comportamiento con la fase mvil, fase
estacionaria y longitud de onda, adems de no ser comparable con el estndar de
acetato de retinol. El anlisis de los carotenoides no se encuentra dentro del
alcance de este estudio.
Como se observa en la Tabla No.21, el valor medio obtenido fue de

39.60gER/100g con una desviacin estndar de 2.14 gER/100g. Se recomienda
realizar una caracterizacin del contenido de vitamina A en la Guayaba Fresa,
debido a que este va depender del estado de maduracin, condiciones de siembra,
clima y nutrientes de la tierra en dnde se cultive.
Para la prueba de hiptesis se determin una t igual a 6.14, para un nivel de

confianza de 95% y 2 grados de libertad debido a que se realiz en triplicado.
Evaluando la t critica en la Figura No.10 de Anexos, siendo de 4.30, se concluy
que la t crtica fue menor a la t calculada por lo que se acept la hiptesis nula y se
rechaza la alterna.
Concluyendo que la Guayaba Fresa posee un contenido de Vitamina A mayor al

valor medio de Guayaba Blanca, dato terico reportado por el Instituto de Nutricin
de Centroamrica y Panam. La guayaba fresa puede tener un contenido mayor de
vitamina A que la blanca, por ser una fruta con alta pigmentacin, la cual es una
caracterstica de los frutos con mayor contenido de vitamina A.
87
VI.
Conclusiones
1. El montaje del mtodo analtico para Vitamina A por medio de

cromatografa lquida de alta resolucin, en fase reversa, es vlido bajo
todos los parmetros de desempeo evaluados, para un rango de anlisis
de 0.1 gER/ml-10 gER/ml.
2. Es selectivo con un tiempo de retencin promedio de 3.65 minutos. Lineal

con un coeficiente de correlacin r2=0.999, con la ecuacin de la curva
y=125.64x+1.3933. Con lmites de deteccin y cuantificacin de 0.007
gER/ml y 0.02 gER/ml respectivamente.
3. Es preciso y exacto, con un coeficiente de variacin menor del 5% para los

valores de repetibilidad, y un valor de HorRat menor de 2 para
reproducibilidad. Es exacto con desviacin de 4.14 gER/100g, y una t de
-3.02 menor al valor crtico, siendo aceptado el valor.
4. Es robusto, variando analista y tiempo de desgasificacin, es sensible al

tiempo de saponificacin con una diferencia de medias de 38.62.
5. El valor determinado del contenido de vitamina A en la Guayaba Fresa fue

de 39.602.73 gER/100g, tomando en cuenta nicamente la deteccin de
retinol, sin la evaluacin de carotenoides con actividad de vitamina A.
6. El contenido de vitamina A en la Guayaba Fresa es mayor que el de la
Guayaba Blanca, comprobando el valor con la prueba de hiptesis con t
igual a 6.14 siendo mayor del valor crtico, aceptando la hiptesis nula.
88
VII.
Recomendaciones
1. Evaluar el mtodo con diferentes tipos de matriz alimenticia. Harinas,

crnicos, aceites, frutas y vegetales. Para ampliar el alcance del mtodo
con diferentes tipos de matrices. Adicionalmente, obtener un material de
referencia certificado, por un ente avalado internacionalmente, cuando el
laboratorio decida ampliar el alcance de la acreditacin y quiera acreditar el
mtodo para cuantificacin de vitamina A.
2. Crear una matriz para determinar el cambio de peso de muestra

dependiendo del contendido de Vitamina A esperado.
3. Evitar en todo momento la exposicin a la luz y oxgeno innecesaria de la

muestra durante la saponificacin y extraccin. Realizar la lectura lo ms
rpido posible despus de ser extrado el analito. Pero si lo amerita, puede
guardarse en congelador por un da. Se recomienda utilizar cristalera
mbar.
4. Realizar un estudio de la caracterizacin de la guayaba fresa, partiendo de

un muestreo ms amplio en el departamento de Guatemala, para
determinar su contenido nutrimental. Adicionalmente analizar los tipos de
carotenoides de la fruta y los que tengan actividad de vitamina A.
5. Estudiar la factibilidad de la industrializacin y comercializacin de la

guayaba fresa, por ser un fruto potencial de siembra en Guatemala.
6. Cuando el laboratorio quiera acreditar el mtodo, evaluar todos los
requerimientos de la Norma ISO 17025 para que el mtodo sea apto para el
fin propuesto.
89
VIII.
Referencias bibliogrficas
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Traducido en Mxico.
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poblacin a partir de 3 aos de edad
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medicin.CENAM.Mxico.
90
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http://www.emp.uva.es/inf_acad/hermer/estad2/material/e2t_tabla_t_de_student
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17. Vallejo. (2009). Validacin de la Metodologa Analtica para la Cuantificacin de
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Resolucin. Tesis indita. Universidad San Carlos de Guatemala.
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19. Zagal.E, Sadzawka. A. (2009). Implementacin del sistema para la validacin
de los mtodos de anlisis y mediciones de laboratorio en suelos y lodos. Chile.
Universidad de Concepcin Facultad de Agronoma Chilln.
91
IX.
Anexos
Tabla No.21 Datos originales para la determinacin de Selectividad y sesgo.
Tiempo de
Corrida
retencin
(min)
rea
Frmula Infantil
Tiempo de
rea
retencin
Acetato de
(min)
Retinol
3.63
240.2
3.65
1249.28
3.64
243.7
3.66
1258.20
3.64
241.9
3.67
1262.03
3.62
238.2
3.66
1262.70
3.64
244.2
3.66
1257.30
3.64
242.6
3.65
1287.07
Tabla No.22 Datos originales para la determinacin de Linealidad y Repetibilidad

por medio de Acetato de Retinol
rea
rea
rea
rea
rea
rea
0.1gER/ml
1gER/ml
2.5gER/ml
5gER/ml
7.5gER/ml
10gER/ml
14.25
125.70
323.25
628.30
932.96
1249.28
14.20
125.50
315.40
627.27
942.30
1258.20
14.38
125.10
315.80
627.54
937.65
1262.03
14.23
125.20
316.20
627.67
935.60
1262.70
14.17
125.36
315.80
624.25
936.43
1257.30
13.69
132.64
322.49
643.53
931.30
1287.07
Corrida
92
Tabla No.23 Datos originales para la determinacin de Reproducibilidad

Corrida
rea
Acetato de Retinol
1267.00
1249.20
1257.50
1263.20
1253.40
1295.00
Tabla No.24 Datos originales para la determinacin de Robustez

Corrida
rea
Variables
Saponificacin
Desgasificacin
242.60
30 min
30 min
238.20
30 min
15 min
220.70
15 min
15 min
218.30
15 min
30 min
Tabla No.25 Datos originales para la determinacin del contenido de vitamina A en

Guayaba Fresa.
Corrida
Peso g
rea
10.0470
48.40
10.0682
53.70
10.0319
52.10
*Nota: Todos los valores de rea para cada muestra corresponden al valor
promedio obtenido de todas las inyecciones realizadas, adems de ser
adimensionales.
93
9.1
-
Muestra de Clculo
Concentracin de Acetato de retinol:
Masa molar de acetato de retinol: 328.5g/mol

Masa molar de retinol: 286.45g/mol
Masa de estndar utilizado: 0.010g
0.010W (XY ) A ZY BY [ A\
-
W
286.45
BY [ A\
]A\
W
328.5
(XY ) A ZY BY [ A\
]A\
0.00872W BY [ A\
Conversin de g a g
0.008721W BY [ A\
1,000,000W
1W
8,720W BY [ A\
Concentracin de acetato de retinol expresado en equivalentes de retinol

ER
Factor de dilucin 10ml,

!
-
Clculo del
volumen
8,720WaB
10]\
necesario
para
872
WaB
]\
preparar
cada
una
de las
concentraciones para los puntos de la curva de calibracin.
El clculo mostrado es para determinar el volumen necesario para preparar la

concentracin de 10gER/ml, siendo de la misma manera para las dems
soluciones, variando nicamente la cantidad del volumen 2. Cada solucin se
realiz con la anterior, la de 10 se realiz con la de 872, la de 7.5 con la solucin
de 10 y as sucesivamente.
94
8!
V1=x
8!
C1=872 gER/ml
V2=25ml
C2=10 gER/ml
25]\ 10gER/ml
872gER/ml
8
-
0.29]\
Contenido de vitamina A en frmula infantil
Se determin el contenido de vitamina A por medio de la ecuacin de la recta.

g
Dnde:
125.64' , 1.3933
y= rea observada de la muestra

x=Concentracin de vitamina A en gER/ml
Para un rea de 242.60, un peso de muestra de 4.3013g
!A XY
242.60 1.3933
125.64
)X[ ZY 8[ )][ ) (
1.92gER/ml
Determinacin del contendido de vitamina A:
!A Y [ZA ZY 8[ )][ ) (
gER
100g
! i
100
]
Dnde:
C=Concentracin de vitamina A en gER/ml
F=Factor de dilucin, para este caso siempre se diluy en 10ml de hexano.
m=Cantidad en gramos de la muestra analizada.
!A Y [ZA ZY 8[ )][ ) (
jklm
==k
n .o
pqrs
v
tu
..-= ->
95
=E6
100
446.38WaB/100W
*El mismo procedimiento se realiz para determinar el contenido de vitamina A en

la frmula infantil y el la guayaba fresa, cambiando la cantidad en gramos de
muestra.
Clculo de t para determinar linealidad
La hiptesis nula H0 es que no existe correlacin entre (x,y). Si el valor observado

de tr es mayor que tcri, se rechaza la hiptesis nula H0, siendo la correlacin lineal
significativa con la probabilidad calculada. Los datos se obtuvieron de la Grfica
No.1.
| |
Fuente: ISPCH (2010)

Dnde:
|r| = Valor absoluto del coeficiente de correlacin
n 2 = Nmero de grados de libertad
r2 = Valor del coeficiente de determinacin.
|0.999|6
-
0.999
63.23
Clculo de t para determinar el sesgo
En este caso existe una diferencia sistemtica importante cuando el sesgo es

mayor, cuanto ms pequeo es el sesgo, mayor veracidad indica el mtodo
s=sesgo
&
x=Valor obtenido en cada medicin
96
&
448.32WaB/100W
450WaB/100W
1.68WaB/100W
Se calcula de la siguiente manera:

&
Dnde:
&
tcalc= t calculado
Xa=Valor medio asignado al material de referencia
X=Valor medio de todas las lecturas realizadas
S= Desviacin estndar de las lecturas obtenidas
n= Nmero de lecturas o valores observados
450wW/100W
444.89wW/100W
wWaB
/6
4.14
100W
3.02
Clculo del coeficiente de variacin de Horwitz, y el ndice de HorRat
Para una concentracin de 10gER/ml, con un factor de 1x10-6.

!89:
; <
@A B)
=./ 6:>?
!8
!89:
; <
Fuente: CODEX. 2009

Dnde:
CVHorwitz=Coeficiente de variacin de Horwitz.
CV=Coeficiente de variacin de las mediciones realizadas.
C=Concentracin del analito expresada en potencia de 10.
!89:
; <
@A B)
=./ xyk =.====
1.29
11.31
97
0.12
11.31
Clculo de robustez por medio del test de Youden y Steiner y la diferencia

de medias entre dos analistas
Se determin el promedio de cada variacin, con el valor alto y el valor bajo, de los
valores obtenidos del contenido de vitamina A en una muestra de frmula infantil,
ejemplo para el factor del tiempo de saponificacin:
(
)
&z
2
&
2
446.34WaB/100W , 438.23WaB/100W
2
405.85WaB/100W , 401.45WaB/100W
2
442.29WaB/100W
403.67WaB/100W
Luego se determina la diferencia entre el valor alto y el valor bajo. El valor de

desviacin es tomado del anlisis de exactitud, igual a 4.14
(
442.29WaB/100W
25
403.67WaB/100W
38.62gER/100g>5.85
5.85
*Por lo tanto el mtodo es sensible al factor de tiempo de saponificacin.

10.04
10.05
6,6
0.12H
6"6
0.14

Dnde:
Scombinada=Desviacin estndar combinada. (Calculada por medio del programa
Excel)
98
Clculo de t para la prueba de hiptesis del contenido de vitamina A en

guayaba fresa.
&
Dnde:
X=Media o valor determinado

u=Media obtenida del valor terico
S=Desviacin de los valores obtenidos
n=Nmero de repeticiones de los datos obtenidos
39.60WaB/100W 32WaB/100W
2.14WaB/100W
3
6.14
*Nota: Los valores del promedio, desviacin estndar y coeficiente de variacin

para cada repeticin fueron determinados por medio del programa Excel.
Clculo de incertidumbre
Se determinan los factores que influyen en el clculo del contenido de vitamina A

por medio de la ecuacin final:
!A Y [ZA ZY 8[ )][ ) (
Dnde:
C=concentracin de vitamina A, en gER/ml
F=Factor de dilucin
m=Cantidad en gramos de muestra
99
gER
100g
! i
" 100
]
Para determinar la incertidumbre aportada por la concentracin se calcul el error

a partir de la ecuacin de la recta, a partir de las 6 repeticiones para la evaluacin
de la linealidad del mtodo, siendo un error tipo A.
Error aleatorio tipo A:
Tabla No. 26 Repetibilidad de la ecuacin de la recta por medio de la curva de

calibracin.
Corrida
Pendiente
Ordenada
124.39
4.54
125.65
0.61
125.74
0.12
125.72
0.13
125.31
0.47
127.04
2.50
Promedio
125.64
1.39
Desviacin estndar
0.85
1.78
Incertidumbre de pendiente:
Incertidumbre de ordenada:
KON
KON
GN
0.85
GN
GN
K:
K:
GN
1.79
6
100
0.349
0.726
Propagacin de error para la concentracin:
Para un rea de 241.79, un peso de muestra de 4.3008g
!A XY
)X[ ZY 8[ )][ ) (
242.60
240.60 { 0.726
125.64 { 0.349
-
1.3933 {
GN
1.91gER/ml
240.40 { 0.726
1.91 { 0.00785gER/ml
Propagacin de error para el peso de muestra medido en gramos:
0.0001W
2
<
0.00005W
Propagacin de error para el volumen de 10ml de hexano

KO ON
K:
0.726
0.349
1.91 " MC
D ,C
D
240.60
125.64
KF
-
241.79 1.3933 { 0.726

125.64 { 0.349
0.02]\/2
0.000408]\
Propagacin de error para el segundo factor de error tipo A, por medio de la

repetibilidad de las 6 corridas para el clculo del valor de vitamina A en la
frmula infantil:
NON F 6 G G
4.14
gER
100g
101
1.6901
gER
100g
:EF
Incertidumbre combinada
gER
gER
1.6901
0.00785
gER
0.00005W
0.00408]\
100g
ml ~ , C
444.89
" |}
D ,C
D ,
gER
gER
100g
4.3008W
10]\
1.91
444.89
ml
100g
Incertidumbre expandida:
KN
:EF
GG
2.4961
gER
100g
2 " 2.4961
102
gER
100g
9.2
Glosario
gER: micro gramos de equivalentes de retinol. Unidad de medida de la actividad

de vitamina A. Gil, A., Snchez, F. (2010).
Acetato de retinol: ester del retinol, (Vitamina A), polvo cristalino amarillo, punto de
fusin (57C-60C), 328.5g/mol. Sche. (2014).
Analito: especie presente en una muestra de la cual se busca informacin

analtica. Skoog (2007).
Coeficiente de variacin CV: desviacin estndar relativa, expresada como

porcentaje. Skoog (2007).
Cromatografa de lquidos de alta resolucin HPLC: cromatografa en columna en

la cual la fase estacionaria se compone de pequeas partculas y la fase mvil se
introduce a travs de las partculas mediante presin elevada. Skoog (2007).
Cromatografa en columna: mtodo cromatogrfico en que la fase estacionaria

est contenida en un tubo estrecho o en su superficie interna, y la fase mvil es
forzada a travs del tubo, donde ocurre la separacin de los elementos. Skoog
(2007).
Cromatografa en fase reversa: tipo de separacin por HPLC en la que se utiliza

una fase estacionaria no polar y una fase mvil polar. Skoog (2007).
Cromatograma: grfico de la seal de concentracin de un analito en funcin del

tiempo o del volumen de elucin. Skoog (2007).
103
Decantacin: transferencia del lquido sobrenadante y las aguas de lavado desde

un recipiente hacia un filtro sin alterar el slido precipitado en el recipiente. Skoog
(2007).
Desgasificar: extraer un gas de un recinto cerrado o de una sustancia. Real

Academia Espaola.
Desviacin estndar de la muestra S: estimador de precisin que se basa en las

desviaciones de los datos individuales con respecto a la media, de una muestra
finita. Tambin se la conoce como desviacin estndar. Skoog (2007).
Desviacin estndar relativa: desviacin estndar dividida entre el valor de la

media de un conjunto de datos. Skoog (2007).
Elucin isocrtica: elucin con un solo tipo de disolvente. Skoog (2007).
Fase estacionaria: en cromatografa, un slido o lquido inmovilizado sobre el cual

se reparte la especie de analito durante el paso de una fase mvil. Skoog (2007).
Fase mvil: en cromatografa, un lquido o gas que transporta los analitos a travs
de una fase estacionaria slida o lquida. Skoog (2007).
Frmula infantil: frmula infantil modificada de la leche de vaca para lactatnes,

asemejndose a la composicin de la leche materna. Fortificada con hierro y una
relacin de suero:casena de 60:40. La fuente de protena es la casena y tiene
como base la leche de vaca. Vademcum de Productos Nutricionales para la
Alimentacin Enteral (2005).
Saponificacin: hidrlisis de un ster bajo condiciones bsicas, resultando glicerol

ms sales de sodio o potasio. Yurkanis (2008)
104
Test t: prueba estadstica que se emplea para decidir si un valor experimental es

igual a un valor terico conocido, o si dos o ms valores experimentales son
idnticos con un nivel dado de confianza, se utiliza con la desviacin estndar y la
media. Skoog (2007).
Tiempo de retencin: en cromatografa es el tiempo entre la inyeccin en una

columna cromatogrfica y la llegada de un pico de analito al detector. Skoog
(2007).
105
Figura No.10 Tabla de datos para la distribucin normal t-Student, dos colas
106
Figura No.11 Diagrama de Flujo para realizar el procedimiento de validacin
107
Figura No.12 Cromatograma para la concentracin de 10gER/ml
Imagen extrada del programa ChemStation (2014)
Figura No.13 Cromatograma para la concentracin de 7.5gER/ml
108
109
110
Figura No.18 Cromatograma para el blanco
Figura No.19 Cromatograma para frmula infantil
111

Validación de método analítico HPLC para cuantificar vitamina A

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UNIVERSIDAD RAFAEL LANDVAR

VALIDACIN DE UN MTODO ANALTICO PARA LA CUANTIFICACIN DE VITAMINA A EN

LUISA MARA ARIAS GONZLEZ

GUATEMALA DE LA ASUNCIN, AGOSTO DE 2014

UNIVERSIDAD RAFAEL LANDVAR

VALIDACIN DE UN MTODO ANALTICO PARA LA CUANTIFICACIN DE VITAMINA A EN

TRABAJO PRESENTADO AL CONSEJO DE LA FACULTAD DE

GUATEMALA DE LA ASUNCIN, AGOSTO DE 2014

AUTORIDADES DE LA UNIVERSIDAD RAFAEL LANDVAR

P. EDUARDO VALDES BARRIA, S. J.

DRA. MARTA LUCRECIA MNDEZ GONZLEZ DE PENEDO

DR. CARLOS RAFAEL CABARRS PELLECER, S. J.

MGTR. LUIS ESTUARDO QUAN MACK

LIC. ARIEL RIVERA IRAS

LIC. FABIOLA DE LA LUZ PADILLA BELTRANENA DE

AUTORIDADES DE LA FACULTAD DE INGENIERA

MGTR. JOSE CARLOS RICARDO VELA SCHIPPERS

ING. CARLOS ENRIQUE GARCIA BICKFORD

MGTR. KAREN GABRIELA MORALES HERRERA

NOMBRE DEL ASESOR DE TRABAJO DE GRADUACIN

TERNA QUE PRACTIC LA EVALUACIN

A mi mami, por su amor, paciencia, apoyo incondicional, por creer en m, sobre

A las autoridades y personal del Laboratorio CONCALIDAD, por brindarme su

A la Ing.Isis, por su cario, confianza y apoyo incondicional durante la carrera y la

A mis compaeras de trabajo, Lic.Gaby, por su cario, motivndome todos los

A todos mis amigos que me acompaaron durante la carrera, en los desvelos,

Para validar la metodologa se evaluaron 9 parmetros de desempeo regidos por

La guayaba fresa es un fruto con potencial de crecimiento en Guatemala, por

Lo escrito sobre el tema .................................................................. 2

Resumen Crtico del marco terico ................................................. 4

Validacin de un mtodo analtico................................................... 4

Proceso para validar ....................................................................... 7

Requisitos Analticos ....................................................................... 8

Revisin de los mtodos de ensayo ................................................ 9

Seleccin de los Mtodos de Ensayo ............................................ 10

Mtodos Normalizados .................................................................. 11

Mtodos No Normalizados ............................................................ 12

Mtodos Desarrollados por el Laboratorio .................................... 13

Parmetros de desempeo del mtodo ........................................ 13

Cromatografa Lquida de alta resolucin (HPLC) ......................... 25

Planteamiento del problema .......................................................... 37

Objetivo General ........................................................................... 39

Objetivos Especficos .................................................................... 39

Variables Independientes .............................................................. 39

Variables Dependientes ................................................................ 40

Definicin de las variables ............................................................. 40

Definicin Conceptual ................................................................... 40

Definicin Operacional .................................................................. 42

Alcances y Lmites ........................................................................ 44

Sujetos y Unidades de Anlisis ..................................................... 47

Procedimiento para la cuantificacin de Vitamina A...................... 56

Diseo y Metodologa estadstica.................................................. 59

Diseo Experimental ..................................................................... 59

Experimentos, tratamientos y repeticiones .................................... 59

Descripcin de las unidades experimentales ................................ 61

Variables respuestas ..................................................................... 61

Metodologa de anlisis ................................................................. 62

Presentacin y Anlisis de resultados ........................................... 70

Diagrama del proceso de validacin ............................................. 73

Referencias bibliogrficas ............................................................. 90

Muestra de Clculo ....................................................................... 94

Glosario ....................................................................................... 103

Tabla No.10 Linealidad ......................................................................................... 75