Ejemplo prctico de la huella gentica en bacterias.

La tuberculosis bovina es una zoonosis que produce grandes prdidas a la

economa de muchos pases y constituye un problema de salud pblica. Su
epidemiologa resulta muy compleja debido a que se trata de una bacteria
de lento crecimiento, que puede permanecer de forma latente y afectar a
diversas especies animales, incluyendo fauna silvestre que funge como
reservorio. Por este motivo en todo el mundo existe la necesidad de
genotipificar de manera precisa las cepas de M. bovis y rastrear el origen de
la infeccin. En la actualidad existen tcnicas de genotipificacin
sustentadas en marcadores genticos polimrficos con distinta estabilidad
gentica, entre los que se cita a los RFLP, Spoligotyping y VNTRs. Su
factibilidad, reproducibilidad y utilidad para crear bases de datos dinmicas
que coadyuven al control de la TBB se discuten en este trabajo.

Con tcnicas inmunolgicas y de biologa molecular se ha determinado la

enorme similitud existente entre diversas micobacterias causantes de
tuberculosis; algunas de ellas, las de mayor similitud, se han agrupado en lo
que se conoce como complejo M. tuberculosis, que incluye a: M.
tuberculosis, M. africanum. M. microti, M. pinipedii, M. caneti, M. bovis y M.
caprae. M. bovis posee un genoma de 4,345,492 pb, con 4,003 genes que
codifican para 3,952 protenas y 50 RNAs estructurales, incluye un profago y
42 secuencias de insercin (IS). Estructuralmente M. bovis adems, contiene
aproximadamente 65 % de G+C, lo que se refleja en el contenido de
aminocidos bsicos de sus protenas, en su mayora enzimas necesarias
para el metabolismo de lpidos constitutivos de su pared celular, tales como
los cidos miclicos.

El genoma de M. bovis tiene ms del 99.95 % de identidad con M.

tuberculosis, pero su tamao se ha reducido debido a deleciones, eventos
considerados nicos y unidireccionales en las bacterias: la recombinacin
gentica en micobacterias es un evento raro. As como tampoco hay
evidencias de translocacin, duplicacin e inversiones, posiblemente debido
a su lento crecimiento. La ausencia de mecanismos de intercambio
gentico, como la conjugacin o la transformacin se le considera como el
origen de la similitud entre las especies del complejo M. tuberculosis.
Algunas teoras suponen que evolucionaron como patgenos no hace mucho
tiempo, con la aparicin de los primeros homnidos en frica oriental.

En la actualidad una de las tcnicas ms utilizadas para la genotipificacin

de micobacterias del complejo M. tuberculosis es Spoligotyping. Este
mtodo se basa en la presencia o ausencia de variantes de DR (DVR, por
sus siglas en ingls). Las DVR se componen de una secuencia repetida de 36
pb conservada y de una secuencia espaciadora variable de 35 a 41 pb: el
blanco de la tipificacin es esta regin variable. A la fecha se han reportado
94 diferentes espaciadores entre los DR: el cromosoma de la cepa M.

tuberculosis H37Rv tiene 48 DVR y el de M. bovis BCG 41. De este modo,

para la genotipificacin se utilizan de manera rutinaria 43 espaciadores, 37
de H37Rv y 6 de BCG. Como ya se mencion, las secuencias de insercin
IS6110 se integran preferencialmente en este tipo de hot spots,
favoreciendo la delecin de espaciadoras, ya sea por insercin asimtrica o
por escisin de las secuencias IS6110.

El mtodo de Spoligotyping inicia con una PCR donde se utiliza un par de

oligonucletidos complementarios a la regin conservada de los DVR, de
modo que a partir de ah se inicie la amplificacin de las regiones
espaciadores. A los productos de la PCR se les hibrida con cada una de las
43 secuencias complementarias conocidas, previamente fijadas en una
membrana de Nylon. Para discriminar los diversos espaciadores
amplificados, uno de los oligonucletidos est marcado con biotina.
Finalmente, los puntos de hibridacin sern revelados con un conjugado de
estreptavidinaperoxidasa, que se une a la biotina para formar un complejo
luminoso al agregar el sustrato luminol. La reaccin enzimtica que se
produce es capaz de quemar una placa radiogrfica, en el punto que
corresponde a cada espaciador hibridado, determinando los espaciadores
presentes o ausentes en cada una de las cepas.

La genotipificacin bacteriana es un proceso que ha venido evolucionando

de manera continua tratando de dar respuesta a los cuestionamientos
epidemiolgicos de la biomedicina. Una de sus principales aplicaciones es la
deteccin de focos de infeccin. La identificacin precisa de M. bovis en
cada caso es de vital importancia para conocer la distribucin de este
microorganismo en diversas poblaciones, pero el cultivo bacteriolgico y las
pruebas bioqumicas constituyen una barrera de tiempo. No obstante, a
pesar de que el poder discriminacin, reproducibilidad, estabilidad y
factibilidad de algunos mtodos sean ptimos, la relacin gentica no es
sinnimo de relacin epidemiolgica.

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La tcnica de Spoligotyping, es un mtodo que detecta la presencia de

espaciadores de secuencias repetidas (DR, por sus siglas en ingls) en un
locus del genoma de M. bovis. Se encontr que esta regin cromosomal
contiene un nmero grande de DRs de 36 pb separadas por espaciadores de
ADN variable (DVRs, por sus siglas en ingls) de 35 a 41 pb de longitud.
Cuando se compararon las DRs de varios aislados, se observ que el orden
de los espaciadores era similar, pero que ocurran algunas delecciones o
inserciones. De este modo, el polimorfismo viene de la ausencia/presencia
de uno o ms de estos espaciadores variables.
As, el spoligotyping detecta la presencia o la ausencia de estos
espaciadores de secuencia conocida, caracterstica que es utilizada para
determinar similitud gentica entre cepas. Aunque esta tcnica es
bsicamente utilizada para la tipificacin de cepas extradas de cultivo,
tambin ha demostrado su utilidad para simultneamente detectar y
tipificar cepas del complejo M. tuberculosis directamente de muestras
clnicas.
Dado que el procedimiento involucra la amplificacin de la regin DR por
PCR, seguido de la hibridacin con oligonucletidos especficos para cada
espaciador, supuestamente esta tcnica muestra mayor sensibilidad y
especificidad que otros mtodos basados en PCR. As, el objetivo del
presente estudio fue evaluar la sensibilidad y la especificidad de una PCR
anidada, utilizando como blanco el gen MPB70 y la secuencia IS6110, as
como tambin spoligotyping como mtodos de diagnstico rpido de la
tuberculosis bovina en tejido fresco.