Ruptura Celular

Planta Piloto de Fermentaciones
Departamento de Biotecnologa
Rompimiento celular
Sergio Huerta Ochoa

UAM-Iztapalapa

Productos Extracelulares
-Antibiticos
-Enzimas extracelulares
-Muchos polisacridos
-Mayora de aminocidos
Esteroides
(Se extraen sin romper)
Productos Intracelulares
-Mayora de protenas modificadas
genticamente
-Lpidos
-Algunos antibiticos
Biomasa

Productos que requieren de una ruptura celular
Tipo de producto
Ejemplos
Protenas recombinantes
Insulina, HC, Protena A, Protena G
Enzimas
L-Asparaginasa, Invertasa, Glucosinasa
Plsmidos
Terapia gnica
Vacunas
Ttanos, Meningitis
Otros
Mitocondrias, Esporas, Toxinas
Tejeda y col. 2011 Bioseparaciones

Esquema de la pared celular de clulas procariotas
Procariotes Gram
(E. coli produce la mayora de las protenas recombinantes)
Membrana externa
(Protenas y lipopolisacridos)
8 nm
Fuerza mecnica
Polipptidoglucanos
8 nm
Espacio Periplasmtico
(Protenas)
Membrana de plasma
Permeabilidad
Procariotes Gram +
Polipptidoglucanos
Espacio Periplasmtico
(Protenas)
Membrana de plasma
(Fosfolpidos, protenas dispersas, iones metlicos)

Tomado de Advances in product release strategies and impact on bioprocess design (2009)
Bangaru Balasundaram, Sue Harrison and Daniel G. Bracewell


Tomado de
Advances in product
release strategies and
impact on bioprocess
design (2009)
Bangaru
Balasundaram, Sue
Harrison and Daniel
G. Bracewell

Tomado de
Advances in product
release strategies and
impact on bioprocess
design (2009)
Bangaru
Balasundaram, Sue
Harrison and Daniel
G. Bracewell

Fermentacin
Cosecha de clulas
Centrifugacin, filtracin con vaco,

filtracin con membranas
Rompimiento Celular
Homogenizacin, molienda, lisis

(enzimtica o qumica)
Remocin de restos celulares
Centrifugacin, filtracin con vaco,

filtracin con membranas
Concentracin y/o
fraccionamiento
Precipitacin, extraccin, filtracin con

membranas, evaporacin
Operaciones de alta
resolucin
Cromatografa, cristalizacin
Etapas primarias
de recuperacin
Operaciones finales
Producto
Adaptado de: Sanchez-Ruiz, 1989

Studies on cell disruption and cell debris
removal in downstream processing

Ruptura Celular de Saccharomyces cerevisiae
Antes de la ruptura celular
Despus de 2 pasos a 1000 bar dando un

rompimiento celular de 95%

Equipo de ruptura
Industria Alimentaria
(Homogenizacin de la leche)
Aplicacin en
Industria de la Pintura
(Reduccin de Pigmentos)
Industria Biotecnolgica


Mtodo
Qumico
Mecnico
Tcnica
Principio
Estrs
sobre el
producto
Costo
Ejemplo
Choque osmtico
Ruptura osmtica de la membrana
Suave
Barato
Ruptura de clulas de sangre
Digestin
enzimtica
Rompimiento por digestin de la

pared celular
Suave
Caro
Micrococcus lysodeikticus tratado con lisozima

de huevo
Solubilizacin
Detergentes solubilizan la
membrana celular
Suave
Moderadocaro
Sales biliares actuando sobre E.coli
Disolucin de
lpidos
Solventes orgnicos se disuelven en

la pared celular y la desestabilizan
Moderado
Barato
Ruptura de levadura con tolueno
Tratamiento
alcalino
La saponificacin de lpidos
solubiliza la membrana
Fuerte
Barato
Homogenizacin
(tipo navaja)
Clulas cortadas en una licuadora
Moderado
Moderado
Molido
Ruptura celular por molido con

abrasivos
Moderado
Barato
Ultrasonicacin
Clulas rotas con cavitacin

ultrasnica
Fuerte
Caro
Suspensin de clulas a pequea escala
Homogenizacin
(tipo orificio)
Se hace pasar clulas por un

pequeo orificio y se rompen por
estrs
Fuerte
Moderado
Tratamiento a gran escala de suspensin de

clulas excepto bacterias
Rompimiento en
molino de perlas
Se aplastan las clulas entre el

vidrio y perlas de acero
Fuerte
Barato
Tratamiento a gran escala de suspensin de

clulas y clulas de plantas
Tejido animal y clulas

Dificultad de la ruptura
Esporas
Cocos
gram Levaduras
Clulas vegetales
Bacilos gram +
Bacilos gram - y cocos
Micelios
Clulas animales

Eleccin del mtodo de ruptura
Naturaleza de la fuente de la enzima

Escala de la operacin
Velocidad del mtodo de extraccin
Estabilidad del enzima
Pureza requerida
Costo del proceso

Factores que inactivan las enzimas durante su aislamiento
Factor inactivante
Fuente de
enzima
Frecuencia
Modo de
contrarrestarlo
Calor
Cualquiera
Universal
Enfriamiento
Fro
Cualquiera
Raro
Calentamiento
Proteasa
Mayora
Comn
Inhibidores de proteasas o fro
Productos oxidacin de
fenoles
Plantas y hongos
Bastante comn
Agentes reductores
Oxidacin
Cualquiera
Comn
Agentes reductores
Dilucin protena
Cualquiera
Bastante comn
Concentracin rpida
Prdida de estabilidad
Cualquiera
Bastante comn
Restauracin de ese factor
Inhibidores especficos
Plantas y bacterias
Raro
Separacin del inhibidor
Metales pesados
Cualquiera
Raro
Agentes quelantes
Cambio de fase
Cualquiera
Comn
Mnima agitacin

Choque osmtico
1. Suspensin de clulas en solucin tamponada hipertnica (sacarosa 20%)
2. Equilibrio osmtico
3. Centrifugacin: concentracin de las clulas
4. Resuspensin en agua (4 C)
5. Ruptura celular por entrada de agua en el interior
celular
Mayor sensibilidad en GRAM (GRAM + alta
presin osmtica interna)
Ventajas:
Extraccin de enzimas del espacio
periplasmtico, simplificacin de los procesos
de purificacin
NO a gran escala:
Grandes volmenes de medio (400 L/10 kg
pasta celular)
Elevado nmero de pasos de centrifugacin
Necesidad de refrigeracin

Tratamiento con lisozima + EDTA
Digestin de las paredes celulares por ruptura de los enlances beta-(1.4)
glicosdicos entre el cido N-acetilmurmico (NAM) y la N-acetilglucosamina
(NAG) del mucopptido
Mayor susceptibilidad GRAM +

Combinacin con EDTA: quelante del Ca2+
Otros policationes: GRAM +: quitosano, hidroglutamato, polilisina,
antiobiticos GRAM -: lipasas, fosfolipasas, policationes
Hongos/levaduras: quitinasa/glucanasas
Necesidad de choque osmtico
No empleo a gran escala:
Alto precio de la lisozima
Eliminacin de lisozima tras extraccin

Tratamiento con detergentes
Permeabilizacin de clulas por solubilizacin de protenas de membrana,
debido a apertura de poros
Tipos:
1. Inicos: provoca desnaturalizacin proteica
Aninicos: Lauril sulfato sdico, colato sdico, SDS
Catinicos: Bromuro de cetil-trimetil-amonio
2. No inicos: preservan estructura nativa e interacciones de la enzima

Tween, Spam, Triton
Inconvenientes:
Precipitacin de protenas
Necesidad de eliminacin (cromatografa, ultrafiltracin)

Tratamiento con lcalis
Tratamiento de las clulas con soluciones alcalinas
(KOH, NaOH, pH 11.5-12.5; 20-30 min)
Hidrlisis de la pared celular
Ventajas:
Simpleza, barato
Fcil aplicacin a gran escala
Desventajas:
Tratamiento fuerte, es un ejemplo extremo de la solubilizacin
(Saponificacin de lpidos que se convierten a detergentes)
No selectivo
Aplicacin SLO si las enzimas a aislar son estables a pH alcalino

Disolventes orgnicos
Mtodo tradicional de ataque ( tolueno).
No se usan a gran escala.
Inconvenientes:
Precio
Toxicidad
Desnaturalizacin de protenas
Inflamabilidad

Homogeneizacin con abrasivos
Mortero + abrasivo (cristal, albmina, kieselgurh)
Dispositivos de funcionamiento continuo:
Agitador Mickle (agitador vibratorio)
Dyno-mill (agitador de discos giratorios)
Efectividad depende de:

Tipo y concentracin de abrasivo
Tipo, concentracin y edad de las clulas: levaduras >bacterias
Velocidad de agitacin
Cantidad y flujo a travs de la cmara
Temperatura
Dispositivo de discos

Sonicacin
Aplicacin de frecuencia superiores a 20 kHz
Aparicin de reas de compresin/enrarecimiento/cavidades colapso de
cavidades ondas de choque dao celular
Aplicacin continua o discontinua
Eficacia dependiente de:
Tipo de microorganismo: diversidad
Gram ->Gram +
Bacilos > Cocos
pH
Temperatura
Fuerza inica del medio
Tiempo de exposicin
Densidad de la clula
Uso a pequea escal, NO a gran escala:
Elevados requerimientos de energa
Dificultad de transmisin de la energa
Problemas de disipacin del calor producido

Congelacin/Descongelacin
Formacin y fusin de cristales de hielo
liberacin de protenas
Combinacin con otros mtodos: congelacin de sedimentos bacterianos

Ventajas:
Simplicidad
Bajas temperaturas de trabajo
NO a gran escala:
Elevado tiempo de tratamiento
Resistencia de algunos microorganismos
Sensibilidad de las enzimas a congelacin/descongelacin

Cizalla lquida
Paso de la suspensin de clulas a elevada presin (>55MPa) a travs de un
orificio estrecho
Homogeneizador de Manton-Gaulin
Mecanismo:
Ruptura celular por cada brusca de presin y choque
Modos de uso:
Paso nico, series de reciclaje, reciclaje continuo con eliminacin de
sustancia
Efectividad depende de:
Tipo de microorganismos: GRAM -> GRAM +
Historia de la materia de partida:
Condiciones de crecimiento (fase estacionaria > fase exponencial)
Congelacin/descongelacin

Cizalla slida
Paso de clulas congeladas (-20 C) a travs de orificio

Mecanismo:
Agitacin en presencia de abrasivo (cristales de hielo) +
ruptura por cizalla lquida
Fuerzas de cizalla: paso a travs de orificio + desgarro por
cristales de hielo
No produce la desnaturalizacin de las enzimas
NO a gran escala:
Manejo complicado y costoso



Ecuaciones utilizadas en rompimiento celular
(Tejeda y col., 1995, Bioseparaciones)
Choque osmtico: El clculo del gradiente de presin se basa en el equilibrio qumico
Pe Pi = R T ci

Molino de perlas de alta velocidad
Parmetros operacionales
- Velocidad del agitador
- Velocidad de alimentacin de la suspensin celular
- Diseo del agitador
- Tamao de las perlas de vidrio
- Carga de las perlas de vidrio
- Concentracin celular
- Temperatura
Tejeda y col., 2011, Bioseparaciones

Velocidad del Agitador

La Velocidad Perifrica Normalizada de los Anillos agrupa varios parmetros
relacionados con la velocidad del agitador
Dm
U=
60x1000
: velocidad angular del agitador (rpm)

Dm : dimetro
En impulsores concntricos,
Dm = dimetro del impulsor (mm)
En impulsores excntricos,
Dm = dimetro promedio (mm)
d : dimetro de los anillos
del agitador (mm)
d2
2
Dm = 2 e +
e : dimetro de la flecha
4
del agitador (mm)

Flujo de alimentacin, F
El flujo permisible en un molino de perlas depende:
Del volumen del molino
De la carga de perlas
Velocidad del agitador
Al aumentar el
flujo de
alimentacin
Disminuye el grado de
desintegracin
El proceso resulta
ms econmico
NOTA: Conviene operar con

altos flujos de alimentacin y
usar varios pasos para obtener
el rendimiento requerido

Diseo del Agitador y Efectos del Mezclado

El comportamiento de un molino de perlas depende del patrn
de flujo y mezclado que produce el agitado (intermedio a los
dos modelos ideales: Flujo tapn (sin mezclado axial) y tanque
continuo agitado (100% agitado)
El tipo de mezclado puede ser

determinado por tcnicas con
trazadores

(Tejeda y col., 1995, Bioseparaciones)
Molino de Perlas (operacin intermitente): El rompimiento celular con perlas agitadas

a altas velocidades sigue una cintica de primer orden. El balance de masa de protena
liberada puede ser expresado mediante la ecuacin:
VM
dR
= k (Rm R )VM
dt
Integrando y re-arreglando
ln
Rm
= kt
Rm R
ln
Rm
Rm R
Ejemplo 5.2
k

Grado de mezclado en un Molino de Perlas (operacin continua):
El grado de desviacin del flujo tapn ideal en los molinos de perlas comerciales, ha sido
simulado utilizando el modelo de Tanques en serie perfectamente agitados. Esto
permite realizar experimentos con pulsos de tinta para determinar el nmero de tanques
equivalentes al grado de mezclado que tiene el molino de perlas utilizado y calcular la
eficiencia esperada del rompimiento.
C1
C0
1
C2
2
CN
C3
3
Al aplicar un pulso de tinta en la primera etapa de una serie de tanques perfectamente

agitados de igual volumen, el balance de la masa de tinta para cualquier etapa N es:
V M dC N
= F (C N 1 C N )
N dt

Utilizando un tiempo adimensional definido por:
tF
t
=
VM t R
El balance de masa de tinta puede expresarse como:
dC N
= N (C N 1 C N )
d
Integrando para cada etapa, se obtiene que para la etapa N la expresin:
C N N N N 1
E ( ) =
=
exp( N )
(N 1)!
C0
E() es una medida de la distribucin de tiempos de residencia del fluido dentro del
recipiente. Derivando con respecto e igualando el resultado a cero se tiene:
N=
1
1 mx
Donde mx es el tiempo adimensional en el cual E es mxima:

Eficiencia de un Molino de Perlas (operacin continua):
Para relacionar el nmero de etapas con la eficiencia de rompimiento es necesario
realizar un balance de protena liberada (clulas rotas) considerando que el molino
consta de N etapas tipo tanque perfectamente agitado en serie y que el rompimiento
sigue una cintica de primer orden.
El balance de protena liberada en la primera etapa est dada por
Vm dR1
V
= FR1 + k (Rm R1 ) m
N dt
N
Expresando la ecuacin en funcin de un tiempo adimensional e integrando obtenemos
kVm
R1 NF
=
Rm 1 + kVm
NF
Eficiencia de la etapa !!!
Re-arreglando y generalizando para N etapas, tenemos:
Rm
kV
= 1 + m
Rm RN
NF
Ejemplo 5.3

Homogeneizador de alta presin: La desintegracin celular
en un homogeneizador de alta presin a una presin fija puede
ser descrita mediante una cintica de primer orden respecto al
nmero de pasos, de tal manera que:
dR
= k ' (Rm R )
dN
Integrando obtenemos la ecuacin:
ln
Rm
= k' N
Rm R
Se ha determinado experimentalmente que la constante

k tiene una dependencia con la presin de la siguiente
forma:
a
k ' = k" P
Combinando las ecuaciones anteriores se tiene:
ln
Rm
= k " NP a
Rm R

Microflidizador: En el caso del microfluidizador la cintica de rompimiento presenta una
cierta dependencia no lineal con el nmero de pasos expresada mediante la ecuacin:
ln
Rm
= k" N b P a
Rm R
Ejemplo 5.4
Donde b es un exponente que vara con el tipo de clula y toma valores entre 0.28 y 1

Chang and Su, 2006
Kinetic model for simultaneous cell
disruption and aqueous two-phase
extraction
A = Am[1 exp(kt)]

La Ruptura celular, cuando se estn procesando cientos o miles de
litros de material, represanta un reto diferente a la ruptura celular a
nivel laboratorio
Factores claves son: Eficiencia y reproducibilidad
A nivel Industrial slo se emplean los molinos de perlas agitados y
los homogeneizadores a alta presin. El diseo de los molinos
est basado en ecuaciones empricas y en experimentos piloto.
GEA Liquid Processing cell rupture

skid for biologic cell lysing. The
homogenizer feature the high
efficiency sharp profile rupture valve
type R which enable cell disruption at
lower pressures

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Homogenizacin, molienda, lisis

Remocin de restos celulares

Centrifugacin, filtracin con vaco,

Precipitacin, extraccin, filtracin con

Adaptado de: Sanchez-Ruiz, 1989

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Antes de la ruptura celular

Despus de 2 pasos a 1000 bar dando un

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Rompimiento por digestin de la

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Ruptura de levadura con tolueno

Clulas cortadas en una licuadora

Ruptura celular por molido con

Clulas rotas con cavitacin

Suspensin de clulas a pequea escala

Se hace pasar clulas por un

Tratamiento a gran escala de suspensin de

Se aplastan las clulas entre el

Tratamiento a gran escala de suspensin de

Tejido animal y clulas

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Eleccin del mtodo de ruptura

Naturaleza de la fuente de la enzima

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Inhibidores de proteasas o fro

Restauracin de ese factor

Separacin del inhibidor

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Mayor susceptibilidad GRAM +

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2. No inicos: preservan estructura nativa e interacciones de la enzima

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Mtodo tradicional de ataque ( tolueno).

No se usan a gran escala.

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Efectividad depende de:

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