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Biotecnologa Vegetal (texto bsico

biotecnologa en espaol)
BOOK APRIL 2005
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974
5 AUTHORS, INCLUDING:
Humberto Prieto
Instituto de Investigaciones Agro
37 PUBLICATIONS 207 CITATIONS
SEE PROFILE
Miguel Jordan
Universidad Mayor
36 PUBLICATIONS 268 CITATIONS
SEE PROFILE
Available from: Humberto Prieto

Retrieved on: 09 April 2016
Biotecnologa Vegetal
INSTITUTO DE INVESTIGACIONES AGROPECUARIAS

MINISTERIO DE AGRICULTURA
IOTECNOLOGA
EGETAL
ISSN O717 - 4713
Humberto Prieto E.
Miguel Jordan Z.
L. Pedro Barrueto Cid
Mara Cristina R. Cordeiro
Don J. Durzan
Santiago de Chile, 2005
COLECCIN LIBROS INIA N 15
BIOTECNOLOGA VEGETAL
2005, Instituto de Investigaciones Agropecuarias, INIA,
Centro Regional de Investigacin La Platina,
Santa Rosa 11610, La Pintana, Telfono (56-2) 7575100,
Fax: (56-2) 5417667. Casilla 439, Correo 3, Santiago, Chile.
N Inscripcin: 149.346
ISBN: 956-7016-23-2
ISSN: 0717-4713
Prohibida la reproduccin parcial o total de esta obra sin
permiso del Instituto de Investigaciones Agropecuarias,
Ministerio de Agricultura.
Diseo y diagramacin: Jorge Berros V.
Impresin: PROGRAF Impresores.
Cantidad de ejemplares: 1.000
Santiago, Chile, 2005.
en recursos humanos. Esto limita sus posibilidades de utilizacin efectiva. Debido a su novedad y a su explosivo desarrollo,
las distintas biotecnologas son rpidamente reemplazadas por
otras ms modernas y algunas de ellas abren nuevos problemas
en el mbito de la bioseguridad, e incluso en la tica. A pesar
de lo anterior, cada da, estas herramientas toman un papel ms
importante y las instituciones de investigacin destinan ms recursos a su implementacin.
Parece obvio sealar que la capacitacin en estas nuevas tecnologas resulta clave al momento de decidir aplicarlas a la
solucin de los problemas tecnolgicos de la agricultura. El libro "Biotecnologa Vegetal", representa un esfuerzo compartido de distinguidos profesionales especialistas en sus aspectos o
ramas ms relevantes, para exponer de una manera didctica y
sencilla, las principales estrategias actualmente en uso. El Instituto de Investigaciones Agropecuarias, ha decidido cooperar
en este esfuerzo al incluir esta publicacin dentro de su "Coleccin Libros INIA", serie que ha hecho una importante contribucin al conocimiento de aspectos relevantes para la agricultura nacional. Con la inclusin de este nuevo ttulo, aspiramos
tambin a cubrir la demanda por informacin ms all de nuestras fronteras, pues creemos que este libro puede transformarse
en un texto de referencia para la enseanza de la biotecnologa
en el mbito latinoamericano.
Paulina Seplveda Ramrez.

Directora Regional
INIA - La Platina.
INTRODUCCIN
CAPTULO 1
INTRODUCCIN
Don J. Durzan
a seleccin, mejoramiento gentico

y desarrollo de plantas, puede ser
trazada desde tiempos prehistricos
(Cowan y Watson, 1985). Las tribus primitivas seleccionaban cuidadosamente
plantas, semillas o estacas, en su intento por domesticarlas y con el propsito
de usarlas como alimento, fibras, curas
de enfermedades, tratamiento de heridas
y tambin, por qu no decirlo, de sus
necesidades espirituales. Un ejemplo de
esto es el uso del canelo (Drimys winteri)
en Chile en ritos sagrados por los
mapuches.
En los ltimos decenios, los mejoradores
de plantas han realizado cruzamientos
intentando obtener descendencias que
proporcionen nuevas caractersticas de
inters y beneficios para horticultores,
agricultores y su economa local
(Simmonds, 1979). Este aspecto representa ya una inconsciente utilizacin del
concepto "biotecnologa de plantas", y
a su vez manifiesta del mismo modo el
requerimiento de una coleccin de
germoplasma y de la mantencin de una
amplia gama de diversidad gentica. La
finalidad ltima: poseer una fuente de
genes, con mapas genticos que permitan la obtencin de plantas de inters
econmico (Tanksley y McCouch, 1997).
La manera ms fcil de capturar y fijar
una ventaja gentica es a travs de la
propagacin vegetativa del genotipo
deseado. Sin embargo, algunas selecciones son difciles de propagar (usando

medios baratos, simples y fciles de realizar). Por otro lado, la domesticacin
por clones podra aumentar los riesgos
de plagas y enfermedades si stos son
colocados en sistemas de produccin no
directamente relacionados con sus nichos o en sus respectivos ecosistemas
naturales. Por ello tambin la necesidad
de efectuar pruebas preliminares de introduccin en cada regin.
Para mejorar la calidad, productividad,
utilidad y acelerar la introduccin de
caractersticas superiores en los productos agrcolas, la biotecnologa de plantas ha desarrollado mtodos para la introduccin de genes exgenos en especies econmicamente importantes. Esto
comprende todos los mtodos de modificacin gentica, fusin de clulas, cruzamientos controlados, apomixia y cultivo de tejidos conducentes a la obtencin de clones y a la fijacin de caractersticas ventajosas propias de cada
zona, regin o pas. Y esto ltimo es muy
importante a la hora de definir programas de desarrollo biotecnolgico en
pases como el nuestro.
La biotecnologa de plantas requiere la
integracin econmica de las ciencias
biolgicas con la produccin y utilizacin tanto de los sistemas agronmicos
como silvcolas. Es un hecho objetivo
17
que, independiente del modelo econmico en boga, la nueva industria emergente proveer de productos y servicios
que generarn un mejor desempeo de
la propia economa en su conjunto
(Enrquez, 1998). Estas innovaciones sin
duda, tendrn un impacto en la calidad
ambiental y la salud y exigirn de manera consustancial una evaluacin y monitoreo de estas nuevas tecnologas dentro de la relacin costo/beneficio. Un
claro ejemplo de ello lo representa la
incorporacin de la tecnologa de los
cultivos genticamente modificados.
La nueva era genmica que est despertando, est forzando a algunas compaas ms poderosas del mundo a reinvertir en ellas mismas para integrar
biotecnologa, agricultura, ciencias forestales, alimentos, qumica de cosmticos, farmacia, medio ambiente e industria informtica y as permanecer viables
en el nuevo mundo de la economa de
la globalizacin (Lander y Weinberg,
2000). Sin embargo, cierta oposicin por
parte de una legislacin genmica demasiado rigurosa, podra inhibir el progreso de nuevas tcnicas de diagnstico en el rea, por ejemplo, de la salud
(Chahine, 2002). El problema surge de
la posicin que pases en desarrollo deban adoptar con respecto a la adopcin
de estas nuevas ramas de la ciencia y la
discusin sobre la necesidad de ellas
dentro del conjunto de requerimientos
que podran bien plantearse para vencer estas condiciones de sub-desarrollo.
Sin perjuicio de que ms adelante en
este libro se traten tpicos pormenori-
18
zados de biotecnologa de plantas, a

continuacin se efectuar una visin sinptica aunque actualizada, sobre esta
excitante promesa de la biotecnologa
en esta poca llamada tambin de "era
del conocimiento". sta, a modo de contribuir a una percepcin ms global y coherente sobre esta materia; esfuerzo nada
fcil, considerando que cada vez es ms
difcil precisar lo que debe ser omitido o
incluido en una prospeccin, por la explosiva velocidad con que el conocimiento cientfico avanza. Sin embargo,
inevitable y til para ir depurando a las
ciencias de errores o conceptos ingenuos.
La necesidad de una biotecnologa

de plantas para una mejor
calidad de vida.
La biotecnologa est ofreciendo muchos
beneficios para la agricultura, medicina,
medio ambiente e industria. Estas nuevas alternativas estn relacionadas
inexorablemente con el crecimiento
asombroso de nuestra poblacin mundial, la pobreza, el desempleo creciente, la asistencia mdica y los cambios
climticos globales que limitan las cosechas. Ello involucra no solamente a la
industria y gobiernos, sino que particularmente a los agricultores (que debern
tambin absorber las nuevas biotecnologas) y a los consumidores.
La llegada de plantas transgnicas promete ayudar a incrementar la flexibilidad del manejo de los cultivos. Por
ejemplo, disminuyendo la fuerte dependencia de los agroqumicos y reducien-
INTRODUCCIN
do la alta contaminacin de los suelos,

ros y lagos. Al mismo tiempo, aumentando la produccin, favoreciendo la
precocidad de las cosechas y en general, adicionando mayor valor agregado
a los productos al aumentar el valor nutritivo y haciendo los productos menos
perecibles (por ejemplo, proveyendo de
mayor tiempo de almacenaje). Sin embargo, una vez que se haya evaluado
adecuadamente el impacto de la tecnologa, ella deber ser probada como segura (y aqu nuevamente surgirn discusiones sobre cmo hacerlo). Debern ser
tambin de costo adecuado y aceptable
para los productores y consumidores.
Por ello, se requiere de mtodos para seleccionar, preservar y clonar nuevos
genotipos. Entretanto, la produccin y
utilizacin de sistemas biotecnolgicos
deben ser flexibles o lo suficientemente
operantes, para adaptar y usar tierras
m a rg i n a l e s , p o c o p r o d u c t i v a s ( e s t o
involucrar disponer de genotipos resistentes al fro, salinidad, altura, etc.). En
general, minimizar los riesgos debidos
a diversas contingencias en el campo.
Seleccin y propagacin vegetativa

de plantas difciles de propagar.
La investigacin sobre plantas transgnicas, buscando alterar selectivamente,
adicionar o remover caractersticas especificas de ellas, debe ser realizada
considerando las necesidades regionales. Caractersticas tales como, resistencia al fro, calor, sequa, contenido de
fibras, gusto, color, fragancia, son buenos ejemplos de esto. Es importante tam-
bin seleccionar para resistencia a plagas y enfermedades de rboles de importancia econmica. Esto, tanto para
especies de clima tropical como el "mogno-brasileiro", Switenia macrophylla,
(Fam. Meliaceae), as como para las especies del gnero Nothofagus del sur de
Chile (Nothofagus pumilio, N. obliqua,
N. alpina y N. leonii) o para las conferas de California (Pinus torreyana,
Sequoia sempervirens, Taxus brevifolia,
etc.). El manejo de la variabilidad gentica de especies arbreas podr incrementar la probabilidad de resistencia
para insectos barrenadores (Coleoptera)
u hongos que atacan el tronco (cancro)
y que dificultan as su uso comercial.
Ello especialmente en una poca donde
la demanda por maderas est aumentando junto al aumento de la poblacin. Las
expectativas son que, de aqu a diez
aos, el consumo de madera, ser alrededor de un 20% ms de lo que representa hoy.
Para la propagacin vegetativa, el enraizamiento de estacas es a menudo el sistema clonal elegido (ejemplo hbrido entre Eucalyptus grandis x E. urophylla para
la produccin de celulosa). Entretanto,
los factores que afectan la capacidad del
enraizamiento son numerosos, especialmente en especies frutales, siendo procesos an escasamente comprendidos. La
propagacin de plantas mediante condiciones in vitro: organognesis y embriognesis somtica (ver captulo 3), son
parte del arsenal de tcnicas (Figuras 1.1
a 1.5) que han sido empleadas en la
biotecnologa de plantas (Hartmann et
al., 2002).
19
Figuras 1.1 a 1.5. Poliembriognesis. Tipo de embriognesis somtica frecuente en conferas,

inducida bajo condiciones in vitro. Sin embargo, es un proceso distinto al de embriognesis
somtica de dicotiledneas, pero que, como sta, puede permitir la multiplicacin de
embriones en grandes cantidades en biorreactores. Figura 1.1, muestra el aspecto de un
embrin cigtico (2 mm) de Picea abies (Abeto de Noruega), en el cual se distinguen muy bien
sus cotiledones. Pequeas cantidades de estos embriones, al ser colocados en frascos tipo
"nipple" y en presencia de un determinado medio nutritivo bsico, se multiplican
asexuadamente por simple ruptura longitudinal. Figura1.2, Los frascos permanecen en
oscuridad, girando a 1 rpm (clinostato). Figura1.3, presenta una muestra de embriones (0,5 mm),
que se destacan por su coloracin rojiza, debido a la tincin con acetocarmn. En azul, el
suspensor teido con azul de Evans. Los embriones ya maduros presentan el aspecto de la
Figura1.4. Por tanto, son muy parecidos a los embriones originarios de semillas (sexuales).
Ms adelante, los embriones son hechos germinar, transformados en plantas llevadas al campo
para su observacin y evaluacin. Figura 1.5, plantas (primer plano) con siete aos de edad,
las cuales no evidenciaron variabilidad gentica (variacin somaclonal), en relacin a sus
congneres obtenidas por semillas. Dependiendo del inters forestal, carga de trabajo del
laboratorio etc., los embriones (Figura 1.4) se pueden criopreservar pudiendo de
esta manera, distribuir mejor su disponibilidad durante el ao.
20
INTRODUCCIN
Los factores que son considerados importantes dentro de esta perspectiva,

corresponden a la aplicacin de reguladores de crecimiento y/u hormonas vegetales (ver captulo 2: Figuras 2.2 y 2.3;
Tabla 2.2), procurando encontrar correlaciones entre respuestas experimentales y dosis aplicadas. Ello dentro de un
contexto de diversos factores tales como
humedad, CO 2 y temperatura. En algunos casos, el pre-acondicionamiento, as
como el conocimiento del origen de
dnde sern retirados los explantes en
la planta madre (zona juvenil, adulta o
embrionaria), son necesarios para mejorar la respuesta morfognica, definidas
antes de proceder a extraer el material.
Una estrategia que ha sido ampliamente utilizada para la seleccin clonal, por
ejemplo en reas tropicales, como es el
caso de Hevea brasilensis, es el escrutinio de un gran nmero de plntulas. Esto
como una forma opuesta a la seleccin
de rboles maduros, sobre la base de su
aparente superioridad, ya que muchos
caracteres son influidos ambientalmente.
Una especie se caracteriza por su incapacidad natural para entrar, bajo circunstancias normales, en una unin sexual fuera de la especie. La biotecnologa de
plantas modifica esta imposicin, proveyendo en cambio, nuevos y tiles mtodos para introducir variacin gentica sin
participacin sexual (ver captulo 4). Los
bilogos de plantas ya han obtenido grandes ventajas de la reproduccin asexuada
para fijar aquellas caractersticas obtenidas va cruzamiento.
Plantas transgnicas
Una gran utilidad de las plantas transgnicas es la de producir nuevos beneficios y proveer servicios que remuevan
las dificultades inherentes para un desarrollo sustentable de la agricultura.
Sustentable, se utiliza en este contexto,
como sinonimia de respeto al medio
ambiente, siendo sta la tnica que ms
tarde o temprano se impondr en el
gerenciamiento y produccin del agronegocio. Los transgnicos tambin podrn ofrecer nuevas opciones para la
substitucin de material, cuando los recursos vegetales estn prximos a la extincin.
Las plantas trangnicas fueron una consecuencia natural del desarrollo de tcnicas como el cultivo de tejido in vitro
de plantas, pero ste era y es, fundamentalmente, una tcnica conservativa (ver
captulo 2). El problema de tornar el mejoramiento ms rpido y factible en muchas especies de importancia agronmica, quedaba todava abierto con ese
vasto arsenal de tcnicas que el cultivo
in vitro despliega (haploides, fusin de
protoplastos, clulas en suspensin,
etc.). Por eso entonces, el surgimiento
de plantas transgnicas era una cuestin
de tiempo.
En la actualidad, hay muchos ejemplos

de plantas transgnicas en produccin,
como es la incorporacin de resistencia
al herbicida glifosato, utilizado en remolacha, soya, raps, tomate, tabaco, algodn, etc. (Jayaraman, 2002). El glifosato
es un potente exterminador de malezas
eliminando aquellas plantas que poseen
la va del cido shiqumico. La resistencia contra insectos tambin se ha conseguido a travs de la introduccin en
la planta, del gen que codifica una toxina de Bacillus thuringensis, la cual provoca alteraciones fatales en el intestino
del insecto; a pesar de que, la gran plas-
21
ticidad genmica de estos, puede desarrollar resistencia a esta toxina (Huang

et al., 1999). Otras alteraciones genticas han sido la modificacin de la composicin de aceites de algunas oleaginosas en favor de cidos grasos ms
compatibles con la salud humana. El enriquecimiento del endosperma del arroz
con pro-vitamina A, no deja de ser una
esperanza para la poblacin de bajos ingresos (Ye et al., 2000). Tambin es importante mencionar el problema de la
maduracin del tomate y retraso de este
proceso, conseguido por va transgnica
mediante la alteracin de la sntesis del
etileno, la hormona vegetal justamente
decisiva en la maduracin de ste. En
frutillas, especie conocida por su corta
vida de post-cosecha, la va transgnica
ha conseguido aumentar su perodo de
almacenamiento mediante la incorporacin de secuencias antisentido del gen
que codifica para la enzima pectatoliasa, relacionada con el ablandamiento del fruto (Jimnez-Bermudez et al.,
2002). Siendo larga la lista de ejemplos,
no se puede dejar de mencionar los esfuerzos por inducir la sntesis de antgenos en las plantas (vacunas) para inmunizar poblaciones infantiles de sectores de bajos recursos contra diversas
infecciones bronquiales o intestinales
(Tariq et al., 1995; ver captulo 6).
Algunos intentos por identificar otras
familias de genes, como los genes responsables de caractersticas cuantitativas "QTL", (Quantitative Trait Loci; ver
captulo 7), se han visto frustrados por
la complejidad de los genomas. Para
ilustrar esta afirmacin, debe asumirse
que muchos rboles tienen un genoma
varias veces mayor al genoma humano.
Es as como en la Familia Pinaceae por
22
ejemplo, se encuentran rboles con alrededor de 20 billones de pares de bases, o sea, siete veces ms que lo hallado en humanos. Las limitaciones tecnolgicas del uso de QTLs, es que su manejo no implica el manejo de genes, sino
que stos identifican efectos genticos
que pueden estar ligados a muchos
genes. Por otro lado, los QTL no detectan interacciones epistticas entre loci.
De esta forma, mapas de alta resolucin
gentica y experiencias de mutagnesis,
pueden potenciar la relacin entre genes
candidatos y el anlisis con QTL (Flint y
Mott, 2001).
Dentro del arsenal moderno de otras tcnicas, se pueden sealar la sintenia y la
quimeraplastia. La primera, es un mtodo que compara mapas de genes de diferentes especies, pudiendo ser usada
para evaluar la funcin de genes basados en la similitud de secuencias y posiciones dentro de la hebra de DNA. La
segunda, se refiere al mtodo de insertar segmentos de DNA/RNA en la clula
vegetal, visualizando la induccin de
mutaciones de un gen especfico. En
maz, se puede lograr un gran nmero
de mutaciones por va de insercin de
DNA. El silenciamiento de RNA o la sobre-expresin de genes, han sido tambin usados para desactivar o activar
genes en las plantas, respectivamente.
Mayor eficiencia en la produccin.

Gracias a la ingeniera gentica, genes
de especies incompatibles pueden ser
introducidos en plantas para aumentar
la produccin y calidad de los cultivos.
Para la agricultura, tales aspectos en
concordancia con componentes ecolgi-
INTRODUCCIN
cos conforman un enfoque conveniente

y, por lo dems, altamente demandado
hoy en da. Por otro lado, en la parte forestal (Durzan y Campbell, 1974; Campinhos et al., 1992; Ferreira, 1995; Campinhos, 1999), no menos importante ha sido la contribucin del uso de los marcadores moleculares, la propagacin
clonal y el uso de micorrizas, en la perspectiva de aumentar la densidad de la
plantacin para disminuir costos (Lander
y Weinberg 2000). A consecuencia de
esto, surgen tambin preguntas fisiolgicas fundamentales, como por ejemplo,
Cules son los efectos de la competencia por luz, por nutrientes, por agua, por
espacio, por crecimiento alomtrico y
por problemas de fitosanidad? (Sinclair
y Gardner, 1998).
cmo sern afectadas las poblaciones

naturales de los diferentes ecosistemas?
Por ello, se tendrn que desarrollar nuevas plataformas tecnolgicas (Durzan y
Durzan, 1993).
Nuevas plataformas tecnolgicas

para el progreso de la
produccin agrcola
El estudio del genoma de las plantas est
presentndose ms difcil de lo imaginado, de modo que se tienen que desarrollar nuevos mtodos. Dentro de esta
perspectiva, los investigadores de plantas podrn utilizar los "transposones" y
crear mutantes que ayudarn a identificar efectos fenotpicos en su comparacin con los efectos ejercidos por genes
normales.
Cambios en el clima global

Es ampliamente aceptado que existen
cambios en el clima global que afectan
la atmsfera, hidrsfera y litsfera de
muchas partes del mundo (Watson y
Team, 2001). O tal vez, que los cambios
en estas ltimas hayan llevado a cambio en el clima global. Nuestra mayor
evidencia cientfica sugiere poderosamente que un importante componente
de estos cambios es debido a la accin
humana. Entretanto, se necesitan ms
estudios para llegar a comprender las
causas ms profundas que los han originado, sus implicaciones a mediano plazo y las posibles soluciones, a objeto de
direccionar ms adecuadamente las predicciones y soluciones ms plausibles.
Por ejemplo, cunto tiempo va a durar
la falta de agua en el norte de Chile?,
cunto ser su abundancia en el sur y
Una importante nueva tecnologa para

el estudio de plantas es el "DNA
microarray" (microarreglos de DNA),
conocido tambin por "DNA chip" o simplemente "chip" (Dhiman et al., 2002;
ver captulo 8). Esta poderosa herramienta capacita un rpido y simultneo anlisis de un gran nmero de experimentos de hibridacin de cidos nucleicos
para identificar genes en respuesta a
"estrs" ambiental y cambios relacionados con etapas del desarrollo. Por ejemplo, saber cuntos genes intervienen en
la formacin de una manzana, un meln, o una papa. As, la tecnologa del
"microarray" ayuda a la identificacin de
genes expresados ante un estmulo especfico y levanta el perfil transcripcional de un determinado fenotipo, permitiendo separar o identificar los efectos adversos cuando la planta es some-
23
tida a variados estmulos. La tcnica genera modelos ms amplios de anlisis

para entender los factores involucrados
en el "diseo" de nuevos genotipos y
para el desarrollo de productos ms especficos, tales como drogas y vacunas,
por ejemplo, contra la mastitis en animales.
En el futuro, laboratorios biotecnolgicos podrn usar tambin fuerzas atmicas minsculas y nanotecnologas para
investigar el DNA. As, los productos
sern mejor ajustados a las necesidades
de los genotipos deseables (Anon, 1999).
La explosin de nuevos datos de los estudios genmicos y de la biologa
molecular en general, ha conducido al
nacimiento de la bioinformtica como
un paso crtico en la realizacin del pleno potencial de la revolucin biotecnolgica (Gwynne y Page, 2000). La bioinformtica nos permite pensar de manera bastante asertiva la construccin de
la filogenia de las plantas. Por ejemplo,
en lo que se denomina evaluacin lineal
de secuencias de DNA. El prximo nivel de diagnstico bioinformtico comprende el abordaje del genoma funcional basado en el anlisis de DNA, RNA,
protenas y metabolitos (Risch, 2000).
Esto involucra la identificacin de la funcin y del gen, su organizacin y control sobre vas genticas que influencian
la fisiologa del organismo. Por cierto
que la bioinformtica ser decisiva en
esta cuestin. As, los datos provenientes de la bioinformtica ayudarn a establecer la posicin relativa de un particular gen en un cromosoma, demarcar
su posicin y esclarecer el papel en una
va metablica, las que en plantas existen muchas por conocer mejor todava.
Es claro que la identificacin funcional
24
de un gen significa conocer su producto; en este sentido, el proteoma envuelve toda la terminologa usada para describir la expresin funcional de protenas responsables de un fenotipo dado
(Pandey y Mann, 2000). En adicin a
esto, la biotecnologa de plantas tiene
que explorar la frmaco-genmica, o el
estudio de cmo las diferencias genotpicas influyen en las consecuentes
y variadas respuestas de las plantas frente a los agroqumicos (herbicidas, y
fungicidas). Ello implica entre otras cosas, seguir la pista de un determinado
metabolito en la clula (Roses, 2000; Shi
et al., 2001). El trmino "metanmico"
justamente est relacionado con este
concepto (Bailey, 1991). El diagnstico
"metanmico", por otro lado, ha generado el concepto de "metabolmico".
Este comprende la idea del anlisis de
conjunto de perfiles metablicos en el
interior de la clula, envolviendo por
tanto, aislamiento, separacin, identificacin y caracterizacin de esos perfiles o secuencias bioqumicas. Esto, en
un esfuerzo por realizar modelos que relacionen estructura y funcin (Hunter,
1993; Kauffman,1993).
La tecnologa de los protoplastos, sin
duda, ha generado inters desde este
punto de vista. Al permitir fusionar clulas, podra ofrecer mayores posibilidades de estudios de genomas susceptibles
o resistentes. El potencial de estudio
parece amplio y vasto. As no ser extrao producir algn da, hbridos interespecficos. Por ejemplo, introduciendo
cloroplastos en la clula animal. Entretanto, cabe mencionar que estos abordajes han sido pocos exploradas en funcin del limitado inters.
INTRODUCCIN
Planta, biotecnologa
y medio ambiente.
El excesivo uso de recursos renovables
y no renovables debido al incremento
de la poblacin y otros factores, coloca
bajo severa amenaza al medio ambiente, implicando la produccin de xido
de azufre, compuestos nitrogenados y
carbnicos.
La biotecnologa e industria qumica han
dependido fuertemente de derivados del
petrleo para la produccin de bienes y
servicios. Con los recientes progresos de
la biotecnologa de hoy, existe una considerable promesa para el uso de plantas y recursos renovables que puedan
aminorar este problema. La plataforma
tecnolgica de la bioingeniera de plantas est sensibilizada con el problema e
incluye en sus procesos, nuevos abordajes que puedan resultar en manufacturas con menor impacto ambiental.
Se han realizado esfuerzos significativos
para crear positivos beneficios en reas
como las siguientes: Produccin y uso
de energa, Reduccin de polucin,
Reciclaje de materiales de desperdicio,
Progresos en agricultura y ciencias forestales, Armas biolgicas. En este sentido, la fermentacin de biomasa renovable y reciclable, representa un esfuerzo integrado que puede disminuir los
problemas. As ella produce un producto energtico (etanol) de "fuentes verdes", que provoca menos polucin que
su anlogo fsil. Por otro lado, los biorreactores y digestores al producir gas
metano, con el consiguiente reciclaje de
desechos y produccin de energa, estn dando su contribucin efectiva contra la polucin. Los organismos genticamente modificados podran reducir los
desechos industriales evitando el impacto negativo del progreso (Wiseman,
1988). Hongos y plantas podran ser programados para ser usados como indicadores de la calidad ambiental detectando y absorbiendo txicos y metales pesados; en fin, disminuyendo los riesgos
de cncer u otro tipo de enfermedades.
Nosotros estamos justamente comenzando a comprender cmo las plantas crecen y funcionan molecularmente, inclusive con el uso de modelos de microgravedad (Durzan, 2000). Tambin se requiere de mejores modelos para definir
cmo la vida de las plantas se podra
extender a ambientes hostiles fuera de
nuestro planeta; por eso, la necesidad
de construir plataformas espaciales.
Tratndose del medio ambiente, es bueno hacer un poco de historia. sta nos
recuerda que nuestro ambiente nos ha
impuesto pesadas tragedias, causadas
por minsculos enemigos (microorganismos). Fue as con las papas en Irlanda
en 1875, con el caf en Ceyln en 1870,
con los castaos en Estados Unidos en
1904 y en general, con ataques epidmicos en cereales. Todos estos hechos
nos sugieren que agentes patognicos y
ms recientemente plantas transgnicas,
podran ser utilizados con fines militares o terroristas (United Nations, 1969).
Los objetivos podran ser los productos
agrcolas y/o reservas de germoplasmas
naturales.
25
Cuatro pre-condiciones podran ser sealadas para provocar estas amenazas:

1. Una gran poblacin de plantas hospederas debera estar presente.
2. El agente debera ser capaz de reconocer y atacar una particular poblacin.
3. Cantidades adecuadas del agente infeccioso o vector deberan estar disponibles.
4. El ambiente debera ser favorable a la
propagacin del vector. Los agentes
podran ser lanzados desde aviones,
misiles, aerosoles, etc.
El uso de otros mtodos tales como la
radiacin electromagntica y el rayo lser, aplicados por avin, no podra ser
descartado. Esto permitira irradiar plantas afectando su ciclo natural de desarrollo, quebrando su dominancia apical,
ciclo floral, produccin de yemas, etc.
(Durzan y Campbell, 1979; Durzan,
1980). Empero, es bueno precisar que
sera el hombre, y no la ciencia, el responsable por el mal uso de ella.
Entretanto, ya a nivel de laboratorio, la

biotecnologa ha producido una serie de
productos farmacuticos. Entre ellos
pueden citarse: la insulina, el interfern
para el tratamiento de infecciones virales
y cncer, la hormona del crecimiento,
interleuquinas contra el cncer y
pptidos neuroactivos para disminuir la
intensidad del dolor. Existe una amplia
variedad de antibiticos y agentes
antimicrobiales. Sin embargo, muchos
de estos productos necesitan todava del
visto bueno de aprobacin por agencias
gubernamentales.
La frmaco-genmica, como rama emergente de la biotecnologa, tendr gran
preponderancia en este sentido en el
futuro. Ello se debe a que requerir examinar detenidamente las variaciones individuales en respuesta a la terapia con
drogas, polimorfismo gentico, marcadores y anlisis de ligamiento, sin llegar
necesariamente a involucrarse con terapia gentica o clonaje de rganos humanos.
Desafos futuros
La biotecnologa de plantas,
la industria y la salud
A travs del control de procesos metablicos y fisiolgicos, la ingeniera bioqumica podra mejorar y modificar la produccin de metabolitos secundarios que no
pueden ser sintetizados por problemas
qumicos o econmicos. Esto incluye hormonas, drogas anticncer, modificacin
de vitaminas, contenidos de carbohidratos, etc. Las plantas podran ser clonadas
y cruzadas para proveer la apropiada diversidad gentica, necesaria para la produccin a gran escala en el campo.
26
La produccin sustentable de alimentos,

fibras, maderas, combustible, etc., permanecen como desafo frente a cuestiones candentes, como lo es el explosivo
aumento de la poblacin mundial. Poblacin que hoy ya casi alcanza los seis
billones de habitantes, la exclusin social, la polucin, seguridad social, la disminucin de los recursos naturales renovables y la corrupcin. Por otro lado,
la cantidad de tierra disponible para la
agricultura, aprovechamiento de la energa solar a un costo ms barato y la disminucin de las fuentes de agua dulce,
INTRODUCCIN
levantan preocupaciones colocando lmites para los modelos propuestos de

produccin sustentable. La llegada de la
biotecnologa y toda su amalgama de
derivados, es solamente una fraccin de
las posibles soluciones para vencer todo
este abanico de desafos que se avecinan (Mann y Plummer, 2002). Sin embargo, las soluciones tendrn que ser
probadamente seguras y pblicamente
aceptadas, aspecto muchas veces nada
fcil. En ello debemos considerar la serie de factores que pesan sobre ellas,
entre las cuales pueden citarse, la misma ciencia, la religin, la filosofa, la
economa, los derechos humanos y la
infaltable poltica. Existe eso s, la conviccin de que tomado en su conjunto,
este proceso biotecnolgico, al final de
cuentas, llevarn a mejorar la salud pblica, la industria y el conjunto de la
economa. Para esto, es clave partir de
una apropiada legislacin, pro-activa y
con agentes reguladores confiables, los
que a su vez gocen de la existencia de
recursos financieros y humanos apropiados (Stock, 2002). Con todo esto en la
mano, los esfuerzos biotecnolgicos
conseguirn: ms con menos, calidad en
lugar de cantidad, reduccin de riesgos
y proveer una existencia humana ms
digna y duradera (Fukuya, 2002).
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29
30
EL CULTIVO DE TEJIDOS
CAPTULO 2
L. Pedro Barrueto C.
ANTECEDENTES HISTRICOS
DEL CULTIVO DE TEJIDOS
VEGETALES
n la teora sobre totipotencialidad

formulada por Schleiden y Schwann
en 1838, cada clula vegetal es autnoma y capaz de regenerar una planta completa cuando est sometida a condiciones especiales (Pierik, 1987a). Esta teora, adelantada para su poca, representa el primer paso para el desarrollo de
las tcnicas de cultivo de tejidos in vitro.
Basado en ella, en 1902, Haberlandt, un
fisilogo austro-hngaro, intent mantener explantes foliares in vitro buscando
perpetuar su potencial mittico. Sin
embargo, sus resultados fueron negativos (Dodds y Roberts, 1982) y su fracaso tuvo como principal causa la falta de
asepsia y el no uso de hormonas. Pocos
aos despus (1910), trabajos realizados
por Carrel y otros investigadores en cultivos de clulas animales y humanas in
vitro, demostraron a travs de sus resultados, un avance significativo.
Las investigaciones en el rea vegetal
continuaron. En 1922, se obtuvieron interesantes resultados preliminares en trabajos con races de tomate (Robbins,
1922), los que ms tarde se confirmaron
por White (1934), quien mostr que stas no paraban de crecer in vitro, incluso
tras un largo tiempo, asombrando as a
la comunidad cientfica de la poca.
En la dcada de 1930, se logr establecer que el uso de vitaminas como B 1, B 6

y tambin la inclusin de compuestos orgnicos, tales como la sacarosa, permitan el enriquecimiento de los medios
nutritivos utilizados anteriormente. As
se posibilit la mantencin contenida de
especies antes imposibles de ser introducidas al laboratorio, dando un empuje
significativo al desarrollo de plantas cultivadas in vitro. Aqu, merece especial
atencin Skoog, en los Estados Unidos,
porque logra inducir regeneracin de
plantas a partir de explantes iniciales de
mdula de tabaco (Skoog y Tsui, 1948).
Por otro lado, en Francia, Morel y Martin
(1952), revolucionaban el ambiente al
promover el crecimiento de dalias libres
de virus a partir de yemas apicales.
Al final de la dcada de 1950, Reinert
en Alemania y Steward en los Estados
Unidos (Steward et al.,1958; Reinert,
1959), logran de manera casi simultanea, inducir embriones no cigticos de
zanahorias, haciendo disponible as una
metodologa de propagacin clonal en
gran escala con especial repercusin en
las empresas forestales (ver captulo 1:
Figuras 1.1-5) y de comercializacin de
flores.
Por otro lado, al comenzar la dcada del
1960, Cocking en Inglaterra (Cocking,
1960) obtiene protoplastos (clulas sin
pared celular) y Murashige y Skoog
(1962), publican su medio nutritivo para
31
el cultivo de plantas in vitro, siendo esta

publicacin tal vez la ms citada en el
mbito del cultivo de tejidos vegetal de
todos los tiempos.
La suma de descubrimientos no se detiene y en la misma dcada Guha y
Maheshwari (1964), dos investigadores
indios, consiguen obtener plantas
haploides a partir de granos de polen
inmaduros y algunos aos ms tarde en
los Estados Unidos, son publicados los
primeros resultados sobre seleccin in
vitro (Carlson, 1970). Mientras tanto,
Power hace lo mismo sobre fusin de
protoplastos (Power et al., 1970). Avanzando en el tiempo, Larkin y Scowcroft
(1981), introdujeron en la nomenclatura del cultivo de tejidos de planta, el
trmino de variacin somaclonal. En la
misma dcada, comienzan a aparecer
los primeros trabajos con Agrobacterium
tumefaciens y biobalstica, en el campo
de la transformacin gentica de plantas (Larebeke et al., 1974; Klein, et al.,
1987).
Todas estas investigaciones, adems de
reafirmar la vitalidad de la teora de la
totipotencialidad, tuvieron un profundo
impacto en biologa de plantas, agricultura y especialmente, en el cultivo de
tejido de plantas, tcnica que ofrece entre otras, las siguientes ventajas:
Permite fijar caractersticas de hbridos, en menor tiempo, que el mtodo clsico de mejoramiento va cruzamientos repetitivos.
Produce gran cantidad de propgulos
(clones), a partir de un nmero reducido de los mismos.
Los propgulos a su vez, pueden re-
32
presentar caractersticas superiores a

sus congneres oriundos de semillas.
Provee material clonal durante todo
el ao, con la ventaja que este material est libre de contaminantes. Por
tanto, sin riesgo de diseminar plagas
o enfermedades a nuevas reas.
Sirve de base para trabajos de ingeniera gentica y transformacin de
plantas,
Da soporte tcnico para la investigacin bsica en diferentes campos de
la biologa, gentica, fisiologa,
fitopatologa, etc.
Puede facilitar enormemente el intercambio de germoplasma entre pases.
LA BASE DEL CULTIVO in vitro,

EL MEDIO NUTRITIVO
Componentes inorgnicos
a.- Agua.
El agua es el componente ms abundante
de los seres vivos, pudiendo constituir
aproximadamente hasta el 90 % del peso
fresco de los mismos. Por eso, no slo
es fundamental en el medio nutritivo,
sino que tambin es el componente principal.
Sus propiedades fsicas y qumicas son
resultantes de su estructura molecular.
A pesar de ser elctricamente neutra, es
un dipolo que presenta carga positiva y
negativa. Una consecuencia de esto, es
su capacidad de disolver o neutralizar
la atraccin de cargas elctricas de cristales como NaCl, los cuales son desarmados como tales para ser convertidos
en iones hidratados aislados. Esta capa-
cidad del agua como disolvente de substancias inicas, est reflejada en su alta
constante dielctrica (en torno de 78),
si se compara con la de un lquido orgnico no polar como el etanol, que es 24
(Hopkins, 1999a).
Otra propiedad resultante de aquella estructura bipolar, es la atraccin electrosttica entre las molculas de agua a travs de puentes de hidrgeno. Por esta
propiedad, cada molcula de agua puede ligarse a cuatro otras vecinas, configurando una red fantstica de conexiones. Esto, sin duda, otorga un grado de
fuerza de cohesin molecular. Sin embargo, estas ligaciones por puentes de
hidrgeno son dbiles (5 Kcal/mol), lo
cual hace que se rompan casi instantneamente. Debido a la fuerza electrosttica de las cargas de la molcula, que
estn siempre presentes, estos puentes
se reconstituyen casi con la misma velocidad. As, el estado lquido del agua
al final de cuentas, es un estado oscilante entre esta red de molculas de
agua que se hace y deshace, que se arma
y desarma. De esta forma, se va generando la fluidez que para todos nosotros
es tan familiar a temperatura ambiente
y, que es fundamental para el transporte
de nutrientes, reacciones metablicas,
eficiencia fsico-qumica del coloide
protoplasmtico, presin osmtica y de
turgor de la clula vegetal (Voet y Voet,
1995).
La existencia de esa alta capacidad de
formar puentes de hidrgeno entre las
molculas de agua, tambin es responsable por su alto calor de fusin y de
vaporizacin. Calor de fusin es la cantidad de energa necesaria para que una
substancia pase del estado slido al l-
quido. En el caso del agua, este valor es

de 80 cal/g ( 1,4 Kcal/mol). Por otro
lado, calor de vaporizacin es la cantidad de energa necesaria para una substancia dejar el estado lquido y pasar al
estado gaseoso. En el caso particular del
agua a 25 C, el calor de vaporizacin
es de 583 cal/g ( 10 Kcal/mol 44 KJ/
mol), que es a todas luces, un alto valor
para cualquier lquido. Debido a que la
mayor parte de esta energa es usada para
quebrar los puentes de hidrgeno, es precisamente el agua, el elemento indicado
para que los seres vivos la utilicen en los
procesos fisiolgicos de regulacin de
temperaturas fisiolgicas, como lo es la
transpiracin y el control de la temperatura foliar (Taiz y Zeiger, 2002).
Desde el punto de vista prctico, en un
laboratorio de cultivo de tejidos, adems
de destilar el agua, es conveniente pasarla por un sistema de desionizacin
para conferirle una mayor pureza. Generalmente puede aceptarse una resistencia elctrica de aproximadamente 10
mega-Ohm. Por otro lado, los recipientes donde sta se almacena, tambin
deben ser motivo de cuidado, siendo los
de vidrio Pyrex preferibles a los no
Pyrex, pues estos ltimos pueden liberar impurezas, como algunas sales en
forma de silicatos, propio de vidrios poco procesados. Tambin son tiles recipientes plsticos, pero muchos de stos
no son autoclavables.
b.- Sales Minerales.
Las sales minerales que encontramos en
un medio nutritivo disueltas en el agua,
son denominados de macro y micronutrientes y estn constituidos por aproximadamente 17 elementos. Esta denomi-
33
nacin alude al hecho de que los primeros, se adicionan al medio en mayor

cantidad que los segundos. As por ejemplo, el KNO 3 se puede adicionar hasta
1900 mg/L en el medio Murashige y
Skoog (MS), contra 6,2 mg/L de H 3 BO 3
(un micronutriente) en este mismo clsico medio MS. La inclusin de estos
17 elementos est relacionada con el carcter esencial de ellos para la planta.
Esto quiere decir que, sta no se desarrolla adecuadamente en su ausencia.
De esta forma, los elementos esenciales
son irremplazables por otros, an estando estos vecinos en la Tabla Peridica.
Estos elementos son los siguientes: carbono, hidrgeno, oxgeno, nitrgeno,
fsforo, potasio, calcio, magnesio, azufre, boro, cloro, cobre, fierro, manganeso, molibdeno, zinc y nquel (Salisbury
y Ross, 1992). Existen varias formulaciones de medios nutritivos, entre ellas est
el medio: White, MS, B5, Nitsch, SP, etc.
(Tabla 2.1). En la actualidad, se cuenta
con medios especficos para la induccin de diferentes morfognesis, considerando por ejemplo si los explantes
provienen de plantas leosas o herbceas, e incluso se han descrito medios
preferenciales dependiendo de ciertas
familias o grupos de plantas taxonmicamente afines (Figura 2.1).
En muchos casos, la esencialidad o no
de un elemento en la planta, o en el reino vegetal, todava no est clara. Respecto al fsforo y el magnesio por ejemplo, deduciremos fcilmente que unos
de sus papeles fundamentales en las
plantas se relacionan obviamente con la
constitucin del DNA y clorofila, respectivamente. Pero en el caso del silicio,
este rol (o roles) se desconoce (n); as,
puede ser encontrado en muchas plan-
34
Figura 2.1.
Plntula de Eucalyptus globulus
de 20 das de edad.
La planta ha sido germinada in vitro en
medio SP ms Phytagel, con fotoperodo de
8 horas luz y temperatura de 25 2 C.
Las semillas, antes de ser colocadas a
germinar, fueron desinfectadas con
hipoclorito de sodio al 5 % durante
30 minutos y provenan de un lote
almacenado durante 4 aos a 10 C
aproximadamente. En la figura se
puede observar el vigoroso desarrollo
del hipoctilo y ausencia del epictilo.
Tabla 2.1. Composicin de algunos medios nutritivos (mg/L)

Componentes
MS
**
(NH4)2SO4
B5
1.650,0
KNO3
Ca(NO 3)2
1.900,0
2.500,0
440,0
370,0
150,0
250,0
Na2SO 4
KH2PO 4
NaH2PO4 . H2O
KCl
*
FeSO4 . 7H2O
Na2EDTA
FeCl3 . 6H2O
Fe2(SO4)3
MnSO4 . 4H2O
MnSO4 . H 2O
ZnSO4 . 7H2O
H3BO3
KI
Heller
SP
825,0
600,0
80,0
300,0
720,0
950,0
75,0
250,0
220,0
185,0
125,0
85,0
200,0
170,0
150,0
27,8
37,3
16,5
65,0
750,0
27,8
37,3
13,9
18,65
1,0
2,5
22,3
8,6
6,2
0,83
10,0
2,0
3,0
0,75
Na2MoO 4 . 2H2O
CuSO4 . 5H2O
CoCl2 . 6H2O
NiCl2 . 6H2O
AlCl3
0,25
0,025
0,025
0,25
0,025
0,025
Mio-inositol
cido nicotnico
Piridoxina . HCl
Tiamina . HCl
Glicina
Pantotenato de Calcio
100,0
0,5
0,5
0,1
2,0
100,0
1,0
1,0
10,0
Sacarosa
30.000,0
Kinetina
2,4-D
AIA
0,04-10,0
pH
134,0
(NH4)2NO3
NaNO3
CaCl2 . 2H 2O
MgSO 4 . 7H2O
White
7,0
0,01
22,0
3,0
1,5
0,75
1,0
1,0
0,01
8,0
6,0
0,03
0,25
0,25
0,25
0,03
0,03
0,5
0,1
0,1
3,0
1,0
1,0
50,0
1,0
1,0
1,0
20.000,0
20.000,0
20.000,0
20.000,0
0,1
0,1-1,0
6,0
5,5
5,5
1,0
1,0-30,0
5,7-5,85
5,8
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**Macronutrientes: NO 3, S0 4 , H 2 P04 , Ca, Mg, K.
*Micronutrientes: Fe, Mn, Zn, B, Mo, Cu, Co, Ni, Cl.
2
3
35
tas (ejemplo gramneas), pero no se ha

demostrado su esencialidad en soluciones nutritivas, a pesar de que, en diatomeas es vital (Epstein, 1975). El selenio
es otro elemento cuya esencialidad no
est declarada para la mayora de las
plantas, no obstante, algunas lo presentan en relativamente altas concentraciones en sus tejidos, (Astragalus y Atriplex,
por ejemplo) a pesar de ser un elemento
txico. El nquel es otro caso sorprendente, se encuentra en la lista de elementos esenciales, a pesar de que principalmente forma parte de enzimas bacterianas. Entre ellas, la ureasa y monxido
de carbono (CO) deshidrogenasa, ambas
importantes en el ciclo del N 2 y CO 2 en
la naturaleza (Thauer, 2001).
La interaccin de los iones (aniones y
cationes) con la interfase celular, en el
mbito de la clula vegetal, ha sido estudiada con intensiva atencin dentro de
la fisiologa vegetal. Por la informacin
disponible actualmente, el flujo de iones
a travs de la membrana celular depende de una serie de factores. Entre ellos
se pueden citar: carga elctrica de los
iones, concentracin, temperatura, respiracin, configuracin de la membrana (protenas intrnsecas y extrnsecas),
potencial elctrico de membrana,
AT P a s a s , t r a n s p o r t a d o r e s , c a n a l e s ,
acuoporinas, etc. (Clarkson, 1984;
Levitan y Cibulsky, 2001; Taiz y Zeiger,
2002). Estos factores slo se mencionan
y no se describen, por alejarse del objetivo del presente captulo.
En el laboratorio el uso de esta extensa
lista de sales minerales, plantea el problema de cmo manipularlas. Manteniendo la premisa de la mnima manipulacin de los reactivos para as evitar
36
al mximo los focos de contaminacin,

es altamente recomendable la preparacin de soluciones madres y su mantencin en el refrigerador o congelador
(cuando se pueda). Tambin, es recomendable preparar soluciones madre
para macro y micronutrientes. En una solucin madre, las distintas sales se preparan varias veces en su concentracin
normal de trabajo por litro. En el caso
de los macronutrientes del medio MS,
por ejemplo, 10x para un litro (lo que
significa hacer un litro de una solucin
madre con diez veces la concentracin
de usual trabajo de macronutrientes). En
el caso de los micronutrientes, para el
mismo MS, la solucin madre podra ser
de 100x para100 mL de agua (lo que significa hacer cien mL de una solucin
madre con cien veces la concentracin
de usual trabajo de micronutrientes). As,
en la preparacin de un litro de medio
(solucin de trabajo), deber utilizarse
1 mL de solucin madre de los micro- y
100 mL de solucin madre de los
macronutrientes.
Las cantidades de sales presentes en los
medios nutritivos, como los ya mencionados, vara de medio en medio. Una
planta in vitro puede presentar deficiencias o consumo en exceso (o lujo), segn se encuentre bajo o sobre la concentracin crtica del elemento, respectivamente. Esto es, por ejemplo, dependiente de si la planta se encuentra sin
races o con ellas. Por este motivo, numerosas veces son preferidos medios
ms diluidos, como el SP. La concentracin crtica de un elemento, es aquella
un poco menor al nivel que da el crecimiento ptimo de la planta (Hopkins,
1999b). La informacin sobre concentracin crtica de un elemento, en su
mayora es proveniente de las condiciones de nutricin de las plantas en el

campo, o de soluciones hidropnicas en
laboratorio. De esta forma, la utilizacin
de este concepto en el cultivo de tejidos, es una extrapolacin de la informacin de las condiciones de nutricin. Sin
duda, una lnea de estudios que considere lo sealado, se visualiza promisoria
para la tcnica de cultivo de tejidos.
Componentes orgnicos
a.- Vitaminas.
Las vitaminas son una denominacin
genrica que incluye un grupo de sustancias orgnicas presentes en pequeas
cantidades dentro de la clula, participando de determinadas funciones dentro de ella, como por ejemplo, ser un
cofactor no proteico de enzimas.
El nombre de vitaminas est ligado histricamente al polaco Casimiro Funk,
quin descubri que este principio activo estaba vinculado a la prevencin del
denominada beriberi, una carencia
nutritiva relacionada con la vitamina B 1
en poblaciones que consuman preferentemente arroz blanco.
En general, las vitaminas forman parte
de enzimas, por lo que son importantes
para desempear una accin cataltica
normal. En este sentido, son cofactores
de las enzimas, igual que muchos elementos qumicos presentes entre los
macro y micronutrientes.
La vitaminas se dividen en liposolubles
(A, D, E, K) e hidrosolubles. Entre estas
ltimas tenemos: B 1: tiamina; B 2: ribofla-
vina; B 3: niacina; B 6: piridoxina; biotina;

cido flico; B 12 : cobalamina; cido
ascrbico: vitamina C (Voet y Voet,
1995).
En cultivo de tejidos vegetales bsicamente son utilizadas las del complejo B, siendo la B1 probablemente la ms frecuentemente incluida. Es vital para la descarboxilacin del piruvato, pues es un
aceptor momentneo del grupo acetaldehdo, co-auxiliando a la piruvato
descarboxilasa, acetaldehido deshidrogenasa y -cetoglutarato deshidrogenasa.
La vitamina B 6 (piridoxina), es grupo
prosttico de varias enzimas, siendo el
piridoxal-fosfato la forma ms activa como
grupo prosttico de enzimas que catalizan
reacciones de aminocidos, como por
ejemplo, las transaminaciones, en las cuales, el grupo amino de un -aminocido
es transferido a un -cetocido, ejemplo:
glutamato cetoglutamato; aspartato
oxaloacetato.
El cido pantotnico es otra vitamina con
funcin de coenzima, pues, es un cofactor
importante de la Coenzima A, molcula
que desempea un papel importante entre la interfase de la gliclisis y el ciclo de
Kreb (piruvato oxaloacetato) (Stryer,
1992).
Otras vitaminas importantes del complejo B (cido flico, vitamina B 12) y vitamina C (cido ascrbico), no son frecuentemente citadas en la literatura del
cultivo de tejidos vegetales. A pesar de
esto, el cido ascrbico puede ser usado como antioxidante (100-200 mg/L) de
explantes, antes de que stos sean inoculados en el medio nutritivo, para evi-
37
tar el fenmeno de pardeamiento

(browning). ste es bastante problemtico en el cultivo de tejidos, especialmente en plantas leosas. Como antecedente tcnico, es importante mencionar que esta vitamina debe ser constantemente ingerida por el hombre y que
su carencia produce el escorbuto (hemorragias diversas y sangramiento de las
encas, entre otros).
La niacina (B 3 , cido nicotnico), como
componente del complejo vitamnico B,
est presente en la mayora de los medios nutritivos. Adems, es precursor de
NAD + (nicotinamida-adenina-dinucletideo) y NADP + (nicotinamida-adeninanucletideo-fosfato), siendo ste su verdadero rol en la planta. En la mayora
de las deshidrogenasas donde estos compuestos estn presentes, se unen transitoriamente a ellas durante el ciclo
cataltico, oxidndose (NAD + ) o reducindose (NADH), como en el caso de
la malato deshidrogenasa, donde el
malato es deshidrogenado y transformado en oxaloacetato.
b.- Sacarosa
Es el soluto adicionado al medio nutritivo en mayor cantidad como fuente de
energa, y es preferido a otros carbohidratos (White, 1934). La sacarosa, desde el punto de vista estructural, est
constituida por la unin de D-glucosa y
D-fructosa ligadas covalentemente a travs de un enlace glucosdico. Es sintetizada por numerosas plantas, pero no es
sintetizada por los animales superiores.
Constituye un producto intermediario de
la fotosntesis, extremadamente soluble
38
en agua y no tiene poder reductor, siendo la forma de transporte de los carbohidratos ms utilizada por las plantas desde las hojas a otros rganos, proceso que
ocurre va floema. A travs de este recorrido, la sacarosa no es degradada por
enzimas, pero, la invertasa la desdobla
en sus componentes naturales, en el interior de las clulas, en beneficio de la
gluclisis, formacin de almidn, celulosa, etc. (Salisbury y Ross, 1992).
Su adicin al medio se justifica debido a
que, el explante o las plntulas que se
generan in vitro, generalmente presentan
una baja tasa fotosinttica debido a sus
condiciones especiales de desarrollo, no
siendo completamente autotrficos.
La concentracin ms frecuentemente
utilizada vara entre 20 a 30 g/L, pero
dependiendo de los casos, puede adicionarse en concentraciones ms altas,
como en el cultivo de embriones, orqudeas, bulbificacin de ajo, etc.
Es oportuno resaltar que la sacarosa puede ser hidrolizada en su paso por el autoclave. Aunque, el impacto de esto para el
explante o la planta no est claro, tampoco para el potencial osmtico del medio.
En el mercado, son comercializadas a
travs de diferentes marcas tales como;
Sigma, Merck, Carlo Erba, Fluka, etc.;
todas ellas con alto grado de pureza, lo
que encarece su costo. Adems, es recomendable llamar la atencin sobre el
hecho de que el azcar comn de supermercado, presenta un alto grado de
sacarosa (tal vez 98 %), pero puede contener impurezas.
Otros carbohidratos como: glucosa, manosa, fructosa, sorbitol, etc., tambin

han sido utilizados, sin embargo, no son
de uso frecuente (Tang, 2000).
c.- Hormonas
La mayora de los cultivos de tejidos
vegetales in vitro necesitan de estas
biomolculas (Tabla 2.2). No obstante,
la concentracin y el tipo de hormona
depender de cada caso. En general, son
tres grupos de hormonas las ms empleadas: auxinas, citoquininas y giberelinas.
Existen otras dos biomolculas muy importantes dentro de las hormonas: el
etileno y el cido abscsico, que aunque
son menos utilizados, juegan papeles
importantsimos dentro del metabolismo
del explante in vitro. Por ejemplo, el
etileno es capaz de activar enzimas relacionadas con la senescencia y oxidacin fenlica del tejido (Davies, 1995).
- Auxinas
Entre stas (Tabla 2.2, Figura 2.2), est
el cido indolil-3-actico (AIA), cuya
sntesis es realizada a partir del triptfano, el cual dependiendo de la planta,
por va enzimtica puede primeramente
descarboxilarse o desaminarse, para despus dar origen al indol-3-acetaladehdo, el cual, por oxigenacin da origen
al AIA. Esta hormona es sintetizada a
partir de tejidos meristemticos en la
planta (meristema apical, radicular, yemas embriones, etc.). El cido naftalenactico (ANA), picloram (cido 3,5,6
tricloropicolinico), cido indolbutrico
(AIB), cido 2,4-diclorofenoxiactico
(2,4-D), cido 4-cloroindol-3-actico (4Cl-AIA), etc., son ejemplos de auxinas.
No todas las auxinas son hormonas, es
as como el ANA, picloram, 2,4-D, etc.,
son denominados reguladores de creci-
Tabla 2.2. Lista de algunos reguladores de crecimiento y de hormonas

usadas en cultivo de tejidos de plantas.
Nombre
Abreviatura
Peso molecular (g)
AIA
AIB
175,2
203,2
2,4-D
ANA
221,0
186,20
APCF
2,4,5-T
186,60
225,49
Dicamba
Picloram
221,0
241,46
ABA
A
264,3
135,13
6-(4-hidroxi-3-metil-trans-2-butenilamino) purina
N 6-furfuriladenina, o, 6-furfurilaminopurina
Zeatina
Kinetina
219,0
215,2
6-bencilamino purina,o,6-benciladenina
6-(,-dimetilalilamino) purina,o, 2-isopenteniladenina
BAP, BA
2iP
225,3
203,25
TDZ
220,2
cido indolil-3-actico
cido indolil-3-butrico
cido diclorofenoxiactico
cido -naftalenactico
cido p-clorofenoxiactico
cido 2,4,5-triclorofenoxiactico
cido 2-metoxi-3,6-diclorobenzoico
cido 4-amino-3,5,6-tricloropicolnico
cido abscsico
Adenina
1-fenil-3-(1,2,3-tiadiazol-5-il) urea
39
CH 2COOH
CH 2CH 2CH 2OOH
N
H
OCH 2COOH
CH 2COOH
Cl
Cl
OCH 2COOH
Cl
OCH 2COOH
Cl
Cl
CH 3O
Cl
NH 2
COOH
Cl
Cl
Cl
Cl
Cl
COOH
N
Figura 2.2. Estructura qumica de algunas auxinas

usadas en micropropagacin.
A: AIA; B: AIB; C: 2,4-D; D: ANA; E: APCF; F: 2,4,5-T;
G: Dicamba; H: Picloram. Ver Tabla 2.2.
miento y no hormonas, pues no son producidos por la planta.

La cantidad de auxinas usadas en los
medios nutritivos es baja, con concentraciones en el orden micromolar (M).
En cantidades mayores, producen efectos de herbicida y por lo mismo, son
txicas. Pueden ser disueltas en KOH o
NaOH 0,1 N y almacenadas en congelador como una solucin madre. Entre
las acciones fisiolgicas promovidas por
las auxinas en la micropropagacin estn: la induccin de callos, induccin
de races, establecimiento de suspensin
celular, metilacin de la citocina, formacin de frutos, etc. (Fernandez, 2000).
40
- Citoquininas.
Este grupo de hormonas (Figura 2.3) es
normalmente usado en el cultivo de tejidos para promover el desarrollo de yemas adventicias a partir de callos o
embriognesis somtica (Barrueto Cid et
al., 2004). Esto ha tenido un gran impacto, por ejemplo, en la industria de la
floricultura. Tambin se ha demostrado
su influencia en la tuberizacin de papas (Solanum tuberosum) in vitro
(Palmer y Smith, 1969).
Las citoquininas pueden ser encontradas
libres o formando parte de anticodn de
tRNAs, como en el caso del tRNA de la
NH 2
CH 2 - CH= C
CH 3
CH 2OH
NH
N
N
H
N
H
C
NHCH 2
N
CH 2
N
H
CH 2 - CH= C
NH
N
CH 3
CH 3
NH
N
F
CH
O
H
N
H
N
H
N
H
C N C N
N
S
Figura 2.3. Estructura qumica de algunas citoquininas.

A: Adenina; B: Zeatina; C: Kinetina; D: BAP; E: 2iP; F: TDZ. Ver Tabla 2.2.
serina (Hall, 1973). La biosntesis de las

citoquininas en plantas, Arabidopsis, es
preferentemente va ATP o ADP con
isopentenilpirofosfato ( 2-iPP) para dar
iPTP (isopenteniladenosina- 5-trifosfato
en el caso de ser usado ATP). En este
paso metablico participa la enzima
isopentenil transferasa (IPT) y es primordial para la sntesis de citoquininas. IPTP
es un producto clave en la biosntesis
de la zeatina: 6-(4-hidroxi-3-metil-trans2-butenilamino purina). A partir de IPTP
sta se origina, siendo la zeatina, una
de las citoquininas ms activas en el
cultivo de tejidos. En bacterias, su sntesis es a partir de AMP y no de ATP o
ADP como en Arabidopsis.
En general, los trabajos pioneros sobre

citoquininas fueron iniciados por Folke
Skoog en la Universidad de Wisconsin,
cuando trataba de encontrar algn compuesto que estimulara la proliferacin
celular en cultivos de tejidos in vitro
(Fosket, 1994).
La zeatina y 2iP [ (6 --dimetilaminopurina, conocida tambin por IPA (isopentenil adenina) ] , son dos citoquininas
naturales en oposicin a la Kinetina (6furfurilamino-purina) y BAP (6-bencilamino-purina), que son dos reguladores
del crecimiento. TDZ (N-fenil-N-1,2,3tidiazol-5-il urea) es una citoquinina sinttica del grupo de la urea, no prica,
teniendo un poderoso efecto citocinnico en muchas plantas cultivadas in vitro
(Murthy et al.,1998).
41
Las citoquininas tambin son usadas en

pequeas cantidades (M), son solubles
en HCl 0,1 N y mantenidas como solucin madre congeladas.
Las citoquininas, a pesar de ser un componente fundamental en los protocolos
de micropropagacin, pueden estimular
hiperhidricidad, fenmeno en el cual la
planta toma un aspecto vitrificado, por
tanto, sin valor comercial. La hiperhidricidad es un desorden fisiolgico de la
planta in vitro, caracterizado por hojas
rgidas y quebradizas, anormalidad estomtica y deficiente formacin de la cutcula. La vitrificacin puede tener otras
causas tambin, por ejemplo, exceso de
humedad relativa dentro del frasco, altos niveles de NH4 y citoquininas
(Daguin y Letouz, 1986; Leshem, et al.,
1988; ver captulo 4).
das del tejido y estrs. En este sentido,

se le ha descrito induciendo poblaciones de mRNAs de varios genes, entre
ellos, aquel que codifica para celulasas
(Tal e Imber, 1970). Vale la pena sealar
que etileno posee ya un rol asumido en
el proceso de defensa de las plantas, el
cual sera aportar en una respuesta defensiva de tipo sistmico.
Interesante es que el CO 2 puede anular
algunos de sus efectos, lo que preferentemente se observa en la inhibicin de
proceso de maduracin de frutos climatricos. Del mismo modo, la cicloheximida y la actinomicina D, pueden inhibir respuestas al etileno, sugiriendo la
mediacin de eventos relacionados con
la transcripcin y transduccin, respectivamente; debido a que estos compuestos actan a estos niveles de la sntesis
proteica (Leopold y Kriedemann, 1975).
- Etileno.
El etileno en su relacin con la planta,
fue conocido primero como un agente
qumico externo con poderosos efectos
fisiolgicos. Mucho ms tarde, se describi en efecto como una hormona vegetal propiamente tal, esto es, como un
principio activo producido por la planta (Johnston, 2000). Su sntesis est ligada a precursores como la metionina,
un aminocido que contiene un grupo
R apolar con S y CH 3 presentes.
Entre los efectos fisiolgicos de este gas
pueden citarse: ruptura de dormancia de
papas, induccin de maduracin de frutas e induccin de abscisin foliar. Paralelamente a esto, el etileno tiene un
efecto regulador sobre otras actividades
de la planta, como respuesta a las heri-
42
El efecto local o a distancia, tal vez no

est mediado por ningn tipo de intermediacin, por que como gas, se moviliza conforme a la ley de Fick, o sea, por
una gradiente de concentracin.
En el cultivo de tejidos, sus efectos son
contradictorios, pues existen casos donde participa promoviendo eventos, como
la embriognesis somtica y casos donde tiene un efecto inhibitorio, como en
la morfognesis (Hatanaka et al., 1995;
Kumar et al., 1998).
El explante tiene capacidad para producir esta olefina y por tanto, influir en su
concentracin dentro del frasco afectando favorablemente o no, la direccin de
un proceso morfognico. Una manera de
disminuir el efecto perjudicial del
etileno presente en el tejido, es a travs

del uso de AgNO 3 . Este es un inhibidor
c o m p e t i t i v o d e l a h o r m o n a ( B e y e r,
1976). Tambin se puede incluir el uso
de CoCl 2 y NiCl 2 , los cuales son inhibidores de su sntesis (Biddington, 1992).
En relacin a la naturaleza gaseosa del
etileno, es oportuno mencionar que adems en las plantas existe el xido ntrico (NO) (Wojtaszek, 2000), un gas que
se comporta como un potente modulador de numerosos procesos biolgicos.
Entre ellos: apoptosis, lignificacin de la
pared celular, defensa de la planta frente a patgenos, etc. (Beligni y Lamattina,
2001; Pedroso et al., 2000; Orozco-Crdenas y Ryan, 2002). Como modulador,
se ha descrito su accin en relacin con
la sntesis de guanosn-monofosfato cclico (cGMP), a partir de la enzima
guanilato ciclasa. El cGMP es considerado un segundo mensajero y por lo tanto, est comprometido en reacciones de
transduccin de seales al interior de la
clula. En este sentido, NO tambin est
ejecutando roles de transducin de seales a nivel de fitocromo, otra molcula de carcter regulatorio en las plantas.
En los animales, NO es sintetizado va
L-arginina por la enzima xido ntrico
sintasa (NOS). En plantas, hasta ahora
esta va no ha sido plenamente aceptada, entre otras razones, porque esta enzima no ha sido aislada. Como radical
libre, NO puede producir fragmentacin
del DNA e inactivacin de ciertas enzimas, por lo tanto, puede provocar la
muerte celular. Finalmente, se discute si
el NO esta metablicamente ligado al
etileno (Magalhes et al., 1999).
- Giberelinas.
La historia de la giberelinas (GA) est
ligada a los arrozales del Japn, en comienzos del siglo XX. En efecto, se observ que plantas contaminadas con el
hongo Gibberella fujikuroi, crecan ms
que sus congneres (Matsumoto, 2000).
Las innumerables giberelinas existentes
en las plantas, son diterpenoides con tres
anillos aromticos, cuya base estructural, en ltimo trmino, es el isopreno,
un compuesto de cinco carbonos. Las
plantas producen una enorme cantidad
de isoprenoides, entre ellos, las resinas
de los pinos y el ltex del caucho. Entre
los precursores de la biosnteis de las
giberelinas estn el cido mevalnico,
isopentenilpirofosfato, kaureno, en una
larga sequencia de pasos metablicos
hasta culminar en el citosol, con la formacin de este tipo de hormonas.
Entre los efectos fisiolgicos de las
giberelinas, puede citarse la elongacin
de: plantas enanas (maz, poroto), plantas en roseta (repollo), hipoctilo de lechuga y produccin de alfa amilasa en
semillas de gramneas. Resulta interesante el hecho que existan sustancias que
pueden anular estos efectos, porque pueden afectar a su biosntesis; entre ellas:
AMO 1618, CCC, Fosfon D, Ancymidol,
etc. (Wareing y Phillips, 1982).
Entre los sitios de sntesis, puede citarse
el meristema apical y radicular, no existiendo evidencias muy poderosas sobre
su polaridad en la translocacin, porque
ha sido detectado tanto en el floema
como en el xilema. En el cultivo de tejidos vegetales, no es frecuente su uso.
43
Sin embargo, existen registros de su utilizacin en la elongacin de brotes adventicios de callos. Adems, debe tenerse presente que las enrgicas condiciones de temperatura y presin del autoclave, degradan la molcula y su presencia en el medio de cultivo, pudiendo inhibir el enraizamiento de las plntulas.
- cido abscsico.
experimentales en este caso han mostrado que la falta de ABA provocara tal
fenmeno, debido a que, aplicaciones
exgenas con ABA restituyen la condicin hdrica normal (Tal y Imbert, 1970).
Por otro lado, trabajos ms recientes, indican que el NO y ms especficamente
el cGMP, seran intermediarios a travs
de los cuales el ABA ejercera su accin
(Steven et al., 2002).
El cido abscsico (ABA) es un compuesto hormonal que tiene ms accin

inhibitoria que estimuladora. Dependiendo de la posicin del grupo carboxilo, presenta dos formas isomricas
cis/trans (referido esto a la posicin de
los grupos sustituyentes en el doble enlace), pero, en funcin de una asimetra
del C 1, presenta tambin isomera . Sin
embargo, en la planta, la forma + y cis
son las ms abundantes. La oxidacin de
la xantofila, un carotenoide, constituye
una va de sntesis (Lemus, 2000), siendo en esta ruta, la 9cis-neoxantina un
intermediario importante capaz de originar a la xantoxina (C 15), el precursor
ms inmediato de la sntesis del ABA
(Walton y Li, 1995).
En cultivo de tejidos vegetales su uso es

muy restringido, pero hay referencias de
su utilizacin en la embriognesis somtica (Ammirato, 1983) y en la poliembriognesis (Cutler y Krochko, 1999), ya sea
para inhibir la germinacin de embriones mal conformados o como requerimiento del proceso de maduracin de los
mismos. Otros antecedentes dan cuenta
de que el ABA ha sido usado para almacenar embriones cigticos durante algn
tiempo bajo condiciones in vitro. Luego
de este perodo, al remover la hormona,
los embriones germinan aparentemente
en forma normal. Tal prctica tendra utilidad en la conservacin de germoplasma
de semillas recalcitrantes, como por
ejemplo en caf (Murthy et al., 1998).
El estrs hdrico en la planta estimula la

sntesis de ABA en la hojas, la que parte
en los cloroplastos (Orozco-Crdenas y
Ryan, 2002). Tambin, algunos plastidios
podran sintetizarlo (Cutler y Krochko,
1999). Desde el punto de vista fisiolgico, el ABA estimula el cierre de los
estomas, desempeando un papel fundamental en la economa hdrica de la
planta (Walton y Li, 1995). Algunos
mutantes carecen de la capacidad para
cerrar sus estomas, presentando un marchitamiento permanente. Las evidencias
- cido jasmnico.
44
El cido jasmnico (JA) y los jasmonatos

en general, se encuentra en forma natural en una serie de plantas desempeando un papel fundamental en el desarrollo de las mismas, especialmente en
cuanto a respuestas a estrs ambiental.
Respecto a su efecto sobre el desarrollo, JA y sus derivados pueden afectar la
maduracin de los frutos a travs de su
accin estimulante sobre la cido 1-aminociclopropano 1-carboxlico sintetasa
(ACC-sintasa) y la ACC-oxidasa, dos enzimas claves en la sntesis del etileno.

En relacin al estrs ambiental, pueden
activar el sistema de defensa de la planta, la ya mencionada proteccin sistmica frente a ataques de hongos o insectos, interaccin en la cual desempea un
papel importante la sistemina, polipptido hormonal que gatilla la sntesis de
JA. ste a su vez, activa la expresin de
ciertos genes, por ejemplo los relacionados con la inhibicin de proteinasas
(Creelman y Mullet, 1997). La ruta biosinttica del cido jasmnico comienza
con el cido linolnico (18:3), un componente de la membrana celular y la
accin de lipoxigenasas (LOX) (Pea Corts, 2000).
En cultivo de tejidos, su uso ha sido ms
bien discreto y se lo ha vinculado a la
produccin de microtubrculos in vitro
en especies tuberizantes (Pelacho y
Mingo-Castel, 1991), inhibidor del crecimiento de callos y de la germinacin
de semillas, cuando es aplicado exgenamente (Steven et al., 2002).
- Triacontanol.
Dentro del conjunto de hormonas y reguladores del crecimiento de plantas que
tradicionalmente han sido utilizados en
la micropropagacin, se suma ahora
tambin el Triacontanol, como promotor de induccin de yemas y enraizamiento (Reddy et al., 2002). Este compuesto es un alcohol primario de cadena larga [CH 3 (CH 2 ) 28 CH 2 OH], con peso
molecular de 438,8 g cuya biosntesis no
es bien conocida. Se encuentra presente en la composicin de la cutcula de
las hojas, mezclado con otros compo-
nentes de la matriz cuticular; entre ellos,

cidos grasos simples, hidroxilados o
esterificados y ceras. El compuesto es
soluble en cloroformo y puede ser
autoclavado (121C / 20 min). En Malus
domestica, ha sido utilizado en concentraciones que van entre 2 a 20 g/L. En
esta especie acta estimulando la
brotacin y el enraizamiento (Tantos et
al., 2001). Esto permite incrementar las
respuestas regenerativas especialmente
en plantas de carcter leoso ms recalcitrantes. Adems, es conveniente recalcar que su uso an no es generalizado.
d.- Agentes gelificantes
El agente gelificante es un carbohidrato
(hetero-polisacrido) cuya concentracin puede variar entre 50 a 90 %. Estos
agentes son necesarios para dar consistencia al medio nutritivo, de modo que
el explante quede en la superficie. En el
mercado se ofrece en diferentes marcas
(Sigma, Merck, nacionales) y precios. La
cantidad por litro puede variar desde 2
g/L en el caso de Gelrite hasta 6 a 8 gr
por litro, en el caso del agar puro y simple. El agente gelificante se disuelve en
el agua a 100 C y solidifica alrededor
de los 45 C. Este ltimo dato es importante, porque en el caso de que sustancias termolbiles deben adicionarse al
medio despus de autoclavado, esto
debe hacerse un poco antes de que la
temperatura del medio llegue a ese valor. Otras preocupaciones respecto a este
tipo de ingrediente es que puede ir
acompaado de sales, producir vitrificacin en las plantas obtenidas y dependiendo del pH, puede ser hidrolizado en su paso por el autoclave
(George, 1993b).
45
Dentro del amplio espectro de ingredientes del medio nutritivo, el precio del
agente gelificante es uno de los ms elevados (sobre US$ 100/Kg). Por eso, a veces, se utilizan alternativas ms baratas
como es el almidn de maz, maicena
(Barrueto Cid et al., 1994) o soportes de
papel de cromatografa (Pierik, 1987c).
Sin embargo, la posibilidad de usar estas
alternativas ms baratas depender de la
complejidad del experimento; por ejemplo, en el caso de la embriognesis
somtica de vides el agente gelificante de
los medios debe ser de mxima calidad.
e.- Otros.
Es oportuno sealar que los medios nutritivos pueden ser complementados con
una amplia gama de otras sustancias,
conforme su finalidad. Por ejemplo, en
el caso de seleccin para tolerancia a
estrs u obtencin de mutantes, pueden
contener variadas concentraciones de
NaCl; metales pesados (Cd, Al y otros);
anlogos de aminocidos (5-metiltriptofano, p-fuorofenilalanina); anlogos de
bases pricas o pirimdicas (bromodeoxiuridina:BUdR; 8-azaguanina, etc);
antibiticos (cefotaxima, puromicina,
kanamicina, etc.); toxinas de hongos,
etc. El estrs es considerado como sinnimo de cualquier causa ambiental capaz de desencadenar efectos hacia el
interior de la clula, estos cambios pueden ser elsticos (reversibles) o plsticos (permanentes). En este ltimo caso,
con la adquisicin o prdida de una caracterstica en particular.
Diversos trabajos en el rea, como obtencin de mutantes, exigen normalmente cultivos de clulas en medio lquido,
46
las cuales se someten por algn tiempo

a un tipo de mutgeno tal como etilmetano-sulfonato o radiacin gamma. Posteriormente, las clulas se transfieren a
un medio slido en presencia de un
agente de seleccin deseado, el cual,
puede ser un antibitico, herbicida,
NaCl, etc., en diferentes concentraciones. Las clulas que se multiplican bajo
condiciones de una concentracin alta
de cualquiera de estos agentes, estarn
presentando una resistencia a tal condicin y, por lo tanto, sugiriendo la presencia de un mutante. Posteriormente,
estas clulas son inducidas a multiplicarse para formar callos y a partir de
aqu, regenerar plantas. Finalmente, stas se sometern a las pruebas correspondientes para verificar si se ha generado realmente un mutante y, si su descendencia presenta o no, tal caracterstica. Este tipo de trabajos tiene bastante
impacto en el rea agrcola, especialmente en el rea fitopatolgica, donde
la bsqueda de materiales resistentes a
enfermedades es muy persistente
(Thakur et al., 2002).
Finalmente, habra que sealar que el
cultivo de tejidos de plantas no es una
ciencia, sino una tcnica, como cualquier otra. As, el cultivo de tejidos unido a otras tcnicas tales como: la inmunofluorescencia para el estudio de microtbulos, el anlisis citomtrico para
determinar cantidad de DNA en el ciclo
celular, la autorradiografa para rastrear
y localizar compuestos radioactivos por
los pasajes secretos de la clula y la
transformacin gentica para el mejoramiento de plantas, ha permitido grandes
avances en el estudio de la biologa de
plantas y en la comprensin del fen-
meno biolgico. De esta forma, el cultivo de tejidos de vegetales ocupa un lugar clave dentro de lo que se ha denominado la segunda revolucin verde,
refirindose a los grandes avances de la
biotecnologa, justamente, por todas
esas ventajas enumeradas al final del
captulo anterior.
les, hormonas, vitaminas, agar, antibiticos, etc. Por otro lado, no menos extensa es la lista de material de vidrio que
invariablemente incluye, matraces
Erlenmeyer, tubos de ensayo, vasos precipitados, placas Petri, etc., todos de
diferentes capacidad volumtrica y resistentes al autoclavado, de vidrio Pyrex
o polmeros plsticos.
ALGUNOS ASPECTOS PRCTICOS

SOBRE EL LABORATORIO DE
CULTIVO DE TEJIDOS
DE PLANTAS.
A estas listas deben agregarse todava los

equipos, tales como cmara de flujo laminar, pH-metros, balanzas, lupas, microscopios, micropipetas, refrigeradores,
congeladores, centrfuga y equipos especializados segn sea el caso, por
ejemplo agitadores, electroporador, ultracentrfugas, biorreactores, etc. Todo
eso sin contar con el personal tcnico y
de apoyo que debe gerenciar y ejecutar
las actividades corrientes de un laboratorio con estas caractersticas.
Como toda tcnica, el cultivo de tejidos

tiene necesidad de una infraestructura y
equipamientos bsicos para operar
(George, 1993a). En relacin a la infraestructura, son varios los espacios necesarios para desarrollar un trabajo adecuado. Si se excluye la produccin de
plntulas a gran escala y si consideramos
una unidad acadmica o de investigacin, la infraestructura bsica considera
cinco salas, incluyndose una dos
como fitotrones. Una sala de lavado y
secado del material de vidrio, una segunda de autoclavado, una tercera para preparacin de medios y balanzas, una cuarta de inoculacin y una quinta de mantencin y crecimiento, con fotoperodo
y temperatura controlada. Se estiman 15
m 2 aproximadamente por sala, alcanzndose 75 m 2 de superficie total.
Por consideraciones de costos, los laboratorios de cultivo de tejidos de plantas,

estn cada vez ms restringidos y es frecuente encontrarlos compartiendo dependencias con el rea de transformacin gentica, que tambin emplea la
misma infraestructura sealada.
Esta estructura slo podra sustentarse

con un proyecto de investigacin y/o
venta de algn tipo de servicio, como
por ejemplo, plntulas o plantines para
el rea agrcola, forestal u ornamental.
Con el propsito de disminuir costos de

mantencin, el cultivo de tejidos de plantas ha desarrollado nuevas estrategias o
soluciones innovativas, como es el caso
de los biorreactores. Estos sistemas de
propagacin de plantas en medios lquidos de cultivo, pueden disminuir costos
de mantencin de una produccin de
plntulas a gran escala (Barrueto Cid et
al., 2002; Teixeira, 2002).
En el tem sustancias qumicas, se incluye una extensa lista que considera; sa-
Considerando que la asepsia del ambiente y del material de trabajo es primordial,
47
el orden en el laboratorio y un equipo

como el autoclave, a pesar del costo de
adquisicin, son elementos bsicos. Adems, es oportuno llamar la atencin que
no todos los componentes de un medio
nutritivo se pueden autoclavar, como por
ejemplo, antibiticos, L-glutamina, GA 3,
pantotenato de calcio, colchicina, extractos de plantas, etc. (Pierik, 1987b). Para
el uso de estos componentes, es necesario disponer tambin de un sistema de
filtracin adicional.
En el momento de abrir un frasco de cultivo para inocular un explante, el aire
circulante debe estar libre de microorganismos. Eso slo es posible en presencia de una cmara de flujo laminar, cuyo
aire circulante es siempre renovado y libre de micropartculas. Por otro lado, el
mencionado frasco conteniendo el medio nutritivo en su interior, ya debera
haber sido previamente esterilizado
(120C, 1 atmsfera por 20 minutos) para
anular el crecimiento de cualquier patgeno en su interior, pues el ambiente
interno es un ambiente propicio para el
desarrollo de esporas de bacterias y hongos. En la Tabla 2.3, se muestra algunos
de los desinfectantes ms usados en un
laboratorio de cultivo de tejidos (Barrueto Cid, 2001).
La concentracin y los tiempos de exposicin dependen del tipo de explante.

Es as como, las semillas requieren de
perodos ms prolongados y concentraciones ms altas que un explante foliar.
Las pinzas y bistur, que es el material
que se pone en contacto con el explante,
puede ser esterilizado a travs de flameo
en el momento de la inoculacin. Por
lo tanto, es suficiente introducir el material en el recipiente (generalmente un
tubo de ensayo con alcohol 95 %) y
retirarlo, luego exponerlo una sola vez
a la llama del mechero y despus apoyarlo en una placa Petri. Si la lmina de
alcohol cubri toda la superficie til de
la pinza o bistur, la llama generada ser
suficiente para lograr la desinfeccin, no
siendo necesario repetir la operacin.
El uso de luz UV ha disminuido como
agente de esterilizacin a partir de la aparicin de las cmaras de flujo laminar, en
el laboratorio de cultivo de tejidos.
Los frascos usados para el trabajo de cultivo de tejidos presentan una gran variabilidad de formas y capacidad volumtrica. El volumen de medio requerido comnmente puede variar de 30 a 15
mL dependiendo si es placa de Petri o
Tabla 2.3. Agentes desinfectantes empleados en la

asepsia de explantes.
Agente desinfectante
Concentracin
(%)
Tiempo
(minutos)
Alcohol etlico
Cloruro de mercurio
75-95
0,1-1,0
0,5 -1
1-5
Hipoclorito de calcio
Hipoclorito de sodio
7-10
2,5 9
5-20
5-20
2-10
5-12
Perxido de hidrgeno
48
tubo de ensayo. Lo importante es que

ste deje un espacio interior libre de 7080% del volumen total del frasco. Esto
no es slo vlido para medios slidos,
sino que tambin para medios lquidos,
como es el caso de clulas en suspensin, las cuales requieren de buenos y
poderosos agitadores para mantener las
clulas en constante movimiento por
perodos prolongados.
El medio nutritivo, representa una diversidad enorme de sustancias (consultar
Tabla 2.1) para las necesidades nutricionales del explante o de las plantas en el
interior de los frascos de cultivo. Esto determina que el pH del medio normalmente quede en un rango muy cido 3,5
4,0 cuando ste termina de prepararse. Este pH es poco adecuado fisiolgicamente para la mantencin y crecimiento del material micropropagado.
Por eso, la necesidad de contar con un
pH-metro para elevar el pH del medio
nutritivo antes de adicionar el agar y proceder a autoclavar, a niveles ms com-
patibles con la absorcin de los iones,

evitando de este modo provocar deficiencias o toxicidad por exceso de absorcin. El valor de pH establecido en
cultivo de tejidos de planta ha sido empricamente fijado en 5,8. Este valor puede ajustarse con K OH o Na OH 0,1-1,0
N (Torres, 1989), sin haberse observado
efectos adversos o txicos sobre la clula. Como la escala del pH es exponencial, la diferencia entre 4 y 5, por
ejemplo, no es de una unidad sino de
10, por eso la preocupacin con este
factor. El uso del pH-metro requiere ciertos cuidados, como por ejemplo, no descuidar la calibracin peridica ni dejar
secar el electrodo. En la eventualidad de
que el medio posea carbn activado, la
medicin del pH tambin debe ser realizada antes de adicionar el carbn activado. Despus de autoclavado el medio
y en la cmara de flujo laminar, es recomendable agitarlo para que tanto el agar
como el carbn queden bien distribuidos en los frascos o tubos de ensayos.
49
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53
54
ESTADIOS DEL CULTIVO DE TEJIDOS
CAPTULO 3
ESTADIOS DEL CULTIVO

DE TEJIDOS
ESTABLECIMIENTO
DEL EXPLANTE
ara el establecimiento del explante,

la asepsia es una condicin relevante y del todo imprescindible para el xito e induccin morfognica del material
bajo condiciones in vitro. Una premisa
es que cualquier tipo de explante utilizado debe estar adems libre de patgenos endgenos, normalmente presentes
en la planta madre. Dado que se utilizan fragmentos de rganos o parte de
tejidos, stos deben ser extrados del tejido madre. En muchos casos existen
patgenos externos y el hecho de manipulacin crea nuevos focos potenciales
de contaminacin. Se han descrito varios protocolos vinculados con la preesterilizacin, esterilizacin y post-esterilizacin de diferentes rganos vegetales que son universalmente utilizados en
diferentes laboratorios (Yeoman, 1973;
Bonga, 1982a). El lavado de los explantes con productos desinfectantes bajo
condiciones aspticas, elimina patgenos superficiales, pero puede ocasionar
daos en las clulas, produciendo
pardeamiento o necrosis y afectando
eventualmente a las respuestas morfognicas. En general, de acuerdo a la superficie de contacto y naturaleza del explante, existen tratamientos que vinculan concentraciones ptimas de usar para cada desinfectante versus tiempo de
exposicin. Concentraciones muy bajas
Miguel Jordan Z.
y tiempos de exposicin cortos, producen desinfeccin incompleta del material y posible contaminacin durante el
cultivo. Tiempos largos y concentraciones mayores, impiden el desarrollo de
patgenos, pero pueden afectar la viabilidad y/o respuestas morfognicas
inducibles en las clulas del explante.
Algunos protocolos de desinfeccin se
indican en el Captulo 2. Otros compuestos que apoyan tratamientos para
eliminacin de patgenos son diversos
antibiticos, los cuales deben ser manipulados cuidadosamente por su toxicidad y/o especificidad. Entre ellos se puede citar para contaminacin bacteriana:
Carbenicilina, Cefotaxima, Geneticina,
Kanamicina, Higromicina y Rifampicina
y sus mezclas (soluciones de Guillard y
Provasoli). Los niveles de concentracin
empleados son del orden de 5-100 g/
mL. Una especial precaucin debe ser
tomada al usar Kanamicina, pues inhibe
la morfognesis en algunas especies
(Mihaljevic et al., 2001; Obando y
Jordan, 2001). Entre los antimicticos,
Amfotericina B, Captafol, Carbendazima, Fenbendazole, Imazalil y Nistatina,
son los ms frecuentemente usados. En
la prctica, tratndose de rganos de
mayor volumen obtenidos en terreno y
de los cuales se va a aislar un explante,
desinfecciones previas con Captan y
Benomyl durante algunas horas, y el uso
posterior de algunos de los antimicticos
55
indicados ms arriba, son eficientes en

la remocin de patgenos.
Frente a infecciones virales, es slo posible el tratamiento en conjuntos de clulas o tejidos especficos. Por ejemplo,
en meristemas caulinares y no en el resto de la planta. Existen productos que
han probado tener accin viricida, el
ms conocido es Virazole (Ribavirina)
[1-B-D-ribofuranosil 1,2,4-triazol-3carboxamida), un nuclesido anlogo,
con el cual fue posible eliminar in vitro
e in vivo el virus PVX en papa (Jordan et
al., 1983), como en otras especies que
comnmente se reproducen por va
vegetativa. Aunque el crecimiento de los
explantes y sus respuestas morfognicas
pueden verse afectadas parcialmente en
esta especie, concentraciones del orden
de 50 mg/L permitieron erradicar totalmente PVX en cuatro clones de papa ensayados al cabo de 90 das de cultivo
(Jordan et al., 1983). En papa, comnmente se presenta tambin un viroide
(PSTV); el cual puede ser erradicado mediante la termoterapia; es decir, mantencin del tejido madre a altas temperaturas en condiciones de humedad (3035C o ms por uno o varios das).
En general, durante la termoterapia, se
induce una intensa divisin y elongacin
celular en las regiones meristemticas;
ello permite tener una porcin de tejidos libres de patgenos en aquellos conjuntos celulares ubicados en la porcin
ms distal del meristema. La eliminacin
de patgenos se debe tambin a que en
dichas regiones existen ms comunicaciones celulares de tipo simplstico lo
cual reduce la velocidad de contaminacin de clulas infectadas a aquellas
56
nuevas en activo crecimiento, provocndose una dilucin gradual con erradicacin total dependiendo del tratamiento.
OXIDACIN FENLICA
Los explantes de diferente origen, aunque predominantemente de material leoso o especies particulares y, segn
condiciones de cultivo, no prosperan
muchas veces a causa de un pardeamiento (browning) de sus tejidos, el
cual se manifiesta superficial o internamente comprometiendo varios estratos
de clulas, superficiales y/o ms profundas. Los explantes de especies que muestran pardeamiento a causa de un metabolismo fenlico oxidativo, generalmente no prosperan. El pardeamiento implica la muerte celular y se debe, por lo
general, a la oxidacin conjunta de diversos productos fenlicos presentes en
la clula por accin de polifenoloxidasas, de efecto poco especfico (Jordan y
Feucht, 1977; George, 1993). El efecto
puede ocurrir en compuestos fenlicos
de diversa complejidad, entre ellos;
fenoles simples, cidos fenilcarbnicos,
fenilpropanos y derivados de flavonas.
El proceso se origina durante la excisin
del explante o con el proceso de desinfeccin. Dado que enzimas y substrato
se encuentran en compartimentos celulares distintos (en general fenoles en la
vacuola y tonoplasto, polifenoloxidasa
en el citoplasma); no existe reaccin en
condiciones in situ. Sin embargo, durante la extraccin o desinfeccin del explante, donde ocurre muerte celular en
las zonas expuestas, dicha oxidacin es
causal del pardeamiento celular. El dao
puede ser incrementado dependiendo de
la estabilidad y metabolismo de estratos

celulares ms internos, pudiendo comprometer totalmente el explante.
La oxidacin qumica resulta de la generacin de quinonas en el anillo aromtico, condicin que es altamente txica por su poder xido-reductor (George,
1993). Dado que las polifenoloxidasas
son poco especficas, las reacciones
afectan a varios compuestos fenlicos
diferentes qumicamente. Debido a que
las plantas leosas sintetizan grandes
cantidades de lignina y sobre la base de
que los precursores de lignina son compuestos fenlicos (cidos ferlico, sinapnico, y p-coumrico), la produccin
de pardeamiento es ms comn en material leoso. Por otro lado, los niveles
endgenos de fenoles determinan la
condicin fisiolgica del explante. Es
sabido que muchos fenoles actan en
forma inhibitoria frenando las respuestas de crecimiento, efecto que se visualiza principalmente en invierno. La dormancia de muchos rboles est definida
por altos niveles endgenos de fenoles;
entre ellos el mismo cido p-coumrico.
En invierno (poca en que se produce
receso vegetativo), existe un mayor contenido de fenoles en los tejidos y se produce normalmente una menor respuesta morfognica ante niveles apropiados
de reguladores promotores incorporados
al medio de cultivo.
Por el hecho que la condicin de la planta madre afecta significativamente la respuesta del explante, una prctica comn
para obviar o reducir el problema de
pardeamiento es el uso de material ju-
venil. El material juvenil expresa igualmente un potencial morfognico mayor

que explantes de origen adulto. Existen
caractersticas genticas fijadas y que se
expresan diferencialmente entre ambos
tipos de explantes de una u otra condicin y que adems son heredables al
proceder a la propagacin vegetativa
(Bonga, 1982b). En muchos casos, y en
aquellas especies que sintetizan
antocianinas en sus explantes juveniles,
dichos pigmentos no afectan normalmente una posterior morfognesis. Por
el contrario, explantes que expresan un
metabolismo oxidativo, no desarrollan
estos pigmentos al desdoblarse sus precursores con anterioridad. Es importante considerar que no es en s limitante
el nivel o contenido endgeno de compuestos fenlicos, sino su metabolismo
bajo condiciones in vitro. En general, las
especies que muestran un metabolismo
oxidativo ms activo, con pardeamiento
de explantes, son aquellos que o bien
presentan niveles altos de fenoles al comienzo del cultivo, o que incrementan
dicho nivel durante el transcurso del cultivo, afectando el proceso morfognico.
En algunos casos, cuando se trata especficamente de la sntesis del grupo de
antocianinas, la morfognesis no se ve
afectada (Jordan y Feucht, 1977). En estos explantes la sntesis de fenoles ha
llegado a uno de los destinos finales sin
ocurrir oxidacin fenlica de compuestos intermedios (Tabla 3.1). Las antocianinas son frecuentemente observables en
material juvenil el cual es considerado
de particular carcter morfognico, comparado con el material adulto (Bonga,
1982b).
57
Tabla 3.1. Niveles de fenoles totales y respuestas morfognicas en hojas y anteras

de algunas especies frutales antes y despus de 40 das de cultivo in vitro.
Espcies
Fenoles
Antes del
cultivo
Carica pubescens
Carica x pentagona
0,18
1,28
()
Cyphomandra betacea
0,16
Fenoles
Posterior al
cultivo
Resultados
0.02
0.59
()
()
0,05
()
()
0,17
()
0,38
()
Hojas y nuevos brotes verdes
0,93
()
Hoja y tallo de color marrn
()
()
Hojas y callos amarillos.

Hojas caf y nuevos brotes
verdes, morfognesis.
Hojas caf y nuevos brotes
verdes, morfognesis.
Hojas y nuevos brotes verdes
Pouteria lucuma
2,0
Solanum muricatum
0,21
Annona cherimola
0,1
Prunus avium
0,54
()
0,22
()
Anteras y callo color marrn
Prunus x Pandora
0,36
()
1,24
()
Anteras y callos rojizos

(antocianinas), andrognicos,
sin pardeamiento
()
()
Absorbancia a 730 nm con el reactivo de Folin-Ciocalteau/100 mg de tejido fresco.

M fenoles/100 mg de tejido fresco.
()
% Fenoles en el peso fresco.
()
USO DE ANTIOXIDANTES
En algunas especies el efecto de pardeamiento puede ser reducido lavando con
agua corriente esterilizada la zona de
corte o escisin del explante por tiempos diversos (2-4 horas), antes de proceder al cultivo. Con ello, los compuestos fenlicos presentes en las clulas daadas son retirados. Si es posible, conviene realizar este proceso con una menor tensin de O 2 , pues este gas eleva
el potencial redox, haciendo la oxidacin de fenoles ms rpida (George,
1993). En la prctica, se usan los antioxidantes (o reductores), los cuales pueden
aplicarse durante las fases de desinfeccin o incorporarlas a los medios de cultivo (Bonga, 1982a). Dichos productos
son de naturaleza diferente y actan
58
igualmente en varios procesos qumicos,

ya sea impidiendo la formacin de quinonas o retirando compuestos inhibitorios del medio por propiedades fsicas
de adsorcin/absorcin, como tambin
evitando la oxidacin de fenoles en el
medio. Dentro de los productos ms comnmente usados se tiene: PVP o polivinilpirrolidona, de diferentes pesos moleculares; entre ellos PVP-360 o PVP6755; cistena; glutation; DIECA (Dietilditiocarbamato de sodio); c. aminooxiactico; mezclas de c. ascrbico
con c. ctrico, (durante la desinfeccin
o en el cultivo); -mercaptoetanol; tiourea y carbn activado. Este ltimo, junto a PVP, parece adsorber varios compuestos fenlicos que producen tejidos
heridos en el medio, conjuntamente con
productos de carcter txico derivados
de la transformacin de azcares (sacarosa) por autoclavado (hidroximetilfurfural). Los otros antioxidantes actan en
forma reductora, impidiendo, ya sea la
generacin de quinonas o de perxido
de hidrgeno, o bien manteniendo los
grupos tioles en forma reducida, activando en este caso la sntesis de protenas
(George, 1993). Lo anterior implica que,
indirectamente, tambin varios compuestos de accin antioxidante pueden
promover crecimiento u organognesis
en algunas especies (glutation, c.
ascrbico, tiourea), como tambin activar el crecimiento en condiciones de
receso (tiourea). Directamente, algunos
fenoles se comportan in vitro como factores promotores, ya sea del crecimiento, induccin de nuevos brotes y como
enraizantes (Lane, 1990), asumindose
una accin protectora de la degradacin
del cido indolactico (AIA) endgeno
o actuando como compuestos sinrgicos
al AIA. Entre estos compuestos se encuentran el floroglucinol, el glicsido
floridzina, el catecol, resorcinol, c.
clorognico, c. cafeico y varios flavonoides. El primero, parece necesario de
incluir en medios para crecer algunas
especies frutales del gnero Prunus; el
segundo, por otro lado, estimula la rizognesis (Jordan, no publicado).
Existen otros productos que han sido
usados con xito aunque no representan en s condicin de antioxidantes.
Estos han demostrado buena eficiencia
en algunas especies de carcter muy oxidativo y difciles de cultivar, como por
ejemplo Annona cherimola, en la cual
el uso de sorbitol e hidrolizado de casena cida ms PVP, favorece la induccin
de brotes de novo (Jordan et al., 1991;
1993). El efecto puede ser igualmente fa-
vorecido al usar un menor contenido de

sacarosa o reemplazando parcial o totalmente la sacarosa por sorbitol (Jordan,
1975). En algunos casos, la condicin de
los gelificantes igualmente tiene efectos
sobre el pardeamiento. Muchas veces la
marca del agar produce una respuesta
diferencial; en otros casos, el uso de Gelrite, agarosa o el reemplazo general de
geles por papel Whatman N1 (en medio lquido), puede evitar o contrarrestar parcialmente el pardeamiento. Para
el caso de algunos cultivos leosos, la
eleccin del agar es determinante (Pierik
et al., 1997). El nivel de algunos microelementos en la solucin debe ser igualmente ajustado segn el tipo de explante
y especie; por ejemplo, la concentracin
final del in Cu en la solucin, al conformar parte del grupo prosttico de las
polifenoloxidasas, puede favorecer la
oxidacin. Al respecto se ha informado
tambin que agentes quelantes adicionados al medio, entre ellos EDTA o
EDDHA, inhiben parcialmente el
pardeamiento de algunas especies; ello
por la capacidad de fijar igualmente el
ion Cu o Fe en solucin, formando
quelatos.
La calidad de la luz es especialmente
importante en el control del pardeamiento. Por un lado, la prctica recomienda evitar la luz y dejar los cultivos
dos a tres das en oscuridad antes de
exponerlos a la radiacin. Por otra parte, es importante considerar que el fitocromo en presencia de luz roja (660 nm)
activa a la enzima fenilalanina-amonioliasa, que convierte el aminocido fenilalanina al primer compuesto fenlico,
el cido trans-cinmico. Desencadena
as, la biosntesis posterior con incremento de otros fenoles de la cadena;
59
entre ellos, por ejemplo, el cido p-coumrico con varios efectos de carcter
inhibitorio (Mohr, 1976). Slo, o como
componente precursor de la lignina, el
cido p-coumrico presenta un rol de
defensa qumica contra el ataque de insectos y animales fitfagos, en alelopata, como factor de competencia espacial de las plantas, en forma intra e interespecfica y fisiolgicamente en la funcin de inhibicin de la germinacin en
algunas especies.
MULTIPLICACIN DE PLANTAS
(MORFOGNESIS, ORGANOGNESIS,
EMBRIOGNESIS)
La generacin de nuevas formas y estructuras, como ser rganos o embriones originados de algunos tipos de explantes
donde no los haba, se denomina morfognesis o ms especficamente, organognesis o embriognesis, siendo todas de
carcter adventicio. Para poder generar
una morfognesis, los diferentes tipos de
explantes (clulas, tejidos y rganos cultivados in vitro), deben poseer la informacin y las condiciones endgenas y
del medio, conducentes a expresar las
diferentes respuestas morfognicas, posibles. stas son organognesis caulinar
(brotes de novo), organognesis radicular o rizognesis (races) y embriognesis
(formacin de embriones).
La respuesta posible a inducir est determinada, por el potencial de totipotencia celular; o capacidad inherente
de cualquier clula vegetal viable, de
recapitular toda la informacin existente en el genoma y de expresar sta a travs de la diferenciacin y desarrollo, ha-
60
cia la formacin de plantas completas

de igual caracterstica gentica. En este
proceso se debe definir la condicin celular o de rgano y el origen del material, de carcter juvenil y/o adulto. Es
bien sabido que explantes de carcter
adulto poseen bajo o nulo potencial
morfognico in vivo o in vitro, versus
material de condicin juvenil, de manera que ste debe ser preferido. El Material juvenil, ms morfognico o embriognico, evidencia un grado de metilacin menor del DNA como tambin una
mayor proporcin de conjugados de
poliaminas libres que material adulto,
pudiendo causar efectos sobre la activacin/desactivacin de genes (Fraga et
al., 2002; Joyce y Cassells, 2002; Santos y Fevereiro, 2002). La primera respuesta inductora de cualquier explante,
consiste en la desdiferenciacin de una
clula diferenciada. En todas las plantas conformantes del Reino Vegetal existe solamente un nmero reducido de clulas, cada una con una diferente caracterstica de diferenciacin segn la funcin a desarrollar, todas derivadas de
una clula embrionaria conformante de
la cigota. En todos los vegetales del planeta, toda la anatoma y arquitectura
posible a generar se basa en el ordenamiento de este reducido nmero de clulas estables o permanentes, entre algunas de ellas: clula meristemtica,
parenquimtica (varios tipos), fibra
esclerenquimtica / colnquima, trquea
/ traqueida, tubo criboso; clula de guarda y clula epidrmica. Dichas clulas
conforman a su vez tejidos especializados. La desdiferenciacin consiste en el
potencial de cualquiera de stas de volver a su condicin de origen de tipo
meristemtico. Las nicas clulas no
totipotentes y que tampoco pueden cambiar su patrn de expresin, son las que
carecen de ncleo, como las traqueidas,
las trqueas del floema o los tubos
cribosos correspondientes al floema.
Durante la diferenciacin se pueden reconocer cuatro eventos fundamentales:
a) seal inductiva y de percepcin donde se le atribuye un especial rol a la
auxina (AIA); b) expresin de genes que
especifican la identidad celular; c) expresin de genes para conformar las estructuras especificas y actividades de la
clula diferenciada y d) actividad de productos gnicos y sus cambios en la estructura celular para hacer efectiva la
funcin de la clula diferenciada. La resultante de un conjunto de clulas con
actividad meristemtica bajo condiciones in vitro es, inicialmente, la formacin de nuevas clulas del tipo parenquimtico que conforman un agregado
celular. De acuerdo a ciertas condiciones inductivas, dadas por niveles endgenos/exgenos de auxina versus citoquininas y en algunos casos de sacarosa, algunas de estas clulas se diferencian en elementos floemticos como
tambin del tipo trqueas, crendose
una cierta polaridad en el sistema. En
otros, casos clulas desdiferenciadas se
diferencian nuevamente para formar un
primordio; de all derivan nuevos brotes o nuevas races. El arreglo longitudinal de estas clulas constituye posteriormente la raz funcional.
Cabe indicar que la mxima expresin
de totipotencia se puede citar en dos
ejemplos: 1) protoplastos, que corresponden a clulas aisladas carentes de
pared celular. En este caso, estos pue-
den, junto con recapitular a plantas, generar y resintetizar su pared celular, provistos los elementos en el medio de cultivo (por ejemplo diversas pentosas) y 2)
microsporas (polen); cuyo programa ontognico, determinado y establecido filognicamente, consistente en la formacin de gametos, puede ser alterado y
transformado en otro programa embriognico (nunca realizado antes, ni establecido por filogenia), conducente a la
generacin de plantas; en este caso, de
nuevas plantas haploides. De ac puede establecerse el hecho de que el total
de la informacin conducente a la regeneracin de plantas (totipotencia), an
se mantena presente en el genoma de
esta clula. La morfognesis finalmente
puede ocurrir de dos maneras diferentes:
a) a partir de clulas diferenciadas sin la
proliferacin de tejido indiferenciado o
b) a partir de clulas no especializadas,
no organizadas y desdiferenciadas de callo o suspensiones celulares.
ORGANOGNESIS CAULINAR
Y RADICULAR
La induccin de brotes o de races puede ser derivada de acuerdo a los niveles
hormonales presentes en un explante. Si
se considera un explante in vitro con
adicin de hormonas del tipo auxina
(AIA y anlogos sintticos) y citoquinina
(varias formas), ambas en concentraciones relativamente altas, las clulas
desdiferenciadas generarn simplemente tejido parenquimtico con algunos
elementos de vasos presentes. Si las mismas hormonas se encuentran en proporciones diferentes; un bajo nivel relativo
de la citoquinina, sin alterar la auxina,
61
el conjunto tisular ser menor, pero generar exclusivamente races. Si en cambio se incrementa el nivel de la citoquinina, reduciendo el de auxina, se generarn exclusivamente brotes (Skoog y Miller, 1957). Este patrn de respuesta, que
se hall antes de los aos 60 especficamente para tabaco, se ha generalizado en
el tiempo para un gran nmero de especies de carcter herbceo y leoso.
de ser superado mediante el sorbitol

(Jordan, 1975). En presencia de sorbitol
(aunque no ante sacarosa), bajo iguales
niveles hormonales, se facilita la induccin brotes en Annona cherimola (Jordan
et al., 1991). Finalmente, manitol promueve la regeneracin de brotes en hojas en menta (Mentha x piperita y M.
spicata).
Los azcares, en cuanto a su tipo y concentracin, tambin influyen en las respuestas morfognicas. Normalmente, se
indica una asociacin de sacarosa a la
formacin de xilema, vinculado a procesos de diferenciacin muy tempranos
de la nueva raz. La sacarosa es el azcar ms comnmente usado en trabajos
in vitro, aunque tambin han sido usados otros azcares en menor frecuencia.
La glucosa y la fructosa son menos comunes, posiblemente por representar a
azcares reductores (se asume que por
este motivo son tambin muy escasos en
la composicin de la savia de las plantas con apenas el 1% o menos con respecto al contenido de sacarosa). Sin embargo, para el cultivo de la confera Sequoia sp., la fructosa aparece como el
azcar ms adecuado, como asimismo
las pectinas y el almidn (Koblitz, 1972).
En el caso de la zanahoria, despus de
la sacarosa, la glucosa y la maltosa tambin sirven en forma satisfactoria
(Koblitz, 1972); la maltosa promueve
tambin el contenido de clorofila apoyando los fenmenos vinculados con la
org a n o g n e s i s e n b a b a c o ( C a r i c a x
pentagona) (Jordan y Piwanski, 1997).
Mientras la glucosa produce en general
bajas respuestas o gran pardeamiento en
tejidos de Prunus avium, este efecto pue-
EMBRIOGNESIS SOMTICA
62
La embriognesis es consistente en la generacin de un embrin somtico y posteriormente de plntulas, a partir de una

clula somtica (o en algunos casos gamtica). Este proceso, bajo condiciones
in vitro, reviste las mismas etapas de desarrollo que ocurren in vivo. Pueden formarse embriones somticos en forma
directa o indirecta; la primera es a partir de una sola clula aislada flotando
en un medio de cultivo o fijada a un
substrato, generalmente derivada de una
suspensin celular (Litz y Gray, 1992).
La segunda forma de generacin indirecta, ocurre igualmente a partir de una sola
clula que forma parte de un tejido no
organizado (callo) o de un rgano (por
ejemplo cotiledones, hoja, hipoctilo)
que se cultiva in vitro.
La iniciacin del proceso de embriognesis se caracteriza por presentar, inicialmente, divisiones celulares desiguales, conformantes de una clula apical
y otra basal; siendo la primera constituyente del embrin. Ello determina la generacin de un patrn de eje apicalbasal, determinado por una expresin
gnica especfica durante la primera divisin celular, de carcter asimtrica.
Durante la ontogenia del embrin, se expresan genes especficos que controlan

ya sea la formacin del futuro meristema
apical, de la raz primaria, as como genes encargados de la mantencin de la
polaridad apical-basal (Taiz y Zeiger,
2002). Segn el estado de desarrollo y tamao, se distinguen tres estadios embriognicos: el globular, estado de corazn y
de torpedo.
Embriognesis directa (ED)

Es la formacin directa de embriones sobre los tejidos correspondientes al explante, sin mediar mayormente proliferacin celular intermedia. Ello ocurre
tambin naturalmente in vivo o in vitro,
como es el caso de ctricos, caf y otros
cultivos. En general, a partir de vulos y
de sus integumentos, de embriones nucelares, o tejidos nucelares, pueden originarse embriones somticos directamente como tambin en clulas epidrmicas, pecolos y an de protoplastos
derivados de lmina de hojas.
Embriognesis indirecta
(o adventicia) (EI)
Se induce a partir de un callo o agregado celular no organizado o de suspensiones celulares. Este tipo de proceso inductivo es ms frecuente que la ED. Por
lo general, existen varios tipos de requerimientos: a) el genotipo particular debe
ser capaz de poder llevar a cabo la morfognesis con el apoyo de un medio de
cultivo y de reguladores de crecimiento, b) el explante debe ser cultivado en
presencia de auxina para su iniciacin,
siendo el tiempo de permanencia un factor crtico, c) el nivel de sacarosa en los
medios de cultivo es crtico (sobre cier-
tos niveles no se produce induccin), d)

despus del cultivo en presencia de auxina, por lo general procede un subcultivo con niveles menores o en ausencia
de ella, e) existe requerimiento de un nivel adecuado de N, el cual puede ser
suplementado por el in NH 4 + o un aminocido, como es el caso de glutamina
o alanina. Otra forma comn de produccin de embriones somticos consiste en
la embriognesis secundaria, la cual
ocurre sobre otro embrin en desarrollo. Se considera este proceso como una
anomala, pero en algunos casos el fenmeno puede servir en una mayor eficiencia en la generacin de material de
una especie.
Poliembriognesis
(o poliembriognesis somtica)
En el caso particular de muchas conferas, se ha descubierto que embriones
cigticos maduros o inmaduros, son capaces de iniciar un proceso de embriognesis mltiple, conducente a la generacin de embriones de igual condicin
gentica en forma simultnea (Gupta y
Durzan, 1986; Fowke y Attre, 1996). El
proceso tiene diferentes fases de cultivo,
el cual procede en oscuridad. La fase de
induccin y/o maduracin sincrnica de
embriones es crtica y requiere de reguladores de crecimiento de carcter inhibitorio (como es el ci d o abscsico
(ABA)). Tambin de potenciales hdricos
bastante negativos en el medio, generados por incremento de azcares u otros
osmticos, (especialmente polietilenglicol (PEG), como tambin manitol o
sorbitol) (Attre et al., 1995). Determinante
en algunas especies es la presencia de altos niveles de uno o ms aminocidos
particulares.
63
Andrognesis
Este tipo de embriognesis es uno de los
ejemplos que mejor representa la totipotencialidad celular. Consiste en que un
grano de polen, en una fase temprana
de su ontogenia (microspora unicelular
o uninuclear, cuya funcin es fecundar
a la megaspora), cambia de funcin y
constituye un embrin de origen gamtico, con la reduccin de su porcin cromosomal (n). Dado que el proceso se
realiza por cultivo de anteras, los embriones gamticos se forman directamente dentro de las tecas, proceso que
puede acontecer al finalizar un mes. Los
primeros antecedentes datan del ao
1964, en que a travs del estudio de la
morfognesis de anteras bajo condiciones in vitro, se evidenci la totipotencia
del polen en su capacidad de cambiar
su programa fijado filognicamente a la
fecundacin a la generacin directa de
plantas (Guha y Maheshwari, 1964;
1966; 1967). Para la dcada de los aos
90, una gran cantidad de reportes informaron sobre la posibilidad de obtener
plantas haploides en cereales y especies
leosas y sobre sus aplicaciones en
biotecnologa y mejoramiento gentico
(Bajaj, 1990).
El proceso tiene gran importancia en el
mejoramiento gentico de plantas dado
que: a) es posible en la prctica usar directamente la planta de caractersticas
haploides a travs de la variacin gametoclonal (ejemplo la generacin de
material de caractersticas enanas o
enanizante para uso como patrones de
injerto; generacin de mutantes waxy
con mayor contenido en cera y, por tanto, mayor resistencia a patgenos, cambios en el perodo de floracin, cambio
64
en el contenido de metabolitos secundarios, cambios en morfologa, etc.); b)

es posible hallar caracteres genticos
que pueden estar enmascarados en cruzamientos normales, dada la incompatibilidad que se presenta en algunas especies; c) es posible diploidizar tejidos o
partes de la planta, obteniendo plantas
doble haploides (homocigotos diploides), con lo cual se pueden seleccionar
directamente pares de genes dominantes o recesivos en una sola generacin y
haciendo posible emplear este material
en cruzamientos posteriores; y d) proceder a realizar mutaciones en clulas haploides, con lo cual se puede generar
material diverso con propiedades genticas de importancia (Bajaj, 1990). Dada
la mutacin frente a agentes qumicos
(por ejemplo toxinas, pesticidas/herbicidas, metales pesados, etc.), las clulas
sobrevivientes al expresar dicha tolerancia, regeneran plantas tolerantes (Maliga, 1984). La diploidizacin de ellas
conlleva a genotipos dobles haploides
(ambos genes dominantes o recesivos).
El cambio de la informacin conducente a la induccin de respuestas andrognicas, puede ser inducido slo bajo condiciones in vitro. El cultivo de anteras
con sus microsporas en fase uninuclear;
o usando microsporas directamente, debe ser, por lo general, mantenido en presencia de los reguladores del tipo auxina
y citoquininas. Niveles de cido naftalenactico (ANA) con benciladenina (BA)
de 1,0 mg/L, permiten dichas respuestas
en varias especies. El proceso de induccin consiste en que a partir de la primera gran mitosis conducente a un ncleo clula vegetativa y un ncleo o
clula generativa (o clula espermtica),
la ontogenia se desarrolla en forma di-
ferente. En condiciones normales, slo el

ncleo generativo se divide una vez ms,
conformando as los tres ncleos para el
desarrollo del tubo polnico, la formacin
del zigoto y del endosperma. En el caso
de la induccin andrognica, la clula generativa, por lo general no se divide ms;
en cambio, el ncleo o clula vegetativa,
constituye divisiones repetitivas confor-
mando un grano de polen multicelular.

Esta estructura se organiza posteriormente en forma de un pro-embrin y la manifestacin de la polaridad conduce a un
embrin gamtico al cabo de 4-5 semanas (Figuras 3.1 a 3.4). Las respuestas
andrognicas de algunas especies frutales
estudiadas y sus condiciones de induccin
estn resumidas en la Tabla 3.2.
Figura 3.1. Desarrollo de la microesporognesis

normal y andrognesis in Vitro.
Figura 3.2. Polen multicelular (pro-embrioides) de peral (Pyrus sp.)

finalizadas tres semanas de cultivo in vitro, mostrando
dos planos (A y B) de la tabicacin celular interna.
65
Figura 3.3.
Algunos estados de desarrollo en la
andrgenesis de lcumo (Pouteria lucuma)
Figura 3.4. Emergencia de una plntula

haploide de tabaco (Nicotiana tabacum) a
partir de polen despus de 35 das de cultivo.
Tabla 3.2. Diferentes condiciones inductivas de la

andrognesis en varias especies frutales.
Respuestas
Morfognicas/
Condiciones
Carica
pubescens
Pouteria
lucuma
% Generacin
de Embrioides()
6,5
3,7
0,0
39,7
3,1
0,0
0,0
% Formacin de callo
91,1
80,0
<5,0
100
100
<5,0
<5,0
% Pardeamiento
5,7
51,9
90,0
<5,0
95,0
95,0
100
MS-mod(2)
NN(3)
MS,NN,G(1)
NN
NN
NN
NN
AIA 1.0
BA 1.0
ANA 1.0
BA 1.0
Diferentes
combin.
ANA 1.0
BA 1.0
ANA 1.0
BA 1.0
60
40
Diferentes
niveles
20
20
20
20
Ninguno
8 das
a 8C
Ninguno
Ninguno
Medio de
Cultivo
Reguladores de
Crecimiento (mg/L)
Conc. de
Sacarosa (g/L)
Requerimientos
de bajas temp.
()
Cyphomandra Prunus X
betacea
Pandora
Prunus
avium
Solanum Annona
muricatum cherimola
Diferentes Diferentes
combin. combin.
Porcentaje estimativo de induccin respecto a anteras sembradas [Gamborg et al., 1968 (1); Murashige y Skoog,
1962 (2); Nitsch y Nitsch, 1969 (3)].
66
Finalmente, es importante considerar

que los mecanismos que inducen la divisin asimtrica para la diferenciacin
de la clula generativa durante la
ontogenia normal, pueden ser alterados
in vitro mediante aplicacin de colchicina, que inhibe la formacin del huso mittico. Al contrario del efecto de altas
dosis de colchicina, que inhibe totalmente la divisin celular, bajos niveles
de colchicina, an permisivos para la divisin de la microspora uninucleada,
provocan divisiones simtricas conformando dos clulas vegetativas, como
ocurre durante la induccin de la andrognesis de la microspora uninucleada. Alternativamente, existe la posibilidad de obtener tambin plantas
haploides, no a partir de gametos, sino
del tejido megagametofito femenino presente en gimnospermas, ofreciendo
igualmente un gran herramienta en el
mejoramiento gentico particular de
conferas. El gametofito femenino de
gimnospermas est constituido por clulas haploides genticamente idnticas
y que constituyen este tejido de funcin
nutricional para el embrin (Cardemil y
Jordan, 1982; Chavez y Litz, 1999).
ENRAIZAMIENTO In vitro
El enraizamiento in vitro depende del
potencial de la especie, del tipo de
explante y de las condiciones de cultivo y del tipo y niveles de reguladores
que son usados. Muchas especies tienden a enraizar fcilmente; otras, como
algunas trepadoras, lo realizan con mucha dificultad o manifiestan escasa frecuencia. El pardeamiento del material
puede provocar tambin falta de res-
puestas. En general, la norma es que in

vitro, el grado de facilidad de induccin
es semejante al de las plantas bajo condiciones de campo. A veces, el material
denota intensa proliferacin de brotes
pero no de races o viceversa. En la prctica, se procede a usar mayormente el
cido indolbutrico (AIB) como nico
regulador, aunque tambin se ha citado
de usarse junto con AIA u otros reguladores, como ANA. Varias condiciones
del medio tambin aparecen como idneas; entre ellas, el uso de soluciones
nutritivas de baja tonicidad, la reduccin
del contenido de azcar (sacarosa) de
2% a 1%, aumento de pantotenato de
calcio (5 mg/L), tiamina y la adicin de
otros compuestos pueden ser tiles. Por
ejemplo el carbn activado, que junto
con prevenir un excesivo crecimiento de
callo puede condicionar la promocin
de races.
ACLIMATACIN
Las plntulas que se desarrollan bajo
condiciones in vitro, lo hacen con altos
contenidos de humedad tanto en el medio como en su microambiente. Las
adaptaciones endgenas no consideran
entonces, en fases tempranas, la formacin de cutcula en las hojas ni los mecanismos regulatorios del control estomtico, vinculados a la retencin de
agua e intercambio gaseoso. Por un lado,
aunque el nmero de estomas puede
variar en las hojas de las plantas in vitro
comparado con plantas en condiciones
de crecimiento externas, ms relevante
es el hecho que su forma sea diferente y
estn situados en zonas superficiales de
la hoja, en vez de encontrarse ms bien
67
sumergidos bajo la capa epidrmica,

aparte de su incapacidad en el funcionamiento de cierre en respuesta de estrs
hdrico.
En mayor medida, el efecto ms perjudicial en la deshidratacin de una hoja
es la falta de produccin de cera
epicuticular. Su carencia implica que el
total de la superficie de las hojas permita la libre entrega de agua de la planta
al ambiente, efecto causado por diferencia de potenciales hdricos en el sistema. El resto de la planta recin desarrollada es tambin un material muy delicado, que recin est generando las estructuras con sus sistemas enzimticos
que le permiten su vida. Especficamente, las plntulas, de condicin mixotrfica o heterotrfica, recin estn comenzando a entrar a la fase de autotrofa.
Ello implica la generacin de pigmentos
y organelos, pasando de una fase de consumo de nutrientes orgnicos del medio
(por ejemplo sacarosa como fuente de
carbono) a su sntesis a travs de la fotosntesis. Al respecto, se han estudiado
estas primeras fases de aclimatacin y
se ha visto que, aunque durante la primera semana la fotosntesis neta bajaba
al detectarse alta fluorescencia, exista
recuperacin posterior.
Por otro lado, los niveles de sacarosa durante el cultivo in vitro son relevantes,
puesto que concentraciones de 6% en
el medio, dificultan ms la capacidad
adaptativa a plena fotosntesis y autotrofa. Igualmente, la condicin lumnica
es crtica en esta fase; mientras que una
intensidad de luz baja promueve la aclimatacin, los flujos de luz muy inten-
68
sos provocan fotoinhibicin y severo estrs en este estado. Adicionalmente,

existe un problema de generacin de
enzimas antioxidantes. La catalasa y la
superxido-dismutasa son las enzimas
antioxidantes ms eficientes en las plantas, que evitan la formacin de especies de oxgeno activadas, cuya resultante es la formacin de radicales de O 2 ,
d e O H y d e H 2O 2. A m b a s e n z i m a s
incrementan su contenido en los tejidos a medida que aumenta el grado de
estrs de plantas creciendo en su hbitat natural.
Plntulas recin transferidas de la fase in
vitro a la de aclimatacin, expresan escasa actividad de ambas enzimas, la cual
se incrementa posteriormente (a partir de
2 4 semanas), efecto dependiente de
las condiciones favorables de adaptacin
en esta fase, especialmente de acuerdo a
los niveles adecuados de humedad relativa y luz del invernadero. Cabe destacar que an a condiciones de muy alta
humedad en el medio, por ejemplo HR
de 99%, las tensiones ejercidas por la atmsfera ya son muy altas correspondiendo a aproximadamente 1.38 MPa (Megapascal) mientras en condiciones ms
normales aun, por ejemplo de HR 50%,
el potencial asciende a aproximadamente
93.6 MPa. El hecho de no poder regular
entonces la demanda de agua, an existiendo sta en el nuevo substrato, puede
conducir a un alto porcentaje de prdida del material. En estos casos se usa una
estrategia intermedia que depender nuevamente del tipo de planta, por ejemplo,
induciendo un lento endurecimiento de la
planta mediante el traspaso a etapas parciales antes de su paso a invernadero.
En algunas condiciones se usan osmticos e inhibidores in vitro, que desencadenan por s algunas respuestas. Por
ejemplo, altos niveles de sacarosa aplicados durante la fase de germinacin de
embriones somticos han estimulado la
sntesis de antocianinas, de lpidos y de
alcaloides. Los cambios en los niveles
de CO 2 en envases hermticos de los cultivos en la fase previa al transplante,
pueden afectar las densidades estomatales, el ndice estomtico y la apertura y
cierre de estomas de acuerdo al cultivo,
efecto tambin influenciado por la intensidad lumnica (Ross-Karstens et al.,
1998). Sin embargo, a nivel de invernadero, una accin benfica importante se
ha encontrado mediante el uso de compuestos diversos de accin antitranspirante, que se aplican por aspersin sobre la superficie de las hojas. Con ello
se puede crear una pelcula muy fina,
que acta como reflectora de luz, reduciendo de esta manera, la prdida de
agua por evapotranspiracin, mientras
se genera la cutcula y operen los mecanismos de apertura y cierre estomatal.
Se debe tener especial cuidado con la
seleccin y preparacin de dichos productos pues pueden generar toxicidad.
Uno de los compuestos usados ha sido
una resina polivinlica, el polivinilacetato o combinaciones de parafina de
bajo punto de fusin y/o grasa de petrleo con 50% glicerol acuoso, disuelto en
dietilter. Otro problema frecuente vinculado con la adaptacin, pero tambin
con respuestas morfognicas, es el efecto llamado vitrificacin o condicin
hiperhdrica que se presenta en tejidos de algunas especies bajo condicin

in vitro y que se analiza ms adelante.
La aclimatacin en ambientes controlados tambin est vinculada a mejorar el
desarrollo y funcionamiento de rganos.
En muchos casos, las races formadas in
vitro no prosperan en condiciones de
substrato. Sin embargo, explantes enraizados fcilmente regeneran nuevas races. Con respecto a esto, se ha reportado
que niveles altos de CO 2 (aproximadamente 750 ppm) en presencia de ciertos
niveles lumnicos (80 mol m -2 s -1), favorecen el desarrollo radicular, al mismo
tiempo que condicionan una mejor aclimatacin de las plntulas en tiempos menores (George, 1993). A fin de lograr la
mejor aclimatacin ambiental de las
plntulas a condiciones ex vitro, se deben tener adems presentes los siguientes factores/condiciones: a) alta humedad, sombra, asepsia; b) eliminacin de
agar con el objeto de eliminar la presencia de azcar disuelta; c) uso de substratos porosos, empleando en mezclas:
perlita, arena, vermiculita, pumicita, turba y suelo; desinfectados con fungicidas
entre ellos Benomil, Propamocarb, Captan, Thiram, Mancozeb, etc. y sus combinaciones, en concentraciones bajas cada
dos semanas; d) segn sea el caso de la
especie y substrato y una vez formadas
las races (y follaje), aplicacin de macro
y micronutrientes mediante soluciones
nutritivas concentradas o diluidas que incluyan elementos menores en forma soluble.
69
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71
72
APLICACIONES DE LA TCNICA DE CULTIVO DE TEJIDOS
CAPTULO 4
APLICACIONES DE LA TCNICA
DE CULTIVO DE TEJIDOS
PROPAGACIN CLONAL
as plantas pueden propagarse mediante dos ciclos de vida; la va

sexual y la asexual. En la va asexual o
vegetativa, los caracteres individuales de
las plantas madres son mantenidas en
sus descendientes, dado que el proceso
ocurre a travs de clulas somticas que
se copian exactamente y no recombinan
ni segregan como ocurre en la va sexual
(semillas). Muchas selecciones se han
obtenido sobre la base de mutaciones
espontneas que han ocurrido en algunos tejidos. Tales caractersticas pueden
igualmente perpetuarse, usando estos
como material madre. Al grupo de plantas reproducidas a partir de esta manera, se denomina clon.
Las tcnicas de micropropagacin, no
slo permiten mantener la homogeneidad o constancia del genotipo (salvo
excepciones), sino que tambin perpetan la condicin fisiolgica de los
explantes. Por ejemplo, expresar y mantener la condicin de juvenilidad o madurez existentes en los explantes maternos, o de poder mantener o de capturar
rasgos poco comunes en una poblacin
(Maynard, 1988). Igualmente por ejemplo, perpetuar hbitos arbustivos o de
tronco en poblaciones de ambas caractersticas. De igual manera, material en
floracin o con yemas florales, generar material con expresin inmediata de
caractersticas adultas.
Miguel Jordan Z.
De acuerdo a varios autores, las ventajas de la micropropagacin son varias,

entre ellas: necesidad de contar slo
con pequeos explantes (Figura 4.1) para producir grandes cantidades de material lite en tiempos relativamente cortos; posibilidad de multiplicacin durante todo el ao; escasos requerimientos de espacio y energa; posibilidad de
obtencin de plantas libres de patgenos o de eliminar estos de madres infectadas; y reduccin de costos cuando
otros mtodos aparecen excesivamente costosos, dependiendo de la especie.
La micropropagacin es, adems, la herramienta central en la amplificacin de
material gentico de alta calidad, permitiendo adems, el establecimiento y
perpetuacin de germoplasma o genotipos modificados a travs de la ingeniera gentica.
Figura 4.1. Organognesis caulinar

(formacin de brotes) en una seccin de hoja
de pepino (Solanum muricatum) de 1 cm2.
73
CULTIVO DE EMBRIONES
En diversos programas de mejoramiento
gentico, es conveniente combinar caractersticas genticas importantes que
se encuentran en variedades, como tambin en especies afines, mediante la obtencin de material hbrido. Ello puede
realizarse mediante cruzamientos intra
e interespecficos. Sin embargo, la fertilidad puede ser extremadamente baja
por problemas de incompatibilidad
gentica, lo que provoca la muerte de
los embriones en desarrollo, o bien, permite completar slo parte de su desarrollo (Raghavan y Srivastava, 1982). La incompatibilidad gentica puede darse a
nivel de la polinizacin (no penetra el
polen por el estigma), a nivel del estigma y durante la fecundacin.
Existen genes de incompatibilidad que
operan evitando los cruzamientos interespecficos naturales entre especies. En
otros casos, el problema puede darse
igualmente entre variedades que son incompatibles. Se pueden distinguir dos
tipos de infertilidad:
a) Incompatibilidad pre-cigtica, en la
cual no ocurre la germinacin del polen y/o crecimiento del tubo polnico,
por lo cual el cigoto no se forma.
b) Incompatibilidad post-cigtica, en
que se produce el cigoto, pero ste
no es aceptado por el endosperma.
La falta de nutricin del cigoto por parte del endosperma, provoca su desintegracin o aborto (Dimantoglou y Banilas, 1996). En algunos casos, la polinizacin y desarrollo de embriones pue-
74
de darse extrayendo los ovarios de las

flores, despus de unos pocos das ocurrida la fertilizacin y cultivndolos in
vitro despus de polinizar estos y previa escisin del estilo (polinizacin o fertilizacin in vitro).
Se ha visto que bajo estas circunstancias,
es posible promover el desarrollo de dichos embriones subcultivndolos (retirndolos de los factores inhibitorios presentes en el tejido placental materno) en
estadios tempranos de su ontogenia
(Raghavan y Srivastava, 1982). De esta
manera, es posible realizar el rescate de
embriones derivado de combinaciones
que no hubiesen sido posibles en la naturaleza.
Una segunda utilidad, consiste en lograr,
a travs del rescate de embriones, la obtencin de material con caractersticas
juveniles, el que tiene mayor potencial
regenerativo para multiplicacin clonal.
Lo mismo tambin para el material libre
de patgenos, dado que la frecuencia de
transmisin a travs de gametos es slo
de un 5%. Tambin es una estrategia eficiente de obtencin de mutaciones, pues
es posible someter polen (haploide) a
tratamientos mutagnicos (radiacin
ionizante, UV y productos qumicos) y
polinizar posteriormente los ovarios.
Adicionalmente, se ha visto que embriones generados de esta manera pueden
obviar la demanda de dormancia.
De acuerdo a su estadio de desarrollo
al momento de extraccin, los medios
cambian en cuanto a complejidad de
composicin. Estadios tempranos de cultivo requieren de vitaminas, aminocidos, reguladores, agua de coco y otros
compuestos naturales. En cambio embriones ms desarrollados crecen en presencia slo de sales inorgnicas y sacarosa. Los parmetros que afectan las fases conducentes a la obtencin de embriones somticos y de ellas, plantas,
est bastante conocida en diferentes especies, lo que permite automatizar el sistema de cultivo en biorreactores (Ibaraki
y Kurata, 2001).
Dada la mutacin frente a agentes qumicos (por ejemplo, toxinas, pesticidas/

herbicidas, metales pesados etc.); las clulas sobrevivientes al expresar dicha tolerancia regeneran plantas tolerantes. La
diploidizacin (Ejemplo AA BB CC dd)
de ellas, conlleva a genotipos homocigotos dominantes (dobles haploides).
OBTENCIN
DE HAPLOIDES
Anteriormente se present el potencial

morfognico existente en gametos a travs de la andrognesis, que manifiestan
microsporas conducente a la produccin
de plantas haploides. Junto a la condicin del genoma, la ventaja de su uso
implicaba aprovechar la variabilidad
gametoclonal en la deteccin y seleccin de varios caracteres agronmicos
de inters. De acuerdo a la expresin de
estos, la condicin haploide permite evidenciar tempranamente mutantes y, en
el caso de la manipulacin gentica, los
protoplastos haploides y sus productos
de fusin interespecfica o intergenrica, representan el material ms apropiado en el estudio de la inestabilidad
cromosomal en trabajos de mejoramiento gentico basado en cruzamiento gentico convencional o en fusiones somticas bajo condiciones in vitro. Una serie de cambios que implican variacin
gentica, pueden ocurrir en cultivos de
origen haploide combinados. Estos corresponden a variacin cromosomal, alteraciones moleculares del genoma nuclear y cambios citoplasmticos (Ziauddin y Kasha, 1990). Dentro de los primeros, se pueden citar translocaciones,
deficiencias y nmeros irregulares de
cromosomas (Chen y Chen, 1980;
DAmato, 1977); las segundas pueden
estar relacionadas con amplificacin de
La generacin de haploides (por ejemplo genes A B C d), tiene gran importancia en el mejoramiento gentico de plantas dado que:
a) Es posible, en la prctica, usar directamente la planta de caractersticas
haploides, a travs de la variacin gametoclonal (ejemplo patrones de injerto enanizantes);
b) Es posible hallar caracteres genticos
que pueden estar enmascarados en
cruzamientos normales dada la incompatibilidad que se presenta en
algunas especies;
c) Es posible diploidizar tejidos o partes de la planta, obteniendo homocigotos diploides, con lo cual se pueden seleccionar directamente pares
de genes dominantes o recesivos en
una sola generacin, haciendo posible emplear este material en cruzamientos posteriores; y
d) Proceder a realizar mutaciones en clulas haploides, con lo cual se puede
generar diverso material con propiedades genticas de importancia.
a) Andrognesis.
75
secuencias repetitivas (De Paepe et al.,

1982) y las terceras, con prdidas de
genes en el DNA-plastidial, causante de
la condicin albina en muchas gramneas (Day y Ellis, 1984). Tales variaciones, permiten que con el uso de haploides, la metodologa de obtencin de
mutantes resistentes a varias pestes, a
patotoxinas, herbicidas y tolerancia a
sales y estrs, se vea altamente facilitada y de hecho, gran cantidad de nuevas
lneas y variedades de carcter productivo, han sido generadas en varias especies de importancia agronmica (Bajaj,
1990). Igualmente, clulas y protoplastos de carcter haploide, son una herramienta de especial inters en trabajos de
transformacin gentica (Zhang y
Lespinasse, 1992).
limitaciones actuales, una estrategia

para generar material de caractersticas
genticas importantes de condicin haploide, sera la de generar plntulas de
material fecundado cuyo polen hubiese
sido irradiado con altos niveles de rayos X o radiacin gamma, o polinizar
con polen infrtil de carcter triploide
(German y Chiancone, 2001). La ginognesis es relevante en aquellos casos
de genotipos no andrognicos o con esterilidad masculina (Zhang y Lespinasse,
1992). En particular, la posibilidad de
obtener haploides a travs de ginognesis en Citrus clementina, aparece como
la nica estrategia viable en diferentes
especies de ctricos dado que, por lo
general, diferentes genotipos ensayados
no desarrollan andrognesis (German
y Chiancone, 2001).
b) Ginognesis.
La informacin concerniente a esta modalidad de generacin de haploides es
muy escasa. El cultivo in vitro de ovarios no polinizados, vulos aislados o en
conexin con tejido placental, se realiza preferentemente en el momento en
que el saco embrionario cuenta con
ocho ncleos haploides. Los resultados
no son tan generalizados como a travs
de la andrognesis, en menor parte atribuible a la dificultad de determinar el
estado del saco embrionario. En plantas
leosas, las respuestas son an ms limitantes; a la fecha, se ha reportado la formacin de callo con estructuras de aspecto de embrin, pero que no condujeron a la formacin de plantas. Sin embargo, el potencial de esta tcnica es alto
por el tipo de material generado de origen materno, como se indic anteriormente (Yang y Zhou, 1990). Frente a las
76
c) Potencial del megagametofito femenino de gimnospermas.

El gametofito femenino de gimnospermas
es de relativo gran tamao y facilidad de
manipulacin. Este tejido haploide, conformado enteramente por clulas haploides idnticas entre s (rico en almidn), nutre y rodea el embrin de las conferas. En el caso de Araucaria araucana
(Cardemil y Jordan, 1982), se presenta
con clulas que corresponden a un cenocito; es decir, clulas con varios ncleos haploides sin tabicacin interior.
Intentos de cultivar ste han conducido
a la formacin de callo con proliferacin
celular y formacin de clulas delimitadas por pared. Sin embargo, a pesar de
no encontrar respuestas morfognicas en
A. araucana, se ha reportado morfognesis conducente a la formacin de brotes
en gametofitos de Larix sp. (Nagmani y
Bonga, 1985) y en varias Cycadales del

gnero Zamia spp., Ceratozamia spp. y
Dioon sp. (Chvez y Litz, 1999).
d) Haploida por cruzamientos

interespecficos incompatibles correspondientes al gnero Hordeum.
En este caso, durante el cruzamiento de
H. vulgare con H. bulbosum (Konzak et
al., 1951; Kasha y Kao, 1970; Bajaj,
1990), una mitad cromosomal de la
recombinacin se pierde (H. bulbosum)
quedando el embrin cigtico F1 en condicin haploide, el cual debe ser recuperado mediante el cultivo de embriones
poco despus de la polinizacin. Tal estrategia es importante en programas de
mejoramiento, dado que puede incluirse
igualmente en cruzas de trigo (Triticum
aestivum) con maz (Zea mays), de las
cuales se han podido generar embriones
de trigo dobles haploides (Bajaj, 1990).
PRODUCCIN DE PLANTAS
LIBRES DE VIRUS.
Las virosis son enfermedades bastante
frecuentes en vegetales. Aunque por semillas se transmiten solamente un 5% de
ellas, los problemas por contaminacin
son muy importantes en especies que se
propagan vegetativamente. El uso de
bulbos, tubrculos, rizomas, estacas y
otro material posible de multiplicar, (junto a injertos), derivado de plantas contaminadas, conlleva dichas infecciones.
En algunos casos, el uso de la propagacin vegetativa es ineludible, puesto que
un cultivo determinado corresponde a
variedades y clones cuya homogeneidad
gentica se perdera por uso de semillas.
Por otro lado, el empleo de semillas de-
rivadas de polinizacin cruzada, por la

variabilidad que expresan, no sera idnea para efectos de mantener la homogeneidad y/o productividad de un cultivo. Frente a cada caso, debe considerarse que, para muchas comunidades
agrcolas las metodologas ancestrales
de cultivo son mantenidas todava por
tradicin y que cambios por modernizacin, seran socialmente poco viables al
haber hecho uso del mismo recurso especfico por generaciones.
La propagacin vegetativa conlleva dichos riesgos, con lo cual una atencin
especial debe ser dedicada a la mantencin de la calidad clonal y el control
fitosanitario de las plantas madres y descendencia. Al mismo tiempo, la posibilidad de erradicar contaminantes de
material de alto valor cultural debe ser
una constante con este propsito.
Las infecciones de tipo viral son transmitidas principalmente a la planta por insectos ya sea de tipo picador-chupador
(fidos) o nemtodos a nivel del suelo,
que llevan los patgenos en su sistema
digestivo, adquirindolo de otras plantas contaminadas. A medida que la planta va completando sus fases de desarrollo y durante toda su ontogenia, la infeccin transmitida puede incrementarse
en los tejidos. Aparte de eso, nuevos focos de infeccin, con la misma u otras
virosis, pueden aparecer con el tiempo.
En el caso de papayas (Carica papaya);
al cabo de unos aos, las plantas deben
ser reemplazadas dado que, por presencia de virus (en este caso Papaya ringspot virus, PRV), su productividad baja
considerablemente (Manshard, 1992).
Dado que en este o en otros cultivos se
77
tienen formas ms productivas deseables, por ejemplo, (formas florales/plantas masculinas, femeninas, hermafroditas), plantas polinizadoras, o resistentes a varios tipos de estrs bitico o
abitico, a partir de ellas es posible su
propagacin y la obtencin de material
libre de patgenos mediante tcnicas de
cultivo de tejidos.
Los tejidos meristemticos en activo crecimiento se encuentran generalmente
libres de diferentes tipos de patgenos,
an en plantas contaminadas. Dicho potencial es explotable puesto que, de ser
posible su cultivo y conduccin a respuestas morfognicas, es de esperar poder generar plantas idnticas sanas. Esta
condicin est dada porque el movimiento transcelular de patgenos, a travs de las vas simplsticas (ms frecuentes en clulas jvenes de tejidos meristemticos), aparece como temporalmente demorado con respecto a la velocidad de crecimiento de zonas api-
cales. De all que en las zonas de activa

divisin (y elongacin), ms distales,
pueden encontrarse temporalmente libres de contaminacin (Figura 4.2). Otra
causa posible es la competitividad por
sntesis de protenas y cidos nucleicos
entre patgenos y tejido meristemtico,
competitividad que no ocurre en clulas ms adultas en fase de diferenciacin. Finalmente, se postula que la auxina es una hormona determinante que
inicia la sntesis de muchas protenas,
entre ellas las que otorgaran caractersticas de resistencia a algunos virus.
El meristema es un centro principal de
sntesis de auxina para la planta. A fin
de lograr por tanto el escape, es comn mantener plantas a altas temperaturas, segn su grado de tolerancia (3040C, por das o semanas, con alta humedad relativa en el ambiente), lo cual
promueve gran actividad meristemtica
y crecimiento. Conjuntamente, puede
darse la condicin de oscuridad, la cual
Figura 4.2. Obtencin de pices caulinares libres de

patgenos en papa (Solanum tuberosum) mediante
brotacin mltiple de secciones nodales y quimioterapia.
78
promueve la etiolacin del eje central

(y el crecimiento) de las plantas en su
regin de elongacin celular, localizada debajo del meristema.
Con el aislamiento y cultivo in vitro de
estos tejidos, se pueden obtener plantas
totalmente libres de patgenos. La tcnica consiste en aislar y extraer el conjunto de clulas o tejidos que conforman
exclusivamente la regin meristemtica,
del orden de 0.1 mm de dimetro. Como
ello implica un trabajo lento, muchas
veces se cultivan los pices enteros (con
mayor riesgo de contaminacin/menor
erradicacin de patgenos), pero se emplean posteriormente tcnicas de deteccin rigurosas para evaluar la calidad
fitosanitaria del explante; por ejemplo,
ELISA (Enzyme-Linked Immuno Sorbent
Assay), de sensibilidad mil veces mayor
en comparacin con tcnicas convencionales (por ejemplo, Ltex) (Wood,
1985). El grado de confianza de usar esta
metodologa, est dado tambin por el
hecho de que, en algunos casos, la multiplicacin de patgenos en los tejidos
mantenidos in vitro se ve inhibida con
el tiempo y que explantes de mayor tamao (virtualmente contaminados), aparecen igualmente libres despus de un
perodo largo de cultivo. Existen estudios especficos realizados en meristemas y callos (tejidos no organizados),
que demuestran una reduccin de
patgenos en el tiempo, bajo condiciones in vitro (Ingram, 1973). Varios trabajos en tejidos meristemticos han empleado compuestos de posible accin
antiviral con respuestas diversas. Entre
ellas, bases anlogas (por ejemplo, 8azaguanina, 2-tiouracilo), se han mostrado eficientes en el control del virus Y
(PVY) de la papa, o verde malaquita
(diaminotrifetilmetano), etc.; especialmente Virazole ha mostrado en el tiempo, tener efecto antiviral en una serie de
especies. La ventaja de su empleo e inclusin in vitro, es que se trata de un
producto estable a altas temperaturas
(autoclavable) y que posee escasa toxicidad en los tejidos. En papas se logr
control de PVX en dosis de Virazole de
5-25 mg/L (Jordan et al., 1983), aunque
niveles de 50 mg/L o mayores, provocaron cierto grado de toxicidad en los pices cultivados in vitro, afectando su crecimiento y rizognesis. Virazole tambin
fue aplicado directamente a la planta,
previo al cultivo, consiguindose erradicacin de PVX, bajo ciertas concentraciones (Figura 4.2).
Las tcnicas anteriores contemplan igualmente la termoterapia. Con ella fue posible eliminar la presencia de un viroide de
la papa (PSTV) y lograr la obtencin de
explantes potencialmente libres de
patgenos (Roca, comunicacin personal).
CRIOPRESERVACIN
Se refiere a la posibilidad de preservar
en el tiempo, el germoplasma existente
en la forma de clulas u rganos a bajas
temperaturas. El trmino criopreservacin se refiere mayormente a temperaturas cercanas a 196 C. Esta metodologa consiste en transferir material biolgico a almacenamiento en nitrgeno
lquido, temperatura a la cual todo el
metabolismo es suspendido. Tericamente, no existen daos biolgicos en
el procedimiento, salvo posibles cambios que involucran radiaciones ionizantes naturales.
79
En la prctica, en la criopreservacin
existe la ventaja de poder conservar material de valor, de manera que los gastos
operacionales in vivo e in vitro pueden
ser omitidos por perodos prolongados.
Esto es relevante en programas de mejoramiento gentico de especies
arbreas o material forestal (Smith,
1997), donde se requiere superar un
perodo de larga juvenilidad y/o esperar
la expresin de caractersticas
fenotpicas de las plantas sujetas a su
conservacin y propagacin sexual programada (Haines, 1994). Otro inters de
esta tcnica consiste en la posibilidad
de conservar material en inminente peligro de extincin. Ello es especialmente relevante en reas poco exploradas
cientficamente, donde la explotacin
desmedida, por ejemplo, en vastas regiones de bosques tropicales, y donde
la maquinaria avanza ms rpidamente
que la descripcin taxonmica, se sacrifica la existencia de especies sin siquiera ser descritas o ser conocida su importancia para el hombre y cuya eliminacin las har irrecuperables para la humanidad (Raven et al., 1999).
La tcnica de conservacin es igualmente de utilidad, puesto que bajo algunas
condiciones in vitro, se produce variabilidad por inestabilidad gentica; como
ocurre por variacin somaclonal, otros
tipos de alteraciones en callo, o suspensiones celulares de carcter endgeno o
producido por algunos factores (ejemplo
2,4-D). Por criopreservacin se mantiene al alcance inmediato el material original invariable a lo largo del tiempo. En
trminos prcticos, la ventaja tambin reside en poder conservar y usar material
o germoplasma que es altamente heterocigoto y donde, por causa de la propaga-
80
cin por semillas, pueden ser perdidas las

combinaciones deseables de genes.
Igualmente, es importante para aquellas
semillas de especies que son poco tolerantes a las condiciones ambientales, de
escasa viabilidad y en peligro de extincin (Maynard, 1988). La conservacin
de polen es una de las alternativas afines
posibles para conservar dicha biodiversidad, al contar solamente con un representante de cada cromosoma maximizando su estabilidad gentica y tiempo de
almacenamiento (Grout y Roberts, 1995).
Salvo algunas excepciones, especialmente en el caso de semillas o yemas en condicin de dormancia, donde se coloca directamente el material a temperaturas
criognicas, el proceso es comnmente
gradual y requiere satisfacer ciertas etapas. Una de ellas es el acondicionamiento previo, que puede inducirse mediante
el cultivo de explantes en presencia de
altos niveles de osmticos y el uso de
crioprotectores. Los primeros, estn indicados para reducir el contenido de agua
intracelular de los explantes; los segundos, para impedir la formacin de cristales de agua que puedan daar la estructura celular.
Este proceso de desecacin permite reducir gradualmente la temperatura del explante por debajo del punto de congelacin sin mayor dao. A continuacin, el
proceso puede ser ms rpido colocndose el material ya protegido directamente
en el N 2 lquido. En algunos casos, se ha
procedido a una interfase de desecacin
previa mediante encapsulado del material
en alginato de Ca. La crioproteccin puede lograrse con combinaciones de varios
compuestos; por ejemplo, dimetilsulfoxido (DMSO) al 0,5 M hasta 15%, en presencia de glicerol o con combinaciones que
pueden incluir uno o varios de los siguientes compuestos: polietilenglicol (PEG)

10%, sorbitol 0,4-0,5 M, etilenglicol 1015%, sacarosa 2-3%, glucosa 6-10%, prolina 0,5%. Bajo estas condiciones comnmente se baja la temperatura a razn de
0,5-1,0C por minuto hasta -40C; para sumergir luego directamente en nitrgeno lquido. Alternativamente, la descongelacin puede ser ms bien rpida hasta
aproximadamente los -40C para luego, en
presencia de algunos criopreservantes,
ascender gradualmente hasta el punto de
congelacin. A continuacin, se transfiere el material a medios sin criopreservantes
y se establece la temperatura usual de cultivo (por ejemplo 20-25C). En esta fase,
varias modificaciones especficas han contribuido a mejorar la eficiencia en algunos
cultivos; por ejemplo, la substitucin de
nitrato por amonio y el empleo de carbn
activado. Detalles sobre metodologas para
criopreservar diferentes rganos de plantas, callos y suspensiones celulares, test de
viabilidad de los explantes y aspectos de
estudio bajo microscopa electrnica, estn igualmente descritos (Withers, 1985).
SUSPENSIONES CELULARES
Dado el potencial morfognico de algunas clulas, es posible obtener gran eficiencia en la regeneracin de plantas
mediante embriognesis somtica. Cada
clula en cultivo es, de por s, potencialmente capaz de regenerar una planta completa. La eficiencia de este sistema es superior a la regeneracin a travs de organognesis, con diferenciacin secuencial de brotes y races, mediante subcultivo. En condiciones apropiadas, se requiere solamente de uno o
dos subcultivos para lograr la induccin
embriognica de numerosas clulas, que
se mantienen por lo general en matraces
(Figura 4.3). La eficiencia en la multiplicacin puede ser aumentada, dada la caracterstica que muchos embriones durante su ontogenia, expresan la formacin de embriones adventicios; ello frente a posibles desbalances hormonales y
condiciones del medio (Jordan y Velozo,
1996). Estos embriones pueden ser separables y aumentar la biomasa resultante. El uso de suspensiones celulares
Figura 4.3. Suspensiones celulares conducentes a la

embriognesis somtica en papaya (Carica pubescens).
81
ha sido relevante en la metodologa conducente a la poliembriognesis y, en algunos casos, ha servido directamente en

regeneracin clonal de algunas especies
de Pinus (Dimantoglou y Banilas, 1996;
Fowke y Attre, 1996).
Entre las muchas otras ventajas de usar
suspensiones, est la de generar productos metablicos, compuestos secundarios y/o estructuras qumicas activas
biolgicamente, que no pueden ser sintetizados qumicamente. Ha sido posible derivar en lneas y condiciones de
cultivo que puedan maximizar la produccin de metabolitos especficos.
Igualmente, ha sido posible generar
compuestos metablicos que no han
sido sintetizados bajo condiciones naturales y que pueden tener gran importancia a nivel medicinal (apoatropina).
De entre los ejemplos de metabolitos secundarios cuya concentracin producida in vitro es mayor que en tejidos intactos, se puede citar a: antraquinonas,
berberina, cafena, saponinas de Ginseng, cido rosmarnico, shikonina, ubiquinona 10 (Matsumoto et al., 1982).
Mediante cultivo de races se han producido tambin nicotina, atropina, escopolamina e hiosciamina; igualmente en
concentraciones mayores que las races
in situ.
Con excepcin de lo anterior, por lo general la metodologa es dirigida no tanto a la regeneracin de clulas u rganos a plantas, sino ms bien dando prioridad a la mantencin del metabolismo
secundario, lo cual no favorece necesariamente la regeneracin. En estos casos, nuevamente, el uso de biorreactores
homologando condiciones in vitro aparecen de gran utilidad. La metodologa
82
de uso de clulas como fuente de productos bioqumicos de diferente naturaleza, ha sido de gran aplicacin biotecnolgica y est profusamente descrita en
la literatura (Staba, 1980).
Las suspensiones celulares se han usado tambin profusamente como unidades de seleccin in vitro a diversos productos como toxinas, herbicidas y metales pesados. Se postula que aquellas
clulas que son tolerantes a ciertos niveles de compuestos txicos para la
planta madre de la cual provienen, pueden generar material ms resistente y
conducir a plantas adultas con dicha
caracterstica.
Una ltima ventaja del cultivo de clulas en suspensin, reside en el hecho
que las condiciones definidas para la regeneracin de clulas de una especie a
plantas, pueden ser aplicadas a aquellas
demandadas por protoplastos. Por norma general, transcurridos los procesos
crticos en cuanto a la viabilidad de protoplastos, las condiciones definidas para
clulas pueden ser satisfactorias en la
fase de multiplicacin celular de protoplastos, tratndose de material afn.
PROTOPLASTOS
Corresponden a clulas vegetales aisladas bajo condiciones de cultivo, que se
encuentran temporalmente desprovistas
de su pared celular. La posibilidad de
obtener, mantener y cultivar protoplastos
parti en la poca de los aos 1960
(Cocking, 1960) y en la dcada siguiente, ya estaban establecidos grandes
avances sobre aspectos bsicos de aislamiento y cultivo. (Cocking y Evans,
1973). La viabilidad de protoplastos reside mayormente en las condiciones del

medio de cultivo, su tonicidad y composicin. La delgada membrana plasmtica
unitaria, bajo condiciones ptimas, mantiene la integridad de los organelos que
contiene; as como de sus funciones metablicas. Los protoplastos pueden regenerar su pared si parte de sus componentes nutritivos estn presentes o pueden ser resintetizados; por ejemplo, en
presencia de un conjunto de pentosas.
La importancia de los protoplastos es doble; por un lado, son una evidencia adicional de la totipotencia celular, pues
virtualmente pueden regenerarse plantas a partir de cada protoplasto en particular, por lo que se les ha designado
como protoclones. En segundo lugar,
la posibilidad de usarlos como mtodo
para lograr recombinaciones genticas,
algunas no ocurrentes en la naturaleza
por incompatibilidad gentica (Shivanna, 1982). Ms all, est la posibilidad
de recombinar genes pertenecientes a
otras variedades, especies y plantas de
otro gnero o familia (fusiones interespecficas). La forma final aleatoria de recombinacin gentica, determina el producto de fusin alcanzado.
Los productos de fusin, cuanto ms cercanos en parentesco, tienen mayores
probabilidades de expresarse como clulas totipotentes, y emprender respuestas morfognicas conducentes a plantas.
Sin embargo, es frecuente la inestabilidad cariotpica de los productos de fusin (Chaleff, 1981).
Dado que es tcnicamente factible juntar dos protoplastos y fusionar estos, lo
que implica la mantencin de las estruc-
turas y propiedades contenidas en el

citoplasma (aparte de mitocondrias y
plastidios), se crean fusiones con productos diferentes a las fusiones gamticas; stas se denominan fusiones somticas. Cabe destacar que en las fusiones gamticas solo el vulo participa
con su contenido citoplasmtico; en fusiones somticas el aporte es de ambas
clulas. De mayor importancia an es la
situacin de protoplastos haploides, los
cuales sirven como excelentes herramientas para inducir mutaciones con o
sin fusin de otro material recombinante.
El aislamiento de protoplastos se logra a
partir de tejidos en activo crecimiento,
siendo igualmente importante contar
con material que provea de protoplastos
de tamao homogneo. Otro factor a
considerar es la presencia de ciertas caractersticas como tamao o pigmentacin como por ejemplo, las antocianinas; su presencia es prctica ya que pueden servir como indicador al fusionar
con protoplastos derivados de otra planta. El tejido u rgano elegido, primeramente se desinfecta y se coloca en soluciones estriles, en presencia de agentes osmticos (manitol, sacarosa) en alta
concentracin. El tratamiento consiste
en lograr plasmolizar el protoplasma,
contrayendo la plasmalema y separndola de la pared celular. Bajo estas condiciones, se procede a subcultivar los tejidos en un medio similar, pero que contiene las enzimas celulasa, pectinasa y
en algunos casos hemicelulasas (Ishii,
1989). Las primeras, proceden principalmente de Trichoderma viride, (con diferentes nombres comerciales) junto a la
driselasa (derivada de Irpex lacteus). Las
pectinasas son obtenidas de Rhizopus
arrhizus, Aspergillus japonicus o Bacillus
83
polymyxa, mientras que las hemicelulasas provienen del caracol Helix pomatia
o de Aspergillus niger.
En cuanto a sus concentraciones, combinaciones de uso y tiempos de accin ptimos, junto a temperaturas y tipos de
explantes a tratar, son todas variables que
deben ser evaluadas. Existen diferencias
a considerar segn sea el material, por
ejemplo, en gramneas, a diferencia de
dicotiledneas, donde las paredes contienen adems glucoarabinoxilanos, las
mezclas de celulasas con xilanasas y pectiliasas fueron ms eficientes para varios
cultivos (Ishii, 1989). La incubacin con
enzimas resulta en la degradacin de la
pared, cuyos restos son eliminados mediante centrifugacin; as como posteriormente los remanentes de enzimas mediante varios subcultivos.
Con el objeto de efectuar la fusin y obtencin de recombinantes intraespecficos o interespecficos, se procede en forma paralela para los protoplastos de la
otra especie o planta a combinar. Finali-
zada esta etapa, se subcultivan ambas

alcuotas en forma separada, con un osmtico en menor concentracin. Esto
permite regenerar la forma globular de
los protoplastos, a niveles de turgencia
que deben ser muy exactos, para as impedir la ruptura celular por ingreso excesivo de agua y ruptura de la plasmalema (Figura 4.4).
Finalmente, se mezclan los medios fusionantes con los protoplastos, pudiendo
aplicar las siguientes tecnologas poblacionales o especficas para inducir su
fusin.
1. Electroporacin y electrofusin, con la
cual se descarga temporalmente la carga negativa interna debajo la membrana, la cual impide la fusin natural.
2. Agregando CaCl 2 , PEG Ca(NO 3 ) 2
con lo cual se logra agregacin celular y fusin al azar.
3. Mediante mtodos ms especficos
como microinyeccin; que inmovili-
Figura 4.4. Protoplastos de Carica pubescens y

C. papaya, previa fusin (izquierda) y fusionados (derecha).
84
za un protoplasto por su superficie,

se procede a inyectar DNA, organelos
o ncleos de clulas deseadas, a travs de la plasmalema, bajo observacin microscpica.
(Jordan et al., 1986). En caso de que no

existan limitaciones morfognicas, la
regeneracin a plantas completas puede proceder. Lo ms usual es a travs de
organognesis expresada en un conjunto celular o callo.
Otros mtodos se indican en la Tabla 4.1.

La regeneracin a partir de protoplastos,
procede en primer lugar, con la formacin de la pared celular antes de que ocurra una primera mitosis, e independientemente de que se haya procedido a la
modificacin del genotipo mediante insercin de genes o cromosomas. Sin embargo, dicha capacidad depende de las
compatibilidades derivadas del proceso
de arreglos y reintegracin cromosomal
y de la capacidad de su expresin posterior.
Es conocido el fenmeno que cuanto
ms distante es el parentesco del material a fusionar, existir una menor probabilidad de viabilidad y respuestas morfognicas. En algunos casos, como lo
han sido cruzamientos entre especies del
mismo gnero, incompatibles sexualmente, la fusin de protoplastos permite la formacin de estructuras globulares, semejante a embriones, pero que no
son capaces de continuar su desarrollo
Durante las primeras fases de cultivo los

factores ms importantes a ser considerados son: la densidad de plaqueo, la
composicin nutritiva del medio y tipo
de substrato (generalmente agarosa o
medio lquido en suspensin), las fitohormonas, la presin osmtica, la luz y
la temperatura. Para la induccin de embriognesis u organognesis es igualmente importante: contar con un medio regenerativo, provocar un descenso en la
osmomolaridad y cambios sucesivos de
medios y sus hormonas. En algunos casos se debe acompaar a los protoplastos
con clulas nodrizas (nurse cultures),
a modo de condicionar el medio nutritivo con clulas en activo crecimiento,
(lo que la literatura ha indicado como
requerimiento metodolgico en algunos
casos (Reinert y Yeoman, 1982; Kyozuka
et al., 1990)). Bajo condiciones adecuadas, normalmente los protoplastos empiezan a dividirse a los 3-4 das, formando
colonias compactas con pequeas clulas ricas en material citoplasmtico.
Tabla 4.1. Tcnicas de fusin de protoplastos y sus efectos principales.
Espontnea
Medios mecnicos
Sales/Shock osmtico
Ac. grasos y steres
Iones Ca y alto pH
Dextran y D. sulfato
Alcohol Polivinlico
Polietilenglicol
Electrofusin
Degradacin enzimtica de protoplastos (clulas) multinucleadas.

Por presin o compresin (microinjeccin).
Na2NO3 a conc. 0,025 M provoca shock desplasmolizante
Fosfolpidos cargados positivamente atraen membranas.
Provocan leve lisis a membranas que no daa a los protoplastos.
Dextran de alto PM agrega y fusiona protoplastos.
Adhiere protoplastos sin afectar viabilidad.
Adhiere protoplastos, usado para diferentes gneros y familias.
Campos elctricos de 5-10V, 500Hz y pulsos de 15V, 50 seg.
85
Para aumentar la eficiencia en algunas

especies, el acompaamiento de las clulas nodrizas debe prolongarse hasta 10
das. La primera etapa de crecimiento
tambin es afectada por la densidad de
protoplastos, siendo la eficiencia de plaqueo en el rango de 5 x 10 4 a 10 6.. Concentraciones inferiores reducen notablemente la eficiencia de plaqueo y desarrollo posterior. A partir de 3-8 semanas,
es comn ver la formacin de nuevos
brotes a partir de callo, siendo kinetina y
zeatina importantes en esta respuesta.
Existen numerosas ventajas de la regeneracin a partir de protoplastos recombinados a fin de aumentar la variabilidad.
Por ejemplo, es tambin posible la generacin de cbridos en los cuales la recombinacin de protoplastos no slo considera recombinar material nuclear, sino tambin posibilita optar por la incorporacin
del DNA de cloroplastos y/o mitocondras
de una o de las dos clulas recombinan-
tes. La incorporacin de DNA de organelos (como cloroplastos o mitocondrias),

hace factible manejar la expresin de dichos genes insertos en ellos. Por ejemplo, la obtencin de esterilidad masculina, factor importante en programas de
mejoramiento en maz; resulta del control de un gen ubicado en mitocondrias.
A travs del cultivo de protoplastos haploides (derivados de plantas haploides),
es posible tambin inducir mutaciones,
las cuales pueden derivar en plantas homocigotas (2n) en una sola generacin.
Protoplastos y clulas haploides tambin
pueden ser usados en procesos de seleccin in vitro para determinar tolerancia
a toxinas de algunos microorganismos o
frente a metales pesados y diversos productos qumicos. Las principales fuentes
y tcnicas conjuntas posibles de aplicar
para lograr aumentar la variabilidad gentica en plantas, se encuentran resumidas en la Tabla 4.2.
Tabla 4.2. Metodologas aplicables a la obtencin de variabilidad en plantas.
()
Mutaciones inducidas (Rayos X, rayos gamma, radiacin UV; mutgenos qumicos.

Variabilidad inherente detectable por cultivo de tejidos (variacin somaclonal).
Variacin gametoclonal () mediante induccin de andrognesis y ginognesis.
Efectos combinados de caracteres de plantas haploides junto a mutagnesis.
Cruzamientos dirigidos usando polen mutado (in vivo o in vitro).
Cruzamientos con eliminacin natural de cromosomas.
Fusin simtrica de protoplastos (intraespecfica e interespecfica) in vitro.
Cibridizacin (fusin asimtrica con eliminacin de uno de los ncleos).
Cibridizacin (fusin asimtrica con incorporacin/eliminacin de mitocondrias
y/o cloroplastos).
Microinyeccin.
Electroporacin.
Transferencia de genes (A.tumefaciens, A. rhizogenes, Biobalstica).
La variacin gametoclonal no aade nuevos genes al conjunto existente en la especie. La existencia de un solo juego
cromosomal (en plantas haploides), hace posible la expresin de algunos de ellos (normalmente recesivos), al ser eliminado el efecto del alelo. De esta manera, la o las caractersticas de la expresin de variabilidad de algunos genes deseables, puede ser conservada por autoduplicacin, siendo posible de su incorporacin ms fcilmente en programas
de mejoramiento.
86
SEMILLAS SINTTICAS
Corresponde a embriones generados por
tcnicas de embriognesis somtica que
a partir de cierto grado de desarrollo, son
encapsulados en compuestos gelificantes que les aportan nutrientes y proteccin al desecamiento y de factores biticos/abiticos (Figura 4.5). Estas semillas pueden tratarse, posteriormente,
como semillas naturales, procedindose
a una siembra con desarrollo de plntulas en condiciones de vivero o de campo. Las cubiertas gelificantes se refieren
principalmente a alginatos, que corresponden a cido algnico derivado de algas (cido manurnico y cido glucurnico), en forma de sal de sodio. Las soluciones de alginato gelifican posterior
aplicacin de iones calcio, protegiendo
al embrin. En esta fase de gelificacin,
es posible incorporar diversos productos fitosanitarios y/o nutrientes que estimulan el crecimiento durante la germinacin (Redenbaugh et al., 1988).
Bajo condiciones ptimas, la tcnica

permite el almacenaje de material seleccionado por perodos de tiempo considerables sin que exista prdida de viabilidad; ello de acuerdo a las caractersticas genticas y metablicas de la especie vegetal usada (Redenbaugh et al.,
1988). Las semillas sintticas tambin
tienen la propiedad de proporcionar un
sistema rpido, barato y universal para
propagar material lite. Con igual objetivo, ha sido tambin posible la encapsulacin con alginatos de pices caulinares
de varias especies, que se mantienen
viables por perodos prolongados, utilizando para ello bajas temperaturas
(Lisek y Orlikowska, 2004). Con este
propsito, la encapsulacin puede ser
complementada con posterior criopreservacin en N 2 lquido, que en el caso
de suspensiones celulares embriognicas
de cultivares y patrones de injerto de
Vitis spp., dan respuestas de sobrevivencia muy satisfactorias (Wang et al.,
2004).
Figura 4.5. Encapsulacin de embriones somticos de

C. pubescens en alginato. Izquierda, mantenidos a 25C
en placas tapadas con agar. Derecha, mantenidos a 4C
por 30 das. La baja temperatura deshidrata los geles y
reduce la viabilidad de los embriones encapsulados.
87
LIMITACIONES DE LA TCNICA
Variacin somaclonal
La variacin somaclonal es un fenmeno que se ha observado en protoplastos,
clulas en suspensin y explantes de hojas, junto a otros tipos de material. Consiste en el aparecimiento, sin mediar
causa conocida, de efectos diversos que
pueden ser tanto heredables como no
heredables. Comnmente, la variacin
fenotpica y genotpica en las plantas regeneradas, se observa al derivar de algn cultivo celular (Larkin y Scowkroft,
1981). Se asume que pueden acontecer
cambios de carcter gentico y epigentico leves, en uno o ms cromosomas.
Los cambios genticos asociados con variacin somaclonal, corresponden a mutaciones de punto, cambios en el
cariotipo, cambios crpticos asociados
con rearreglos cromosomales, secuencia
alterada del nmero de copias, de elementos transposables, crossing-over somtico, intercambio de cromtidas hermanas, amplification de DNA y delecin
(Jain y De Klerk, 1998). Al respecto, los
cambios de algunos caracteres en algunas variantes, han sido referidos a
locus particulares con cambios en un
solo gen (Dennis et al., 1987). La respuesta puede ser diversa, pudiendo manifestarse tan simplemente en cambios
de expresin de pigmentacin, o en forma de una alta frecuencia de variacin
en varias caractersticas hortcolas, como de resistencia a enfermedades. As,
variantes somaclonales en el cv. de papa
Russet Burbank, presentan diferencias en
el crecimiento (de tipo compacto), cambios en la fecha de floracin y maduracin del tubrculo, en las caractersti-
88
cas del tubrculo y requerimientos de

fotoperodo del cultivo. Igualmente, algunos variantes somaclonales evidenciaron resistencia a pestes como Alternaria
solani y a Phytophtora infestans (Sheppard et al., 1980). En lamos, variantes
somaclonales de rboles hbridos mostraron tolerancia aumentada al herbicida
solfometuron-metil (Michler y Haissig,
1988). Cambios en filotaxis han sido atribuidos igualmente a variacin somaclonal en olivo (Caas et al., 1992). A pesar
de que el concepto de variacin somaclonal apareci en la literatura en el ao
1980, en el perodo de 10 aos, numerosos reportes referidos a especies frutales,
evidenciaron la generalizacin de este fenmeno como una nueva fuente de variabilidad (Hammerschlag, 1992).
El material derivado con caractersticas
diferentes al material donante, se ha denominado como protoclones y si derivan de callo, como calliclones. Es
comn encontrar variacin en la capacidad morfognica en callos que se han
mantenido por largo tiempo en subcultivo; el riesgo de induccin de variacin
somaclonal en las plantas derivadas de
estos es bastante frecuente, afectando
tambin el origen del explante (Negrutiu
y Jacobs, 1978) y tratamientos iniciales
de 2,4-D en su condicin embriognica.
En callos de algunas especies mantenidos en forma indiferenciada (sin hormonas), puede ocurrir mayor inestabilidad
gentica (Orton, 1984). La variacin
somaclonal tambin se observa en las
clulas provenientes de una misma hoja
(Brand y Lineberger, 1992), las cuales al
ser tratadas con enzimas degradativas de
la pared celular, presentan volmenes
diferentes en suspensin, debiendo ser
idnticos (Larkin y Scowkroft, 1981;

Hammerschlag, 1992). Es comn que los
brotes de novo regenerados a partir de
dichas clulas, muestren las diferencias
atribuibles a variacin somaclonal, consistente en la variacin del patrn isoenzimtico de varias enzimas, entre ellas,
peroxidasas, aminoaspartato-transaminasas, como se ha reportado en papas
(Figura 4.6) (Jordan et al., 1991). Como
resultante de la variacin somaclonal,
existen regenerantes y productos variados como ser, plantas de tomate con frutos de color amarillo o naranja, con resistencia al hongo Fusarium y con cambios estructurales morfolgicos a nivel
del pedicelo. Dichas respuestas estn
adscritas a cambios en los cromosomas
N 3 y 10 para la pigmentacin y N 11
para los otros dos caracteres (Evans, comunicacin personal). Existen muchas
especies donde igualmente se ha demostrado la existencia de variacin somaclonal; especialmente en tabaco, caa de
azcar, banana y Pelargonium, donde se
gener a travs de esta va una variedad
Figura 4.6. Variacin somaclonal mediante

formacin de brotes a partir de hojas en dos
clones de papa (Solanum tuberosum).
nueva. La seleccin y deteccin de variantes somaclonales, especialmente en

especies leosas, puede ser realizada en
microsporas o clulas haploides en caso
que los genes de utilidad sean expresados a nivel celular; entre ellos, aquellos
que codifican para tolerancia al estrs,
resistencia a algunos herbicidas y fitotoxinas (Bonga et al., 1987).
Hiperhidratacin (Vitrificacin).
Como se ha advertido anteriormente, por
diversas razones del medio y del tipo de
explante, un desorden fisiolgico de
"hiperhidratacin" se produce en las clulas del explante, con lo que aumenta
la presin de turgencia celular. Adicionalmente, tambin ocurre la lignificacin y menor pigmentacin de rganos, como por ejemplo, de nuevos brotes (Kevers et al., 2004). El fenmeno se
asocia a un mal funcionamiento de las
clulas estomatales y defectos en la
constitucin de las paredes celulares
de las clulas epidrmicas. Al mismo
tiempo, estomas hiperhdricos evidencian la presencia del polisacrido callosa, que tambin se presenta en callos y
tejidos heridos, pero que no est presente en estomas de hojas normales (Ziv y
Ariel, 1992). Lo contrario ocurre con el
nivel de inositol (Zimmerman y Cobb,
1989). El exceso de agua en las clulas
provoca comnmente problemas en respuestas de diferenciacin y deformaciones a nivel tisular (Debergh et al., 1992;
Kevers, et al. 2004). Este tipo de plantas
son extremadamente difciles de manipular para su adaptacin a condiciones
de vivero y ha significado prdidas de
hasta un 60% en algunos cultivos durant e l a m i c r o p r o p a g a c i n c o m e rc i a l
(Paques, 1991). El funcionamiento
89
estomatal tiende a normalizarse a medida que se produce la aclimatizacin,

aunque en algunos casos, las hojas no
son funcionales y debe esperarse la
brotacin de yemas con nuevo desarrollo foliar expresando endurecimiento
adaptativo al ambiente (Hammerschlag,
comunicacin personal). Para evitar este
fenmeno, varios factores deben considerarse y ser evaluados para cada cultivo, entre ellos: evitar condiciones de
cultivo deficientes, ajustar la humedad
relativa ptima alrededor del explante,
favorecer la transpiracin del explante,
ajustar los potenciales hdricos del medio y evaluar la composicin de macro
y micronutrientes en el medio, junto con
la concentracin de agar. Se han usado
con xito varios productos comerciales
que inhiben fuertemente este efecto,
como lo son el agente anti-vitrificante
EM2, un gel que contiene pectina (MGel) y extractos de polisacridos en algas marinas, algunos muy eficientes en
el cultivo de varias especies/hbridos de
Eucalyptus spp. normalmente muy afectados por este fenmeno (Whitehouse et
al., 2002). La aclimatacin implica adems, correcto funcionamiento fotosinttico, metabolismo de carbono y aumento de enzimas de accin antioxidante
contra especies activadas de oxgeno,
t a l e s c o m o H 2 O 2 , O 2 * - y O H * ( Va n
Huylenbroeck y Debergh, 1996).
OBSERVACIONES FINALES
Paralelamente al avance del conocimiento sobre el potencial morfognico
y capacidad regenerativa de diferentes
tipos de explantes de variadas especies,
se evidenci un substancial progreso
con el desarrollo de la tecnologa del
DNA recombinante. Con ello, se esta-
90
blecieron bases fundamentales sobre la

regulacin, expresin y recombinacin
de genes. Lo anterior posibilitara, que
a mediados de la dcada del 80, la
aplicacin de la ingeniera gentica, pudiera vincularse y emplearse directamente con el mejoramiento no convencional en especies vegetales de importancia econmica. Sin embargo, cabe
destacar que si bien hoy da es posible
insertar y expresar un sinnmero de
genes forneos en plantas y modificar
stas genticamente en forma permanente, la tcnica de transformacin y su xito, sigue dependiendo de la expresin
de la totipotencia celular del explante
experimental usado (protoplasto, clula
en suspensin, explante multicelular), y
de su potencial morfognico in vitro, segn la especie, conducente a la regeneracin exitosa de una planta frtil y/o
que mantenga estables durante su
ontogenia y descendencia los caracteres de los genes insertos y/o modificados. Dichos aspectos no siempre han
sido resueltos sin necesidad de estudios
particulares, por ejemplo, se requiri de
un largo perodo de investigacin para
hacer exitosa la transformacin en varias gramneas (Vasil, comunicacin personal) y otro tanto en lo concerniente a
especies leosas, forestales y/o recalcitrantes. En los captulos siguientes, se
muestra el potencial de las herramientas que ofrece la tecnologa de DNA
recombinante, la posibilidad de insertar
genes junto a su deteccin a travs de
i n g e n i e r a g e n t i c a y m a rc a d o r e s
moleculares en plantas superiores.
Un segundo punto que es importante
resaltar, se refiere al hecho que los parmetros generales conducente al crecimiento, diferenciacin, morfognesis y
regeneracin establecidos sobre la base

de algunas soluciones nutritivas, de relaciones hormonales entre unos pocos
compuestos y la adicin de suplementos a los medios, es suficiente o tan universal en cuanto a requerimiento
metablico. Ello permite alcanzar respuestas regenerativas en clulas, tejidos
y rganos de las especies ms diversas,
especficas y particulares, sobre las cuales no se tienen a priori, mayores antecedentes fisiolgicos. As, han sido
exitosos esfuerzos particulares realizados en diferentes pases a fin de lograr
definir condiciones para iniciar respuestas inductivas y regenerativas de especies relevantes a su flora endmica en
particular. La composicin de los varios
medios nutritivos y addenda hormonales sustentan as la regeneracin/propagacin y saneamiento exitoso de muchas especies, gneros o familias que
hasta ahora han sido de menor inters y
por ello menos conocidas en sus requerimientos y respuestas. As pueden ser
recuperadas a tiempo varias especies, las
que adems de su endemismo, poseen
valor intrnseco como germoplasma,
condicin de extincin, importancia
cultural y/o comercial y que a veces tan
escasa y nicas en el mundo. Ello es
particularmente frecuente en varios pases del continente americano, donde
ocurre sobreexplotacin descontrolada
con prdida irreversible de especies apenas descritas. Tomando como un ejemplo la condicin de Chile, considerando una extensin longitudinal de 4000
Km. (diferentes latitudes), con grandes
variaciones altitudinales y aislamiento
geogrfico, se tiene una flora con un alto
grado de endemismo. De all, resulta
que, muchas especies relevantes, nicas
de la Regin, son recursos valiosos con
propiedades medicinales, ornamentales,

frutales, forestales y/o culturales, que
han formado parte de la cultura y vida
de los habitantes pre-colombinos. Con
dicha valoracin, se han emprendido a
la fecha, varios estudios conducentes a
obtener respuestas regenerativas en tales especies, asociado al inters en el
patrimonio gentico, recuperacin de
germoplasma olvidado y material vegetal de gran valor, por hoy ya considerado en programas de mejoramiento a nivel nacional e internacional.
Entre los gneros y/o especies chilenas
relevantes, donde ya se cuenta con antecedentes de respuestas regenerativas
se han reportado las siguientes: Allium
spp. (Muoz, et al., 1988; Tapia, 1996),
Aloysia spp. (Arancibia, 2002), Alstroemeria spp. (Lyon, 1991), Annona cherimola (Jordan et al, 1990; 1991, Camacho, 1991), Brassica spp. (Campos et al.,
1993), Corynabutilon spp. (Rodriguez,
1997), Cyphomandra betacea (Obando
et al., 1992; Obando, 1995, Obando y
Jordan, 2001), Drimys winteri (Jordan y
Corts, 1981; Jordan, 1999), Euphorbia
spp. (Mancinelli et al., 1993), Fabiana
imbricata (Schmeda, et al., 2004),
Fragaria chiloensis (Mieres, 1997),
Fuchsia spp. (Banda, 1998; Chvez,
2002), Gevuina avellana (Grinbergs et
al., 1986), Gomortega keule (CaldernBaltierra et al., 1993), Haplopappus spp.
(Norambuena, 2001), Ipomoea batatas
(Tapia et al., 1997), Jubaea chilensis (Cabello, 1990), Lapageria rosea (Jordan et
al., 1983; Seeemann, 1983), Leucocoryne spp. (Briones, 2003), Nothofagus
spp. (Jordan y Velozo, 1996; Pedraza,
2000; Cardemil, 2002), Pitavia punctata
(Araneda, 2002), Pouteria lucuma
(Jordan y Oyanedel, 1992; Jordan et al.
91
1994), Prosopis spp. (Jordan y Balboa,

1985); Puya spp. (Campos,1995),
Quillaja saponaria (Jordan y Roveraro,
2004), R h o d o p h i a l a s p p . ( B a s u a l t o ,
2001; Lever, 2001; Ferrando, 2002),
Solanum muricatum (Jordan, 1996),
Solanum tuberosum (Jordan et al., 1991;
Leppe, 1993), Solidago chilensis
(Schmeda et al, 2005), Sophora toromiro
(Iturriaga et al, 1994; Jordan et al.,
2001), Triticum aestivum (Hewstone et
al., 1990; 1992), Ugni molinae (Avendao, 1998; Martnez, 2002), Ullucus
tuberosus (Jordan, et al. 2002).
Se asume que la comunidad cientfica
reconoce la importancia de este patrimonio y concuerda que es necesario
conservar la biodiversidad, protegiendo
los recursos nativos a la par del proceso
productivo.
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TECNOLOGA DEL DNA RECOMBINANTE
CAPTULO 5
TECNOLOGA DEL DNA

RECOMBINANTE
INTRODUCCIN
a dcada de los setenta represent

una revolucin en todos los laboratorios del mundo. Fue durante esta poca, en la que todos los conocimientos
de la biologa molecular surgieron rpidamente a su aplicacin masiva. Todo
esto, debido al inmenso fondo de conocimientos que se vena generando desde los aos de la post-Segunda Guerra
mundial. El avance cientfico en reas
como la gentica, bioqumica, biologa
celular y la fsico-qumica, convergieron
en la aparicin de la tecnologa del DNA
recombinante. Esta tecnologa, se estableci cooperativamente en los laboratorios de Stanley Cohen, Paul Berg y Herbert Boyer. De esta forma, genes especficos comenzaron a ser aislados (lo que
se conoce como clonamiento) y manipulados (proceso de sub-clonamiento), de
forma tal de hacerlos funcionales fuera
de su fuente de origen, lo que se lograba generalmente en esa poca, en bacterias.
Para entender cmo se lleg a esta revolucin, revisaremos algunos elementos que sern clave para entender la tecnologa del mejoramiento gentico por
transgenia en plantas.
Humberto Prieto E.
EL FUNCIONAMIENTO
BSICO DE UN GEN.
Estructura del material gentico.
En 1953, James Watson y Francis Crick
publican un detallado modelo de la estructura del DNA, la molcula hereditaria de la vida. Se saba, por trabajos ya
realizados por Phobeus Levene, que el
DNA estaba compuesto por grupos fosfato unidos a grupos de azcar del tipo desoxirribosa, los que a su vez estaban unidos a una base nitrogenada. Esta base
puede ser de un grupo de cuatro posibles: dos del tipo purina (adenina (A) y
guanina (G)) y dos del tipo pirimidina (timina (T) y citocina (C)). El conjunto constituido por un grupo tri-fosfato, un azcar y una base nitrogenada, se denomina nuclesido. Para formar una cadena
de DNA, los nuclesidos son unidos entre s, en serie. Esto quiere decir, desde
un fosfato hacia un azcar y luego al
fosfato siguiente, enlace repetido a travs de toda la cadena y denominado
fosfodister, formando una hebra simple
del DNA. Una vez insertados y formando esta cadena simple, los nuclesidos
tri-fosfato se denominan nucletidos, o
simplemente bases nucleotdicas (Figura
5.1). Comnmente, el tamao o largo del
DNA es referido en trminos de bases de
nucletidos o simplemente bases. De esta
forma, el DNA puede variar su tamao
desde unas pocas bases, algunos miles de
nucletidos (kilobases) o megas de
nucletidos (megabases).
99
NH 2
O
O
NH
N
O
FOSFATO
H3C
CH2
H
H
H
ADENINA
O
N
NH
TIMINA
NH 2
GUANINA
NH2
N
OH H
AZCAR
CITOSINA
Figura 5.1. Nuclesidos tri-fosfato: Adenina, Timina, Guanina y Citosina

se unen al grupo azcar en la estructura bsica del DNA. A su vez, estos
se unen con unidades similares mediante el grupo fosfato.
Inicialmente, Levene predijo que el DNA

tena una secuencia repetitiva de nucletidos, por ejemplo AGTCAGTC. Sin
embargo, se intua que el DNA deba ser
inteligente y este ordenamiento repetitivo no cumplira con la misin de llevar toda la informacin que necesita la
clula y los organismos vivos. Adems,
ya se haba demostrado por Erwin Chargaff, que las abundancias relativas de los
cuatro nucletidos en distintas clulas,
tanto eucariontes como procariontes, no
estaban en una razn estequiomtrica
(1:1:1:1). Ms bien, estos resultados indicaban que, sorprendentemente, el
contenido de G era similar al de C y,
correspondientemente, el contenido de
A era muy prximo al contenido de T.
En forma casi simultnea, Linus Pauling,
trabajando en el Cal Tech, desarrolla una
poderosa herramienta: la cristalografa
de rayos X. Watson y Crick tomaron los
procedimientos que Pauling utilizaba en
sus estudios de estructura de las protenas cristalizadas y los aplicaron al DNA.
Cuando un grupo de rayos X son dirigidos hacia un conjunto de tomos cristalizados y chocan con ellos, estos son
desviados de forma tal que colisionan
entre s, generando puntos de diferentes
intensidades al ser colectados en una
100
pelcula fotogrfica. Maurice Wilkins y

Rosalind Franklin realizaron este tipo de
experimentos con preparaciones de
DNA semi-cristalino, obteniendo imgenes claves para que Watson y Crick interpretaran los patrones de difraccin de
estas molculas. Ellos realizaron mediciones y clculos desde estas fotografas
(autorradiografas), fascinados por la simetra que ellas mostraban. As finalmente, se aventuraron a postular que el
DNA tena una estructura de doble hlice (dos hebras de DNA), con los grupos
fosfato orientados hacia fuera de esta
hlice. Tambin, determinaron las dimensiones bsicas de esta estructura,
como ancho y ngulo de alguno de los
enlaces entre los grupos que componan
los nucletidos.
Pese a estos resultados, estos estudios no
podan informar cmo ambas hebras de
DNA estaban unidas. Pauling, con gran
conocimiento de qumica orgnica y de
estructura de protenas, haba propuesto
el modelo de una triple-hlice. Sin embargo, este modelo no era compatible
con los resultados inferidos de los estudios de difraccin de rayos X. Fue entonces cuando Watson lig los antecedentes de la existencia de los puentes de hidrgeno, un tipo de enlace en el que se
De esta forma, la estructura del DNA

basa su estabilidad en dos tipos de enlaces bsicos: a) el enlace fosfodister
del grupo azcar con el grupo fosfato en
la cadena lineal de una hebra del DNA
y b) la interaccin mediante puentes de
hidrgeno entre las bases nitrogenadas
de cada nucletido de dos hebras de
DNA. El nmero de puentes de hidrgeno es proporcional a la fuerza con que
ambas bases interactan, por lo que la
interaccin GC es ms fuerte que la
interaccin AT. Crick postul que, segn
la estructura observada, haban ciertos
ngulos y distancias entre los grupos
qumicos, que sugeran que en la doble
hlice ambas hebras deban orientarse
en forma antiparalela. Es decir, la orientacin qumica entre los enlaces formados por los grupos fosfato y los grupos
OH del azcar del esqueleto lineal de
comparte un tomo de hidrgeno entre dos tomos con cierta densidad de

electrones, como lo son el nitrgeno (N)
y el oxgeno. l analiz cada posibilidad
de unin entre los nucletidos mediante
estos enlaces. Adems, ya conoca las
medidas bsicas del DNA y, apoyado en
estos antecedentes, concluy que exista
una interaccin de este tipo entre las bases G (una base fsicamente grande) y C
(una base pequea), mediante tres puentes de hidrgeno entre tomos de los anillos de las bases nitrogenadas, y entre A
(base grande) y T (base pequea), mediante dos puentes de hidrgeno entre los
tomos del anillo de las bases. Este modelo se llam de apareamiento de bases y
estaba en completo acuerdo con las proporciones estequiomtricas obtenidas por
Chargaff y con las medidas deducidas de
la difraccin de rayos X (Figura 5.2).
N
H-N
GUANINA
-H
CITOSINA
N
H-
N-
TIMINA
O
ADENINA N
N-H
PUENTES DE
HIDRGENO
-H
Figura 5.2. Enlaces de hidrgeno formados por los grupos N, H y O. En estas

interacciones, el hidrgeno est en realidad siendo "compartido" por los otros
dos tomos. Las dimensiones obtenidas en la difraccin de Rayos X fueron
coincidentes con las distancias que tericamente ofrecen los puentes de
hidrgenos entre G (una base grande) y C (una base pequea). De la misma
forma, estas medidas coincidan para enlaces entre A (base grande) y
T (base pequea). De esta forma, entre G y C existen tres nubes
electrnicas tipo puente de hidrgeno y entre A y T, dos.
101
una hebra, deba ser inversa a la que tienen las bases en la hebra complementaria. As, el DNA es un riel de trenes que
se ha torcido, con los grupos azcar y
fosfato formado los rieles y con las bases nitrogenadas y sus puentes de hidrgeno formando los durmientes. Ambos
rieles son opuestos en direccin y los
durmientes siempre son complementarios: A aparea con T y G aparea con C.
Flujo de la informacin biolgica.

Una vez conocida su estructura, la
replicacin del DNA pas a ser la siguiente pregunta. Ya Watson y Crick haban
adelantado la idea de que cuando una
clula se divide, su material gentico es
replicado y para esto, la doble hebra de
DNA deba separarse. Este modelo se llam de replicacin semiconservativa.
Meselson y Stahl, en 1958, realizaron importantes experimentos para demostrar la
forma en la que el DNA se replica. Ellos
hicieron crecer en un tubo, bacterias
Escherichia coli (E. coli) en presencia de
15
N, un istopo pesado del N, para que
incorporaran este elemento en sus bases
A, T, G y C; a este llamaron tubo de experimentacin #1 (tubo #1). Posteriormente, trasladaron una fraccin de bacterias
a un nuevo medio (tubo #2), el cual slo
contena N y no el istopo pesado. Esperaron el crecimiento de las bacterias y repitieron la operacin anterior dos veces
ms, generando un tubo #3 y un tubo #4,
siempre utilizando N (Figura 5.3). Extrajeron muestras de DNA de las cuatro preparaciones bacterianas y evaluaron el contenido de nitrgeno en el DNA de stas.
Este anlisis se realiz mediante la formacin de gradientes de sedimentacin en
soluciones salinas, las que se generaron
por centrifugacin a alta velocidad. La
102
idea fue separar este DNA segn su peso

o densidad, debido a la incorporacin de
15
N y su reemplazo con N. El DNA extrado del tubo #1, mostr que todo este material era ms pesado que aquel DNA aislado de las bacterias crecidas en el tubo
#4. Aquellas bacterias que crecieron inicialmente en 15N y que luego se cambiaron a un medio sin istopo (tubo #2),
mostraron tener una banda intermedia a
las dos primeras preparaciones (tutbo #1y
tubo #4). El tubo #3, mostr poseer tanto
bandas livianas (al igual que el tubo #4) y
bandas intermedias (similar al tubo #2) (Figura 5.4). Estos resultados engranaron perfectamente con el modelo semiconservativo propuesto por Watson y Crick
para la replicacin del DNA, en donde
ambas hebras son separadas y cada una
sirve de molde para su hebra complementaria, generando dos dobles hebras, donde una hebra de cada par es sintetizada
de novo y la otra es mantenida. Fue Arthur
Kornberg quien encontr, en forma casi
simultnea a los experimentos de
Meselson y Stahl, la enzima (una protena
con actividad biolgica) encargada de
hacer este trabajo dentro de la clula, a la
que llam DNA polimerasa (DNApol).
Kornberg desarroll sistemas in vitro de
replicacin del DNA, con extractos de E.
coli y los cuatro nucletidos; eso s, utilizando uno de ellos, T, marcado con tritio
(3H, un istopo radiactivo del hidrgeno).
De este modo, l pudo medir la radiactividad incorporada en forma de 3H, al DNA
que se iba sintetizando por accin especfica de la DNApol. Posteriormente, este
mismo investigador descubri que en estas bacterias, la DNApol no era una sino
tres, siendo la DNApol III la encargada
preferentemente de la replicacin
semiconservativa del genoma de la bacteria.
Figura 5.3. La replicacin del DNA es semiconservativa. Primero se hizo

crecer bacterias en nitrgeno 15 (tubo # 1), desde donde se tom una alcuota y se sembr en el tubo #2 que tena nitrgeno 14. Este se dej crecer
nuevamente y de l se sac una nueva alcuota para sembrar en el tubo #3.
Finalmente, se hizo lo mismo para terminar con el tubo #4, tambin en
nitrgeno 14.
Figura 5.4. Gradientes de sedimentacin de DNA . Las bacterias que crecieron

en los tubos con nitrgeno 15 y 14 se lisaron y su DNA se deposit en una
gradiente de cloruro de cesio. Se centrifug y as el DNA lleg a su punto de
equilibrio de densidad. El DNA extrado de las bacterias del tubo#1 se ubic
en un punto ms abajo que en el resto de los DNAs de los otros tubos. En el
tubo#4, el DNA se ubic por encima de las otras preparaciones. El DNA del
tubo#2, se ubic exactamente en la mitad de #1 y #4. Y el DNA del tubo#3,
present dos bandas, la media y la superior. Con esto, se demostr que el
nitrgeno 15 en el DNA bacteriano se fue "diluyendo" a travs de las
generaciones. Las ubicaciones equidistantes, permitieron inferir
que el modelo de replicacin era semiconservativo.
La transmisin de la informacin desde

la molcula de DNA hacia molculas
efectoras como las protenas, fue tambin establecida por Francis Crick, bajo
la idea de un Dogma Central para el flujo de la informacin a travs de una
molcula transportadora. Tal mediador
surgi de inmediato debido a su abundancia en el citoplasma celular, el cido ribonucleico (RNA). Al igual que el
DNA, el RNA posee un esqueleto otorgado esencialmente por enlaces entre un
grupo azcar y un grupo fosfato, pero
esta vez las azcares provienen de un
103
grupo llamado de las ribosas, en vez de

las desoxirribosas, como en el DNA. El
RNA utiliza las mismas bases nitrogenadas, excepto que T es reemplazada
por uracilo (U). Como se mencion, el
DNA es una macromolcula doble hebra, en contraste, el RNA es usualmente
hebra simple. La existencia del RNA
como molcula transportadora de la informacin planteaba la existencia de
otras molculas accesorias, que realizaran funciones de adaptadores moleculares. En efecto, para cada aminocido,
debera existir un adaptador especfico.
Esta idea, se desarroll en forma paralela e independiente de Crick por Paul
Zamecnik, quien en 1953 desarroll un
sistema in vitro para sintetizar protenas
a partir de extractos de hgado de rata.
En estos sistemas, Zamecnik fue capaz
de distinguir cuerpos voluminosos
adosados a las cadenas peptdicas (se
llama pptido a una cadena de hasta 20
aminocidos) que se estaban sintetizando. Estos cuerpos se llamaron posteriormente ribosomas. Con la ayuda de
Mahlon Hoagland, este mismo grupo
encontr enzimas asociados a los
ribosomas y en 1955, se pudo definir
que los aminocidos eran unidos primero a otro RNA antes de ir a formar una
protena. Estos RNAs solubles se llamaron RNA de transferencia (tRNA).
Inicialmente se pens que el RNA asociado a los ribosomas era la molcula
utilizada como molde para la sntesis de
protenas. Pero el grupo formado por
S y d n e y B r e n n e r, F r a n c o i s J a c o b y
Mathews Meselson, descartaron pronto
al tRNA como molcula de la informacin y demostraron la existencia de un
tercer tipo de RNA, altamente inestable,
que llevara esta informacin desde el
104
DNA. Ellos evaluaron la replicacin de

un bacterifago (virus que infecta bacterias) en bacterias, utilizando la idea de
poder distinguir entre los ribosomas y
tRNA aportados por las bacterias y el
nuevo material generado por el fago para
su replicacin (aqu es necesario recalcar que la replicacin de los fagos implica la sntesis de sus protenas utilizando la maquinaria de la misma bacteria).
Los experimentos de este grupo consistieron en hacer crecer bacterias en un
medio con istopos pesados de C y N
( 13C y 15N). Luego, estas bacterias se sacaron de estos medios y se infectaron
con fagos en presencia de un tercer
nucletido, 32 P. Una vez producida la
infeccin y un tiempo antes de la lisis
de las bacterias por parte del fago, se
procedi a la extraccin de RNAs y
ribosomas y su separacin por gradientes
de densidad. Las fracciones correspondientes a ribosomas completos y a
ribosomas desmantelados en sus subunidades (producto de la separacin),
mostraron todas poseer los istopos 13C
y 15N pero no 32P (Figura 5.5). Esto implicaba que los ribosomas haban sido
sintetizados antes de la infeccin con el
fago. Al analizar la existencia de 32P en
las fracciones observadas, ste se detect en la zona donde se encontraban los
ribosomas completos y tambin en el
fondo del tubo (Figura 5.7, derecha); este
ltimo material, al ser estudiado, se describi como un RNA distinto a los conocidos, el que se llam RNA mensajero (mRNA). El mRNA vino a ser la pieza
faltante del rompecabezas que era el
Dogma propuesto por Francis Crick y se
reconoci como la molcula molde para
la sntesis de protenas, la que adems,
estaba de alguna forma interactuando
con ribosomas completos (Figura 5.6).
Figura 5.5. Descubrimiento del RNA mensajero. Se hizo crecer bacterias

en un medio con istopos pesados de C y N (13C y 15N). Luego, stas se
sacaron de estos medios y se infectaron con fagos en presencia de un tercer nucletido, 32P. Luego se procedi a la extraccin de RNAs y ribosomas
y su separacin por gradientes de densidad. Las fracciones
correspondientes a ribosomas completos y a sub-unidades ribosomales
(artefacto tcnico de la separacin), mostraron poseer 13C y 15N pero
no 32P. As, los ribosomas haban sido sintetizados antes de la infeccin
con el fago. El 32P se encontr en la zona correspondiente a los
ribosomas completos y tambin en el fondo del tubo (tubo a la
derecha). Al ser estudiado, ste se describi como RNA mensajero.
Figura 5.6. Dogma Central. El RNA es transcrito a RNA, del cual existen tres
tipos: rRNA, RNA ribosomal que participa en la estructura de los ribosomas y
tambin tiene funciones en la traduccin; tRNA, RNA de transferencia, que
posibilita la traduccin a protenas mediante el acoplamiento de
aminocidos; y mRNA, RNA que contiene el mensaje para la
sntesis de la protena en el proceso de traduccin.
105
As, el Dogma Central estableci que la

informacin para generar una protena
estaba codificada en el DNA, el cual
utilizaba como molcula mediadora al
mRNA, la que con ayuda del tRNA y
ribosomas, generara finalmente las protenas. La codificacin utilizada por el
DNA para informar de la formacin de
una protena especfica vendra a ser
dilucidada en 1961, cuando Marshall
Niremberg y Johann Matthaei, demuestran que un aminocido es codificado
por tres nucletidos ledos en el mRNA
por las molculas de traduccin. Al ordenamiento y uso de esos grupos de tres
nucletidos del mRNA para ubicar un
aminocido especfico se llam codn,
generndose de este modo el cdigo
gentico, en donde grupos de codones
serviran para posicionar determinados
aminocidos. Finalmente, fue Phil Leder,
quien demostr que cada codn es reconocido en el mRNA utilizando para
ello el tRNA, el cual proporciona a travs de su estructura, tres bases complementarias a dicho codn. Entonces en
el tRNA existen los anticodones, que
reconocen especficamente un codn en
el mRNA, existiendo un tRNA especfico para cada uno de los 20 aminocidos.
Partes de un gen.
En 1950 Fred Sanger fue el primero en
determinar la secuencia de aminocidos
de una protena, demostrando que los
51 aminocidos de la insulina, siguen un
orden especfico. Sin embargo, para poder entender cmo esta secuencia ordenada de aminocidos derivaba de su
molde, el DNA, se requiri de 27 aos
ms. En la dcada de 1970, el grupo de
Rich Roberts en el Cold Spring Harbor
Laboratory, se dedic a trabajar activa-
106
mente en el desarrollo de nuevas herramientas para la tecnologa del DNA

recombinante. Ellos realizaron importantes experiencias basados en la capacidad de separacin y re-asociacin de las
hebras de DNA, debido a la ruptura y
generacin de los puentes de hidrgeno
entre las bases complementarias. Las
cadenas simples de DNA son posibles de
separar y unir nuevamente en virtud de
la temperatura. Segn esto, si se tuviera
hebras simples de DNA, mediante la
manipulacin de la temperatura, se puede hacer que hebras complementarias se
unan nuevamente. El grupo de Roberts
desarroll importantes experimentos de
hibridacin entre mRNA y DNA
bacterianos. Estos experimentos, permitieron establecer que para un gen
bacteriano, el mRNA y el DNA que lo
sintetizan son colineales, es decir, se
aparean o hibridan completamente,
siendo la secuencia del DNA exactamente complementaria a la del mRNA
generado por sta. Sin embargo, al realizar los mismos estudios de reasociatividad en eucariontes, observaron
la formacin de estructuras de lazo entre un mRNA y su correspondiente preparacin de DNA. Estos lazos mostraron
corresponder a zonas en el DNA que ya
no existan en el mRNA. En 1977, se
determin que en eucariontes no todas
las secuencias del DNA son transcritas
a mRNA para que este genere una protena. De este modo, los genes en
eucariontes estn compuestos por dos
tipos de secuencias: a) secuencias que
codifican efectivamente para la protena que se expresa, llamadas exones y b)
secuencias que son procesadas y
escindidas en el mRNA, llamadas
intrones. Los exones corresponden a secuencias que generarn directamente la
cadena de aminocidos correspondientes a la protena o pptido y los intrones

son secuencias que se presentan en el
gen originalmente, intercaladas entre los
exones y que son procesadas en el n-
Promotor
Exn 1
Intrn 1
cleo de la clula, para formar un mRNA

que generar finalmente la protena. Un
gen original, es decir, con intrones y
exones, se denomina gen genmico (Figura 5.7).
Exn 2
Intrn 2
Exn 3
Terminador
Figura 5.7. Un gen eucarionte est constituido tanto por secuencias que no
codifican finalmente para una protena (intrones), como para aquellas que
lo hacen (exones). Adems, existen secuencias que ordenan que un gen
active su transcripcin (produccin de RNA), denominadas secuencias
promotoras y, por contrapartida, secuencias que ordenan que se
termine esta expresin, denominadas secuencias terminadoras.
TECNOLOGA DEL DNA

RECOMBINANTE.
Herramientas para manipular genes:
Los plasmidios.
La posibilidad de aislar un determinado
fragmento de DNA y manipularlo, es el
final de dcadas de estudio en distintas
reas de la ciencia. El conjunto de estos
aportes es conocido hoy como biologa
molecular. Una herramienta importantsima en biologa molecular la constituyen DNAs circulares extracromosomales
(no genmicos) bacterianos, denominados plasmidios (Figura 5.8). Los plasmidios poseen un sistema de replicacin
de su DNA que es autnomo, por lo que
se pueden multiplicar independientemente de cmo lo hace el genoma de la
misma bacteria en que se encuentran. A
diferencia de los experimentos de Meselson y Stahl, quienes aislaron y evaluaron la integracin de 15N a purificaciones
de DNA total de bacterias, los plasmidios
presentan una ventaja tcnica en extremo importante para su trabajo en labo-
Figura 5.8. Un plasmidio. DNA circular

extracromosomal que se utiliza en biologa
molecular como herramienta de multiplicacin
de genes. En determinadas secuencias de estos
plasmidios (denominados sitios mltiples de
clonamiento), se pueden introducir secuencias
o genes de inters, los que sern multiplicados
por las bacterias que lo posean, de forma
independiente de su genoma, por poseer
un origen de replicacin autnomo.
107
ratorio, como lo es la posibilidad de

purificarlos para trabajarlos de una forma independiente del DNA genmico.
En general, los plasmidios son entidades
genticas con un tamao molecular relativamente pequeo, alcanzando slo
unos pocos miles de nucletidos de DNA
(alrededor de 3.000 bases), en comparacin con los cientos de miles de bases
que pueden alcanzar los cromosomas o
genomas bacterianos. Esta posibilidad
de purificacin y su tamao reducido,
los hacen excelentes herramientas para
introducir, en determinadas regiones de
ellos, fragmentos especficos de DNA
que sean de inters. De esta forma, los
plasmidios son estructuras circulares discretas de DNA, que se multiplican dentro de las bacterias y que pueden servir
como un sistema de amplificacin de
genes que son introducidos dentro de
ellos, debido a su tamao apropiado.
de ser cortada por estas enzimas, produciendo dos tipos de productos: a) fragmentos cuyos extremos generados en el
sitio de corte son adhesivos ("sticky") (Figura 5.9a) y b) fragmentos cuyos extremos generados en el sitio de corte pueden ser romos o planos ("blunt") (Figura
5.9b). El corte de un fragmento de DNA
con una enzima de restriccin especfica, generar siempre los mismos fragmentos tras su digestin, con el mismo
tipo de extremo en la zona de corte y
siempre en la misma secuencia
palindrmica. Por ejemplo, una enzima
de restriccin llamada EcoRI, cortar
siempre cualquier fragmento de DNA
que tenga la secuencia GAATTC, rompiendo el enlace entre los nucletidos
G-A y generando fragmentos adhesivos.
XXXX G A T A T C XXXX
Clonamiento.
En la dcada de 1970, Rich Roberts y
Phil Sharp, del Cold Spring Harbor
Laboratory, desarrollaron las primeras
herramientas de la biologa molecular
moderna, las endonucleasas de restriccin o enzimas de restriccin. En lneas
generales, el aislamiento de un gen o un
segmento especfico de DNA se realiza
mediante protenas que son capaces de
cortar especficamente el DNA. Estas
protenas se conocen con el nombre de
enzimas de restriccin, las que reconocen secuencias blanco que se denominan secuencias palindrmicas o
palndromes (Figura 5.9).stas, en lneas
generales, corresponden a secuencias de
4 6 nucletidos que son reconocidas
y cortadas en el enlace fosfodister. De
esta forma, la doble hebra de DNA pue-
108
XXXX C T A T A G XXXX
a
XXXX G A
XXXX C T A T
T A T C XXXX
A G XXXX
b
XXXX G A T
A T C XXXX
XXXX C T A
T A G XXXX
Figura 5.9. Secuencia palindrmica.

Secuencia de reconocimiento para enzimas
de restriccin. stas, luego de detectar
secuencias especficas de este tipo, cortan
el DNA con dos posibilidades: a) generando
dos fragmentos escalonados con extremos
cohesivos o b) generando dos fragmentos
con extremos lisos o romos. Cada enzima
de restriccin reconoce solo un sitio
palindrmico especfico.
Estos fragmentos de DNA que son digeridos, pueden volver a ser pegados
por otra enzima, que se llama DNA
ligasa. Esta ligasa de DNA unir fragmentos correspondientes a DNAs digeridos que sean adhesivos complementarios, vale decir, cortados con una misma enzima de restriccin. En el caso de
fragmentos romos, la ligasa los pegar
tambin, pero en esta operacin no se
requiere que los fragmentos hayan sido
producidos por la misma enzima de restriccin, sino slo que sean romos o planos. En la prctica, la ligacin mediada
por la DNA ligasa es ms eficiente para
DNAs con extremos adhesivos que la de
DNAs con fragmentos romos.
Si en dos reacciones por separado se
digieren, con una misma enzima de restriccin, un DNA genmico y un DNA
plasmidial (de forma tal que el plasmidio
es cortado slo en un sitio), se puede
mezclar estos DNAs digeridos y la mezcla someterse a una reaccin de ligacin
con la enzima DNA ligasa. Producto de

esto, se tendr mltiples posibilidades de
la reaccin de ligacin, siendo la de inters aquella en donde el plasmidio ha
insertado un fragmento genmico, generando as lo que se llama plasmidio recombinante y que se refiere a un plasmidio en el que se insert efectivamente
el fragmento de DNA de inters (Figura
5.10)(Buchanan et al., 2001).
Genes quimricos y cassettes de

expresin.
Discutamos ahora el uso de los genes en
biotecnologa. El aislamiento o clonamiento de un gen y su uso, necesitan no
slo tener un plasmidio recombinante
con un gen genmico, o un gen complementario al mRNA (llamado gen
cDNA, el que considera slo la informacin lineal de todos los exones). Cada
plasmidio posee elementos adicionales
que permiten la multiplicacin del gen
de inters y su expresin, ya sea en bac-
Figura 5.10. Plasmidio recombinante.

Plasmidio en el que se ha insertado una o varias secuencias (mostradas en
rojo) de inters para multiplicar. Las flechas indican el sentido en el que
el gen se lee (o transcribe) por la RNA polimerasa.
109
terias, animales o plantas, segn sea el

objetivo final de uso del gen. La secuencia que contiene los codones necesarios
para que un gen origine una protena,
necesita ser activada transcripcionalmente, para que ese DNA se transcriba
a mRNA y luego se traduzca a protena.
Para esto, el extremo 5 del gen debe
tener, a una distancia adecuada (entre
20 a 100 nucletidos), una secuencia
que informe a la RNA polimerasa que
debe transcribir ese gen. Esa secuencia
se denomina promotor y posee toda la
informacin para este proceso y tambin
para la traduccin del mRNA (Goodrich
et al., 1996; Sambrook et al., 1989) (Figura 5.7). Existen promotores que son especficos para bacterias, para animales
y para plantas (Busbry y Ebright, 1994;
Odel et al., 1985; Buchanan et al.,
2001), por lo que un aspecto importante para expresar un gen en una clula
especfica, es insertar un promotor adecuado segn el sistema. Adems, de estas secuencias promotoras, un gen debe
poseer en su otro extremo, el 3, nucletidos que informan a las enzimas celulares del trmino de la transcripcin de
un gen, estas se denominan terminadores (Goodrich et al., 1996) (Figura 5.7).
Tambin se debe considerar que el correcto funcionamiento de los terminadores depender del sistema en donde
se quiera expresar el gen. Cuando se
transforma plantas, las secuencias accesorias (intrones, promotores y terminadores) tienen por funcin asegurar una
correcta expresin del gen (Goodrich et
al., 1996; Buchanan et al., 2001). Los
intrones son secuencias propias de los
organismos eucariontes, cuya utilizacin
en genes quimricos para transforma-
110
cin de plantas, ha demostrado aumentar la estabilidad y expresin del transgn. De este modo, un gen mnimo debe
tener, adems de sus exones, un promotor y un terminador transcripcional apropiado segn el sistema. El conjunto de
estos elementos que permiten la correcta expresin de un gen, se denomina
cassette de expresin. Usualmente, los
plasmidios comercialmente disponibles
estn desarrollados de forma tal que el
gen a clonar es directamente insertado
entre un promotor y un terminador. Esto
quiere decir que el sitio de insercin est
generalmente predefinido y corresponde a una serie de sitios palindrmicos,
denominndose sitio mltiple de
clonamiento (Sambrook et al., 1989).
Dentro de los promotores ms utilizados
hasta hoy en la transformacin gentica
de plantas, est aquel que proviene del
RNA 35S del virus del mosaico de la
coliflor (cauliflower mosaic virus,
CaMV). Este promotor, llamado simplemente 35S 35S CaMV, ha mostrado ser
especialmente fuerte en casi todos los
tejidos de las plantas transgnicas que
se han generado a la fecha. Del mismo
modo, una de las secuencias terminadoras ms utilizadas en el desarrollo de
plantas transgnicas, aunque no con la
omnipresencia del 35S CaMV, es el terminador del gen de la enzima nopalina
sintetasa (nos-ter) de Agrobacterium
tumefaciens. Sin embargo, la gran mayora de los clonamientos de genes, independiente de su uso final, requiere su
paso por un sistema bacteriano, por lo
que el manejo de plasmidios de clonamiento en bacterias, es un requisito bsico de laboratorio.
Transformacin bacteriana.
Una vez ligados los fragmentos de DNA,
dentro de los que se encuentra nuestro
plasmidio recombinante con el gen de
inters, estos son introducidos nuevamente a las bacterias mediante un proceso denominado transformacin bacteriana. La transformacin bacteriana es
un mtodo de fcil desarrollo en el laboratorio, existiendo mltiples procedimientos para hacerlo. Dos de los ms
utilizados son:
a) Transformacin mediante CaCl 2 : en
el que bacterias tipo E. coli son lavadas exhaustivamente primero con
H 2 O estril y finalmente con una solucin de CaCl 2. Este tratamiento se
conoce como elaboracin de bacterias competentes y son bacterias que
estn en una curva ascendente de
crecimiento. De esta forma, las bacterias competentes son puestas en
contacto con el DNA ligado (la mezcla de ligacin anterior en donde interesa slo el plasmidio con el DNA
forneo insertado) y mediante un golpe trmico, generalmente de 42C por
un tiempo breve (por ejemplo 90 seg),
stas incorporan este DNA mezclado.
Si el plasmidio es funcional, es decir, est cerrado, permitir que las
bacterias que lo incorporaron puedan
seguir creciendo en medios selectivos. Para esto, un nuevo factor entra
aqu en juego, los genes de resistencia para la seleccin de las bacterias
efectivamente transformadas. Los
genes de resistencia vienen incorporados en los plasmidios comercialmente disponibles para clonamiento
y sirven como indicador de la incor-
poracin del plasmidio por parte de

la bacteria, pues slo aquellas que incorporan el plasmidio funcional proliferarn en medios selectivos con
antibiticos (Figura 5.5).
b) Electroporacin: en este sistema tambin se preparan clulas competentes (se les llama en este caso electrocompetentes). Esta vez se utiliza una
solucin de glicerol en lugar de
CaCl 2. As, las bacterias electrocompetentes son una solucin de bacterias resuspendidas en glicerol, un
agente que se intercalar en las membranas facilitando la penetracin de
macromolculas, como lo es el DNA
ligado. Una preparacin de bacterias
electrocompetentes es mezclada con
la ligacin de DNA y entonces se
aplica sobre esta mezcla una cada
de tensin, durante un tiempo del orden de los milisegundos. El resultado son bacterias que incorporaron el
plasmidio recombinante, las que tambin son llevadas a seleccin como
sucede con la transformacin por
CaCl 2 .
Deteccin de clones recombinantes.

Como se mencion, las bacterias incorporarn distintos DNAs forneos ligados,
generando diversos clones bacterianos.
Solamente proliferarn aquellos clones
que hayan incorporado plasmidios con
genes de resistencia a antibiticos, lo
que implica que se tendrn poblaciones
de bacterias tanto con el plasmidio original como con el plasmidio recombinante. Para buscar qu clones bacterianos poseen plasmidios recombinantes,
existen varias tcnicas, dentro de las que
111
destaca la deteccin por hibridacin de

cidos nucleicos. Al tener una colonia
de bacterias que poseen un plasmidio
con el inserto, sta puede adherirse a un
filtro y una vez all, ser lisada para as
dejar el plasmidio expuesto. Si se aplica temperatura y/o agentes desnaturalizantes sobre este filtro (por ejemplo
NaOH), se inducir a que el plasmidio
recombinante se separe en cada una de
sus hebras complementarias. Si entonces este filtro se incuba con una solucin en donde se encuentre el mismo
gen de inters (o una parte de l) tambin desnaturalizado, pero que ha sido
marcado con algn istopo (como por
ejemplo 32P), al volver a bajar la temperatura se re-asociarn las dobles hebras
de DNA, pero esta vez se ver favorecida la unin entre el gen marcado o sonda (agregado en exceso para producir
esta condicin) y la hebra complementaria fijada al filtro, proveniente de la
bacteria. Luego este filtro hibridado se
expone a una pelcula sensible a la radiactividad, generndose las manchas
tal como se obtiene en el proceso de
difraccin de rayos X, pero esta vez indicando zonas en donde ha ocurrido la
hibridacin entre el gen marcado y DNA
plasmidial adherido al filtro.
112
REFERENCIAS.
Buchanan, B., Gruissem, W. y Jones, R. 2001.
Biochemistry & Molecular Biology of Plants.
John Wiley & Sons, Somerset, New Jersey,
USA.
Busbry, S. y Ebright, R. 1994. Promoter
structure, promoter recognition, and
transcription activation in prokaryotes. Cell
79:743-746.
Goodrich, J., Cutler, G. y Tjian, R. 1996.
Contacts in context: promoter specificity
and macromolecular interactions in
transcription. Cell 84:825-830.
Odell, J., Nagy, F. y Chua, N. 1985. Identification of DNA sequences required for
activity of the cauliflower mosaic virus 35S
promoter. Nature 313:810-812.
Sambrook, J., Fritsch, E. y Maniatis, T. 1989.
Molecular cloning: a laboratory manual.
Nolan, C. (ed). 2a edicin. Cold Spring
Harbor Lab. Press., New York, USA.
TRANSFORMACIN GENTICA DE PLANTAS
CAPTULO 6
TRANSFORMACIN
GENTICA DE PLANTAS
INTRODUCCIN
ace aproximadamente 150 aos

que Gregor Mendel realiz sus trabajos destinados a establecer cmo determinados caracteres eran traspasados
entre distintas generaciones de plantas
de arvejas. Sin embargo, pasaron ms de
50 aos para que los resultados de
Mendel fueran redescubiertos y explicados de forma tal que as permitieran formular las que hoy se conocen como Leyes de Mendel. Sus experimentos se basaron en la emasculacin de flores de
arveja, lo que consiste en eliminar estambres de stas para poder polinizarlas
manualmente. Esta tcnica es exactamente la misma que desde comienzos
del siglo XX viene siendo utilizada, en
lo que es conocido como mejoramiento
convencional de plantas.
El mejoramiento convencional de plantas utiliza varias metodologas para la
generacin de mejores individuos aprovechables para el ser humano. Estas
metodologas pueden clasificarse en dos
grupos, segn su grado de profundidad
en cuanto a la manipulacin del material gentico. El primer grupo se refiere
a tcnicas en las que no hay un intento
de modificacin de los cromosomas de
los individuos que son utilizados, salvo
la utilizacin sexual de sus gametos. Para que esto sea posible, las especies a
mezclar en busca de mejores individuos, deben ser sexualmente compati-
Humberto Prieto E.
bles. El segundo grupo de tcnicas,

involucra mtodos que inducen modificaciones del material gentico propiamente tal, ya sea generando algn tipo
de mutaciones en los nucletidos del
genoma de una especie parental, o cambiando en la cantidad original de DNA
de ste.
Cada vez que se aplica la manipulacin
sexual a los cromosomas mediante el uso
de los gametos en cruzamientos sexualmente compatibles, estos aportan el 50
por ciento de material gentico. Esto
genera lneas de plantas hijas, que a
su vez pueden ser retrocruzadas varias
veces ms, para enriquecer en un fondo
gentico deseable (por ejemplo el del
parental A), pero adems de mantener
el carcter de inters (por ejemplo el
parental B). De hecho, los experimentos de Mendel jams hubieran tenido los
resultados obtenidos si l no hubiera desarrollado un gran trabajo previo a travs de la generacin de parentales con
un genoma estable y bien conocido en
cuanto al fenotipo que genera (lo que
se denomina lnea pura). Dentro de esta
categora de tcnicas de mejoramiento
tenemos:
a) La seleccin de lneas puras: que consiste en la seleccin de determinados
caracteres que sern retenidos en una
planta individual, procurando un estado homocigoto (presente en ambos
cromosomas) tras varias retrocruzas.
113
b) La hibridacin: en donde diferentes cromosomas son combinados para generar un individuo en un estado heterocigoto. sta es, por lejos, la tcnica de ms
amplio uso en mejoramiento convencional de plantas, pero requiere tener
lneas puras como punto de partida.
Por contrapartida, el otro grupo de tcnicas involucra la modificacin directa
del genoma de una especie de inters,
implica generalmente un proceso al azar.
As, los nuevos individuos son generalmente utilizados, por ejemplo, como dadores de gametos sexuales o, simplemente, son propagados clonalmente a travs
de las tcnicas de cultivo de tejidos (repique simple), vista en los captulos anteriores. Para este segundo tipo de
metodologas, tenemos como ejemplos:
c) La mutagnesis: en donde mediante
la aplicacin de agentes exgenos
(los que pueden ser qumicos o fsicos), se procura el cambio en la informacin gentica del cromosoma.
d) La poliploida: en donde la aplicacin
de agentes qumicos lleva a un cambio en el juego de cromosomas de una
clula, generalmente aumentndolo.
Lejos es la hibridacin de variedades, la
tcnica de mayor utilizacin en mejoramiento convencional de plantas y por
ejemplo, ha impulsado el crecimiento en
la produccin de maz entre 1930 a la
actualidad, en ms de un 600%. La instauracin de lneas parentales puras es
de tal importancia que, notablemente y
como se mencion, Mendel debi generar lneas puras de arvejas con caractersticas bien definidas, tales como color
de flor, forma de semilla, aspecto de se-
114
milla, etc., para luego hibridarlas. De

otra forma, sus resultados jams hubieran sido tales y por ende, nunca explicados.
La aparicin de la tecnologa del DNA
recombinante, presentada en el captulo anterior, permiti ya en 1980, describir y clonar los primeros genes de plantas. Poco despus, se comenzaron a entender las bases moleculares de la interaccin entre bacterias como Agrobacterium tumefaciens y algunos de sus
huspedes vegetales (plantas que lo alojan), interacciones antes hasta entonces
ignoradas. La disposicin de genes aislados, su manipulacin y el entendimiento del sistema de infeccin por A.
tumefaciens, permitieron que en 1983,
se generara la primera planta transformada genticamente, la que expres un
gen de resistencia a un antibitico.
Si bien es cierto que la transformacin
utilizando A. tumefaciens ofreca una
gran herramienta para la introduccin de
genes en plantas, su espectro de accin
se limitaba, en esa poca, al rango de
plantas huspedes al que la bacteria naturalmente poda transferir su DNA a la
planta, es decir, infectar. Debido a esto,
diversas tcnicas se desarrollaron desde
mediados de la dcada de 1980. Entre
ellas, la que ms destac fue una en que
los genes a introducir son depositados
sobre partculas metlicas microscpicas,
las que son dirigidas a una alta velocidad para impactar las clulas blanco
(objetivo). Este sistema de transformacin
se llam gene-gun, pistola gnica o sistema de biobalstica. En las clulas que
sobreviven al impacto, el DNA puesto en
la superficie de las partculas llega al ncleo celular y se incorpora a su genoma.
De esta forma, a comienzos de la dcada de 1990, ya se poda postular que se

contaba con sistemas de transformacin
gentica de potencialmente todas las
plantas de inters agronmico y de forma cotidiana, de plantas consideradas
como modelo para la expresin y estudios de las secuencias externas introducidas, como lo son tabaco y Arabidopsis
thaliana.
Agrobacterium tumefaciens.
A. tumefaciens es una bacteria del suelo
causante de la enfermedad de la agalla de
la corona (o cuello) (crown gall disease)
(Figura 6.1). El estudio a un nivel molecular de la interaccin planta-Agrobacterium, permiti determinar que entre los
numerosos eventos que ocurren en esta
interaccin, uno de los pasos ms importantes es la transferencia de un trozo de
DNA desde la bacteria hacia el ncleo de
las clulas vegetales que son infectadas.
Para entender cmo es este paso de un
trozo de DNA hacia la planta, empezaremos por describir que A. tumefaciens
posee un plasmidio gigante, si se compara con el de bacterias utilizadas en la
tecnologa del DNA recombinante (E.
coli). Este DNA plasmidial se denomina
plasmidio Ti (Figura 6.2), por inductor
de tumores (tumor inducing) y contiene todos los genes responsables de la
enfermedad de la corona de agallas, de
su fenotipo y de este proceso de transferencia de un trozo de DNA a la planta.
Sin embargo, vale la pena sealar que
slo una pequea porcin de DNA del
plasmidio Ti es transferido a la planta,
ste es llamado DNA de transferencia o
simplemente T-DNA.
Figura 6.1. Aspecto de la enfermedad

de la agalla de la corona.
Manifestacin fenotpica de la interaccin
entre A. tumefaciens y una planta
dicotiledonea, sta se debe a la sntesis de
opinas (que proveen una ventaja competitiva
para la bacteria) y fitohormonas (auxinas y
citoquininas, que inducen la proliferacin
celular aumentando el nmero de clulas
que sintetizan opinas).
Genes vir
Borde
derecho
Plasmidio Ti
T-DNA
Borde
izquierdo
Figura 6.2. Plasmidio inductor de tumores o
Ti. Se muestran los cuatro elementos
fundmentales de este DNA circular:
Los genes vir, que aportan toda la maquinaria
de transporte del DNA de transferencia o TDNA. El T-DNA es transportado en forma de
DNA hebra simple, para esto es reconocido
en dos zonas claves, que son repetidas
imperfectas, llamadas bordes
(derecho e izquierdo).
115
Gracias al plasmidio Ti, la bacteria puede sintetizar compuestos aminoacdicos

derivados de arginina, que le permiten
una mejor interaccin con la planta. Estos compuestos se llaman genricamente opinas, las que se pueden clasificar
en: nopalina, octopina y agropina. Cada
plasmidio Ti contiene los genes de sntesis para una clase de opina. Por lo tanto, existen plasmidios Ti con los genes
para la sntesis de nopalinas, otros para
la sntesis de octopinas y otros para la
sntesis de agropinas. De este modo, la
idea de Agrobacterium en su proceso de
infeccin natural de plantas, es sintetizar las opinas que le son tiles para su
desarrollo y esto ocurre en convivencia
plena con la planta infectada. De ello,
se deduce que los genes de sntesis de
opinas estn ubicados en el T-DNA y son
naturalmente transferidos a la planta, de
forma de asegurar la convivencia de esta
interaccin planta-patgeno.
Otra regin de gran importancia dentro
del plasmidio Ti, es la que contiene los
g e n e s q u e o t o rg a n l a v i r u l e n c i a o
infectividad de la bacteria, esta se denomina regin vir (con los genes virA, virB,
virG, virC, virD y virE). Estos genes estn
involucrados especficamente en el mecanismo de activacin de la infeccin
bacteriana y de la transferencia del TDNA a la clula husped (o infectada).
Los genes vir representan la base de la
maquinaria de infeccin de la bacteria,
siendo fundamentales en gatillar la transferencia del T-DNA hacia la planta.
Existe una variante de la enfermedad de
la corona de agalla: la generacin de
pelos radiculares; que es causada por
otra clase de Agrobacterium, el A. rhizogenes. A. rhizogenes posee un plasmidio
116
denominado plasmidio Ri (por root inducing), cuyos genes tambin producen

opinas (preferentemente del tipo agropinas) y tambin posee un sistema de
transferencia de DNA a la clula husped, generando pelillos en la mayora de
las infecciones resultantes, aunque tambin se han visto ejemplos en que este
tipo de Agrobacterium causa agallas del
cuello.
Mecanismos biolgicos involucrados

en la transformacin por
A. tumefaciens.
a) El proceso de activacin y transferencia del T-DNA.
Tal vez uno de los aspectos ms interesantes de la transformacin gentica se
relaciona con los procesos biolgicos
involucrados en la transferencia e incorporacin del DNA exgeno a la clula
vegetal. Como se mencion anteriormente, Agrobacterium tumefaciens posee en su plasmidio Ti un opern (conjunto de genes) denominado vir. Este es
un conjunto de seis grupos de genes que
codifican para todos los productos requeridos en las distintas etapas de la infeccin: a) activacin de la bacteria, b)
generacin del T-DNA apropiado para
ser transferido (formacin del complejo T), c) traspaso del complejo T, d)
ingreso a la clula husped y finalmente su integracin al genoma de ella.
El proceso comienza cuando la bacteria
detecta ciertas seales en su medioambiente y transmite esta informacin hacia su interior. Este paso de informacin
se conoce como transduccin de seales y en general, utiliza dos componente moleculares, una protena sensora en
la superficie de la bacteria y una protena que modula o traduce de la respuesta hacia adentro. En Agrobacterium,
Vir A y Vir G, respectivamente, son las
protenas sensora y moduladora (Figura
6.3). De esta forma, cuando se produce
una herida o dao mecnico en la pared celular vegetal (requisito mnimo para la induccin), se liberan compuestos
fenlicos con un esqueleto carbonado
de un tamao especfico, siendo uno de
ellos el clave: la acetosiringona. Esta
molcula es detectada y sensada en la
bacteria, lo que hace que ella se ligue
frreamente a la clula vegetal utilizando protenas ubicadas en su membrana
(como las protenas ChvA, ChvB, PscA y
Att entre otras propuestas) y por contraparte, reconociendo ligandos de la clula vegetal, los que quedan expuestos
por la herida producida. Los ligandos de
la clula vegetal se denominan compuestos smiles de la vitronectina, por
su estructura similar a este compuesto
conocido en mamferos. La acetosiringona generada por el vegetal induce en el
receptor VirA una reaccin denominada
de autofosforilacin (reaccin tpica de
sistemas de la transduccin de seales
biolgicas), la que hace que un grupo
fosfato se transfiera luego a la protena VirG (Figura 6.3, paso 1). VirG es un
factor transcripcional, es decir, que estimula la transcripcin de un gen a travs de su unin a una zona promotora.
As, los promotores del opern vir en el
plasmidio Ti son activados, generando
la transcripcin del resto de los genes
vir (Figura 6.3, pasos 2 y 3). Al sintetizarse (transcribirse y traducirse) las protenas VirD2 y VirD1 (productos de la
familia de genes virD), ms VirC1 (producto de la familia virC), cortan una sola
hebra del T-DNA y comienzan a sepa-
Figura 6.3. Mecanismo de activacin del

Fragmentos de la pared celular de la
clula vegetal, son reconocidos por la
protena VirA. Esta activacin, causa la
fosforilacin de otra protena ubicada en
la parte interior de la membrana de la
bacteria, VirG. VirG activa la transcripcin
del opern vir, el que permite la sntesis
de varias protenas, como VirD2, la que
reconoce el borde derecho del T-DNA y lo
corta en esa zona. En seguida se produce
la separacin de la hebra cortada (a la vez
se va volviendo a sintetizar la hebra
desplazada), la que es protegida por VirE2
para evitar su degradacin. Este complejo
T es transportado finalmente a la clula
vegetal, a travs de un canal constituido
por otras protenas Vir, como son las del
grupo VirB. En la clula vegetal, VirD2 y
VirE2 sern reconocidas por protenas
receptoras y as, el complejo T llegar
al ncleo y se integrar al genoma.
117
rarla de su hebra complementaria,

unindose covalentemente a sus extremos (Figura 6.3, paso 4). Al mismo tiempo que se produce la separacin y desplazamiento de la hebra simple de TDNA, se replica y reemplaza una nueva
hebra en el plasmidio Ti, quedando ste
intacto hacia el final del proceso de formacin del T-DNA hebra simple (TDNAss). El T-DNAss que se va generando, es rpidamente cubierto y protegido
por mltiples unidades de la protena
VirE2 (Figura 6.3, paso 5), de manera de
evitar su degradacin ocasional (Figura
6 . 3 , p a s o 6 ) . E s t a h e b r a d e T- D N A
recubierta con VirE2, se conoce como
complejo T. Durante todo el proceso,
VirD2 permanece unida covalentemente
al extremo 5 del T-DNA, sirviendo de
mquina de conduccin, ayudada adems por VirE1, para el paso del complejo a travs de un canal intercelular que
une a Agrobacterium con la clula vegetal que va a ser transformada. Este
canal est conformado por principalmente por protenas de la familia VirB
(VirB4 y VirB11) y VirD4.
Una de las caractersticas ms importantes del T-DNA es que est flanqueado por
dos zonas nucleotdicas especficas, que
son secuencias repetidas y directas (Figura 6.4). Es precisamente gracias a estas zonas, comnmente denominadas
brazo izquierdo (ubicado en el extremo
3) y brazo derecho (ubicado en el extremo 5) (Figura 6.2), que las protenas
VirD2 y VirD1 reconocen dnde cortar
el T-DNA para comenzar a formar el complejo T. Uno de los aspectos ms interesantes en la transferencia del T-DNA, es en
la transferencia del T-DNA, donde VirD2
permanece siempre ligada al extremo 5 del
complejo T, haciendo entonces que el brazo derecho del T-DNA sea la zona que se
ve integrada en un cien por cien de las
plantas transformadas. Por el contrario,
existe variada evidencia de que el brazo
izquierdo del T-DNA no es tan perfectamente integrado en el genoma de las
plantas infectadas. Pese a esta falta de
perfeccin en la integracin del extremo
izquierdo, la correcta expresin de los
genes que se desea introducir a una planta especfica no se ha visto alterada.
Figura 6.4. Bordes derecho e izquierdo del T-DNA. Secuencia de estas zonas repetidas
imperfectas. El borde derecho es reconocido por VirD2, activando todo el proceso de
transferencia e integracin al genoma vegetal.
118
b) El paso del T-DNA hacia la clula

vegetal.
No est claro qu protenas acompaan
al T-DNA en su viaje a la clula vegetal
y finalmente al ncleo. Como se advirti ms arriba, un modelo an vlido es
que el complejo T (compuesto por TDNA, VirD2 y VirE2) viaja por el canal,
guiado por VirD2 (Ward y Barnes, 1988).
El rol de VirE2 es menos claro, aunque
es claro que puede unirse a T-DNA hebra simple y protegerlo (Sen et al., 1989).
Existen numerosos experimentos que
han demostrado que el T-DNA slo necesitara ir unido a VirD2 y que podra
pasar en forma separada de VirE2 hacia
la clula vegetal (Gelvin, 2000). En este
sentido, la transferencia del T-DNA hacia la clula vegetal, sera un proceso
bastante parecido a lo que es la conjugacin bacteriana, donde la transferencia de DNA desnudo entre bacterias a
travs de un pili, permite al mismo tiempo la regeneracin del material gentico
en la bacteria de origen, (lo que ocurrira fsicamente cerca del pili (Stachel y
Zambryski, 1986)). Existe una tercera
protena que tambin pasara hacia la
clula vegetal que est siendo infectada: VirF. Su funcin especulativa sera
interactuar con otras protenas de la clula vegetal, para inducir la divisin celular de sta, en conjunto con las fitohormonas producidas por los genes
acarreados en el mismo T-DNA. Este
es un evento sumamente necesario en
los primeros estados de desarrollo de la
infeccin, generando as el fenotipo de
la corona de la agalla. Como puede inferirse, esto es tambin fundamental para
la transformacin con fines biotecnolgicos (Regensberg -Tuink y Hooyas,
1993).
c) Integracin al genoma vegetal.

El proceso de integracin del T-DNA al
genoma vegetal es un ejemplo especfico de un proceso biolgico en el cual
las hebras de DNA dentro de un ncleo,
son intercambiadas o recombinadas; debido a esto, el proceso se llama recombinacin del DNA. La recombinacin forma parte de procesos tan importantes
como la mantencin y divisin celular
(Nam et al., 1998)
- Recombinacin del DNA. Sin duda,
que la supervivencia de las especies est
influenciada por factores tales como una
cuidadosa replicacin del DNA, la reparacin del mismo y su variabilidad. La
recombinacin gentica tiene un rol
muy importante en la evolucin de las
especies, debido al proceso de reordenamiento en las secuencias del DNA para
generar nuevas combinaciones de genes
(Puchta y Hohn, 1996). Estos nuevos
genes permitiran generar nuevos
mRNAs y protenas, y por lo tanto, nuevos y mejores fenotipos. Una etapa muy
activa en cuanto a recombinaciones,
ocurre en la meiosis (etapa del crossing
over), donde la recombinacin del DNA
puede resultar en gametos genticamente distintos, que permitan la produccin de genotipos variados que pueden
ser ms adecuados a un medioambiente
cambiante. Un aspecto esencialmente,
relevante es el rol inmediato que significa la recombinacin del DNA en las
clulas: la reparacin de segmentos daados. Gracias a la recombinacin, una
hebra de DNA (o las dos) que ha sido
daada (en algn segmento del genoma
de cualquier organismo), por ejemplo
por radiacin UV, ser rpidamente detectada y reemplazada por una hebra
119
completamente nueva. Este sistema es

conocido como de recombinacin-reparacin del DNA (Britt, 1996).
Existen tres tipos de recombinacin:
a) Homloga.
b) Sitio especfica.
c) Ilegtima.
- Recombinacin homloga: es aquel
proceso en el que se intercambian dobles hebras de DNA en zonas donde
existe una similitud substancial de las
secuencias (es decir, homologa). Mientras ms largo sea el segmento homlogo, ms posibilidad de recombinacin
habr (Puchta y Hohn, 1996) (Figura
6.5). La recombinacin homloga ha sido explotada ampliamente por el hombre en sus programas de mejoramiento
gentico tradicional de los cultivos (por
ejemplo, en la hibridacin de lneas puras). La recombinacin tanto en clulas
meiticas como mitticas, requiere de
sistemas de protenas que an no son del
todo aclarados. En bacterias, este conjunto de protenas se agrupa con el nombre de protenas Rec (de recombina-
tion), donde RecA es la ms conocida

(Buchanan et al., 2001). En plantas, ya
se han descrito genes homlogos al que
codifica para RecA (o sea, gen recA),
stas se han llamado protenas RAD. En
Arabidopsis thaliana, mutantes que no
reproducen RAD (o rad si se habla del
gen) funcional, no pueden reparar su
DNA cuando se someten a radiaciones
UV (Buchanan et al., 2001, Nam et al.,
1998) (ver ms abajo).
- Recombinacin sitio especfica: este
mecanismo se ha identificado especialmente en E. coli. El DNA de E. coli posee zonas con secuencias que son homlogas al bacterifago . Tras la infeccin,
el fago logra insertarse en el genoma
bacteriano mediante el reconocimiento
de estos sitios homlogos. Las secuencias especficas de reconocimiento y recombinacin se denominan zonas att
(por attachment). Si se habla de las secuencias att del fago , se denominan
zonas attP y si stas son de la bacteria,
se denominan zonas attB. Para la insercin, el fago codifica una protena llamada integrasa (Int), que interacta en
GACTTTAGCACC
CTGAAATCGTGG
GACTTTAGCACC
CTGAAATCGTGG
GACTTTAGCACC
CTGAAATCGTGG
Figura 6.5. Recombinacin homloga. Es el intercambio de dobles hebras

de DNA en zonas donde existe una similitud substancial de las secuencias
(es decir, una homologa). Mientras ms largo sea el segmento homlogo
(mostrado aqu por las secuencias), mayor es la posibilidad de
recombinacin.
120
forma conjunta con un factor bacteriano

de integracin (IHF, integration host
factor). As, todo el DNA comprendido
entre las zonas attP del fago, se integran
entre las zonas attB de la bacteria
(Gardner y Nash, 1986) (Figura 6.6).
- Recombinacin ilegtima: donde se incluyen todos los eventos de recombinacin que no caen en las categoras anteriores. En esencia, este tipo de recambio o integracin entre hebras de DNA
no requiere homologa de secuencias, o
si lo hace, estas son zonas de unos pocos nucletidos de largo. Se postula que
en plantas, existe una importante proporcin de re-ordenamientos del DNA,
que no pueden ser explicados por homologas entre secuencias, asumindose
que la recombinacin ilegtima en plantas en bastante alta (Buchanan et al.,
2001). Un gran ejemplo de recombinacin ilegtima en plantas el la integraDNA fago
cin del T-DNA en el genoma de las

plantas transformadas. El proceso de integracin del T-DNA al genoma vegetal
tiene sus bases en nuestras ya conocidas protenas de Agrobacterium VirD2 y
VirE2, las que en algunos sectores de su
secuencias, poseen sitios que sirven como seales para que se dirijan hacia el
ncleo (Gelvin, 2000), y con ello acarrear al T-DNA unido. Se postula que el
mecanismo de trfico al ncleo vegetal
estara mediado por la interaccin de estas dos protenas bacterianas, proceso
que sera apoyado por protenas de la
planta. Se sabe que VirD2 es fosforilado
en un residuo de serina cercano a su domino de sealizacin nuclear, teniendo
esta fosforilacin un gran efecto en la
eficiencia de transporte al ncleo de la
planta (Gelvin, 2000). VirD2 desfosforilada prcticamente no tendra capacidad de conducir al T-DNA al ncleo.
Secuencia attP
Secuencia attP
Secuencia attP
Secuencia attP
DNA E. coli
Factor de
integracin
bacteriano
Integrasa del fago
Secuencia attP
Secuencia attP
DNA E. coli
Figura 6.6. Recombinacin sitio especfica. El DNA de E. coli posee secuencias que son homlogas al DNA del bacterifago . Tras la infeccin
por parte de este ltimo, las secuencias especficas de reconocimiento y
recombinacin (secuencias attP del fago y attB de la bacteria), son reconocidas por una protena integrasa (Int) del fago, la que interacta con un
factor bacteriano de integracin (IHF) para que todo el DNA comprendido
entre las zonas attP, se integre entre las zonas attB de la bacteria.
121
Se asume que VirD2 juega algn rol en

el proceso de integracin al genoma,
debido a que mutaciones en su estructura alteran la eficiencia de este proceso (Gelvin, 1998; Mysore et al., 2000).
En el caso de VirE2, su rol sera menor,
dado que se ha demostrado que cepas
de A. tumefaciens mutantes que no sintetizan esta protena, muestran una disminucin en su tumorigenicidad (Gelvin, 2000; Yusirov et al., 1994), lo que
sin embargo, no descarta del todo la existencia de problemas en etapas anteriores
a la integracin.
expresin transitoria de estos cassettes,

no requiere la integracin al genoma,
sino slo su presencia dentro del ncleo,
de forma de tener acceso a la maquinaria de expresin de dicho cassette
(protenas nucleares de transcripcin).
Recientemente, algunos experimentos
estudiando la interaccin protena-protena, denominados sistemas de doble
hbridos en levadura, han demostrado
una interaccin fsica entre H2A y VirD2
(Gelvin, 2000, Mysore et al., 1998).
d) Protenas de la planta involucradas en

la integracin.
Debido a su gran tamao, el plasmidio

Ti es en s inmanejable en el laboratorio
y difcilmente podra utilizarse para
clonar directamente genes en l. As,
para transformar una planta mediante A.
tumefaciens, se utilizan plasmidios desarmados tipo Ti. Esto da origen, generalmente, a un sistema en el que dos
plasmidios complementan sus funciones, uno aportando con el opern vir y
el otro aportando el cassette con el gen
de inters. De esta forma, ambos plasmidios en conjunto, complementan las
funciones de un plasmidio Ti normal (Figura 6.7). Estos plasmidios con funciones complementarias se llaman plasmidios binarios. El plasmidio que lleva los
elementos relacionados con el T-DNA,
no posee los grupos de genes encargados de la sntesis de opinas ni los de la
sntesis de fitohormonas (citoquininas y
auxinas). En l se han reemplazado estos, por "cassettes" de expresin de los
genes de inters. Como se ve, existe un
proceso de complementacin de funciones entre ambos plasmidios binarios, los
que en su conjunto, equivalen a tener
un plasmidio Ti funcional, (sin formar el
tumor) y con la ventaja de hacerlos ms
Debido a que la integracin del T-DNA

involucra un proceso de recombinacin
ilegtima, es esperable encontrar que
enzimas vegetales involucradas en el
proceso normal de recombinacin/reparacin del DNA puedan tener participacin en la integracin. Este pensamiento ha llevado a utilizar plantas mutantes
de Arabidopsis thaliana que muestren
una deficiencia en sus sistemas de reparacin de DNA frente a radiaciones. Estas plantas se denominan mutantes rad
(Nam et al., 1998). Se ha descubierto
que histonas (protenas que intervienen
activamente en la formacin de los
cromosomas), especficamente la H2A,
tienen una directa influencia en el proceso de integracin de fragmentos lineales de DNA hacia los cromosomas
(Mysore et al., 2000). Mutantes rad, deficientes en H2A, muestran una eficiencia reducida en la integracin del TDNA, pero no as en la expresin transitoria de genes del cassette contenido
en el vector de transformacin que posee un gen reportero. Como se sabe, la
122
Plasmidios binarios.
Figura 6.7. Racional del uso de A.

tumefaciens en el laboratorio.
Sistema de plasmidios binarios.
Para evitar la manifestacin de la
enfermedad de la agalla de la corona
(producida por la sntesis de opinas),
en el laboratorio se usan plasmidios Ti
desarmados. Esto quiere decir que, se
han desarrollado cepas de
Agrobacterium que tienen un plasmidio
que aporta slo las funciones vir. El
plasmidio con la regin de T-DNA
es manipulado separadamente en el
laboratorio, utilizando todas las tcnicas
del DNA recombinante para introducir
entre ambos brazos, los genes de inters
a expresar en la planta. As, en la zona
del T-DNA, se ponen los cassettes de
expresin de protenas externas y se han
abolido los genes de opinas y
fitohormonas, que propician la
formacin del tumor observado
en la Figura 6.1.
pequeos en tamao, de forma de poder manipularlos adecuadamente en el

laboratorio. Esta estrategia ha permitido
disear cepas comerciales de A. tumefaciens que traen incorporadas el plasmidio que contiene las funciones de virulencia (vir), como ocurre con la cepa
LBA4404, la ms conocida y utilizada
hasta hoy para transformacin de plantas. Esta bacteria posee el plasmidio denominado pAL4404 (al que se llama,
plasmidio Ti residente), con todos los genes vir necesarios para activar un eventual T-DNA que pudiera ser incorporado a la bacteria. El T-DNA es aportado
entonces por otro plasmidio, el que adems posee elementos que le permiten
funcionar como plasmidio lanzadera, es
decir, que funciona tanto en A. tumefaciens como en E. coli. Esta caracterstica, permite que todas las operaciones de
clonamiento de un gen de inters y su
manipulacin para que se exprese correctamente en la planta, son posibles
de realizar en este plasmidio utilizando
bacterias tipo E. coli, tal como si fuera
un plasmidio pequeo y con todas las
herramientas que se pueden aplicar con
la tecnologa del DNA recombinante.
Dentro de las seales necesarias para
este vector binario lanzadera, se encuentran los cassettes de seleccin para
antibiticos y secuencias que permiten
que dicho plasmidio se pueda replicar,
tanto en bacterias tipo E. coli como en
bacterias tipo A. tumefaciens. Tambin
en este plasmidio, se suele incluir el
cassette de seleccin para el proceso
de transformacin propiamente tal, es
decir, la seleccin de las clulas que
efectivamente se han transformado.
Un sistema similar, pero menos usado en
la actualidad, es el denominado de plas-
123
midios integrativos. Este sistema explota

tambin un sistema dual de plasmidios,
con las funciones separadas de la misma
forma anterior. La diferencia con el sistema binario radica en que esta vez se busca reconstituir un plasmidio Ti dentro de
Agrobacterium, a travs de la recombinacin de secuencias homlogas entre
el plasmidio que porta la zona T-DNA y
el plasmidio que tiene la zona vir.
1. Genes reporteros y marcadores.
Cuando se realizan experimentos de transformacin, los explantes (o tejido que se
transforma) que son sujetos al evento, se
conforman por clulas que han sido efectivamente transformadas (las menos) y clulas que no se transformaron eficientemente. Esto ltimo puede deberse a
muchas razones, tales como que en efecto no son clulas transformadas o como
clulas que a pesar de ser transformadas,
es decir que el DNA entr a su interior,
nunca ingresar a su ncleo ni ser incorporado definitivamente a su genoma.
Existen eventos de transformacin en los
que los genes son ingresados al ncleo,
pero estos nunca sern integrados en el
genoma. En este tipo de ensayos, los genes
incluidos en los cassettes de transformacin, son expresados de manera temporal, denominndose eventos de expresin
transitoria y que generalmente duran slo
unos pocos das (por ejemplo, hasta 9
das) para ser finalmente eliminados de la
clula, generalmente por maquinarias de
degradacin cidos de nucleicos que le
resulten extraos.
Cuando se busca generar una nueva variedad de plantas a travs de transgenia,
se busca un evento de transformacin
124
permanente, es decir, la transformacin

estable del tejido blanco. Una forma de
aumentar la certeza de que se ha obtenido clulas establemente transformadas, es el crecimiento selectivo de las
clulas sometidas a transformacin. Este
proceso de seleccin obliga a la utilizacin de cassettes adicionales al de inters, que expresan genes que confieren
alguna caracterstica metablica a la
planta, lo que hace que ella pueda crecer en medios selectivos. Estos cassettes para los genes de seleccin, slo
deben permitir la expresin de dichos
genes en la clula blanco (eucarionte) y
no en microorganismos contaminantes,
como el mismo A. tumefaciens, u otros
que pudieran estar presentes en la transformacin (ex profeso o casualmente).
Los marcadores de seleccin, son genes
que confieren un fenotipo dominante a
las clulas transformadas en comparacin
a aquellas que no lo poseen. Los marcadores de seleccin pueden agruparse en
dos grandes tipos: a) aquellos que confieren ya sea viabilidad o letalidad en
presencia de un agente selectivo en el
medio de cultivo (medio de seleccin) y
b) aquellos que no tienen un efecto evidente en la supervivencia celular, pero
confieren alguna caracterstica fsica
distinguible a las clulas transformadas.
a) Marcadores que confieren viabilidad
o letalidad a las clulas transformadas.
i. Genes de resistencia a antibiticos o
herbicidas: Una de las caractersticas
ms empleadas es la resistencia a antibiticos (por ejemplo kanamicina e higromicina), herbicidas (por ejemplo
Basta) u otras fitotoxinas. En general,
la resistencia conferida a la clula por
este tipo de genes de seleccin, se debe a la codificacin de una enzima

que permite la destoxificacin por
modificacin qumica del txico, a la
sntesis de un agente blanco del txico que sea menos sensible que el silvestre o; a la sobre-expresin de la
protena blanco, haciendo poco significativo el efecto del txico en el medio. El proceso de seleccin de las
plantas efectivamente transformadas,
consiste simplemente en hacer crecer
los explantes transformados en medios
conteniendo estos agentes selectivos
(txicos para clulas normales) en
concentraciones adecuadas. En la actualidad, la utilizacin de genes de resistencia a antibiticos es muy discutida, debido a los posibles efectos secundarios que estos genes pueden
producir al ser ingeridos en alimentos
que utilizan como materia prima a cultivos transgnicos. Esto ha llevado a
la bsqueda y utilizacin de nuevos
genes y estrategias.
ii. Marcadores de letalidad: Ms que en
aplicaciones biotecnolgicas, el uso
de este tipo de marcadores corresponde a ciencia bsica. Un ejemplo de
esto puede ser utilizar un gen que codifique para una protena txica bajo
las rdenes de un promotor que sea
activado slo bajo ciertas condiciones. De esta forma, al darse dicha
condicin fisiolgica o estmulo externo, se producir la muerte celular.
Este tipo de marcadores ha permitido
establecer la tecnologa terminator,
en la que expresando el gen de la barnasa (una ribonucleasa inductora de
macho-esterilidad, originalmente existente en Bacillus amyloliquefaciens;
Denis et al., 1993) en clulas trans-
formadas, la planta transgnica genere una progenie infrtil, eliminando la

posibilidad de escapes, flujo gnico e
incluso de la formacin de progenie.
b) Marcadores visibles.
i. Marcadores histolgicos: Ellos confieren un fenotipo visible en presencia de
un sustrato aplicado exgenamente.
Esto ha dado origen a la utilizacin de
los llamados genes reporteros, los cuales al expresarse dentro de la planta
transgnica, expresan una actividad
biolgica que es fcilmente evaluable
e incluso cuantificable. Dos son las
principales protenas utilizadas; la primera de ellas es la enzima -glucuronidasa (GUS), que utiliza un sustrato
llamado -glucurnido que es incoloro y lo trasforma a un producto coloreado azul, que precipita sobre la misma enzima (Figura 6.8). La desventaja
de utilizar este gen reportero, es que
para realizar la deteccin de GUS, se
debe destruir el tejido transformado,
perdiendo el evento transgnico. En los
ltimos doce a quince aos, ha aparecido un segundo gen, cuya ms importante caracterstica es no requerir esta
destruccin del tejido transformado.
ste codifica para la denominada protena verde fluorescente (green
fluorescent protein, GFP), que se aisl de Aquorea victoria y que tiene la
particularidad de emitir una luz verde
nen cuando es excitada con luz
ultravioleta (Figura 6.9). La utilizacin
de GFP ha permitido generar incluso
procedimientos de obtencin de plantas transgnicas sin la utilizacin de genes de seleccin metablica o resistencia a antibiticos, como los anteriormente mencionados.
125
Figura 6.8.
Genes reporteros.
Expresin de
- glucuronidasa.
La enzima -glucuronidasa (GUS) utiliza un sustrato llamado -glucurnido, que es incoloro y lo trasforma a
un producto coloreado azul que precipita sobre la misma enzima. Cuando una planta es transformada con este gen, el
tejido al ser incubado con el sustrato en las condiciones adecuadas, se tornar azul en
el lugar donde se expresa. En la fotografa izquierda, se muestran embriones de poroto
disparados con partculas de oro recubiertas con DNA que codifica para la enzima
reportera (izquierda misma fotografa) y sin DNA (derecha misma fotografa). La barra
corresponde a 1 milmetro. A la derecha, vista de una semilla de pepino (Solanum
muricatum) despus de ser disparada, observndose los pellets de partculas (ver
biobalstica).
Figura 6.9.
Genes reporteros. Expresin
de protena verde fluorescente.
El gen de la "green fluorescent protein" o
GFP, que se aisl de la medusa Aquorea
victoria y que tiene la particularidad de
emitir una luz verde nen cuando es
excitada con luz ultravioleta. GFP ha
permitido generar incluso procedimientos
de obtencin de plantas transgnicas sin la
utilizacin de genes de seleccin
metablica o resistencia a antibiticos,
como los mencionados en el texto. En las
fotografas se muestra una hoja de pepino
que ha sido infectada con A. tumefaciens
(arriba, la expresin de GFP (emisin en
verde nen) en las zonas cercanas al dao
mecnico generado y el color rojo causado
por la excitacin de la clorofila por luz UV).
Al medio, se ve un acercamiento a esta
situacin, definindose claramente los
bordes de las clulas transformadas.
Abajo, expresin estable de GFP en hojas
de plantas de vid obtenidas en INIA - La
Platina. Al ser iluminadas con luz UV,
la clorofila emite color rojo (izquierda).
Sin embargo, en clulas transformadas,
la emisin de GFP logra sobreponerse con
su tpico color verde nen (derecha).
126
ii. Marcadores morfolgicos: Corresponden a genes que codifican para

protenas que generan, en las clulas
transformadas, un cambio fenotpico
fcilmente evaluable. Si estos marcadores se ubican bajo las rdenes de
un promotor que responde a un estmulo qumico del medio (un agente
inductor), la aplicacin de este agente permitir la seleccin de las clulas transformadas. Este inductor puede ser luego quitado y as las clulas
seleccionadas pueden recobrar su
morfologa normal. Actualmente, estos sistemas son de amplio uso biotecnolgico y se conocen con el nombre de MAT (del ingls multi-autotransformation). Son sistemas que
utilizan genes metablicos que permiten seleccionar positivamente las
clulas o el tejido transformado. Los
sistemas MAT de uso cada vez ms
popular (Ebinuma et al., 2001; Endo
et al., 2002), se pueden agrupar segn el tipo de enzima o elemento
metablico de seleccin: a) aquellos
que usan el gen de la enzima isopentenil transferasa (ipt) (Kunkel et al.,
1999; Wabico et al., 1989) y b) aquellos que usan los genes rol A, B y C
de A. rhizogenes (Kiyokawa et al.,
1994). Al ser transformadas con ipt,
las clulas que incorporan el gen entran en una activa proliferacin, debido a que la enzima cataliza la sntesis de citoquininas. Por otro lado, las
clulas transformadas con los genes

rol, son capaces de inducir la formacin de pelillos radicales areos, debido a un aumento en la sensibilidad
a auxinas. De esta forma, ambas plantas o clulas transformadas, podrn
ser distinguidas fenotpicamente de
sus contrapartes no transformadas.
Los sistemas MAT poseen adems,
elementos que permiten su escisin
del genoma de las clulas o plantas
transformadas (ver ms abajo).
BIOBALSTICA
La interaccin natural entre Agrobacterium y las plantas, inicialmente se crey
limitada al espectro de las dicotiledneas. Debido a esto, en 1991, John Sanford y su grupo, en el Campus Geneva
de la U. de Cornell, crearon un sistema
de alta presin que fuera capaz de impulsar pequeas partculas de metales considerados inertes para la clula, como oro
o tungsteno. Estas partculas se recubren
con genes quimricos, de forma que ellos
lleguen al ncleo y se incorporen al genoma de la clula (Figura 6.10). Se asume
que las partculas, una vez ingresadas a
la clula, desprenden el DNA que se ha
depositado sobre su superficie, debido a
la accin de los lquidos intracelulares.
Este proceso esencialmente fsico, permiti superar el inicial impedimento prctico de transformar especies monocotiledneas en un laboratorio.
Figura 6.10. Principio de la biobalstica. Consiste en precipitar DNA sobre la superficie de partculas, las que sern lanzadas luego a alta presin sobre tejidos o explantes, de forma que el
DNA llegue al ncleo de las clulas que los constituyen.
127
Una de las ventajas del sistema de

biobalstica, es que prcticamente se
puede utilizar en cualquier sistema vegetal, quedando as abierta la posibilidad de transformacin in situ de clulas
diferenciadas, sin necesidad de un cultivo in vitro previo o de regeneracin posterior, como lo requiere la metodologa
a travs de A. tumefaciens. Esto ha permitido, por ejemplo, la transformacin
de clulas meristemticas apicales con
una eficiencia aceptable (0,007 a 0,003
%). Sin embargo, esta eficiencia se puede aumentar (por ejemplo hasta 1%) a
travs de la induccin de procesos de
organognesis en la regin transformada, mediante la utilizacin de citoquininas (por ejemplo bencilaminopurina)
para generar multibrotacin (Ver Captulos 2-4).
METODOLOGAS
DE TRANSFORMACIN
1. Transformacin mediada por
Como se mencion anteriormente, la
factibilidad de instaurar sistemas de transformacin utilizando A. tumefaciens generalmente involucran un gran esfuerzo
en desarrollar lneas celulares con alta
capacidad de regeneracin. Una vez obtenida una lnea celular especfica, se
desarrollan los experimentos de transformacin, los que en trminos generales
constan de tres etapas bsicas (Figuras
6.11a y 6.11b):
a) Infeccin: en la que se ponen en contacto los explantes celulares con la solucin de bacteria. Esta etapa es de
una duracin variable en la que se
128
procura el reconocimiento entre las

protenas receptoras de la bacteria y
los ligandos de la pared celular vegetal. Para la infeccin se pueden requerir tiempos breves de slo algunos segundos (como por ejemplo para tabaco), tiempos intermedios de un par de
minutos (como por ejemplo para vides) o, tiempos bastante prolongados
(como por ejemplo para durazno). De
la misma forma, la concentracin ptima de bacteria (medida como OD600)
vara entre 0,1 y 1,0. Una vez realizada la infeccin, los explantes son extrados de las solucin bacteriana y el
exceso de bacterias es eliminado cuidadosamente mediante un papel filtro. Entonces ya se puede dar paso a
la segunda etapa.
b) Co-cultivo: se denomina as a la etapa que implica todos los eventos de
generacin del complejo-T y traslado a la clula vegetal. El tiempo suficiente para el co-cultivo es dependiente del modelo de trabajo, encontrndose generalmente suficiente
unas 48 horas, en medios propicios
para que ambos componentes, bacteria y explante, interacten efectivamente generando la transformacin.
c) Seleccin y regeneracin del explante transformado: esta es la etapa ms
larga de todo el proceso de transformacin, pudiendo durar tantos meses como el sistema de regeneracin
de la clula vegetal disponga. Una
vez pasado el tiempo de co-cultivo,
ya no interesa ms la presencia de
Agrobacterium en el mismo medio en
que estn las clulas transformadas.
Para eliminarlo, se utilizan antibiticos (usualmente cefotaxime), aplicn-
dolos por un determinado tiempo

hasta que ya no existen evidencias de
la bacteria en el medio de seleccin
y regeneracin. Como este nombre lo
indica, tambin es un medio de seleccin, por ello, junto con eliminar
al Agrobacterium, se pretende no estimular la multiplicacin y regeneracin de clulas no transformadas.
Hasta la fecha, los agentes de seleccin ms utilizados los constituyen
antibiticos como la kanamicina,
cuyo efecto final es precisamente eli-
minar todas las clulas vegetales que

no hayan incorporado los genes deseados desde el plasmidio. Sin embargo, la aparicin de nuevos agentes de
seleccin, como la misma GFP (Figura 6.11b) o genes que confieren caractersticas metablicas especficas
a la planta, han permitido la generacin de nuevos vectores de transformacin en los que se excluyen genes
de resistencia a antibiticos, cuya utilizacin se ha cuestionado debido a
sus posibles efectos en el humano.
Figura 6.11a. Transformacin mediada por Agrobacterium tumefaciens.

En la etapa de infeccin, se ponen en contacto los explantes celulares con la
solucin de bacterias, para dejarse en este estado por un perodo de tiempo
denominado co-cultivo (usualmente entre 48 y 72 horas). Esto da tiempo para
la infeccin y transformacin propiamente tal. Luego viene una etapa de seleccin y regeneracin del explante transformado, en donde se permitir el
desarrollo slo de las clulas efectivamente transformadas, lo que se evala
utilizando diversos genes marcadores, ya sea de resistencia a antibiticos,
metablicos o reporteros (ver texto). Luego de la seleccin, las plntulas
promisorias son traspasadas a tierra y finalmente recuperadas.
Figura 6.11b. Sistema de regeneracin de Nicotiana benthamiana. Utilizando GFP (protena

fluorescente verde) es posible hacer el seguimiento de la transformacin por visualizacin del
verde nen en los callos transformados (1). Luego, estos son rescatados (2) y llevados a re-diferenciar nuevamente, hasta la obtencin de plntulas (3), que son finalmente enraizadas (4).
129
2. Transformacin mediada por

biobalstica.
El sistema de biobalstica consta esencialmente de una cmara de vaco y un
sistema de acumulacin de presin, para
el que se utiliza un gas inerte para las
clulas (por ejemplo helio) (Figura 6.12).
Esta presin ser la que impulsar las
partculas que han sido recubiertas con
el plasmidio o cassette de inters (Figura 6.10). Las etapas ms importantes
en el proceso de biobalstica son:
a) Preparacin de las partculas: donde

se precipita el DNA de inters en introducir a la planta, utilizando para
ello CaCl 2 , espermidina y etanol. Todos estos elementos corresponden, en
esencia, a elementos que desplazan
agua desde las hebras de DNA produciendo as la precipitacin sobre la
superficie de las partculas.
b) Preparacin de las membranas portadoras: stas son membranas circulares de aproximadamente 1,5 cm de
dimetro sobre las que se deposita
Figura 6.12. Principio del sistema de biobalstica.

Las partculas con DNA precipitado en su superficie, son depositadas sobre una membrana
transportadora (1). Esta membrana es invertida, de modo que las partculas quedan mirando
hacia abajo (2). De esta forma, son posicionadas en la pistola (4). Para hacer el disparo,
se acumula presin en el cilindro del sistema (3). Esta presin es rota mediante la ruptura
de membranas que especficamente retienen el gas dentro del cilindro (barra negra en (3)).
As, cuando se decide, stas se rompen, generando la onda expansiva que acelera la
membrana portadora de las partculas. Este viaje dura hasta que la membrana es detenida
por una rejilla de detencin, pero que permite el paso de las partculas con el DNA,
de modo que stas llegan a impactar al tejido blanco (5).
130
una cantidad adecuada de partculas

preparadas (con DNA en su superficie) (Figura 6.12, paso 1). El material
de estas membranas es extremadamente resistente, comercialmente
conocido como Kapton (de Dupont).
c) Preparacin del dispositivo porta
membrana: que corresponde a un
anillo que tiene como objetivo retener a la membrana portadora, de
manera invertida (exponiendo las
partculas hacia abajo (Figura 6.12,
paso 2) y adaptarla al sistema de inyeccin de gas (Figura 6.12, paso 4).
d) Armado del sistema de retensin: tras
ubicar las membranas portadoras del
DNA, a una distancia que puede variar entre 0,5 a 1,5 cm, se ubica una
rejilla de parada para la membrana
portadora. La idea es que, tras el impulso dado por la presin de gas, la
membrana portadora acelere esta distancia y se detenga sbitamente. De
este modo, la membrana ser retenida
por la rejilla de parada y las partculas

seguirn su viaje hasta impactar con el
tejido blanco (Figura 6.12, paso 5).
e) Produccin de la onda de impulso:
Como se mencion, se utiliza un gas
considerado inerte para la clula, el
helio. Para generar la presin de gas,
ste se acumula en un cilindro en el
que uno de sus extremos est abierto y
habilitado para poner membranas de
ruptura. La funcin de estas membranas de ruptura es retener la presin deseada de trabajo y luego, al inducir su
ruptura por accin mecnica (por
ejemplo con una aguja), liberarla generando la onda expansiva necesaria
para impulsar las membranas portadoras (Figura 6.12, paso 3).
Existen numerosos sistemas y variantes
comercialmente disponibles en cuanto a
biobalstica. El costo aproximado de este
tipo de equipos puede ascender a US$
5.000 US$ 10.000, dependiendo de su
automatizacin y origen (Figura 6.13).
Figura 6.13. Vista externa de sistemas comerciales de biobalstica.

Vista exterior del aspecto que tienen dos aparatos de biobalstica. Izquierda,
pistola desarrollada por DuPont semiautomatizada. Derecha, sistema
desarrollado por EMBRAPA-CENARGEN, Brasil. Ambos sistemas se encuentran
en distintos laboratorios de nuestro pas, como son INIA, PUC y Bioforest.
131
ELIMINANDO
LOS GENES INDESEADOS
Existen tres formas de generar la cotransformacin:
La mayora de las tcnicas de transformacin introducen un gen de seleccin

que confiere resistencia a antibiticos,
junto con el gen de inters. Una de las
metas ms deseadas en el camino del
mejoramiento de plantas mediado por
transgenia, es la obtencin de nuevos
cultivos con un mnimo de modificacin
de su fondo gentico, siendo en efecto
sta una de las grandes ventajas de la
transgenia en comparacin con los cultivos mejorados sexualmente (mejoramiento convencional).
Utilizando dos plasmidios binarios,

cada uno en una cepa de A. tumefaciens distinta (De Neve et al., 1997).
En casi todos los casos, el gen de resistencia incorporado en forma accesoria

ya no es til una vez que se ha superado la etapa de seleccin de los clones
transformados, siendo deseable eliminarlo desde las plantas transformadas y seleccionadas. En el caso de los genes insertados en el genoma nuclear de las
plantas, se han ideado varias aproximaciones para retirar estos genes de resistencia al antibitico.
1. Sistemas de remocin de los genes

de resistencia.
i. Co-transformacin: consiste en la
transformacin en paralelo de dos loci
distintos y lejanos, uno conteniendo el
cassette para el gen de inters y el
otro, conteniendo el cassette con el
gen de resistencia a antibitico. Ambos
cassettes se insertan en estos sitios distantes, pudiendo ser separados posteriormente por segregacin de las progenies
de las transformantes, mediante mejoramiento convencional (retrocruzas).
132
Utilizando dos plasmidios binarios,

ambos presentes en una sola clula de
A. tumefaciens (Daley et al., 1998).
Utilizando un plasmidio binario, con
dos T-DNAs distintos, uno para cada
cassette (Komari et al., 1996).
Aunque la eficiencia de estos sistemas
est dada por muchas variables, se ha
observado un amplio rango de variacin
entre la frecuencia de transformacin
con uno y otro cassette. Existen numerosos factores que pudieran explicar
esta diferencia de efectividad, como el
estado de los explantes vegetales y su
efecto sobre la adhesin de la bacteria
a su superficie, en el caso de dos bacterias y dos cassettes. Sin embargo, la
utilizacin de dos T-DNAs o dos plasmidios binarios dentro de una misma clula de A. tumefaciens, ha rendido buenos resultados.
Por otra parte, se ha observado que existen diferencias entre los niveles de segregacin que se obtienen en las plantas transgnicas al utilizar cepas de A.
tumefaciens sintetizadoras de nopalinas
o de octopinas. Las primeras, son bacterias que propician la insercin de TDNAs ms ligados genticamente o, lo
q u e e s l o m i s m o , e n l o c i c e rc a n o s
(Ebinuma et al., 2001).
ii. Recombinacin sitio-especfica: este
proceso explota un fenmeno descrito
en el bacterifago llamado P1, que funciona de un modo bastante similar a lo

descrito para la recombinacin de secuencias att del bacterifago y E. coli.
En el caso de P1, tenemos la existencia
de sitios especficos en un DNA, denominadas secuencias loxP, los que son reconocidos por una enzima que los corta
y promueve su escisin, la recombinasa
Cre. Por lo tanto, cualquier secuencia
que est rodeada de dos sitios loxP, ser
escindida si existe en forma paralela la
expresin de Cre (Odell et al., 1990). Si
un cassette de expresin de resistencia a antibiticos es flanqueado por dos
sitios loxP, bastar la expresin de la
protena Cre en la misma planta para
producir la salida de dicho cassette
(Figura 6.14). En mejoramiento vegetal,
esto se realiza mediante dos formas: a)
la re-transformacin con un cassette
de expresin de Cre de una planta ya
transgnica (Dale y Ow, 1991), b) por
Secuencia
lox
cruzamiento de la lnea de plantas

transgnicas con una lnea que previamente ha sido transformada con el cassette Cre (Ebinuma et al., 2001). La eficiencia de este sistema es relativa, observndose que es la lnea portadora de
Cre el factor que otorga esta variabilidad de resultados (Russel et al., 1992).
En similitud al sistema Cre/lox, el ya descrito sistema de recombinacin basado
en zonas attP de fago y attB de E. coli,
tambin tiene su aplicacin en plantas
transgnicas. Recientemente se ha generado un sistema de plasmidios binarios
que explotan la recombinacin homloga
entre dos sitios attP, prescindiendo absolutamente de los elementos Int e IHF, pero
incluyendo en forma adicional en dicho
plasmidio, una secuencia de nucletidos
estimuladora de eventos de recombinacin (Zubko et al. 2000).
Secuencia
lox
Promotor Resistencia a Terminador

antibitico
(ej. Kanamicina)
Cassette de inters
T-DNA insertado
al genoma vegetal
Cre
Secuencia
lox
Cassette de inters
T-DNA insertado
al genoma vegetal
Figura 6.14. Sistemas de eliminacin de genes marcadores o de resistencia a

antibiticos. Sistema Cre/lox. Es un sistema descrito en el bacterifago P1. ste
tiene sitios especficos en su DNA, denominadas secuencias loxP, que son reconocidas por una enzima (codificada por el mismo fago) que las corta y promueve su
escisin, la recombinasa Cre. Al insertar un cassette de resistencia a antibitico
flanqueado por estas secuencias, una planta que tenga la capacidad de producir la
recombinasa Cre, escindir dicho cassette del genoma de la planta transgnica.
133
iii. Sistema de elementos transposables:

que utiliza elementos genticos saltarines que explotan la recombinacin ilegtima. Estos elementos especficos se
llaman secuencias mviles o transposones, descritos por primera vez en eucariontes por Barbara McClintock a travs
de sus trabajos en maz. Ella identific
este tipo de secuencias y las denomin
Ds (del ingls dissociation)(Rhoades,
1984). Los elementos Ds, son secuencias
repetitivas invertidas y se pueden escindir de un sitio genmico y ubicarse en
otro espontneamente. Eso s, bajo la
presencia de otro elemento, denominado Ac (del ingls activator). Ac proporciona las actividades enzimticas
necesarias para este salto de un lugar a
otro (Fedorof, 1989). Estas enzimas se
Secuencia
Ds
denominan transposasas. De esta forma,

cassettes flanqueados por secuencias
Ds, en presencia de los genes de transposasa ubicados en Ac, generarn el
salto de dicho cassette hacia un
locus distante del originalmente utilizado para la transformacin (Figura 6.15).
As, se permite realizar la segregacin
de ambos cassettes mediante retrocruzas posteriores (Goldsbrough et al.,
1993), de la misma forma como se hara
en un sistema de co-transformacin.
Todos estos sistemas tratan de remover
los genes de seleccin utilizados. Sin
embargo, como contrapartida, se han generado tambin sistemas que utilizan la
incorporacin de un marcador metablico positivo.
Secuencia
Ds
Promotor Resistencia Terminador

a antibitico
(ej. Kanamicina)
Cassette de inters
T-DNA insertado
al genoma vegetal
Ac
Cassette de inters
T-DNA insertado
Secuencia
Ds
Promotor
Resistencia
a antibitico
(ej. Kanamicina)
Secuencia
Ds
Terminador
Transposn que
sali a otro locus
Figura 6.15. Sistemas de eliminacin de genes marcadores o de resistencia

a antibiticos. Sistema con elementos transposables de maz Ac/Ds. Los
transposones Ds son secuencias repetitivas invertidas y se pueden escindir
de un sitio genmico y ubicarse en otro espontneamente. Esto requiere
la presencia de otros elementos proteicos, que se encuentran en genes
denominados Ac. De esta forma, un casete de resistencia a antibiticos
flanqueado por secuencias Ds, en presencia de los genes de transposasa
ubicados en Ac, harn que dicho cassette salte hacia un locus distante
del originalmente utilizado para la transformacin, y que permitir
entonces realizar la segregacin de los cassettes de inters
y de resistencia mediante retrocruzas.
134
2. Sistemas que incorporan un

marcador positivo.
Como se mencion anteriormente, el uso
de marcadores de seleccin positiva (sistemas MAT) ha despertado gran inters,
considerando su potencialidad con respecto a la obtencin de plantas transgnicas libres de "cassettes" de seleccin. Todos los MAT utilizan, en adicin
a los genes o grupo de genes de seleccin, los elementos transposables de
maz Ac/Ds o bien secuencias de recombinacin sitio especficas denominadas
R/RS (que provienen de un plasmidio llamado pRS1 de Zygosaccharomyces rouxi
(Ebinuma et al., 2001)). En ambos casos,
los elementos Ac y R/RS se usan para
flanquear el "cassette" de expresin del
gen marcador metablico, el que es escindido luego de la seleccin primaria,
al expresar la recombinasa respectiva.
El elemento transposable Ac ha mostrado poseer la capacidad de re-ubicarse
en el genoma en el 90% de los eventos
de transformacin, mientras que en el
10% de los eventos restantes, no se reinserta, generando la eliminacin permanente del cassette de seleccin. En
el caso del sistema de recombinacin R/
RS, la recombinasa R reconoce dos secuencias especficas contiguas RS, haciendo posible la eliminacin de un
cassette de seleccin flanqueado por
estos elementos.
PLANTAS TRANSGNICAS
DE PRIMERA GENERACIN.
Las pasadas dcadas han marcado un
hito en la aplicacin de la ingeniera
gentica de plantas y por ende en la agricultura. La primera generacin de plan-
tas obtenidas por biotecnologa, por lejos, se concentr en la incorporacin de

genes de resistencia a insectos y genes
de tolerancia a herbicidas (Chua y Sundaresan, 2000). Estos rasgos incorporados, han permitido la reduccin de prdidas por aparicin de malezas y de pestes, as como una disminucin en la cantidad de qumicos utilizados en su prevencin. Se estima que el primer pas en
comercializar cultivos GM fue China, a
principios de la dcada de 1990. En
1994, la empresa Calgene comercializ
el tomate Flavr-Savr, con maduracin
retardada debido a la introduccin, en
forma antisentido, del gen de la poligalacturonasa, enzima encargada del metabolismo de la pared celular. Ya en
1995, se haban otorgado nueve concesiones para la comercializacin de estos cultivos, siendo Canad y Estados
Unidos los principales pases en aprobarlas. El xito de estos cultivos GM ha
sido tal, que ya en el ao 2000 se super los 40 millones de hectreas, teniendo como pases ms importantes, por su
rea total sembrada, a Argentina y Estados Unidos (James, 2000).
En el caso de las plantas con tolerancia
al herbicida glufosinato de amonio (Basta), destaca como cultivo la soya, representando ms de la mitad del total de
cultivos GM sembrados en el mundo
hacia fines de la dcada pasada (James,
1998). Con este mismo carcter, le siguieron canola y maz en este mismo perodo de tiempo. Casi todos los eventos
disponibles o comercializados con este
rasgo en la actualidad, utilizan como
fuente de resistencia el gen pat, de la
bacteria Streptomyces viridochromogenes cepa Tu494, que codifica para la
enzima fosfinotricin-acetil transferasa
135
(protena PAT). Al estar presente en las

plantas, PAT permite que stas desactiven a la fosfinotricina, principio activo
de los herbicidas de este tipo.
Hacia fines de la dcada de 1990 destac el conocido maz Bt (James, 1998),
que utiliza diferentes genes de la familia cry de Bacillus thuringiensis subsp.
kurstaki cepa HD-1, para expresar la
protena CRY que confiere resistencia
aumentada a insectos (Prieto-Samsonov
et al., 1997). El mecanismo de accin
de esta protena es formar agrupaciones
cristalinas en los aparatos digestivos de
lepidpteros, es decir, verdaderos canales o perforaciones el tracto digestivo de
los insectos, generando su muerte. Este
tipo de cultivo lleg a ser un 25 por ciento del total de los transgnicos sembrados en el mundo en ese perodo.
Un tercer cultivo de importancia por su
volumen de rea sembrada para comercializacin, ha sido la produccin masiva de algodn GM (James, 1998), el
que se ha modificado con ambas caractersticas, es decir, resistencia a insectos y a herbicidas. A fines de la dcada
pasada, su siembra ocupaba el 10 por
ciento del total de cultivos GM sembrados en el mundo.
PLANTAS TRANSGNICAS
DE SEGUNDA GENERACIN
Y POSTERIORES.
a) Plantas con contenido nutricio
mejorado.
Uno de los hitos en el desarrollo de las
plantas genticamente modificadas lo
constituy el denominado arroz dora-
136
do. En 1990, un grupo de investigadores, liderados por Ingo Potrykus (ETHZurich, Suiza), propuso a la Fundacin
Rockefeller y a su Programa de Biotecnologa en Nueva York, desarrollar un
proyecto para introducir una va metablica que permitiera la produccin de
provitamina-A en el endosperma del grano de arroz. Se sabe que la deficiencia
de vitamina A en dietas de pases de escasos recursos, incide en enfermedades
como la ceguera nocturna, xeroftalmia
y keratomalacia, pudiendo generar finalmente ceguera total (Sommer, 1989). Fue
as como este proyecto, a pesar de ser
concebido como de difcil viabilidad
tcnica, comenz su ejecucin mediante la fusin de ncleos de cientficos con
variadas habilidades. Un grupo que estaba trabajando en la va del metabolismo de los terpenos en endosperma de
arroz (grupo de Peter Beyer, University
of Freiburg, Alemania), se uni con otro
grupo de gran dominio en la ingeniera
gentica (grupo de Ingo Potrikus, ETHZurich, Suiza). Estudios preliminares
permitieron a este ncleo de investigadores determinar que, gracias a la funcin de cuatro enzimas: fitoeno sintetasa, fitoeno desaturasa, -caroteno
desaturasa y licopeno -ciclasa; se podra en teora, producir -caroteno, o
provitamina-A (Burkhardt et al., 1997;
Ward y Barnes, 1988). La metodologa
de obtencin de esta nueva variedad de
arroz, consisti en la co-transformacin
con dos cepas de A. tumefaciens portando todos los genes necesarios para la
ruta metablica ms el cassette con el
gen de seleccin. Un plasmidio binario
contena los genes necesarios para la
produccin de licopeno en los plastidios
del endosperma de arroz: el gen de la
fitoeno sintetasa de narciso (Narcissus

pseudonarcissus) y el gen de la fitoeno
desaturasa de una bacteria (Erwinia
uredovora). El otro plasmidio contena
otros dos genes: el de la licopeno ciclasa de narciso y el cassette para
resistencia a higromicina. De esta forma, el segundo plasmidio permitira la
sntesis completa hasta -caroteno.
Como se habr notado, se utilizaron slo
tres de los cuatro genes anteriormente
mencionados como necesarios en la ruta
sinttica completa. Esto debido a que el
uso de una caroteno desaturasa de origen bacteriano, permiti prescindir del
uso de las desaturasas vegetales, las que
en su conjunto tienen el mismo rol que
la enzima bacteriana (introducir dos
dobles enlaces en la estructura del
fitoeno). As, tras ocho aos de trabajo,
se obtuvo una planta de arroz, fenotpicamente normal, frtil y con buen contenido de -caroteno en su endosperma
(1,6 mg/g) (Ye et al., 2000). Desafortunadamente, no se han podido llevar a
cabo los ensayos a nivel de campo, debido a la moratoria de 10 aos que existe en Suiza para las pruebas de campo
con cultivos GM.
Debido a esto, la actual estrategia de los
generadores del arroz dorado es integrarse activamente con sus lneas transgnicas, a programas de mejoramiento y
evaluacin locales, para la introduccin
de este rasgo a especies localmente adaptadas y ecotipos propios de los pases
productores de arroz. Todo esto bajo las
premisas y regulaciones que existen en
los diversos pases para el empleo de cultivos GM. Un claro ejemplo de esto, representa la decisin del Consejo Indio
para la Investigacin Agrcola, quienes
han decidido evaluar detalladamente estas variedades, tanto desde el punto de

vista biolgico como su impacto econmico-social (Potrykus, 2001).
b) Plantas como agentes productoras

de vacunas.
Durante la dcada de 1980, el avance en
el conocimiento de aspectos moleculares
genticos del sistema inmune y su aplicacin a la patologa humana, permitieron sentar las bases para nuevos sistemas
de elaboracin de anticuerpos (como lo
es la produccin de anticuerpos monoclonales) o generacin de vacunas. De
esta forma, la posibilidad de expresar en
plantas, determinadas secuencias nucleotdicas con capacidad de expresar pptidos claves que son capaces de inducir
una respuesta inmune, ha sido de gran
inters. Estos pptidos reciben el nombre
de eptopes o determinantes antignicos,
siendo una cadena lineal de entre 7 y 15
aminocidos especfica del agente infeccioso (Arakawa et al., 1998; Haq et al.,
1995; Thanavala et al., 1995).
Uno de los aspectos ms atractivos del
uso de plantas tansgnicas que expresan eptopes especficos (o plantas productoras de vacunas), es que, a diferencia de los sistemas animales utilizados
para este mismo fin, las plantas slo requieren agua, luz solar y sales minerales para su mantencin, siendo un sistema mucho ms barato. Adems, la produccin de este tipo de pptidos en
plantas, se ofrece como un sistema mucho ms limpio que el animal, si se piensa en los diversos contaminantes biolgicos que acompaan a estos ltimos
(especialmente otros patgenos asocia-
137
dos al animal productor). Tambin resalta que, por sus caractersticas de produccin, las plantas proveen anticuerpos
estables a temperatura ambiente y, finalmente, la produccin de vacunas en
plantas, facilita la obtencin de productos administrables por va oral (Walmsley
y Arntzen, 2000).
El xito de la produccin de vacunas en
plantas implica desarrollar un producto
que sea capaz de inducir una respuesta
inmune a nivel de la mucosa gstrica.
Una vez en el tracto digestivo, el antgeno
suministrado por va oral ser reconocido las clulas M de la mucosa linftica
del tracto. Estas clulas dirigirn el
antgeno hacia otro tipo de clulas, denominadas clulas presentadoras del
antgeno (del ingls antigen presenting
cell, APS). stas internalizarn, procesarn y finalmente mostrarn en su membrana plasmtica, los eptopes especficos asociados a dicho patgeno para que
los linfocitos T de ayuda (linfocitos T
helper del sistema inmune celular) activen a los linfocitos B (del sistema inmune humoral, productor de anticuerp o s ). A s , e s t o s m i g ra r n h a c i a l o s
ndulos linfticos mesentricos, donde
madurarn a clulas plasmticas que
migrarn a la mucosa gstrica para producir anticuerpos del tipo inmunoglobulina A (IgA), especficos contra el
antgeno.
Uno de los primeros ejemplos de vacunas en plantas los constituy, en 1990,
la expresin de una protena de superficie de Streptococcus mutans en tabaco
(Curtiss y Cardineau, 1990). La inclusin
de estas plantas de tabaco en la dieta de
ratones, demostr que efectivamente
138
estos produjeron IgA anti-S. mutans,

aunque los animales vacunados no se
sometieron a experimentos de desafo
con la bacteria. Posteriormente, han
existido algunos ejemplos, siendo la expresin de molculas llamadas antgenos
de superficie correspondientes al virus
de la hepatitis B, uno de los ms recurrentes (Richter et al., 2000). Los primeros experimentos con este patgeno expresando estos antgenos en papas, mostraron una dbil respuesta inmune en ratones alimentados con tubrculos crudos
de papas transgnicas. Sin embargo, estos resultados han mejorado recientemente, cuando en el ao 2001, se transform papas con un plasmidio binario
multicomponente, es decir, que contena los cassettes de expresin para dos
antgenos de la toxina del clera
(antgenos de las toxinas B y A2), un
antgeno de la enterotoxina fimbrial de
E. coli enterotoxignico y un antgeno
de la enterotoxina de rotavirus (Yu y
Langridge, 2001). Los ratones alimentados con los tubrculos de estas papas,
mostraron inducir no slo buenos niveles de IgA y recuperarse ms rpido de
los efectos de la exposicin a rotavirus,
sino tambin, ser capaces de presentar
una respuesta inmune ms generalizada
mediante la sntesis de interleuquinas,
(molculas potenciadoras de la respuesta inmune celular). Interesantemente,
cuando una camada de ratones que se
aliment de leche de madres que fueron alimentadas con estas papas, esta
progenie tambin mostr recuperarse
ms rpido de los efectos del rotavirus.
Hasta la fecha, los datos obtenidos en este mbito no permiten observar un buen
grado de proteccin inmune, debido a
que muchas veces el animal utilizado

como modelo no es susceptible al patgeno o porque las normativas de manipulacin de estos patgenos en el laboratorio son tan estrictas, que no hacen fcil la instauracin en experimentos de
prueba.
Una de las principales preocupaciones
de los investigadores es cmo aumentar
la expresin de los genes utilizados
como determinantes antignicos en este
tipo de alimentos-vacuna. Esto ha dado
paso a la idea de modificar los genes o
secuencias nativas de los pptidos antignicos, generando genes sintticos ms
potentes en su expresin, debido a que
las modificaciones introducidas han aumentado su estabilidad, tanto en la planta como tras ser ingeridos por los animales modelo (Richter et al., 2000). En
1997, se aprob la primera prueba biolgica en humanos de una vacuna de
planta transgnica (Tacket y Mason,
1999). Esto consisti en utilizar como
alimento en un grupo de voluntarios,
papas que constitutivamente expresaban
una sub-unidad sinttica (modificada) de
la toxina B del E. coli enteropatgeno.
Cada uno de los 11 voluntarios recibi
como alimento, una mezcla de cubos de
papas transgnicas y no transformadas,
en una cantidad de entre 50 y 100 gramos de papa cruda. En 10 de los 11 participantes hubo un aumento en anticuerpos anti-toxina B. Esta respuesta inmune fue similar a la observada cuando a
una persona se le desafa con un milln
de bacterias E. coli enterotoxignicos. A
la fecha, se estn desarrollando ensayos
similares de evaluacin en humanos,
para vacunas orales contra la hepatitis
B (Walmsley y Arntzen, 2000).
c) Plantas como productoras de productos biofarmacuticos.

Los productos biofarmacuticos (insulina,
eritropoyetina, hormona de crecimiento,
etc.), histricamente se han obtenido a
travs de organismos genticamente modificados, utilizando para ello bacterias,
levaduras y clulas mamferas en cultivo
(Ganz, 1996; Pen, 1996; Ma y Vine,
1999). Sin duda que la demanda creciente de este tipo de compuestos genera un
punto de colapso en trminos de suplir
la necesidad por ellos, repercutiendo esto
en el costo que los pacientes deben soportar por sus tratamientos. La produccin de protenas con capacidad teraputica en plantas, se vislumbra como una
posibilidad real, de costos realmente inferiores a los de los actuales sistemas de
produccin y generadora de productos
libres de contaminantes patgenos
(Kusnadi et al., 1997).
Dos aproximaciones de transformacin
de plantas se utilizan comnmente en
los sistemas de produccin de biofarmacuticos en plantas: a) la ya conocida y
detallada transformacin por A. tumefaciens o biobalstica y b) la utilizacin
de virus vegetales recombinantes (DellaCioppa y Grill, 1999). En el ltimo caso,
la estrategia consiste en utilizar virus que
infectan plantas y de los que se conoce
completamente su genoma y funcionamiento molecular in vivo. As, se pueden reemplazar partes prescindibles del
genoma de estos virus por los cassettes de expresin del pptido con actividad farmacutica. Con esto, slo bastar la infeccin con este virus recombinante para que dicho pptido sea producido in planta. Desafortunadamente,
139
el uso de virus recombinantes se limita

al conocimiento biolgico del virus utilizado y a su rango de hospederos, lo
que ha limitado mucho su utilizacin
masiva. De esta forma, los virus ms corrientemente utilizados son el virus del
mosaico del tabaco (Kumagai et al.,
1993) y el virus del mosaico de la haba
(Brennan, 1999). Ejemplos en donde se
han utilizado plantas infectadas con virus recombinantes son tabaco y tomates
que expresan el pptido inhibidor de la
enzima convertidora de angiotensina-1
(Hamamoto et al., 1993) y el pptido
inhibidor de la replicacin viral del virus de la inmunodeficiencia humana (atricosantina) en la hierba Nicotiana
benthamiana (Kumagai et al., 1993).
Ejemplo de sistemas de investigacin en
donde se ha aplicado transformacin
gentica son la expresin de encefalinas
en canola (Brassica napus)(Godgjin y
Pen, 1995), interfern en arroz (Godgjin y Pen, 1995), seroalbmina humana en papa y tabaco (Godgjin y Pen,
1995), glucocerebrosidasa en tabaco
(Cramer et al., 1999) y factor estimulador
de colonias de granulocitos y macrfagos en tabaco (Godgjin y Pen, 1995). En
1998 se comenzaron pruebas en humanos para la utilizacin de arroz transgnico que expresa la protena -1-antitripsina (Giddings et al., 2000); de gran
potencial teraputico en el tratamiento
de enfermedades hepticas, de hemorragias y de fibrosis qustica. Otro ejemplo
de la utilizacin a una escala ms avanzada de esta estrategia proviene de la
expresin de hirudina, un compuesto natural con actividad antitrombosis. Canola y tabaco han sido los cultivos transgnicos utilizados para la expresin de este
140
pptido que, en sus fases iniciales mostr problemas para su purificacin desde la planta (Chaudray et al., 1998). Sin
embargo, trabajos fusionando el gen de
hirudina a genes de oleosinas, componentes que habitualmente se encuentran
en los aceites de canola (Boothe et al.,
1997), han permitido soslayar estos problemas y ha permitido la siembra en
campos comerciales en Canad de estos cultivos, para la produccin masiva
del compuesto antitrombtico (Boothe et
al., 1997).
TRANSFORMACIN
DE ORGANELOS
Una de las tcnicas de mayor proyeccin en la transformacin gentica vegetal es la transformacin especfica de
organelos, con especial relevancia la
ingeniera gentica de cloroplastos. Las
plantas transgnicas que poseen el
transgn insertado en el genoma cloroplstico se denominan plantas transplastmicas (Bogorad, 2000). La ventaja de
este tipo de alternativas en la transformacin de plantas reside en que sta es
precisamente una de las formas de eliminar el fenmeno denominado flujo
gnico entre cultivos genticamente
modificados y parientes silvestres o cultivados. As, la produccin de plantas
transplastmicas es de gran inters en especies con alto potencial de cruzamiento con- e inter-especfico. Del mismo
modo, el flujo de polen y su efecto no
deseado frente a insectos no blanco, por
ejemplo en el caso de los cultivos Bt, es
tambin eliminado utilizando este tipo
de estrategia (Daniell, 2002). Estas ventajas provienen del hecho de que, aunque el polen de algunas pocas plantas
pueda contener plastidios metablicamente activos, el DNA de estos es

perdido durante su proceso de maduracin, impidiendo su transmisin a la
prxima generacin de plantas. A manera de ejemplo, se ha visto que an
cuando plantas transplastmicas para el
gen cry llegaron a poseer un 47% de
protena CRY del total de protenas solubles, sta no se encontr en el polen
de estas plantas (De Cosa, 2001).
La transformacin de cloroplastos tiene
su base en un proceso totalmente distinto a la recombinacin ilcita que explotan los plasmidios binarios: la recombinacin homloga (ver Figura 6.5).
Como se mencion, la recombinacin
homloga es un sistema normal de las
plantas, mediante el cual secuencias que
son idnticas entre s son recombinadas,
generando el reemplazo de una hebra
de DNA por otra idntica, con el fin de
reparar hebras daadas de DNA o de
generar simplemente variabilidad
gentica. Para procurar recombinacin
homloga en el cloroplasto, entonces,
se debe tener conocimiento del genoma
en dnde se desea insertar el o los cassettes de expresin de los genes de inters. De esta forma, los plasmidios utilizados en la transformacin de cloroplastos no tienen los elementos descritos anteriormente para los plasmidios
binarios desde el punto de vista de los
bordes T, sino que, en adicin a los cassettes normales de expresin, poseen
segmentos bastante significativos (desde 400 pares de bases a varios kilobases)
de genes plastidiales, los que al ser homlogos al genoma cloroplstico, son
reconocidos por las maquinarias internas de recombinacin y reparacin del
DNA en la clula de la planta, llevando

a la insercin de los cassettes de inters entre dichas secuencias, pero en el
genoma plastidial (Lamtham y Day,
2000).
El tamao de los genomas plastidiales
vara entre 120 y 160 kilobases y codifica para los genes involucrados en la mantencin del propio plstido y en la fotosntesis. Adems de su rol en la fotosntesis, los plastidios sirven como compartimentos para la biosntesis de aminocidos y lpidos, siendo la mayora o todos los genes involucrados, sintetizados
en el ncleo (Gray et al., 2003).
Como en una clula vegetal existen muchos cloroplastos, los sistemas de seleccin deben propiciar la obtencin de
clulas con todos sus plastidios transformados. Para esto, los sistemas de seleccin deben tambin estar dirigidos al
cloroplasto. Inicialmente, la seleccin
de plantas transplastmicas utiliz una
mutante en el RNA ribosomal 16S, que
no una el antibitico espectinomicina
y as confera resistencia a ste (Daniell
et al., 1998). Posteriormente, se ha utilizado el gen de la aminoglicsido 3adenil transferasa (aad), enzima que inactiva este mismo antibitico mediante
la transferencia de la porcin adenil del
trifosfato de adenosina (ATP), hacia la
espectinomicina o su smil estreptomicina (Daniell et al., 1998). Desafortunadamente, estos antibiticos tambin
controlan las infecciones bacterianas en
humanos y animales, por lo que la posibilidad terica de transferencia de este
gen de resistencia hacia bacterias en los
tractos digestivos, aunque remota, est
abierta a discusin (Chambers et al.,
141
2002). Recientemente, se han desarrollado sistemas metablicos de seleccin,

como los descritos anteriormente para
eliminar el uso de genes reporteros que
confieren resistencia a antibiticos. En el
caso de la transformacin de plastidios,
se ha utilizado el gen de la enzima
betana-aldehdo deshidrogenasa (BADH)
de espinaca (Ratinasabapathi, 1994). Esta
enzima est presente slo en los
cloroplastos de un nmero muy reducido de especies con alta resistencia a sequedad y salinidad, por lo que al introducirla en plantas transplastmicas, permite la seleccin de plantas en medios
con el agente txico betana-aldehdo
(BA), las que gracias a la BADH, lo transforman en glicina-betana, compuesto
que es adems, un reconocido metabolito
osmoprotector (Daniell et al., 1998;
Daniell et al., 2001).
Una caracterstica adicional observada
tras el uso de BADH-BA como sistema de
seleccin de plantas transplastmicas, es
la rpida regeneracin de los explantes
que lo utilizan. En lneas generales, se ha
visto que este sistema permite una regeneracin casi tres veces ms veloz que
el uso del sistema de antibiticos
espectinomicina-estreptomicina (Daniell
et al., 2001).
En teora, la seleccin utilizando BA se
muestra como una herramienta muy poderosa y de amplio espectro de aplicacin, siempre que los cultivos o especies a transformar no posean este sistema expresado en muy altos niveles,
como por ejemplo la familia de las
Chenopodiaceae y Poaceae.
142
PERCEPCIN PBLICA
Sin duda que el avance de las nuevas
tecnologas es hoy en da de muy difcil
asimilacin para cualquier persona, aunque est sta vinculada a la ciencia. Esto
ha contribuido a ahondar la brecha entre los cientficos y la persona comn
(Daniell, 1999). Sin embargo, no ha sido
difcil advertir que el debate sobre la
incorporacin y uso masivo de los cultivos GM en el mundo, ha sido preferentemente controversial y manejado de
una forma visceral ms que tcnica y
con distintos intereses.
El mal manejo informativo causado por
la ausencia de una prensa especializada, ha llevado a generar una gran cantidad de movimientos pblicos con cierta
orgnica, conocidos como grupos verdes o ecologistas. Aqu, podemos distinguir varios estratos o tendencias, bsicamente agrupables en dos: a) aquellos que buscan alcanzar una moratoria
el desarrollo de cultivos GM hasta que
los hechos tcnicos demuestren una total certeza de su seguridad y b) aquellos
grupos que quieren incluso detener su
desarrollo, bajo este mismo argumento
de riesgo cero.
Dentro del grupo reivindicativo de un
mayor anlisis de los cultivos GM y sus
productos alimenticios derivados de
ellos, encontramos el uso de argumentaciones como que la tecnologa es
mala, ejemplificndose con accidentes
tecnolgicos histricos como el efecto
del uso del DDT y otros qumicos de la
revolucin verde, de la talidomida, del
asbesto o de las dioxinas. Yendo ms
all, se incluyen ejemplos como los ac-
cidentes nucleares de Chernobyl y Three

Miles Island. En una forma an ms recurrente y preocupante, se ha utilizado
el desconocimiento de una sociedad
sobre sistemas o procesos biolgicos que
efectivamente pueden deber su origen a
deficiencias en el marco regulatorio de
las nuevas tecnologas, como lo son la
encefalopata espongiforme bovina (comnmente llamado mal de las vacas locas) y la enfermedad de Kreutzfel-Jacobs
(enfermedad neurodegenerativa debida
a priones) o las dioxinas en el ambiente
y los alimentos. Sin duda, en ninguno
de estos ejemplos citados, existi un cultivo GM involucrado, ni tampoco un alimento derivado de ellos.
La misma falta de prensa cientfica, ha
contribuido enormemente a la agrupacin de este tipo de organismos genticamente modificados (conocidos ahora como OGMs) y alimentos derivados
de ellos, bajo nombres o denominaciones que muchas veces pueden dar paso
a la discriminacin comercial, siendo
sta la verdadera razn por la que se
debe estudiar en detalle una poltica de
rotulado que incluya un anlisis detenido en los requisitos de dicha etiqueta.
Por ejemplo, adems de llamrseles alimentos transgnicos, muchas publicaciones se refieren a alimentos biotecnolgicos, aunque vale la pena recalcar que los OGMs no han cambiado (salvo casos ex profeso, como la produccin
de una vitamina C por microorganismos
modificados o la misma insulina, sin ser
este un alimento) las tecnologas de produccin de alimentos. Otras denominaciones son las de alimentos genticamente modificados, bioproductos,
alimentos modificados mediante ingeniera gentica, alimentos recombi-
nantes y alimentos obtenidos mediante

la biotecnologa (este ltimo empleado en el Codex Alimentarius). Aqu, es
necesario decir que la ingeniera gentica, la tecnologa del DNA recombinante y sus distintas etapas, no constituyen por s solas, metodologas para el
desarrollo de alimentos y por lo tanto,
mal pueden producirlos. Como se mencion, este punto es de vital importancia a la hora de la presentacin de los
diferentes productos al consumidor final,
sea este un mercado de un pas determinado o una persona enfrentada a los
anaqueles de un supermercado nacional.
Es adems y sin ninguna duda, un punto
neurlgico del etiquetado que se les dar
a estos nuevos productos, donde se debera compatibilizar el nivel de conocimiento real del consumidor y el tipo de
informacin que se le entrega. Ante esto,
surge el cuestionamiento sobre qu tan
urgente debe ser una poltica de rotulado en nuestro pas, si no existe una sociedad con un conocimiento adecuado
del tema.
1. Factores a tener en cuenta

en el Marco Regulatorio Nacional
aplicable a los OGMs.
En virtud de la complejidad del tema,
de los mbitos involucrados y de los sectores afectados (positiva y negativamente), un marco regulatorio nacional para
los OGMs debe armonizar los requerimientos y normas impuestos por los tres
componentes involucrados en su generacin: a) Ministerio de Agricultura, b)
Ministerio de Salud y c) Ministerio de
Economa. No parece razonable la generacin de un marco regulatorio eficaz
y contingente excluyendo a alguno de
estos tres actores.
143
En trminos generales, la normativa debiera considerar aspectos intrnsecos del

alimento u OGM (segn corresponda)
tales como: el tipo de alimento, modificacin gentica del OGM y tecnologas
de procesamiento de las materias primas
utilizadas. Tambin debieran tenerse en
cuenta aspectos tcnicos contingentes;
vale decir, debe ser un reglamento proactivo que considere los cambios en los
conocimientos sobre la ciencia y tecnologa de los alimentos, tipo de informacin al consumidor, percepcin pblica, posible manejo con identidad preservada y reales objetivos mayores de la
salud pblica. El tipo de informacin al
consumidor debera generar la posibilidad de evaluar correctamente, comparar y decidir sobre su opcin por un alimento transgnico.
En la actualidad, los principios generales se basan esencialmente en la aplicacin del Enfoque Precautorio y en la
Evaluacin de Riesgo Previa del OGM.
El Enfoque Precautorio se basa en un
marco regulatorio que necesariamente
va acompaado de la generacin de
nuevo conocimiento, siendo proactivo,
aplicando dudas razonables y significa
que ante la ausencia de fundamentos
cientficos completos, no se acepta el
riesgo o no se puede evaluar. Esto implica una bsqueda de informacin
faltante en plazos de tiempo razonables.
Aqu resulta de gran importancia el hecho de que argumentos tcnicos dbiles
no sean utilizados como barreras al comercio. Esto ltimo ha representado la
constitucin de ejes de opinin divergentes incluso entre distintas agrupaciones de pases.
144
La Evaluacin de Riesgo Previa del OGM,

implica un anlisis del impacto ambiental, un anlisis de seguridad para los
operadores, un planteamiento ante el
consumo furtivo y el escalamiento en
etapas de flexibilizacin (cadena laboratorio-invernadero-campo de bioseguridad, etc.). Un componente estratgico
de esta evaluacin, es la comprendida
por el anlisis cuantitativo y cualitativo
de Equivalencia Substancial del nuevo
alimento, en funcin de su similitud con
plantas no modificadas. El anlisis de
todos los aspectos en que el nuevo alimento puede diferir del tradicional incluye, por ejemplo: modificaciones en
el contenido de txicos y alergenos, toxicidad y alergenicidad, estructura de los
componentes macromoleculares, digestibilidad y metabolismo, biodisponibilidad de nutrientes y micronutrientes,
toxicidad aguda y crnica, formulacin
y ensayo de alimentos para animales y
necesidad de informacin para el consumidor.
Al respecto, es necesario decir que un
an-lisis de equivalencia substancial no
es un parmetro de evaluacin masiva
aplicable por ejemplo, a embarques de
semillas rutinarios. As, el hecho de la
aprobacin de comercializacin para un
evento transgnico, presupone que ha
existido ya una rigurosa evaluacin de
riesgo previa, con su correspondiente y
detallado anlisis de equivalencia substancial, entre muchos otros.
2. Marco Regulatorio Internacional.

Desde 1970 muchos pases han instaurado marcos regulatorios oficiales para
el control de las diversas aplicaciones
de la biotecnologa. De manera particular, los esfuerzos se han concentrado en

aspectos de seguridad de la aplicacin
de la tecnologa teniendo como sujetos
de impacto al hombre, los animales y el
medioambiente. Las Directrices de la
Unin Europea 219/90 y 220/90, constituyen un conjunto de normas para la
liberacin al medioambiente de OGMs.
Por el contrario, las agencias regulatorias de Estados Unidos (el ms grande
exportador de cultivos genticamente
modificados), consideran a estas nuevas
tcnicas de modificacin gentica como
una extensin de otros procesos biotecnolgicos. Esto es, que los nuevos productos (plantas transgnicas) obtenidos
a travs de esta tecnologa, son evaluados segn los mismos marcos regulatorios de evaluacin de riesgos diseados previamente. As, en Estados Unidos
existen tres agencias gubernamentales:
agricultura, salud y medioambiente, encargadas conjuntamente de la regulacin, pruebas de campo y control del
uso de la tecnologa del DNA recombinante. Los criterios utilizados por la Directriz Europea 220/90 y por la Agencia
de Agricultura y Salud Estadounidense,
en cuanto a salud humana y medioambiente, son bsicamente los mismos. Estos difieren slo en que la agencia europea establece los requisitos a cumplir
por el aplicante para una liberacin a
campo; mientras que en EE.UU. los criterios son bsicamente formulados por
el mismo generador del OGM, en acuerdo con la agencia del estado.
De forma similar, en Sudamrica, pases
como Brasil y Argentina han implementado sistemas de trnsito, siembra y vigilancia de material transgnico. En Ene-
ro de 1995, Brasil public la Ley 8.974

y el Decreto 1725/95, estableciendo el
Comit Tcnico Nacional de Bioseguridad (CTNBio), agencia gubernamental
responsable de las regulaciones a campo de plantas transgnicas y de la elaboracin de normas para el uso contenido y la liberacin al medioambiente
de OGMs. El esqueleto normativo y funcional brasileo es muy parecido al esquema europeo, pues considera el control de la tecnologa del DNA recombinante en forma distinta de otros procesos biolgicos. Sin embargo, desde el
punto de vista de los procedimientos de
inspeccin y evaluacin, Brasil sigue el
modelo implementado por EE.UU., en el
cual cada autorizacin es seguida por
una examinacin local crtica, para asegurar que las principales medidas de
evaluacin de riesgo que presenta el
aplicante, sean llevadas a cabo correctamente. Argentina define las condiciones que deben reunir los OGMs para ser
liberados al medio en las Resoluciones
N 656 (de la SAGyP del 30 de Julio de
1992) y N 837 (de la SAGyP del 9 de
Septiembre de 1993). Estas Resoluciones
se suman a las normativas existentes en
materia de proteccin vegetal (Decreto
Ley de Defensa Sanitaria de la Produccin Agrcola 6704/66), de semillas y
creaciones fitogenticas (Ley de Semillas y Creaciones Fitogenticas 20247/
73) y de sanidad animal (Ley de Productos Veterinarios). De manera similar a
Brasil, la estrategia de Argentina se basa
en la aprobacin para liberacin a campo, esencialmente de los mismos eventos transgnicos que estn siendo aprobados en Europa, de manera de no afectar su fuerte posicin exportadora.
145
3. Situacin de Chile.
La legislacin sobre proteccin agrcola
se encuentra contenida en el Decreto
Ley N 3557 de 1980, en donde hay disposiciones genricas que facultan al Servicio Agrcola y Ganadero (SAG), entidad dependiente del Ministerio de Agricultura, para dictar resoluciones especficas que establezcan requisitos, procedimientos y normas particulares para
la internacin y manejo del material
transgnico. La Resolucin Exenta 1927
de 1993, establece normas para la internacin de material vegetal transgnico de reproduccin a Chile, creando en
Octubre de 1993 el Comit Asesor para
la Liberacin de Organismos Transgnicos (CALT). Este comit est constituido
por representantes del Ministerio de
Agricultura y de Salud, de institutos de
investigacin agrcola y de varias universidades; tiene el carcter de comit
permanente y est facultado para incorporar, cuando las circunstancias as lo
aconsejen, a otros especialistas. La Presidencia y la Secretara Tcnica del CALT
son ejercidas por el Departamento de
Proteccin Agrcola del SAG.
En la actualidad, la Evaluacin de Riesgo Previa es aplicada en Chile por el
CALT, la que se basa en un formulario
tipo Declaracin Jurada, completado por
el solicitante, sea este un importador o
el obtentor de un cultivo GM. En este
formulario se vierte una completa descripcin a nivel botnico, agronmico
y molecular de los diversos componentes del nuevo cultivo. Tambin se incluyen todos los ensayos y evaluaciones
tcnicas realizadas al cultivo en el pas
de origen. De esta forma, todo el mate-
146
rial GM ingresado al pas debe hacerlo

bajo las premisas de: a) cada internacin
de material transgnico debe ser previamente autorizada por el Departamento
de Proteccin Agrcola del SAG, b) slo
se autorizar la internacin del material
vegetal transgnico cuyo objetivo sea la
multiplicacin para ser reexportado (es
decir, slo semillas para multiplicacin),
c) el material de internacin debe cumplir cuarentena, d) debe contar con informes que acrediten que en liberaciones a campo, en el pas de origen, el
material mostr ser inocuo al medio
ambiente y a la agricultura, e) se debe
presentar la solicitud de internacin en
la forma de la Declaracin Jurada ya
descrita, y e) la internacin slo podr
hacerse por el aeropuerto Comodoro
Arturo Merino Bentez, con el objeto de
facilitar el seguimiento del material.
Como se mencion, el CALT basa sus decisiones en esta informacin, pero no
posee una capacidad de evaluacin in
situ del efecto o nivel de interaccin con
el medioambiente, la salud animal o la
salud humana. Sin embargo, podemos
decir que en Chile ya se est comenzando la formacin de ncleos tcnicos para
el anlisis de la incorporacin e interaccin de cultivos GM con la flora nativa,
es decir, la formacin de centros de estudios de bioseguridad y de personal con
conocimiento en el rea, con participacin de personal del Instituto de Investigaciones Agropecuarias y del SAG.
Desde la dcada de 1990, Chile comenz su incursin tcnica en el desarrollo
de plantas GM, debido a esto, el CALT
dict una nueva resolucin, la Resolucin 1523 de 2001, en donde los culti-
vos GM desarrollados en el pas se someten a las mismas normas que rigen

para los cultivos GM desarrollados fuera del pas e importados. Esto obliga a
todo nuevo material transgnico generado en el pas a someterse a las evaluaciones y regulaciones del CALT. Antes
de la publicacin de esta Resolucin,
slo se haca sometimiento voluntario de
los cultivos GM producidos en Chile,
como efectivamente sucedi con los
nicos dos trabajos realizados en esa
poca: papas resistentes a Erwinia
carotovora y melones resistentes al virus del mosaico de la sanda tipo II, el
primero desarrollado por investigadores
de la Pontificia Universidad Catlica de
Chile e INIA - La Platina y el segundo,
desarrollado ntegramente en INIA - La
Platina.
El 30 de Noviembre de 2000, se public en el Diario Oficial la creacin de
los Comits Asesores en Materias Ambientales Internacionales. Esto incluy el
Comit Asesor en Materias de Bioseguridad. Este organismo, bsicamente con
centro de coordinacin en la Comisin
Nacional del Medio Ambiente (CONAMA), ejercer la articulacin de las distintas organizaciones nacionales ligadas
a la bioseguridad, incluyendo al CALT,
Ministerio de Relaciones Exteriores y a
la CONAMA misma. Bajo este marco, el
comit se plantea con una composicin
multisectorial de las instancias ya mencionadas, ms Aduanas y Ministerios de
Economa, Agricultura, Salud y Sub-Pesca. La idea de esta instancia es, en base
a la pronta entrada en vigencia de acuerdos internacionales como el Protocolo de
Cartagena sobre Bioseguridad en Biotecnologa, generar en el pas todas las ca-
pacidades necesarias para el anlisis poltico en base a informacin tcnica, procedente desde un Comit Asesor Tcnico, sobre el movimiento de material
genticamente modificado tanto en el
pas como a travs de sus fronteras.
4. Protocolo de Cartagena sobre

Bioseguridad en Biotecnologa.
El Protocolo de Cartagena sobre Bioseguridad en Biotecnologa tiene sus races en la Conferencia de las Naciones
Unidas de Medio Ambiente y Desarrollo, celebrada en 1992 en Ro de Janeiro.
Este Convenio acord tres reas primordiales: la conservacin de la biodiversidad, el uso sustentable de sus componentes (plantas, microorganismos, animales, cromosomas, genes, etc.) y el
equilibrio en la reparticin de los beneficios de la utilizacin de los recursos
genticos.
El Protocolo representa un acuerdo legalmente vinculante, para proteger el
medioambiente de los eventuales riesgos que podra ocasional el movimiento
transfronterizo de organismos vivos modificados (OVMs). El objetivo es que los
pases tengan la oportunidad de realizar
el anlisis de riesgo que involucra la internacin de los productos obtenidos
mediante la biotecnologa moderna. De
esta forma, se persigue que cada pas
pueda tomar decisiones de manera informada, con respecto a estos organismos y sus contenedores (alimentos, granos, materias primas, etc.)
Este sistema de anlisis de riesgo nacional o local, fuerza a cada pas a generar
una capacidad tcnica especializada.
147
As, los gobiernos podrn indicar a la comunidad internacional si aceptan o rechazan las importaciones de commodities agropecuarios que incluyan OVMs,
mediante un conjunto de instancias conocidas como Clearing House de Bioseguridad. Esto es, la instauracin de una
red o sistema de informacin del conocimiento cientfico, tcnico, medioambiental y legal, sobre los eventos de
OVMs en cuestin e implica tambin un
derecho a asistencia tcnica si hubiera
necesidad. Finalmente, con todos estos
antecedentes, los estados debern tomar
una decisin.
Para esto, los embarques con commodities con contenido de OVMs debern ser
identificados como tales y para otros tipos de OVMs, como semillas y peces
que vayan a ser introducidos intencionalmente al medioambiente, se aplicar un conjunto de etapas tcnicas denominadas Acuerdo Fundamentado Previo
(AFP). El AFP prev la provisin de informacin en forma detallada al Estado
del pas en donde se interna el OVM, en
una forma anterior al primer embarque.
As, con todos los antecedentes en
mano, el Estado importador deber responder a dicha aplicacin.
En todo caso, el Protocolo contiene en
su referencia bsica, el establecimiento
de un Enfoque Precautorio para el manejo de este tipo de importaciones. Esto
es, ante dudas razonables, lo aconsejable es la abstencin.
Un poco de historia.
En conformidad con los artculos del
Convenio sobre la Biodiversidad Biol-
148
gica, se estableci un grupo de trabajo

ad hoc para el tema de bioseguridad.
Este grupo, con carcter de ampliable,
mantuvo seis reuniones entre Julio de
1996 y Febrero de 1999, producto de las
cuales se desarroll un borrador en el
que se incluy las mayores preocupaciones de las partes participantes. Este texto se discuti en lo que se llam la Primera Reunin Extraordinaria, desarrollada a fines de Enero de 2000 en Montreal
(Canad). All se convino la adopcin de
un Protocolo de Bioseguridad dentro del
marco de la Convencin, que ya se haba escrito en Cartagena (Colombia), en
Febrero de 1999, pero que no se pudo
acordar su entrada en vigencia en esa
misma oportunidad.
La aprobacin del documento en Montreal implic, dejar abierta la posibilidad de realizar modificaciones hasta su
entrada en vigor y a una ratificacin de
su firma por parte de los pases representados. Para esto, existira una instancia denominada Comit Intergubernamental para el Protocolo de Cartagena
sobre Bioseguridad (Intergovernmental
Comitee for the Cartagena Protocol,
ICCP), que ya se ha reunido en Montpellier (Francia) en Diciembre de 2000, en
Nairobi (Kenia), en Octubre de 2001 y
en La Haya (Holanda), en Abril de 2002.
Las posturas de los distintos pases tras
estas reuniones, en forma muy sinttica, es que existen dos agrupaciones:
Unin Europea ms frica y Pases
Exportadores (ex Grupo de Miami, del
cual Chile formaba parte). Una gran diferencia entre estas dos posturas es que,
con respecto a los embarques de commodities, sean indiscutiblemente iden-
tificables y trazables, en lo posible mediante una metodologa tcnica en comn, siendo la postura ms estricta la
europea. Para los exportadores, el sello
de puede contener OVM sera suficiente. Tambin existen notorias diferencias, an menos trabajadas que el punto anterior, sobre los procesos administrativos o legales a seguir en cuanto al
cumplimiento de responsabilidades comunes, a la responsabilidad y formas de
compensacin que existira entre los
pases miembros, debido al movimiento
transfronterizo de estos productos.
En forma adicional, el Protocolo establece la generacin de redes de intercambio de informacin y la generacin de
capacidad tcnica en cada uno de los
pases. Puntos que estn en distinto estado de avance.
Finalmente, podemos decir que la posicin chilena tras esta ltima ronda de
discusiones es mantener una equidistancia de los dos bloques, en espera de definir internamente una poltica nacional
en materia de OVMs.
As, es necesario recalcar que el estado
de negociaciones internacionales, la poltica interna y la percepcin pblica aqu
expuesta, representan slo una fotografa de un sinnmero de eventos que an
estn sucediendo, por lo que es probable que esta situacin ya sea obsoleta en
el momento de su lectura. Sin embargo,
pensamos que representa una buena forma de informar el cun complejo y cmo
se han sucedido los hechos con respecto
a los OGMs (u OVMs), tanto en los pases ms directamente involucrados (pases desarrollados), como en Chile.
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MARCADORES MOLECULARES
CAPTULO 7
MARCADORES
MOLECULARES
INTRODUCCIN
os marcadores moleculares son protenas o fragmentos del DNA que diferencian a un ser de otro; a una especie
de otra. Estas diferencias eran tomadas
en otros tiempos, simplemente como las
encontradas en el mbito morfolgico (en
plantas: presencia de flores, tipo de hojas, races, frutos, etc; en animales: presencia de antenas, pelos, color de los
ojos, etc.). Pero, Cmo eran distinguidas dos especies con una similitud muy
grande? No se poda diferenciar. Esto es
ahora posible, gracias al uso de los marcadores moleculares y al desarrollo de
tcnicas que permiten su anlisis.
Tipos de Marcadores Moleculares

Los primeros marcadores moleculares
conocidos y utilizados fueron las isoenzimas; por eso, son tambin conocidas
como marcadores bioqumicos. Estas
enzimas pueden presentar ms de una
forma pues, son constituidas por ms de
un tipo de cadena de polipptidos (protenas multimricas) o tambin se puede decir, que corresponden a polpptidos diferentes con la misma funcionalidad. Estos marcadores pueden representar los dos alelos de los genes que constituyen las enzimas, llamndose por ello,
marcadores co-dominantes, al poder distinguir genticamente una especie con
expresin gnica en homocigosis o en
M. Cristina Rocha C.
heterocigosis de estos genes. Como

ejemplos de este tipo de marcadores podramos mencionar a las siguientes enzimas: aconitasa, adenilato quinasa, alcohol deshidrogenasa, glutamatoxaloacetato transaminasa, fosfoglucomutasa,
triosafofato isomerasa, leucina aminopeptidasa, isocitrato deshidrogenasa,
shikimato deshidrogenasa y otras
(Ellstrand y Lee, 1987).
As, ahora pueden ser distinguidas especies que no podran diferenciarse por aspectos morfolgicos, pero que tenan diferencias al nivel de las isoenzimas. Para
efectuar un ensayo con isoenzimas (Figura 7.1), es necesario extraer la protena (enzima) del tejido que la contiene,
separarla en un gel a travs de una
electroforesis y finalmente, hacer una
reaccin enzimtica para distinguirla
por medio de la formacin de un producto coloreado, en condiciones apropiadas de pH y temperatura, pues como
buena enzima, esta molcula presentar dichos requisitos para revelar su funcin. En la Figura 7.2 se puede observar
que dos especies de Penaeus (conocidas
como gambas); se distinguien por un ensayo de actividad de la isoenzima
adenilato quinasa. Esto se realiza determinando en un gel al que se ha adicionado almidn. Este ensayo es relativamente sencillo y de bajo costo, siendo
por ello empleado en diversos sistemas
animales y vegetales.
153
Extraccin de la enzima
del tejido apropiado
Anlisis de electroforesis
en gel de almidn
Figura 7.2. Anlisis de polimorfismo de la isoenzima

adenilato quinasa entre:
1 Penaeus subtilis M I; 2 P. subtilis M II.
(fotografa gentilmente cedida por Dr J.Gusmo, UFRJ)
(Gusmo, 2001).
Reaccin de la enzima con un sustrato

apropiado y revelado de actividad por
formacin de un producto coloreado
Figura 7.1 Esquema demostrativo de

las principales etapas para anlisis de
polimorfismos utilizando isoenzimas.
De esta forma, muchos estudios vinculados con caracterizacin de plantas

anuales o perennes y tambin de animales, se han basado en la utilizacin de
este tipo de marcadores, los que incluso
se utilizan hasta hoy (Ellstrand y Lee,
1987; Degani et al., 1990; Gusmo,
2000; Huamn et al.,2000; Gusmo,
2001;). Otra aplicacin del estudio con
isoenzimas, es identificar cambios
genticos producidos en plantas propagadas in vitro (nuestro ya conocido trmino variacin somaclonal). Ese ensayo fue utilizado con este objetivo en
papas propagadas a travs de cultivo de
tejidos.
El principal problema con los marcadores bioqumicos es que representan solamente unos pocos genes de todo el
genoma, existiendo casos en que no se
puede distinguir bien algunas especies
que son muy semejantes. Otro problema frecuente es que, en la preparacin
154
de las muestras proteicas, se tiene que

partir de material vegetal exactamente
en el mismo estado de desarrollo fisiolgico, pues pueden haber diferencias
de expresin de las isoenzimas durante
distintas etapas. As, para que los ensayos sean reproducibles, es necesario obtener tejidos en la misma etapa del desarrollo. Sin embargo, los marcadores
bioqumicos siguen siendo tiles, pues
algunas veces son marcadores prximos
a genes importantes en programas de
mejoramiento. Por ejemplo, el gen de resistencia del tomate al nemtodo Meloidogyne incognita, se encuentra prximo
a un gen de una isoenzima de fosfatasa
cida y eso ayud en la seleccin de
plantas resistentes a ese nemtodo
(Medina-Filho, 1980).
Con el desarrollo de diversas herramientas modernas de la biologa molecular
(Tecnologa del DNA recombinante, captulo 5), aparecieron otras estrategias
para analizar marcadores moleculares.
Todas esas tcnicas permiten establecer
diferencias evaluando directamente el
material gentico contenido en la molecula del DNA. Una de esas tcnicas,
se basa en el corte del DNA genmico
con enzimas de restriccin seguida de

electroforesis en gel de agarosa, transferencia hacia un filtro de nylon, hibridacin con fragmentos de genes conocidos o no, marcados con radioactividad
seguida de autorradiografa (Figura 7.3)
(ver tambin Deteccin de clones recombinantes, capitulo 5). Esta tcnica
se llama Polimorfismo del Largo de Fragmentos de Restriccin (Restriction
Fragment Length Polymorphism - RFLP).
Adems de RFLP, tambin existen otras
metodologas que utilizan como base la
Reaccin en Cadena de la Polimerasa
(Polymerase Chain Reaction - PCR). Esas
otras tcnicas son conocidas como la del
DNA Polimrfico Amplificado al Azar
(Random Amplified Polymorphic DNA RAPD), Repeticiones de Secuencia Sim-
Corte del DNA

genmico
con enzima
de restriccin
Electroforesis en gel de agarosa

seguido de transferencia para
filtros de Nylon, hibridacin
con secuencias radioactivas y
autorradiografa (Southern blot)
A B C
Figura 7.3. Esquema demostrativo de las

principales etapas para anlisis de
polimorfismos por RFLP.
ple (Simple Sequence Repeats, SSR; tambin conocida como microsatlites),

Repeticiones Inter Secuencia Simple
(Intersequence Simple Repeats, ISSR),
Secuencia Sitio Marcada (Site Tagged
Sequence, STS), Regiones Amplificadas
de Secuencias Caracterizadas (Sequence
Characterized Amplified Regions, SCAR)
y Polimorfismo del Largo de Fragmentos Amplificados (Amplified Fragment
Length Polymorphism, AFLP). Adems
de stas, tambin tenemos las VNTR o
Repeticiones Adjacentes de Nmero Variable (Variable Number of Tandem Repeats, tambin llamada de minisatlites).
Todas estas metodologas sern ms detalladas a continuacin.
El marcador RFLP, como se indic, tiene
como base el corte del DNA genmico
con una enzima de restriccin. En las diferentes especies pueden ocurrir variaciones genticas puntuales que hacen
variar el sitio de restriccin de una enzima. As, se pueden detectar diferencias de tamao en fragmentos de restriccin relacionados a un gen o alelo. Esa
tcnica es empleada en pruebas diagnstico de enfermedades genticas (Griffiths
et al., 2001) o tambin en anlisis de diversidad gentica entre organismos (Liu
y Musial, 1995; Pruvost et al., 1998). Como los marcadores bioqumicos (isoenzimas), el RFLP tambin es co-dominante,
pues distingue caracteres genticos en
homocigosis y heterocigosis. El costo de
un ensayo RFLP es superior al de las
isoenzimas, siendo tambin ms lento,
adems de demandar entrenamiento especializado. Como las isoenzimas, tiene la desvantaja de solamente distinguir
variaciones especficas con relacin a
pocas secuencias gnicas. Adems, para
155
realizar el ensayo, es necesario conocer

la secuencia del gen para el anlisis u
obtener secuencias de DNA en una librera genmica o de DNA complementario (cDNA) (Liu y Musial, 1995) (ver
tambin captulo 8). Una variacin de
esta tcnica utilizada hoy en da, es amplificar una secuencia de un gen y enseguida hacer digestin con enzima de
restriccin. Esa variacin del RFLP, llamada RFLP/PCR, disminuye el costo del
anlisis, adems del tiempo para la obtencin de los resultados (Gusmo,
2001).
La VNTR es una tcnica donde se hace
hibridacin del DNA genmico con secuencias que son repetidas en el DNA.
La variabilidad encontrada en ese tipo
de marcador, ocurre probablemente por
errores de lectura de la DNA polimerasa
en la clula que no son corregidos (replication slippage). Tambin es llamada
tcnica de minisatlite y es utilizada
para elaborar fingerprints, que son variables de especie en especie. Los fingerprints son muy interesantes en el senti-
do de distinguir variedades para protegerlas, como ocurre a travs de las patentes o registros de obtentor, segn sea
el pas (Sharon et al., 1995).
Marcadores Moleculares
con base en PCR
Antes de comentar las tcnicas de marcadores moleculares que tienen como
base la PCR, es necesario explicar sta.
El PCR es una reaccin in vitro que imita la replicacin del DNA dentro de las
clulas. Para que ocurra la reaccin de
PCR son necesarias tres etapas fundamentales: desnaturalizacin del DNA,
hibridacin de un partidor y extensin
de la nueva cadena del DNA produciendo dos molculas a partir de una (Figura 7.4). Esas etapas son repetidas en ciclos de 30 o 40 veces. En consecuencia, se produce amplificacin de una secuencia de DNA en progresin geomtrica, que puede ser analizada en un gel
de agarosa teido con bromuro de etidio
(Figura 7.4). La etapa de desnaturaliza-
Desnaturalizacin de la cadena del DNA
Hibridacin
del partidor
o primer
Duplicacin
de la cadena
Extensin de la
nueva cadena por
la DNA polimerasa
(Taq polimerasa)
Figura 7.4. Diseo demostrativo de las principales

etapas de la reaccin en cadena de la polimerasa.
156
cin ocurre, en general, a la temperatura

de 92 o C o 95 o C; la etapa de hibridacin
del partidor es variable y depende de la
secuencia a amplificar. Los partidores (se
usan dos por reaccin) son oligonucletidos de secuencia directa (uno) y complementaria (el otro), a aquellas que
flanquean la zona que se quiere amplificar. El partidor o primer es muy importante, pues es l quien ofrece una
conformacin en la cadena del DNA
desnaturalizada tal que la enzima DNA
polimerasa se acopla y empieza la extensin de la nueva cadena complementaria.
Esa temperatura (de apareamiento) es
calculada a partir de la cantidad de adenina, timina, guanina y citosina en la secuencia del partidor. Recordemos que
los puentes de hidrgeno entre adenina
y timina y entre guanina y ciotosina, generarn fuerzas distintas en la unin de
las cadenas complementarias, haciendo
importante la proporcin de las bases en
el partidor. Cuanto mayor es la temperatura para la hibridacin del partidor,
ms especfica es su asociacin al DNA
genmico, pudiendo variar entre 35 y
65-68 o C. Cuanto mayor la especificidad
del partidor, mayor es la reproducibilidad del ensayo. Y finalmente, la etapa
de extensin de la nueva cadena se da,
en general, a la temperatura de 72 oC.
Esa es la temperatura ptima de la DNA
polimerasa. Todo ese proceso es posible
in vitro gracias a la automatizacin y,
porque la DNA polimerasa utilizada en
l, es resistente a temperaturas altas, tales como aquella de la etapa de
desnaturalizacin. Esta polimerasa fue
encontrada por primera vez en la bacteria Thermus aquaticus y es conocida
como Taq polimerasa (tambin existen
variaciones como la Pfu y el fragmento

de Klenow). La PCR se realiza en equipos que producen un cambio rpido de
temperatura, llamados termocicladores
(Rojo, 1999). Las tcnicas de marcadores moleculares que tienen como base
la PCR son: RAPD, Microsatlites, ISSR,
SCAR, STS y AFLP.
RAPD (Figura 7.5) utiliza como partidor
un nico oligonucletido de 10 bases nitrogenadas y de secuencia al azar (inespecfica). Ese partidor har asociacin en
cualquier sitio de toda la cadena del DNA
genmico. Por no ser especfico, en el
RAPD suelen ocurrir problemas con la
repetitividad de los ensayos (reproducibilidad). As, es necesario fijar muy bien
los parmetros del trabajo. La verdad, es
que pequeas diferencias de concentracin de los reactivos en la reaccin, pueden alterar el resultado; incluso, pueden
ocurrir varaciones por la utilizacin de
diferentes termocicladores. Es la tcnica
ms difcil de reproducir entre los laboratorios y por eso no es recomendada para ensayos con objetivo de caracterizacin molecular. Pese a esto, RAPD es la
tcnica de menor costo que tiene como
base la PCR. Adems de un fcil manejo,
detecta polimorfismos dominantes; esto
es, slo detecta estados orgnicos en
homocigosis. En la Figura 7.5 se puede
observar un anlisis en RAPD, donde se
encontr un fragmento marcador relacionado a un gen de resistencia del Phaseolus vulgaris al hongo Uromyces phaseoli
(Faleiro et al.,2000).
RAPD ya ha permitido muchsimos estudios que van desde identificacin gentica, anlisis de diversidad, mapeo gentico en plantas anuales como arroz,
maz, soja (Ferreira y Grattapaglia,
157
Figura 7.5. Productos de amplificacin en RAPD del DNA genmico de Phaseolus vulgaris
con el partidor OPF10 en gel de agarosa 1,2% teido con bromuro de etidio.
P1 y P2 corresponden a los parentales resistente y susceptible al hongo Uromyces phaseoli
respectivamente y F2 es una poblacin segregante de 27 plantas. M corresponde al
marcador de peso molecular (fago digerido com EcoRI, BamHI y HindIII.
La flecha indica el fragmento marcador relacionado al gen de resistencia.
Fotografa gentilmente cedida por el Dr. Fbio G. Faleiro, EMBRAPA Cerrados.
1998), forrajeras (Kazan et al., 1992) e

incluso en plantas forestales, como el
eucalipto (Grattapaglia y Sederoff, 1994,
Grattapaglia et al., 1995), frutales como
el mango, naranjo, chirimoya (Fang et
al., 1997; Ravishankar et al., 2000;
Ronning y Schnell, 1995; Schnell, 1993)
y nemtodos o microrganismos (Hahn et
al., 1994; Hayden et al., 1994). Otra
aplicacin para RAPD tambin es la deteccin de variaciones somaclonales en
plantas micropropagadas en cultivo de
tejidos, pues puede analizar posibles diferencias inducidas genticamente que
pueden ocurrir durante la regeneracin
de las plantas en medio nutritivo (ver
tambin captulo 4).
Aunque RAPD no pueda detectar estados gnicos en heterocigosis, se puede
aadir informacin por medio del clonaje de una banda representativa en el
anlisis que, en seguida, es sometida al
158
corte con una enzima de restriccin. Si

esta banda contiene una secuencia de
nucletidos distinta entre dos o ms especies, se observar un patrn diferente
de fragmentos producidos por la accin
de la enzima. De esa manera entonces,
se consigue distinguir las diferentes especies. Otra alternativa es clonar el fragmento polimrfico y transformarlo en un
SCAR. As, el fragmento polimrfico se
estabiliza y se puede aadir informacin
al estudio, como por ejemplo su propiedad como carcter gentico en homocigosis o heterocigosis, utilizndosele en
ensayos de RFLP (Fang et al., 1997). Estas estrategias utilizan herramientas de
la tcnica del DNA recombinante, como
el clonamiento y la deteccin de clones
(ver tambin captulo 5).
Los microsatlites son secuencias repetidas en el DNA genmico. Estos marcadores son muy polimrficos y pueden
ocurrir como secuencias perfectas, por

ejemplo (GA) 8 , (TTA) 9 o imperfectas,
como por ejemplo (TC) 4GAATGA(TC) 7 .
Esos marcadores son especficos para
cada especie, por lo cual se hace necesario caracterizar esas secuencias para
cada caso especfico a estudiar. Lo anterior implica un costo muy alto. Para
caracterizar las secuencias microsatlites, es necesaria la construccin de una
librera genmica (ver captulo 8) y la
seleccin de colonias que contengan secuencias homlogas a las posibles secuencias de microsatlites ya caracterizados (patrn semejante) (Figura 7.6). El
fragmento de DNA de las colonias seleccionadas debe ser secuenciado, la
secuencia evaluada y a partir de ellas,
son diseados partidores homlogos a
las zonas flanqueadoras de las posibles
secuencias repetitivas, que corresponderan a los microsatlites encontrados.
Esos partidores deben ser probados en
una PCR. Para cada reaccin son utilizados dos partidores. El anlisis del PCR
se hace en geles de poliacrilamida teidos con nitrato de plata o tambin se les
puede hacer en geles de agarosa teidos con bromuro de etidio. El primer tipo
de anlisis tambin eleva mucho el costo de la tcnica. Los microsatlites producen polimorfismos del tipo co-dominante, por lo tanto, reconocen expresin
gnica en homocigosis y heterocigosis.
Actualmente, esos marcadores son recomendados principalmente para los ensayos de caracterizacin, pues son ellos
los que mejor reproducen resultados
entre los laboratorios de Europa (Jones
et al., 1997). Esos marcadores tambin
sirven para fingerprints y anlisis de diversidad gentica (Eiadthong et al.,
1999).
Construccin de
librera genmica
Seleccin de
colonias positivas
para secuencias
relacionadas con
microsatlites
(Hibridacin
en colonia)
Purificacin y secuenciacin
de las colonias
Anlisis de las secuencias y diseo

de partidores de las secuencias
flanqueadoras de microsatlites
Pruebas para seleccionar los mejores
partidores en PCR (polimrficos y
marcadores de carcter gentico)
Figura 7.6. Esquema demostrativo de las
principales etapas para obtencin de
microsatlites especficos.
El ISSR es semejante al microsatlite,

pero lo que se hace es producir un partidor que amplifica la secuencia entre las
secuencias microsatlites. Esa tcnica es
patentada cuando se utiliza el extremo
5 (Deshpande et al., 2001).
La tcnica de STS es aquella que desde
el RFLP, permite clonar el fragmento
marcador (cuando no se conoce) y, a partir de su secuencia, hacer diseos de partidores especficos, para amplificar slo
esa secuencia. De la misma manera,
cuando es clonado un fragmento polimrfico desde RAPD, y es secuenciado
para utilizacin en amplificacin PCR,
se produce un SCAR. Como se comen-
159
t, el SCAR estabiliza el fragmento marcador de RAPD y esa es una posibilidad

que puede disminuir la desventaja que
tiene RAPD con respecto a la repetitividad. SCAR permite tambin la utilizacin del fragmento clonado en anlisis
RFLP y as, ese marcador puede ser evaluado en expresin en homocigosis y
heterocigosis. STS y SCAR son herramientas muy tiles en programas de mejoramiento (Deng et al., 1997; Fang et
al., 1997; Barbosa, 1998; Milach, 1998).
5
3
GAATTC
CTTAAG
Ambas metodologas utilizan las tcnicas del DNA recombiante ya mencionadas en el capitulo 5.
AFLP (Figura 7.7) es una herramienta
donde tambin se emplea el corte del
DNA genmico con enzimas de restriccin. Pero, en este caso, se hace con dos
tipos de enzimas, una de corte infrecuente (por ejemplo EcoRI)y otra de corte frecuente (Msel). Despus de la digestin, se hace ligacin de adaptadores paTTAA
AATT
3
5
Restriccin con EcoRI y Msel

AATTC
G
C
GTTAA
T
AAT
TAC
+
G
Adaptador Adaptador Msel
Adaptador EcoRI
CAATTC
GTTAAG
TTAC
AATG
Amplificacin con primers

selectivos
3
Con. 1
GTTAAG
CAATTCC
AATG
1/4
de los fragmentos
CAATTCCG
1/16
de los fragmentos
CAATTCCGA
1/64
de los fragmentos
Nucletidos selectivos
Primers
con 3
nucletidos
selectivos
3
5
GTTAAGGCT
CAATTCCGA
AATG
Amplificacin
3
5
GTTAAGGCT
CAATTC G
G
A
AATG
NO Amplificacin
Electroforesis desnaturalizante en acrilamida y

tincin con nitrato de plata
Figura 7.7. Esquema demostrativo de las principales etapas para anlisis AFLP.
El DNA genmico es digerido con las enzimas de restriccin EcoRI y MseI, reaccin a la que
se ligan los adaptadores - EcoRI y - MseI (azul y verde respectivamente). Luego de ligados, estos
mismos sitios sirven como zonas de anclaje para una serie de primers que amplificarn
selectivamente, segn el nucletido adicional a la secuencia del adaptador. Estos pueden ser
con +1 nucletido selectivo, +2 nucletidos o +3 nucletidos (bases en rojo), amplificndose
1/4, 1/16 1/64 de los fragmentos totales. Usualmente, se utiliza una reaccin de pre-amplificacin con primers +1 nucletido selectivo y luego, desde esta reaccin de PCR,
se reamplifica con primers +3 nucletidos selectivos. Finalmente, los productos
de PCR se resuelven en electroforesis en acrilamida y tincin con plata.
160
ra los dos tipos de enzima. Luego, la PCR

se hace en dos etapas que son selectivas. La primera se hace utilizando partidores de secuencia complementaria a
los adaptadores, pero con un nucletido
al azar. En la segunda etapa, se utilizan
partidores complementarios a los
adaptadores pero con dos nucletidos al
azar. Esas distintas etapas de amplificacin son utilizadas para disminuir el
nmero de fragmentos amplificados y
poder resolverlos bien en un gel de
poliacrilamida. Asimismo, en el anlisis
AFLP se produce amplificacin de un
gran nmero de fragmentos. El anlisis
de los fragmentos amplificados se hace
en gel de poliacrilamida teido con plata
o tambin, se suele utilizar fluorescencia y radioactividad (Figura 7.8). Igualmente tiene un costo alto, pero es la es-
trategia que produce ms polimorfismos.

Tiene gran potencial para ser utilizada
para producir fingerprints (Figura 7.8)
(Eiadthong et al., 2000; Faleiro et al., en
prensa). De la misma forma que algunas
anteriores, el polimorfismo producido
por AFLP slo analiza estados gnicos
en homocigosis (como RAPD) y tiene
como desventaja, ser una tcnica
patentada.
CARACTERSTICAS
DE LOS MARCADORES
MOLECULARES
Un marcador es evaluado por su capacidad de producir polimorfismos (Contenido de Informacin Polimrfica o PIC)
y Multiplex (nmero de bandas), que co-
Figura 7.8. Patrn de amplificacin AFLP separados

en gel de poliacrilamida y revelado con fluorescencia
obtenidos desde 23 plantas distintas de Theobroma cacao.
(Fotografa gentilmente cedida por el Dr. Fbio G. Faleiro, EMBRAPA Cerrados).
161
rresponde a la cantidad de loci analizados simultneamente. Esos dos parmetros deben ser los ms altos posibles y
representan el ndice del marcador. En
la Tabla 7.1 pueden ser observadas las
diferencias de PIC y Multiplex para los
principales marcadores.
Tabla 7.1.
Comparacin entre Diferentes Marcadores
Moleculares con respecto a la produccin de
informacin polimrfica y loci analizados*
Marcador/Tipo
RAPD
Multiplex
PIC
RFLP
SSR
AFLP y ISSR
Informaciones obtenidas en el Curso Aplicao de

marcadores Moleculares em Programas de
Melhoramento Gentico Vegetal, Programa CABBIO /
CNPq, UFRGS, 2000.
En RAPD, se puede aumentar multiplex

utilizando geles de poliacrilamida y en
microsatlites, con muestras hechas en
geles de manera escalonada (utilizacin
de dos secuencias microsatlites que
producen fragmentos de distintos tamaos). Adems de esas diferencias, hay
otras con respecto al tipo de ensayo,
deteccin, tiempo, etc., que estn resumidas en la Tabla 7.2.
Aspectos importantes al momento de
elegir un marcador son: objetivo del estudio y disponibilidad tcnica y financiera del laboratorio. Es necesario saber
muy bien el objetivo que se quiere alcanzar y el perodo de tiempo disponible para lograrlo, ya sea corto, mediano
o largo.
162
APLICACIONES DE LOS
En general, los marcadores moleculares son
utilizados en estudios de enfermedades
genticas, pruebas de paternidad/parentesco, tambin como herramientas en la seleccin de plantas o animales, en programas de mejoramiento (Barbosa, 1998;
Milach, 1998; Coutinho y Reginato, 2001;
Griffiths et al., 2001) y finalmente, en estudios cuya finalidad es la caracterizacin
(taxonoma, evolucin, conservacin).
Aplicacin para estudios

de caracterizacin
Los parmetros ms importantes para utilizar marcadores moleculares en la caracterizacin son: novedad, distiguibilidad, homogeneidad y estabilidad. As, deben ser capaces de demostrar pblicamente un alto poder de discriminacin, no
deben presentar interaccin con el ambiente, deben ser capaces de producir resultados equivalentes entre distintos laboratorios, deben permitir el clculo de distancias entre genotipos en forma consistente con otros caracteres, como informacin de pedigree. Preferentemente, debe
conocerse el control gentico de los
descriptos, y ser posible su localizacin
cromosmica. Adems, la metodologa de
anlisis de los perfiles generados, debe
ser capaz de traducirlos e interpretarlos.
Entre las principales tcnicas de marcadores moleculares, la ms adecuada a esos
parmetros es la de microsatlites. Actualmente, este tipo de estudio tiene un gran
impacto, pues son apuntadas como las herramientas ms poderosas para identificacin/caracterizacin de variedades, dando soporte a la propiedad intelectual de
las mismas (Eiadthong et al., 1999).
Tabla 7.2. Comparacin entre los principales

marcadores (distintos aspectos)*
Marcador/
Parmetro
RAPD/ISSR
RFLP
SSR
AFLP
Evaluacin
expresin
gnica
Dominante
Co-dominante
Co-dominante
Dominante
PCR
Southern blot
e hibridacin
PCR
Digestin,
ligacin, PCR
Gel agarosa o
poliacrilamida
teido con
bromuro de
etidio o
fluorescencia
Hibridacin
(quimioluminescencia,
fluorescencia
o radiactividad)
Gel de poliac
y nitrato de
plata o
fluorescencia
Gel de
poliacrilamida y
nitrato de plata
o fluorescencia
Cantidad de
DNA utilizado
20-25 ng
2-20 mg
20-30 ng
0,5 ng
Tiempo
Relacin entre
los genotipos
1 2 das
Bandas
homlogas =
movilidad
4 a 12 das
Homologa
X sondas
1 2 das
Se amplifica
y detecta locus
2 das
= RAPD
Especificidad
Nivel de
polimorfismo
No
Medio
Si
Medio
Si
Alto
No
Medio
Bajo
Alto
Menor que
RFLP y mayor
que RAPD
No
No
No/ Si para
ISSR para el
extremo 5
Ensayo
Deteccin
Costo
Patente
Menor que
RFLP y mayor
que RAPD y SSR
Si
Informaciones obtenidas en el Curso Aplicao de marcadores Moleculares em Programas de Melhoramento

Gentico Vegetal, Programa CABBIO / CNPq, UFRGS, 2000.
Aplicaciones de los marcadores

moleculares en programas de
mejoramiento
En programas de mejoramiento, los marcadores moleculares pueden ser utilizados con finalidad de identificacin de
individuos, anlisis de diversidad gnica, mapeo gentico, mapeo de caractersticas cualitativas y cuantitativas he-
redadas, mapeo comparativo entre distintas especies, estudios de evolucin,

caracterizacin gentica de especies,
gentica de poblaciones y clonaje de
genes (Lee, 1995; Ferreira y Grattapaglia, 1998).
La identificacin de plantas puede ser
hecha por medio de VNTR, RAPD, SSR,
ISSR o AFLP. La aplicacin de marcado-
163
res moleculares para identificacin gentica, permite optimizacin de bancos

de germoplasma y colecciones nucleares para programas de mejoramiento. Ese
tipo de anlisis asociado a evaluacin
en software adecuados, conduce a los
estudios de diversidad gentica que permiten al fitomejorador, una base para su
eleccin de individuos como progenitores, pues analiza la proximidad o divergencia gentica de los progenitores top
cross del programa. De esa manera, el
fitomejorador puede optimizar los cruzamientos y alcanzar individuos hbridos con caractersticas mejoradas en
tiempo ms corto.
El mapeo gentico es un estudio importante en programas de mejoramiento,
pues es necesario, en un momento dado,
saber en cual cromosoma est la caracterstica de inters y cmo sta segrega
en la poblacin (Ferreira y Grattapaglia,
1998). El mapeo gentico que se consigue por medio de trabajos con marcadores moleculares (como veremos en el
captulo 8), tambin puede ser utilizado
para ubicar en el genoma de una planta
transgnica, el gen que otorg la caracterstica introducida a travs de la transformacin.
La utilizacin de los marcadores moleculares para mapeo de caractersticas
cuantitativas (Quantitative Trait Loci,
QTL), es extremadamente til. Rasgos
tales como resistencia a enfermedades
o produccin, son caractersticas que
dependen de ms de un gen y as son de
difcil evaluacin. Por eso, hacer seleccin asistida con marcadores moleculares para fragmentos relacionados con
QTL, tiene un gran impacto (Barbosa,
164
1998). Adems de eso, tambin se puede hacer el mapeo de caractersticas

heredadas que sean cualitativas. En esos
casos, la tcnica de SCAR es muy til
para hacer seleccin asistida. La seleccin asistida fue sealada como una tcnica que disminuye el costo de un programa de mejoramiento (Deng et al.,
1997, Schneider et al., 1997, Yu et al.,
2000). La seleccin asistida puede tambin ser utilizada para reconocimento de
individuos en una progenie que contiene un gen introducido por transformacin gentica de plantas.
Una tcnica asociada a los marcadores
moleculares que tambin es muy utilizada en programas de mejoramiento, es
el anlisis en grupos segregantes (Bulked
Segregant Analysis) (Michelmore et al.,
1991). Esa herramienta, ya permiti la
identificacin de genes o fragmentos
asociados a una caracterstica (Gusmo,
1997), como tambin fue utilizada en
estudios para encontrar fragmentos especficos entre diferentes especies, utilizndose como tcnica de marcadores
moleculares, el RAPD (Grattapaglia et
al., 1992).
Los marcadores moleculares ya permitieron el clonaje de un gran nmero de genes (Map-based cloning) (Wing et al.,
1994; Wang et al., 1999). As, la tcnica de los marcadores moleculares puede tambin relacionarse con las del DNA
recombinante y transformacin gentica
de plantas.
Es conveniente indicar que, el estudio
utilizando marcadores moleculares en
programas de mejoramiento con objetivo de anlisis de diversidad gentica,
mapeo de caractersticas cualitativas o

cuantitativas o an mapeo gentico, necesita no slo conocimiento tcnico de
esas metodologas, sino que tambin conocimiento para anlisis estadsticos en
las progenies analizada (mtodos biomtricos de evaluacin) y tambin de softwares tales como SAS, NTSYS, Mapmaker, Mapmaker-QTL o Linkage.
Actualmente, en la era de la genmica,
los estudios de secuenciacin conducen
al conocimiento de diversas secuencias
gnicas nuevas. La caracterizacin de
nuevos genes, asociados a alguna caracterstica de inters, puede ser una herramienta muy poderosa para dar soporte
a los programas de mejoramiento y estn asociadas al anlisis con marcadores moleculares (ver Captulo 8). Por medio del conocimiento de sus secuencias,
se pueden hacer diseos con partidores
especficos y as hacer amplificacin especfica de los genes ms importantes
que se quieren fijar en una poblacin y
analizar su segregacin en sta. An
ms. se puede estudiar su presencia gentica (homocigosis o heterocigosis). El
mapeo gentico de organismos utilizando los marcadores moleculares, tambin
da soporte a los trabajos de secuenciacin completa de genomas (Ferreira
y Grattapaglia, 1998).
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167
168
GENMICA
CAPTULO 8
GENMICA
Humberto Prieto E.
INTRODUCCIN
a decodificacin de las secuencias

en que los nucletidos se ordenan
para dar origen a los diversos genomas,
constituye una de las contribuciones ms
espectaculares de los ltimos aos en el
mbito de la ciencia. Esto ha permitido
formular ya variadas teoras acerca de
las relaciones evolutivas de varias especies vivas, en las que obviamente, se incluye la humana.
En 1965, trabajando con el tRNA de
alanina, Robert Holley (Holley, 1968) por
primera vez obtuvo la secuencia completa de un cido nucleico. l encontr que
ste estaba constitudo por 76 bases, de
las cuales 10 de ellas estaban modificadas qumicamente. Sin embargo, la propuesta de cdigo gentico para la traduccin de secuencias nucleotdicas de
Marshall Nirenberg y Har Khorana, estableca que esta traduccin se realizaba
bajo la base de la lectura de grupos de
tres nucletidos, llamados codones, pero
adems reconoca la existencia de varios
codones para un mismo aminocido (codones redundantes). As, el ordenamiento aminoacdico descubierto por Sanger
slo dio paso a la incgnita de la real
secuencia nucleotdica que deba tener
su gen.
En los aos 70, el mismo Sanger y el
equipo conformado por Alan Maxxam y
Walter Gilbert, implementaron en forma
paralela, distintas aproximaciones qumicas para acceder al conocimiento del

orden lineal de los nucletidos que conforman un gen. De este modo, surge el
mtodo de secuenciacin de los cidos
nucleicos, conocido como de la terminacin de la cadena, utilizando anlogos de los nucletidos que conforman
el DNA (Sanger et al., 1977).
La metodologa propuesta por Sanger, se
bas en trabajos preliminares propuestos por Kornberg en base a la replicacin
del DNA a partir de un molde (captulo
5). As, si se utiliza una cadena de
politiminas (poliT) como molde o templado, la DNA pol ir incorporando
adeninas como complemento a este
molde. Si recordamos, la adicin de residuos en la hebra naciente del DNA es
mediante la generacin de un enlace
entre el grupo fosfato unido al C-5 del
grupo azcar del nuclesido entrante y
el OH- del C-3del grupo azcar del
nucletido previo (lo que se conoce
como direccin 5-3 de sntesis). Por lo
tanto, la existencia de este grupo OHen el C-3 de la nueva cadena de DNA
(cadena naciente), es fundamental para
la reaccin de polimerizacin. Precisamente, Sanger predijo que si este grupo
OH- no existiera, la polimerizacin no
proseguira. De esta forma, si en vez de
situarse un nucletido con sus grupos
OH- en el C-3 en la cadena que se est
elongando, se situara un nucletido sin
este grupo OH, es decir un anlogo
169
didesoxinuclesido trifosfato (ddNTP), la

polimerizacin o elongacin de la cadena de DNA, se detendr.
En otras palabras, si un DNA molde es
distribuido entre cuatro tubos distintos
y a cada de ellos les adiciona una mezcla de los cuatro desoxinuclesidos trifosfato (dATP, dTTP, dGTP y dCTP) con
uno de ellos marcado radiactivamente,
ms la DNA pol y un partidor, la elongacin ocurrir sin ningn problema en
ninguno de estos tubos. Pero Sanger adicion a cada uno de estos tubos, uno de
los ddNTPs (ddATP, ddCTP, ddGTP o
ddTTP). As, cada tubo de Sanger contena los cuatro dNTPs ms un ddNTP especfico. De esta forma y cuidando una
adecuada razn dNTPs/ddNTP, la elongacin se detuvo cuando ese ddNTP se
incorpor a la cadena naciente de DNA.
Como cada tubo estaba marcado segn
el ddNTP que se haba adicionado, Sanger saba en dnde estaban parando su
elongacin los fragmentos nuevos de
DNA. As, en cada uno de los tubos haba una mezcla o poblacin de fragmentos de DNA de distinto tamao, pero que
siempre haban parado en un ddNTP especfico, el adicionado a ese tubo determinado.
En seguida, Sanger separ cada uno de
los fragmentos amplificados mediante
electroforesis. Deposit el contenido de
cada tubo en un pocillo de un gel de
acrilamida y luego puso en contacto este
gel con una placa tipo fotogrfica, de
manera que las bandas correspondientes
a cada fragmento se hicieron visibles al
revelar dicha placa, pues recordemos que
tambin haba un nuclesido radioactivo
en la mezcla de reaccin. Segn el principio de la separacin electrofortica, al
170
someterse a un campo elctrico, las bandas ms pequeas se movern ms rpido en la trama del gel, que las ms grandes. De esta forma, la placa fotogrfica
tendr marcada una escala de tamaos correspondiente a los fragmentos generados
por la DNA pol en cada tubo, hasta que
se incorpor un ddNTP y detuvo la elongacin. As, el DNA estaba siendo secuenciado de manera confiable y de una manera relativamente poco laboriosa.
Con el desarrollo de esta gran herramienta, tambin en 1977, se public la
primera secuencia de un gen humano
(Seeburg et al., 1977). En 1986, Hood y
su grupo (Strauss et al., 1986) publicaron un mejoramiento de la metodologa
originalmente propuesta por Sanger. Esta
mejora consisti en no utilizar radioactividad en alguno de los dNTPs que estaba siendo incorporado por la DNA pol,
sino emplear ddNTPs fluorescentes coloreados de manera distinta segn fueran ddATP, ddCTP, ddTTP o ddGTP. As,
cada fragmento elongado en la polimerizacin incorporar un anlogo terminador de la cadena que ser adems
"coloreado", por lo que ser ledo de
manera automatizada por un sistema
detector, sensor de la longitud de onda
o color del respectivo ddNTP. Al mismo
tiempo, la relacin entre el tamao del
fragmento sintetizado y su color, poda
ser fcilmente relacionada por un computador. De esta forma, nace el proceso
conocido como secuenciacin automtica, tenindose como el primer secuenciador automtico aquel desarrollado
por la empresa Applied Biosystems, en
California en el ao 1987.
Se inici as, una carrera que an estamos viviendo, la genmica de los seres
GENMICA
vivos. Es decir, conocer exactamente el

orden que tienen los nucletidos a travs de todo el genoma de los seres vivientes. A priori, se podra pensar que esta es una misin relativamente sencilla,
pero en realidad el ordenamiento simple
de los nucletidos a travs de un genoma
no se puede evaluar de manera solitaria
y, hoy en da, se sabe que a l deben adicionarse estudios que relacionan este genoma con su funcionalidad y productividad. Y como se supondr, esto es una funcin del contexto celular. As, en forma
paralela, surgieron reas como la Protemica y Metabolmica. Finalmente, a estas alturas ya es evidente que slo con la
ayuda de los computadores y programas
especficos seremos realmente capaces
de entender toda esta gran cantidad de
informacin que a diario se est generando, surgiendo as la Bioinformtica.
UBICNDONOS
EN UN GENOMA.
Las primeras banderillas, marcadores
moleculares.
De una forma consecuente al descubrimiento de la nucleina, primera descripcin para los cidos nucleicos, una de
las primeras herramientas para orientarnos en los genomas proviene de las tcnicas de tincin de DNA, las que en su
mayora lo utilizan en forma de cromosomas. La tincin de los cromosomas
genera patrones especficos de bandas,
los que son de gran utilidad en estudios
citogenticos. Sin embargo, estas bandas corresponden a millones de nucletidos y miles de genes. Si consideramos
estos cromosomas teidos como un molde de cocina que debe ser llenado con
un delicioso pastel, uno de los primeros
objetivos ser hacer el pastel que se deber cocer. As, una de las primeras
aproximaciones para la elucidacin de
un genoma, es el saturar este complejo
mapa lineal de nucletidos constituyente de los tangibles cromosomas, con
cientos o miles de marcadores moleculares, los que ya conocemos del captulo anterior.
Vayamos a un ejemplo simple pero a la
vez complejo, el desarrollo del Genoma
Humano, proyecto emprendido en 1989.
El primer director del Programa Genoma
Humano, James Watson, plante la estrategia de utilizar a los marcadores moleculares como herramientas de aproximacin a los genes de un cromosoma.
Su idea fue ubicar tantos marcadores
como fuera posible, de modo que estos
estuvieran relacionados con secuencias
nicas. De esta forma, uno de los primeros trabajos en el desarrollo del Proyecto Genoma Humano, fue ubicar lotes de marcadores sobre unidades subcromosomales, por ejemplo, de 150.000
nucletidos. Encontrar genes, los cuales
en trminos muy generales tienen unos
10.000 nucletidos en humanos, dentro
de estos segmentos de 150 mil bases es,
en la prctica, mucho ms fcil que encontrarlos dentro de un cromosoma
completo. Watson logr ubicar 30 mil
marcadores con secuencias nicas de
entre 100-300 nucletidos de largo, a
travs del genoma humano completo.
Para realizar esto, los cromosomas se
cortaron con enzimas de restriccin de
corte infrecuente, de forma de tener
como resultado estos fragmentos de
150.000 pares de bases aproximadamente (Figura 8.1A). Estos se ligaron y clonaron en unas nuevas herramientas mo-
171
leculares, pero que manejan los mismos

principios tericos descritos anteriormente en el captulo 5: los cromosomas
artificiales de bacterias (BACs, Bacterial
Artificial Chromosomes). Los BACs y los
plasmidios poseen grandes similitudes,
en cuanto a que son DNAs que se utilizan en el mesn del laboratorio, a los
que se les puede introducir un segmento de DNA de inters. Ambos son de origen bacteriano, por lo que podemos trabajarlos con bacterias, pero como se podr ver, un BAC admite 150 mil pares
de bases, fragmento notablemente mayor al que soporta un plasmidio.
Partiendo de estos clones BAC, la estrategia general consisti en cortarlos ordenadamente con distintas enzimas de restriccin (en digestiones separadas), de
forma de tener varios fragmentos que pudieran se superponibles entre ellos (Figura 8.1B). Con estos mapas de digestiones de cada clon BAC, se alinearon
zonas consenso de cortes entre varios
clones y se ensamblaron computacionalmente (Figura 8.1C), generando marcadores que en esencia, corresponden
a secuencias nicas de 100 a 300 bases
cada una (Figura 8.1D).
Figura 8.1. Clones BAC para secuenciacin del genoma humano. Watson propuso generar
fragmentos de los cromosomas humanos (de alrededor de 150 mil pares de bases) a travs
de cortes con enzimas de restriccin de corte poco frecuente (A). Estos se clonaron en
cromosomas artificiales de bacterias (BACs) (B) donde nuevamente se cortaron con enzimas
de restriccin, esta vez generando cortes ms frecuentes (C). Finalmente, estos mapas se
reconstituyeron, sobreponiendo segmentos comunes, de manera de ordenarlos de la forma
como deberan estar en su respectivo cromosoma. Al mismo tiempo, se aislaron los
marcadores especficos, los que corresponderan a secuencias nicas representativas
de cada fragmento cromosmico inicial (D).
172
GENMICA
Nuevas marcas, etiquetas de secuencias expresadas.

Considerando que aproximadamente el
3% del genoma humano corresponde
efectivamente a genes, el intentar ubicarlos utilizando el mapa de marcadores diseado por Watson, se converta
en una misin extremadamente laboriosa. De a esto, muchos de los integrantes
de este megaproyecto, saban que sera
necesario reducir el universo sobre el
cual buscar. El DNA recombinante y la
transformacin de plantas nos han mostrado que, una de las primeras necesidades en el conocimiento de los genes,
es el poder manejarlos en el laboratorio. Como ya hemos visto, una de las
formas de manipular DNA en un tubo de
ensayo es la etapa de clonamiento. En
teora, un investigador puede introducir
o clonar prcticamente cualquier segmento de DNA en un plasmidio. Este
DNA insertado y su significancia biolgica, es la base de dos tipos de herramientas bsicas de la biologa actual, las
genotecas.
Las genotecas.
stas son colecciones de plasmidios (u
otro vector manipulable de DNAs como
por ejemplo un fago), que tienen insertados fragmentos representativos de
genes de un organismo.
Existen al menos dos vas de tener representado un gen. Como se discuti en
el captulo 5, en eucariontes un gen est
constituido por exones e intrones. Como
contrapartida, una bacteria no posee
intrones. De esta forma, si se piensa que
se puede tener el genoma de una clula
eucarionte digerido con enzimas de res-
triccin y ligado a plasmidios, estarn

clonados genes con todas sus secuencias, incluyendo las secuencias reguladoras, los exones y los intrones. Esto
se conoce como una genoteca genmica
y representa toda la carga informtica de
un individuo, independiente de su medioambiente o de su estado fisiolgico.
Sin embargo, si mediante herramientas
del DNA recombinante extraemos
mRNAs de una clula (eucarionte o procarionte), y utilizando transcriptasas reversas generamos una primera hebra de
DNA exactamente complementario al
mRNA aislado, fabricamos lo que se llama un cDNA hebra simple. Si con ayuda de la DNA pol sintetizamos su hebra
complementaria, tendremos un cDNA
doble hebra. Vale la pena referirnos a la
cualidad de este cDNA: en l no estn
representadas secuencias promotoras ni
los intrones. Si clonamos en plasmidios
cDNAs retrotranscritos de una poblacin
representativa de mRNAs de una clula,
tendremos lo que se denomina una
genoteca cDNA (Figura 8.2). Ntese que
por lo general, nuestra poblacin de
mRNAs aislados corresponder a aquel de
clulas bajo un determinado estado fisiolgico o ambiental, por lo que guardar
as una relacin funcional respecto de una
situacin especfica. De este modo, las
genotecas cDNA son en su mayora funcionales.
Una aproximacin experimental, a la
vez sencilla y barata para dar con genes
que conforman nuestro genoma, es el
utilizar seales que estn ya situadas
dentro de genes que se expresan. El requisito es que stas, al igual que los
marcadores desarrollados por la estrategia de Watson, deben ser nicas.
173
Figura 8.2. Genoteca cDNA de cerebro. En un estadio especfico se extrae el mRNA

de estas clulas, el que sirve para ser retrotranscrito a cDNA hebra simple.
Luego, mediante la DNA pol I se sintetiza la segunda hebra de este cDNA y
posteriormente se clonan en un vector apropiado, en este caso, un fago.
Seales etiqueta de genes que se

expresan.
Craig Venter, un colaborador y amigo de
Watson, quien trabajaba buscando genes
humanos en el Nacional Institute of
Health (NIH), utiliz una genoteca cDNA
de cerebro humano que estaba hecha con
anterioridad, como base de templados
para buscar secuencias nicas que fue-
ran etiqueta o marcadoras de genes que

estaban representados en esa genoteca de
cerebro. Estas secuencias se denominan
etiquetas de secuencias expresadas (EST,
de Expressed Sequence Tags). La estrategia de Venter fue amplificar por PCR,
zonas de 150 a 400 nucletidos, utilizando como DNA templado esta genoteca
cDNA de cerebro humano (Figura 8.3).
Para esto, utiliz partidores aleatorios,
Figura 8.3. Desarrollo de ESTs. A partir de cDNAs de una genoteca, estos son amplificados
aleatoriamente mediante partidores, generndose amplicones de distinto tamao, representativos de los genes capturados por la genoteca. Los amplicones, representan entonces a genes
especficos, los que pueden ser secuenciados y utilizados como seales de una secuencia
de un gen que se est expresando en un momento especfico de una clula.
174
GENMICA
que permitieron amplificar distintas bandas nicas en tamao y secuencia. Estos

ESTs corresponden, entonces, a genes expresados en el cerebro, puesto que ellos
provienen de una genoteca cDNA de cerebro (es decir, de un mRNA de este tejido). El resultado final de este grupo fue
la obtencin de 2375 ESTs y sus respectivas secuencias. Increblemente, slo el
17% de stas fue conocida, al compararla con una base de datos que contena la
secuencia de todos los genes conocidos
a la fecha. Algunos de los genes identificados result ser de distribucin generalizada en el cuerpo humano, como el de
la -actina; pero otros mostraron ser ms
especficos del cerebro, como el gen bigbrain previamente identificado en
Drosophila melanogaster (Rao et al.,
1990).
El 83% de genes deconocidos fue, sin duda, el resultado ms excitante a estas alturas. As, pronto este grupo desarroll
30.000 ESTs adicionales en unos pocos
aos, los que estaban obviamente relacionados a genes nuevos. Esto marc el
inicio, tanto de grandes empresas biotecnolgicas dedicadas a la genmica (como
Human Genome Sciences e Incyte Genomics), como de la discusin sobre la finalidad de la carrera por conocer y manipular genes.
Desde el punto de vista tcnico, uno de
los lados dbiles de esta estrategia es
que, genes con baja expresin de su
mRNA, estarn pobremente o simplemente no representados por una coleccin de ESTs. Adems, los bancos de
ESTs, no identificaran zonas reguladoras
de los genes que estaban siendo anotados.
ROMPIENDO UN GENOMA
Y ESTUDINDOLO POR PARTES
Consciente de la debilidad de los ESTs,
Watson decide extender la estrategia de
romper el DNA humano para tenerlo
prcticamente por completo, en forma
de pedazos manejables y abordables en
el laboratorio. Esta estrategia recibe el
nombre de mapeo fsico completo.
Mapeo Fsico por ensamblaje de

clones BAC.
Debido al trabajo previo de mapeo con
los clones BAC de 150 mil nucletidos,
se tena toda una librera BAC con marcadores de secuencias nicas de 100300 nucletidos anclados o ubicados.
En adicin, a aquellos clones BAC que
no se les pudo relacionar experimentalmente con un marcador, se les someti
a un estudio ms detallado, digirindolo con enzimas de restriccin adicionales. Esta vez se utilizaron enzimas con
secuencias de corte ms comunes que
las inicialmente utilizadas. Estos sitios
de restriccin, tambin se convirtieron
en seales fsicas tiles como marcadores moleculares y permitieron dar cierto
orden a la librera de BACs ya diseada.
Luego de este ordenamiento, se seleccionaron los BACs que tericamente seran suficientes para cubrir todo un
cromosoma, segn la comparacin con
los marcadores que originalmente se haban situado, a razn de uno por cada
150 mil bases. Como trabajar con megaplasmidios como los BACs con insertos de ms o menos 150 mil nucletidos,
es abordable pero no trivial en el laboratorio, estos se digirieron nuevamente
para generar fragmentos de aproximada-
175
mente 1.500 pares de bases, los que se

subclonaron en vectores tipo fago, de
manejo experimental similar a los plasmidios descritos anteriormente (sobre
todo en lo referente al tamao del DNA
externo insertado). Los fagos tambin
pueden ser utilizados en la elaboracin
de genotecas y, para ser apegados a la
verdad, fue una genoteca elaborada con
fagos, la que utiliz Venter para generar
sus ESTs de cerebro (Figura 8.2).
De este modo, y nuevamente para asegurar la factibilidad de sobreposicin de
fragmentos en el armado final, se digiri cada clon BAC con distintas enzimas
de restriccin.
Los clones de fago (con fragmentos de
DNA genmico humano de aproximadamente 1500 nucletidos), se secuenciaron individualmente, informacin con la
que luego se debi emprender el camino reverso. Es decir, comenzar a pegar
fragmentos, aunque en forma terica y
con ayuda de programas computacionales. Como podr calcularse, la base
del armado reverso fue la utilizacin de
las secuencias de las zonas que se superponan. Esto se hizo tambin con la
ayuda del conocimiento previo de la posicin relativa de los marcadores moleculares generados inicialmente por el
proyecto. De esta forma, se armaron las
secuencias contiguas o simplemente
contigs. Armar nuevamente cada uno
de los fragmentos pequeos, hasta llegar al orden de los fragmentos de 150
mil nucletidos de cada clon BAC, fue
el paso siguiente. Luego, obtenida la informacin para cada clon BAC derivado de cada cromosoma, se armaron los
cromosomas. Al tener la informacin de
la secuencia de cada cromosoma, se
176
haba terminado el secuenciamiento del

genoma humano.
Mapeo por ruptura fsica del DNA.

Venter, en su anhelo por desarrollar formas ms directas para secuenciar genomas, propuso el mtodo de la secuenciacin por ruptura del DNA, lo que se conoce como shotgun sequencing. Este mtodo se inicia con la generacin de pedazos de DNA generados al azar, pero que
tengan secuencias que se sobrepongan.
Esto se consigue hacindolo pasar en forma de solucin acuosa, por una jeringuilla con aguja (Figura 8.4). Segn la presin o nmero de veces que esta solucin
se haga pasar por la aguja, ser el tamao
promedio de los fragmentos que se generarn. De esta forma, Venter obtuvo soluciones con fragmentos promedio de 2.000
bases y otra solucin con fragmento promedio de 10.000 bases. Ambas soluciones de ruptura se clonaron en plasmidios,
a modo de genoteca genmica. Luego, se
secuenciaron los extremos de cada uno
de los clones bacterianos (Figura 8.5A),
puesto que l ya saba que no necesitaba
conocer la secuencia del todo el fragmento. Finalmente, utiliz esta informacin
para que, con ayuda de programas computacionales desarrollados ex profeso, se
hiciera automticamente el ensamblaje de
los contigs (Figura 8.5B). As, sumando
secuencias que se sobreponan, Venter se
propuso acortar camino sobre el trabajo
que significa el uso de marcadores y
clones BAC, para obtener la secuencia del
genoma humano completo (Figura 8.5C).
Su primer gran resultado vino en 1995,
cuando report la secuencia de los 1,8 millones de nucletidos de Haemophilus
influenzae (Smith et al., 1995). Un nuevo
resultado vino luego en 1999, cuando des-
GENMICA
de su compaa Celera, inform del genoma completo de Drosophila melanogaster

(Adams et al., 2000), el cual obtuvo en
colaboracin con el ya formado Drosophila Genome Project.
Sin duda, estos primeros resultados de
secuenciacin de genomas ya auguraban
un pronto primer anuncio en el conocimiento del genoma humano. As, en 26
de Junio del 2000, el mismo Venter y
Francis Collins, reemplazante de Watson
como jefe del Programa Genoma Humano, informaron en la Casa Blanca, el trmino del libro borrador para las secuencias del genoma humano. Un anlisis
funcional-estructural de este borrador
Fragmentos de 2.000 y 10.000 pares de bases.
Figura 8.4. Estrategia de ruptura del DNA

mediante su paso por el orificio de una
jeringuilla. El tamao de los fragmentos
generados depender de la fuerza con que
se hagan pasar estos a travs de la aguja
(mientras ms fuerza, mayor ruptura).
A
AAGACTTATG
GACCTTA
GGACACAGGTTATGG
CGTTGGA
GCACGTT
TAT
TATGGAC
GGTGC
TAAGGT
GACACAGGTT
TTATGGACCA
TAGGATTA
TATGGA
GGACACA
CGTTATAGG
GATTGGG
AACGTTATA
GTGCACG
AAGGTGCACGTTG
GTTGGACA
ACCAACGT AGGTGCA
AGGTTATGGA
ACCAACG
AGGCCCGA
AAGGAC
GATTAGGCC
ACACAGGTTATGGACC
TTAAGGTG
CCGA
GTTA
AGGATTAGG
GGCCCGAGATTGG
AAGGAC
TTAAGGTG
GACTTAT
GGTGC
TATGGA
GTGCACG
GACCTTA
CGTTGGA
AAGGACTTATC
C C A C A C A C C T TAT C C
TTAAGGT
GGACACA
AGGTGCA
CACAGGTT
GCACGTT
TATGGAC
GTTGGACA
ACCAACGT
AAGGTGCACGTTG
G T TATA G G AT TA G G C
GACACAGGTT
CGTTATAGG
AGGTTATGGA
AGGATTAGG
TTATGGACCA
GATTAGGCC
TGGACCAACG
AGGCCCGA
A A C G T TATA
CCGAGAT
TAGGATTA
GATTGGG
ACACAGGTTATGGACC
GGCCCGAGATTGGG
AAGGACTTATGGACCTTAAGGTGCACGTTGGACACAGGTTATGGACCAACGTTATAGGATTAGGCCCGAGATTGGG
Figura 8.5. A) Secuenciamiento de los extremos de los fragmentos generados por ruptura
con jeringuilla y luego clonados hacia vectores de manipulacin en el laboratorio. B) Seguida
esta etapa de secuenciacin de los bordes de los fragmentos, computacionalmente se
alinean las secuencias superponibles, de modo de ordenar estos fragmentos, generando
finalmente una secuencia lineal, que corresponde al DNA completo
fragmentado originalmente (C).
177
fue publicado en Febrero de 2001 (Venter et al., 2001), quedando a la vez de

manifiesto que an quedaba mucho trabajo por realizar. Ejemplo de esto, son
varias de las secuencias correspondientes a las regiones centromricas. stas
contienen una gran cantidad de secuencias repetitivas (repeticiones de unos
pocos nucletidos). Este tipo de secuencias hace muy difcil la tarea de los computadores, puesto que ellos otorgan varias posibilidades de las cuales slo una
es la acertada. As, la tarea est an en
marcha.
GENMICA FUNCIONAL
Induccin diferencial de genes. Hibridacin substractiva.
Qu genes estn involucrados en una
respuesta especfica?. En ciencia, la
comprensin de los eventos moleculares
involucrados en una respuesta por parte
de un organismo o un individuo ante un
estmulo especfico, involucra el tener,
en la medida de lo posible, tanto la situacin de reposo o control, as como la
situacin especfica. Como bien lo dice
nuestra pregunta, los eventos componentes de la respuesta sern entonces la
diferencia entre estas dos condiciones.
A nivel de genes, aquellos que son apagados o activados durante una respuesta, sern evaluables slo si podemos
compararlos con una condicin en la
que no est el agente que produjo tal respuesta. Una de las primeras herramientas para estudiar este tipo de procesos,
proviene de la tcnica de hibridacin
substractiva de cidos nucleicos.
Igor David y Thomas Sargent desarrollaron este procedimiento para descubrir
178
aquellos genes que se inducen en una

clula como respuesta a un estmulo medioambiental. Para ello, utilizaron clulas de ranas (Xenopus laevis), las que como sabemos, tienen distintos estados de
desarrollo. Entre estos estados, tambin
se pueden distinguir distintas morfologas, aunque las clulas siempre tengan
el mismo genoma. En la blstula encontramos un montn de clulas en estado
indiferenciado, pero ya en la gstrula,
encontramos capas celulares como ectoderma, endoderma y mesoderma. As,
ellos supusieron que los genes encargados de esta diferenciacin en capas, deba gatillarse a tiempos terminales del
estado de blstula o muy iniciales de la
gstrula. Para realizar su estudio, extrajeron mRNAs desde individuos en ambos estados a distintos tiempos de edad
(Figura 8.6). Tal como se realiza en la
elaboracin de una genoteca cDNA, utilizaron transcriptasa reversa para obtener los cDNAs (hebra simple) correspondientes a las distintas muestras del estado gstrula. Luego utilizaron estos
cDNAs para hibridarlos con los mRNAs
procedentes de las distintas muestras de
blstula. Los hbridos formados entre
cDNA-mRNA, correspondieron a genes
que se transcribieron en ambos estados,
quedando en estado de cDNA no hibridados, slo aquellos correspondientes a
transcritos que especficamente se expresaban en los estadios de gstrula.
Para separar esta mezcla de hbridos
cDNA-mRNA de las hebras cDNA no comunes, la hicieron pasar por una columna de hidroxiapatita, que une especficamente los cidos hibridados, dejando
pasar los cDNAs hebra simple (no hibridados), correspondientes especficamente a genes expresados en el estadio
gstrula.
GENMICA
Figura 8.6. Genoteca substractiva. . Desde los estadios de blstula y gstrula del embrin
de Xenopus laevis, se aislaron los mRNAs en tubos separados. Luego se retrotranscribieron
aquellos mRNAs correspondientes al estado de gstrula y se mezclaron, de forma de producir
la hibridacin entre mRNA de blstula y cDNAs de gstrula. Los hbridos formados entre
cDNA-mRNA correspodieron a genes que se transcribieron en ambos estados, quedando en
estado de cDNA no hibridado, aquellos correspondientes a transcritos que especficamente
se expresaban en los estadios de gstrula. Para separar esta mezcla de hbridos cDNA-mRNA
de las hebras cDNA no comunes, se le hizo pasar por una columna de hidroxiapatita,
que slo deja pasar los cDNAs hebra simple (no hibridados) que corresponden,
especficamente, a genes expresados en el estadio gstrula.
Estos fragmentos cDNA hebra simple, se

llevaron a cDNA hebra doble para finalmente utilizarlos en la construccin de
una genoteca, correspondiente a genes
que exclusivamente se expresan durante el estadio de gstrula de Xenopus
laevis. La utilidad de esta tcnica es poder conocer y tener representada, una
poblacin especfica de genes correspondientes a un evento fisiolgico, como lo es un estado de desarrollo de un
individuo. Por ejemplo, David y Sargent
utilizaron estos cDNAs marcados radiactivamente, para hibridarlos a una membrana de nitrocelulosa que tena adheridos en puntos especficos, mRNAs procedentes de distintos tiempos de cada
uno de los estados de desarrollo de Xenopus (Figura 8.7). As, pudieron detectar cules genes son en verdad claves en
el proceso de desarrollo.
El poder acceder a representaciones de

los genes de una especie, abri una nueva puerta en la posibilidad de analizar
la respuesta molecular global de un organismo ante un estmulo determinado.
Esto, a la hora de referirnos a genes, se
conoce como genmica funcional. As,
cuando un organismo es sometido a una
situacin especfica, como bien podra
ser un estado especfico de desarrollo en
el caso de Xenopus, su respuesta finalmente se reflejar en una modificacin
de la expresin de sus genes.
Los microarreglos.
En el desarrollo de los ESTs, Venter asumi la funcionalidad de las secuencias
de un genoma en un momento determinado. Para esto, l utiliz una genoteca
cDNA de cerebro humano obtenida pre-
179
Figura 8.7. Experimento de puntos de hibridacin sobre membranas, para el estudio

de la expresin diferencial de genes del desarrollo embrional en Xenopus laevis.
Diez preparaciones de cDNAs, aislados mediante hibridacin substractiva (figura anterior),
se marcaron radioactivamente y se hibridaron sobre un arreglo de mRNAs aislados a distintos
tiempos de desarrollo de cada estado embrional. La intensidad de los puntos est directamente
relacionada con la expresin, en ese tiempo y estado, del cDNA (es decir del gen) especfico.
viamente. La irrupcin de la tecnologa

en el uso de los estudios genmicos, ha
llevado a una aceleracin en la generacin de resultados. As como Venter y
su criterio prctico llev a modificar
variadas veces la propuesta original del
Programa Gubernamental Genoma Humano, el principio de mezclar las tcnicas de hibridacin substractiva con el de
los ESTs, ha dado paso a una impresionante herramienta: los microarreglos de
DNA, o chips de DNA.
Unos pocos aos antes, Pat Brown haba desarrollado una tcnica en la que
se pueden fijar cidos nucleicos sobre
una superficie de vidrio. Para ello, utiliz placas de vidrio a las que recubri
con polilisina, la que confiere una carga positiva al vidrio. El DNA, cargado
negativamente, al ser impreso o puesto en contacto con este vidrio activado, se une fuertemente a su superficie
y puede ser utilizado adems, como sonda de hibridacin (Figura 8.8). La ventaja de este sistema es que se pueden ad-
180
herir varios DNAs ordenadamente en la

superficie del vidrio. Brown, interesado
en saber qu genes eran responsables de
un linfoma (cncer de ndulos linfticos)
de las clulas B, saba que existan distintos sub-tipos de esta enfermedad, la
que se relacionaba con distintos grados
de supervivencia del individuo. As, l
construy lo que se denomin el linfochip, un vidrio con 17.856 cDNAs pegados ordenadamente en su superficie
(Alizadeh et al., 2000). Estos cDNAs provenan tanto de preparaciones de ndulos
linfticos como de cDNA de genes
conocidamente involucrados en cncer.
Luego, obtuvo mRNAs desde ndulos
linfticos afectados por dos subtipos de
linfoma (DLBCL1 y DLBCL2) y los retrotranscribi a cDNAs, marcndolos con un
colorante especfico para cada caso. Incub el linfochip con sus cDNAs diferencialmente marcados para que se produjera la hibridacin y vio cmo se producan apareamientos entre el chip y los
cDNA marcados, dependiendo del subtipo de linfoma (Figura 8.9).
GENMICA
Figura 8.8. Microarreglo sobre vidrio activado.

Mediante interaccin electrotstica, el vidrio activado
y reforzado en su carga positiva, retiene a los cDNAs
depositados ordenadamente sobre l.
Figura 8.9. Experimentos realizados

por Pat Brown para descubrir la
expresin diferencial de genes
expresados en dos tipos de cncer
de ndulos linfticos de las clulas B
(DLBCL). l saba que existan distintos
sub-tipos de esta enfermedad (DLBCL1
y DCBCL2), la que se relacionaba con
distintos grados de supervivencia del
individuo. As, construy el "linfochip",
un vidrio con 17.856 cDNAs adheridos
ordenadamente en su superficie.
Obtuvo mRNAs desde ndulos
linfticos afectados ambos subtipos de
linfoma y los retrotranscribi a cDNAs,
marcndolos con un colorante para
cada caso (rojo y verde). Incub
el linfochip con sus estos cDNAs
marcados para hibridarlos y evalu
los apareamientos entre el chip y los
cDNA marcados, dependiendo
del subtipo de linfoma.
C o m o s e p u e d e v e r, B r o w n u t i l i z
cDNAs para pegar a los vidrios que iban
a ser hibridados. Sin embargo, poco pas
para que este chip fuera variado por
Stephen Fodor, quien pens que no era
necesario tener cDNAs para generar estos chips de DNA. l desarroll la tcnica de los arreglos de sondas o Gene-
Chip, que es un arreglo mucho ms pequeo y que utilizan un vidrio especial.

Sobre este mini-vidrio, Fodor fue sintetizando los cidos nucleicos que haran
el trabajo de sonda de hibridacin. Para
ello, utiliz un sistema de sntesis qumica de DNA dirigida por luz, haciendo
que se pegarn secuencialmente nucle-
181
tidos, uno sobre el otro, en la superficie

de este vidrio especial. Para ello, se pone
primero una capa de nuclesido sobre
el vidrio (por ejemplo A), en seguida se
bloquea esta capa con un agente fotosensible. Luego se aplica una mscara,
que contiene orificios en las zonas que
slo se desean desbloquear, es decir,
aquellas en donde se adicionar un nuevo nuclesido al anteriormente adherido. Mediante la aplicacin de luz (la que
penetrar por aquellos orificios definidos por la mscara), el protector fotosensible desbloquear el nucletido adherido al vidrio, dejndolo disponible para
unir otro a l. Luego, nuevamente se
aplica el agente bloqueador/fotosensible, otra mscara especfica (distintos
agujeros por ejemplo), se elimina especficamente el protector con luz y se adiciona otro nuclesido. Y as, hasta completar un chip, con oligonucletidos de
unos 20 residuos de largo y con ubicaciones especficas. En estos microchips,
se pueden ordenar hasta 65 mil oligonucletidos de secuencia conocida.
As, la revolucin de los microarreglos
de DNA ha comenzado. Estos chips tienen en la actualidad innumerables usos.
Por ejemplo, pueden utilizarse para detectar poblaciones de genes que se expresan en un determinado momento,
para detectar mutaciones puntuales en
alguna secuencia gentica, para caracterizar un individuo transgnico, etc.
Genmica de vegetales.
Hasta ahora hemos presentado un sinnmero de eventos clave en el desarrollo de la genmica como Era. Pero no
hemos dicho que, el Proyecto Genoma
182
Humano en realidad contempl a todos

los organismos modelos mejor conocidos a la fecha, como Escherichia coli,
Drosophila e incluso ratn, pero por razones desconocidas, no incluy a ningn modelo vegetal. Es as como en
1994, la Comunidad Europea (hoy Unin
Europea), bajo la inquietud de Michael
Bevan, del John Innes Institute, inicia un
programa para secuenciar el cromosoma
4 de Arabidopsis thaliana, una pequea
hierba prcticamente sin significado
agronmico, pero de biologa relativamente fcil y conocida, al grado de ser
la especie modelo en vegetales.
Se implement un Consorcio de Laboratorios Europeos (ESSA), liderados por
Bevan. Al poco andar, Satoshi Tabata del
Kazusa DNA Research Institute, de Japn, comienza la iniciativa para secuenciar el cromosoma 5 de Arbidopsis.
En 1996, varios de los ncleos involucrados en la iniciativa del Proyecto
Genoma Humano, logran consolidar la
Iniciativa Genoma de Arabidopsis (AGI),
conformada por el ncleo europeo, el
japons y un fuerte contingente de grupos estadounidenses, provenientes principalmente de la National Science
Foundation, Department of Energy y del
US Department of Agriculture. El objetivo general, secuenciar los 125 megabases de su genoma, con fecha lmite en
2004.
La estrategia seguida por AGI fue la utilizacin de las libreras BAC y el mapeo
fsico, tal como Watson haba emprendido la iniciativa humana. En esa poca, el sistema shotgun sequencing,
aunque propuesto, se consider muy
riesgoso. El camino no estuvo exento de
GENMICA
problemas, sobre todo si se considera

que no haban mapas fsicos completos
que apoyaran los resultados que se iban
obteniendo desde los BACs. Tambin
hubo buenas discusiones acerca del porcentaje de error de secuenciacin que
se admitira y de cmo y cundo liberar
esta informacin a la luz pblica. Con
todo esto, en Diciembre de 1999 se publica la secuencia de los cromosomas 2
y 4 (Mayer et al., 1999) y un ao despus, se dan a conocer las secuencias de
los restantes cromosomas 1, 3 y 5, junto
con un completo anlisis del genoma de
Arabidopsis.
El genoma posee aproximadamente

25.500 genes, en una densidad de 1 gen
por cada 4 kilobases. El tamao promedio de estos es de 2 kilobases, con 5
exones como promedio. Uno de los aspectos ms relevantes de los resultados
obtenidos, fue el observar que existe una
gran duplicacin de las secuencias tanto
intra- como inter-cromosomales, alcanzando a ser un 60% del genoma total.
Luego de esta iniciativa han surgido numerosos consorcios y proyectos. En la Tabla
8.1 se muestran los programas de genmica de plantas existentes en la actualidad.
Tabla 8.1. Estado en cifras de ESTs de los diferente programas de

genmica vegetal en el mundo.
Sistema
en estudio
Estado de avance
pblico al:
Estado de ESTs
ingresados
Arabidopsis thaliana
Algodn
Arroz
Caa de azcar
Cebada
Cebolla
Centeno
12 de enero de 2004
14 de agosto de 2003
16 de enero de 2004
6 de enero de 2004
9 de enero de 2004
4 de septiembre de 2003
22 de diciembre de 2003
227.670
52.818
254.916
246.046
341.924
19.553
9.119
Chlamydomonas
reinhardtii
5 de enero de 2004
152.263
Ice plant
Lechuga
Lotus japonicus
Maz
Maravilla
Medicago truncatula
Nicotiana benthamiana
Papa
Pinus
Sorghum bicolor
Soya
Tomate
Trigo
Vides
23 de abril de 2003
12 de enero de 2004
21 de abril de 2003
1 de mayo de 2003
6 de enero de 2004
22 de diciembre 2003
17 de abril de 2003
13 de noviembre de 2003
25.640
68.120
32.881
377.188
59.426
189.714
18.832
131.750
125.061
158.133
333.481
155.317
542.781
132.316
183
Estos proyectos estn en distinto estado

de avance. La mayora de ellos comprende iniciativas que no slo involucra el
secuenciamiento e identificacin de
ESTs con el fin de generar bases de datos finales de genes de estas especies,
sino tambin, son trabajos en paralelo
al mapeo fsico y ordenamiento (saturacin de los mapas) de marcadores moleculares descritos a travs de mucho
tiempo de trabajo.
Un detalle ms acabado de alguno de
estos proyectos puede observarse en la
Tabla 8.2, la que resume el estado a enero de 2004 de varias de estas iniciativas.
Genmica funcional en Chile.

A fines del ao 2001, se crea la Iniciativa Genoma Chile bajo el contexto del
Programa de Desarrollo e Innovacin
Tecnolgica del Gobierno de Chile 20012004. Esta Iniciativa est dirigida por un
comit formado por representantes de:
Corporacin de Fomento de la Produccin (CORFO), dependiente del Ministerio de Economa; Comisin Nacional
Cientfica y Tecnologa (CONICYT); y
Fundacin para la Innovacin Agraria
(FIA), dependiente del Ministerio de Agricultura. As, en su primera instancia, se
enfatiza el desarrollo de capacidades tcnicas en nuestro pas, en el rea de la
fruticultura. Para este plan inicial, se destinan 3 millones de dlares, con los que
se financian tres proyectos de genmica
funcional:
a) Genmica Funcional en Nectarines:
Plataforma para fomentar la competitividad de Chile en exportacin de frutas. Cuya Institucin Principal es la
Universidad de Chile, teniendo como
184
instituciones beneficiarias y asociadas

a: INIA, Fundacin Chile, Asociacin
de Exportadores de Chile, Fundacin
para el Desarrollo Frutcola.
Proyecto que se centra en estudiar
por genmica funcional, desrdenes
metablicos y fisiolgicos que sufren los
duraznos y nectarines en su almacenamiento en fro, cuando es transportado
a sus mercados de destino. Este fenmeno se conoce como dao por fro. De
este modo, la idea es ver qu genes son
alterados en su expresin durante la aplicacin por fro. Para ello, este proyecto
plantea la ruta de elaborar genotecas
cDNA y obtener ESTs para utilizarlos en
arreglos que sern hibridados con
mRNAs de duraznos almacenados en fro
y duraznos control.
b) Plataforma cientfico-tecnolgica
para el desarrollo de la Genmica
Vegetal en Chile. Etapa I: Genmica
funcional en vid. Cuya Institucin
Principal es la Universidad Tcnica
Federico Santa Mara, teniendo como
instituciones beneficiarias y asociadas a: Universidades de Chile, Santiago y de Talca, INIA, Asociacin de
Exportadores de Chile, Fundacin
para el Desarrollo Frutcola, Fundacin Chile.
Proyecto de genmica funcional que
est compuesto por tres subproyectos, en
donde se investigar el fenmeno de
generacin de apirenia (falta de semilla)
en el cultivar sultanina, la respuesta defensiva de vid frente al hongo Botrytis
cinerea y finalmente, se caracterizarn
eventos moleculares que generan el fenmeno de corrimiento de la baya en el
emblemtico cultivar Carmenre (este
GENMICA
Tabla 8.2. Estado de algunos proyectos especficos de genmica en el mundo,

presentados en el Plant and Animal Genome 2004.
Iniciativa
Contacto o lider
Estado a enero 2004
International
Triticaceae
Mapping
Initiative
Perry Gustafson,
USDA/ARS y
Brian Foster,
Scottish Crop
Research Institute.
Programa de dos fases: desarrollo de ESTs en trigo y

cebada. 16.000 ESTs de trigo y 6.000 de cebada. Se
espera desarrollar 300.000 secuencias para ambos
cultivos. De momento, la comparacin entre los
genomas de trigo y arroz, con una estrictez alta han
mostrado una homologa del 80% entre ambas
especies.
Maize Genome Georgia Davis,

Initiative
University of
Missouri
En l se ha generado una base de datos iMap para

maz. sta tiene como objetivo generar datos,
validarlos y verificarlos, analizarlos y unirlos e
integrarlos. iMAP posee ya informacin para el
genoma de maz de 2.025 Mbases, 4.443 contigs.
(www.maizemap.org).
Forest Trees
Genomes
Christophe
Plomion, National
Institute for
Agricultural
Research
Se ha llegado al establecimiento de diversos tipos de

marcadores moleculares en distintas especies (Norway
spruce, Japanese black pine). Tambin se han
obtenido ESTs para Norway spruce (4.007) y Loblolly
pine (20.337). Tambin ya se ha desarrollado un
poplar-chip, un arreglo tipo cDNA para 15000 ESTs
de hoja y cambium.
International
Grape Genome
Project
Douglas Cook,
University of
California, Davis.
En donde destaca el proyecto de University of

Nevada-Reno, con una inversin de 3,6 millones de
dlares para 4 aos. Es un proyecto sistemtico de
genmica, protemica, metabolmica y bioinformtica.
Se planifica el secuenciamiento de 350.000 ESTs y su
uso en microarreglos para genmica funcional
(especialmente de resistencia a estrs hdrico).
Tambin en este consorcio existen grupos europeos,
australianos y chilenos, dedicados a la obtencin de
marcadores moleculares con vas a generar un mapa
saturado de marcadores moleculares, entre los que
destacan los marcadores de polimorfismos basados en
mutaciones puntuales. En esta iniciativa, ya destaca el
desarrollo de Informa de la construccin de 3 libreras
BAC, de las variedades Syrah, Pinot y Cabernet. Estas
genotecas comprenden tamaos entre 100 y 200 Kbs.
En Chile tambin existe un grupo destinado a la
obtencin de ESTs.
185
(Continuacin Tabla 8.2).
Iniciativa
Contacto o lider
Estado a enero 2004
Internacional
Consortium of
Prunus persica
Albert Abbott,
Clemson.
Sus objetivos son: a) anlisis del grado de macro y

micro sintenia en el genoma de especies de Rosaceae
y b) genoma de durazno como modelo de Rosaceae.
Estos objetivos incluyen la bsqueda de genes
candidatos mediante ESTs, desarrollo de un mapa
gentico general, construccin de libreras BAC
y desarrollo de mapas fsicos. Hasta el momento
este equipo ha desarrollado 7 genotecas cDNA, en
funcin de los distintos estados de desarrollo. Han
desarrollado 149 marcadores anclados al mapa fsico
y tienen una gran cantidad de ESTs (9984).
Otras iniciativas interesantes:

Papa y Tomate
Esther van der

Knaap,
Ohio State
University.
Estudios en tomate, Proyecto Genetic, molecular,

and developmental anlisis of variation in tomato
fruti shape.
Richard Visser,
Center
Biosystems
Genomics,
Wageningen
University.
Proyecto Solanaceae for genomics
fenmeno lleva a que en un mismo racimo existan granos semillados y asemillados, o de calibre notoriamente distinto).
En lneas generales, este proyecto generar distintas genotecas cDNA para cultivares de vid sultanina y carmenre, desarrollar ESTs y los utilizar en el formato
de microarreglos, los que sern hibridados con mRNAs de distintas muestras provenientes de los tres sub-proyectos.
c) Estudios Genmicos y de expresin
gentica en vides: respuesta a la infeccin viral y desarrollo de sistemas
de diagnstico. Su Institucin Principal es la Pontificia Universidad Catlica de Chile, teniendo como instituciones beneficiarias y asociadas a:
186
Universidad de Chile, Fundacin de

Ciencia para la Vida, Bios-Chile Ingeniera Gentica S.A.
Este proyecto plantea el estudio de la
respuesta de vides, frente a virus de impacto sobre su productividad. Para ello,
se plantea un estudio comparativo a travs del uso de microarreglos de cDNAs
de Arabidopsis thaliana, los que sern
utilizados como fuente de hibridacin
con mRNAs de vides infectadas con virus como el Grape leaf roll virus. De la
misma forma, plantea conocer variantes
poblacionales locales de virus que infectan vides y tambin el desarrollo de
sistemas de deteccin de estos.
GENMICA
REFERENCIAS
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of Drosophila melanogaster. Science
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Alizadeh, A., Eisen, M., Davis, R., Ma, C.,
Lossos, I., Rosenwald A., Boldrick, J., Sabet
H., Tran, T., Yu, X., Powell, J., Yang, L.,
Marti, G., Moore, T., Hudson, J., Lu, L.,
Lewis, D., Tibshirani, R., Sherlock, G.,
Chan, W., Greiner, T., Weisenburger, D.,
Armitage, J., Warnke, R., Levy, R., Wilson,
W., Grever, M., Byrd, J., Botstein, D.,
Brown, P. y Staudt, L. 2000. Distinct types
of diffuse large B-cell lymphoma identified
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small nucleic acids. Prog. Nucleic Acid Res.
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Mayer, K., Schuller, C., Wambutt, R., Murphy,
G., Volckaert, G., Pohl, T., Dusterhoft, A.,
Stiekema, W., Entian, K., Terryn, N., Harris,
B., Ansorge, W., Brandt, P., Grivell, L.,
Rieger, M., Weichselgartner, M., de Simone,
V., Obermaier, B., Mache, R., Muller, M.,
Kreis, M., Delseny, M., Puigdomenech, P.,
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Sequence and analysis of chromosome 4 of
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402:769-777.
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product of the Drosophila neurogenic gene
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Sanger, F., Nicklen, S. y Coulson, A. 1977. DNA
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Venter, J. et al. 2001. The sequence of the
human genome. Science 291:1304-1351.
187
188
GLOSARIO
GLOSARIO
Acetosiringona. Molcula carbonada derivada de fenol y

producida por dao mecnico en las paredes celulares de las plantas dicotiledneas. Activador de las seales de infeccin para Agrobacterium tumefaciens.
cido ribonucleico. Molcula lineal constituida por una cadena nica de ribonucletidos, conteniendo cuatro
monmeros de nucletidos, los monofosfatados de
adenosina (AMP), guanosina (GMP), citosina (CMP) y
uridina (UMP). Estructuralmente, la molcula de RNA
es similar a la de DNA, con la excepcin que en el
RNA el azcar presente es una ribosa. Existen tres tipos de RNAs: ribosomales (rRNA), mensajero (mRNA)
y transferencia (tRNA). El RNA es sintetizado a partir
del DNA mediante la transcripcin.
ADN (o DNA). cido desoxirribonucleico; corresponde a
una macromolcula polimrica formada por los cuatro desoxinucletidos monofosfato en una doble hebra ligada por enlaces de hidrgeno entre las bases.
sta es portadora de la informacin gentica.
Agrobacterium. a) tumefaciens: bacteria del suelo tipo bacilo, Gram negativo. Sus cepas virulentas poseen, en
adicin al DNA genmico, un plasmidio gigante llamado Ti. Cuando infecta a una clula vegetal, una porcin del Ti (el T-DNA) pasa a la clula que es infectada, causando un tumor conocido como la enfermedad
de la agalla de la corona; b) rhizogenes: bacteria del
suelo tipo bacilo, Gram negativo. De igual forma que
A. tumefaciens, las cepas virulentas poseen un plasmidio Ri el que tambin posee T-DNA que acta de la
misma forma que su congnere. El fenotipo de esta
interaccin es la proliferacin de races; c) cepa desarmada (comercial): cepa de tumefaciens o rhizogenes
en el que su plasmidio (Ti o Ri) ha sido desarmado,
dejndosele los genes vir y escindindosele los genes
para sntesis de opinas y otros elementos innecesarios
189
para la transferencia de T-DNA. Son complementados

con plasmidios binarios, que se trabajan en el mesn
del laboratorio, los que llevan los brazos izquierdo y
derecho, flanqueando el cassette del gen de inters.
Albino. Planta con marcada deficiencia de pigmentacin,
generalmente referida a la falta de color verde por deficiencias de clorofila en cloroplastos .
Alimento transgnico. Alimento de consumo directo, derivado de una planta u otro organismo genticamente
modificado.
Anlogo. Molcula ligeramente diferente de otra y que puede entrar en la composicin de otra, a causa de su parecido. Esto puede acontecer en protenas y cidos
nucleicos.
Antera. Porcin apical de un estambre que produce las microsporas o polen en una flor.
Antibitico. Molculas orgnicas de origen microbiolgico,
que en trminos generales, inhiben selectivamente el
crecimiento de clulas. Actan a travs de la alteracin de algn evento relacionado con la replicacin
del DNA o con la sntesis de protenas. Estos agentes
son txicos para clulas que no poseen sistemas especficos para eliminarlos, por lo que son utilizados en
la seleccin de clulas que ha sido transformadas. Existen antibiticos que afectan la vida de clulas procariontes y, otros, que afectan a las clulas eucariontes.
Anticodn. Secuencia trinucleotdica ubicada en el aminoacil-tRNA, encargada de reconocer el codn respectivo en el momento de la traduccin del mRNA.
Anticuerpo. Molcula proteica de las clases de las inmunoglobulinas, producida por clulas linfocitarias B, encargada de reconocer especficamente secuencias
polipeptdicas en los antgenos. Los anticuerpos se
unen especficamente a los antgenos que inducen su
sntesis, neutralizando toxinas, aglutinando bacterias
o clulas, precipitando antgenos solubles. Un antgeno
190
GLOSARIO
es cualquier molcula que estimula una respuesta inmune en la forma de un anticuerpo. Polen y vacunas
son ejemplos de antgenos.
Antgeno. Compuesto extrao que ingresado (inyectado) en
cualquier animal vertebrado, genera una respuesta inmune contra l. Los antgenos son reconocidos por los
anticuerpos para su destruccin.
Apareamiento de bases. Tipo de interaccin entre las bases
nucleotdicas descrita por Watson y Crick.
Autotrficos. Organismos que son capaces de producir su
propio alimento. Un ejemplo son las plantas. En oposicin, los hetertroficos no producen su propio alimento, ejemplos: hongos, hombre, etc.
Autorradiografa. Metodologa en la cual se observa en una
pelcula, la radioactividad o marca luminiscente incorporada en macromolculas (DNA, RNA, protena).
Auxina. Regulador de crecimiento vegetal que promueve la
elongacin de brotes y formacin de races entre varios otros efectos, en bajas concentraciones. La auxina
natural producida por todas las especies de plantas es
el cido indolactico (AIA o IAA).
Bacteria competente. Clula bacteriana sensibilizada artificialmente para que sea capaz de captar DNA del medio.
Bacterifago. Virus que infecta bacterias.
Base nitrogenada. Molcula qumica que posee un anillo
heterocclico con tomos de carbono y nitrgeno. En
la constitucin de cidos nucleicos, existen aquellas
del tipo purinas (adenina y guanina) y del tipo pirimidinas (citosina, timina y uracilo).
Biobalstica. Sistema de transformacin gentica (de plantas) alternativo a A. tumefaciens. Surgi como necesidad de sistemas capaces de transformar plantas monocotiledneas.
191
Bioinformtica. Se refiere al campo de estudio que extrae

informacin biolgica de un gran nmero de bases
tales como secuencias, interacciones entre protenas,
microarreglos, etc. Este campo tambin incluye el rea
de visualizacin de datos.
Biommica. Se refiere a lo que es el rea de simulacin del
diseo biolgico en procesos manufacturados.
Brazos izquierdo y derecho del plasmidio Ti. Secuencias
repetidas directas de 25 nucletidos que bordean el
DNA de transferencia en el plasmidio Ti.
Bromuro de Etidio. Qumico utilizado para observar molculas de cidos nucleicos (DNA y RNA) por su capacidad de intercalarse en las bases nitrogenadas y
fluorescer bajo luz ultravioleta.
Cadena peptdica. Secuencia de aminocidos de no ms de
20 unidades.
CALT. Comit Asesor para la Liberacin de Transgnicos,
creado en 1991. Organismo multidisciplinario dependiente del SAG, encargado de la aprobacin o rechazo de nuevos eventos transgnicos en nuestro pas.
Caracteres cuantitativos de locus (QTL). Genes que codifican fenotipos que pueden ser medidos en una escala
cuantitativa. Cada gen tiene un pequeo efecto sobre
el fenotipo, siendo atribuible al ambiente un gran efecto. Muchos caracteres de inters econmicos son influenciados por muchos genes.
Cassette de expresin. Conjunto de seales necesarias en
una hebra de DNA sea capaz de expresar correctamente una enzima o protena especfica. Contiene todos
los elementos promotores y terminadores de la transcripcin para que esto ocurra.
cDNA. Secuencia de DNA que corresponde, complementariamente segn reglas de Watson y Crick, al mRNA de
una protena.
192
GLOSARIO
Ciclo de Krebs. Tambin llamado ciclo de los cidos tricarboxilicos, es un conjunto de reacciones enzimticas
que comienzan con la condensacin de la Acetil CoA
con el oxalato, liberando CO 2 e H + en la medida que
el ciclo va girando. En los eucariontes, estas reacciones acontecen en el interior de la mitocondria.
Clivaje poliembriognico. Cuando ms de un embrin es
formado por divisin del cigoto, en dos o ms unidades, cada una desarrollndose en un embrin. Los embriones resultantes son monocigticos en cuanto a su
origen e idnticos genticamente.
Clon bacteriano. Conjunto de bacterias que poseen un fondo gentico comn. En trminos prcticos, en el laboratorio, un clon corresponde por ejemplo, a una colonia de bacterias creciendo en placas nutritivas slidas, o a un cultivo lquido sembrado con un solo tipo
de bacterias; todo esto tras haber sido transformadas
con un plasmidio de inters.
Clonamiento. Conjunto de pasos que involucran la manipulacin de un gen o un segmento de DNA y su introduccin a bacterias competentes para su multiplicacin o mantencin.
Co-cultivo. Etapa de la transformacin de plantas mediada
por A. tumefaciens en la que, luego de la infeccin
propiamente tal, los explantes son incubados en conjunto con las bacterias que han quedado adheridas a
su superficie. En general, esta etapa suele durar un par
de das.
Cdigo gentico. Todo el conjunto de informaciones genticas de un ser dado. Sistema en que los nucletidos
permiten indicar la correspondencia de aminocidos.
Cada tres nucletidos, se seala un aminocido especfico, existiendo en todo caso, para casi todos los
aminocidos, ms de un triplete (codn) posible. Tambin existen tripletes que indican el comienzo y el trmino de una protena. Puede definirse por un conjunto de 64 codones y se dice que es degenerado, debido
a que la mayor parte de los aminocidos es codificada
por ms de un codn.
193
Co-dominante. Un marcador molecular que expresa los dos

alelos del gen.
Codn. Ordenamiento de tres nucletidos de DNA que indican correspondencia con un aminocido especfico.
Colchicina. Alcaloide usado en la duplicacin artificial del
nmero de cromosomas, pues impide la separacin de
los cromosomas despus de la mitosis.
Commoditie. En el caso de las plantas transgnicas, trmino referido a granos y otros elementos producidos por
ellas y que posee una comercializacin interfronteriza
muy comn.
Complejo T. Conjunto molecular consistente de T-DNA hebra simple, una protena VirD2 unida a su extremo 5
como conductora y varias protenas VirE2 con funcin
protectora, conocida como actividad de protenas de
unin a hebra simple. Este complejo viaja desde A.
tumefaciens hasta la clula vegetal blanco que se quiere transformar.
Co-transformacin. Accin de co-cultivar, seleccionar y regenerar un explante que ha sido infectado con dos
clones de A. tumefaciens. Frecuentemente cada uno
de los clones lleva cassettes de expresin distintos.
DNA ligasa. Enzima que se encarga de unir dos fragmentos
de DNA hebra doble (DNA normal) a travs del grupo
fosfato 5 de un extremo y del grupo OH-3 del otro.
Esta enzima puede o no requerir adenosina trifosfato
(ATP) para esta actividad, dependiendo de su origen
(por ejemplo de un fago o de una bacteria, respectivamente).
DNA polimerasa. Enzima encargada de la sntesis de cadenas nucleotdicas, utilizando un DNA como molde y
un RNA como partidor o primer. Las ms utilizadas
en biologa molecular son la DNA pol I de Escherichia
coli y el fragmento Klenow.
194
GLOSARIO
DNA polimerasa I. Primera DNA polimerasa aislada de E.

coli, que posee actividad exonucleasa (degradadota
de nucletidos) 5-3 y 3-5. Su principal funcin biolgica es durante la reparacin del DNA.
DNA polimerasa III. Polimerasa de DNA encargada de la
sntesis de fragmentos largos de DNA de una clula,
es decir, la primera responsable de la copia del genoma
de una clula (es de E. coli). Esta actividad es complementada por la DNA polimerasa I, quien rellena los
sitios vacos dejados por la degradacin de los
primers.
Dogma Central de la biologa molecular. Principio ordenado de eventos postulado por Watson y Crick, de forma
de predecir que el DNA se replica, transcribe a RNA y
que este ltimose traduce a protenas.
Dominante. Marcador molecular que expresa slo un alelo
del gen.
Dormancia. Fase de inactividad comn en semillas, esporas
y yemas en los cuales el crecimiento y desarrollo es
retardado o frenado.
Electroforesis. Metodologa de separacin de macromolculas en un soporte slido (tambin se puede hacer en
papel, acetato de celulosa) que es sometido a un campo elctrico.
Electroporacin. Tcnica de transformacin de bacterias mediante la cual, a travs de un pulso elctrico de milisegundos de duracin, se fomenta la captura de DNA
por parte de una clula. Esto sucede debido a la generacin momentnea de heridas o poros en la membrana de dichas clulas.
Embriognesis. El desarrollo de un embrin normalmente
cigtico a partir de un tejido cualquiera. Cuando existe desarrollo embrionario de otra forma, se obtiene
embrioides.
Embrin cigtico. Es el embrin resultante de la fecundacin sexual.
195
Embrin somtico. No es resultante de la fecundacin sexual,

sino de la manipulacin de condiciones in vitro. Se
puede originar a partir de un callo o directamente del
explante. Ejemplo: hoja. Es generado a partir de una
clula somtica, generalmente bajo condiciones in vitro.
Endosperma. Tejido nutritivo triploide que se encuentra en
el saco embrionario de las plantas con semilla.
Enfermedad de la agalla de la corona. Fenotipo producido en
el cuello de plantas dicotiledneas tras la infeccin por
A. tumefaciens. Esto se debe a que, en forma original, el
T-DNA posee genes que codifican enzimas para la sntesis de opinas y fitohormonas que, entre otros procesos,
promueven la divisin de las clulas husped.
Enfoque precautorio. Sistema de operacin entre los distintos gobiernos que se han acogido al Protocolo de Cartagena, en el que ante dudas razonables de la internacin de un evento transgnico (alimento o commoditie,
ver arriba), ste no ingresa a las fronteras de dicho pas.
Enlace fosfodister. Enlace O-P-O esqueleto del DNA. Este
se realiza entre el grupo OH 3 de la base nucleotdica
previamente adicionada en la hebra y el grupo PO 4 5
del nucletido entrante.
Enzima. Protena con alguna funcin biolgica de catlisis
de una reaccin especfica. Tambin se ha descubierto ltimamente, que existen algunos RNAs (en algunos organismos inferiores) que tienen actividad cataltica, como Tetrahymena.
Enzimas de restriccin. Proteinas capaces de romper los
enlaces fosfodister entre diferentes nucletidos en una
misma cadena de ADN doble hebra en sitios especficos.
Epistasis. Representa una forma de interaccin gnica, donde un gen interfiere con la expresin fenotpica de otro
gen o genes no-allico (s).
196
GLOSARIO
Eptopes. Secuencia lineal de 7 a 9 aminocidos en el antgeno, que son los responsables del reconocimiento por
parte del anticuerpo.
Etiolacion. Caractersticas que evidencian las plantas cuando crecen en condiciones deficitarias de luz, elongndose excesivamente y mostrando desarrollo anormal
de cloroplastos, que no sern funcionales.
Evaluacin de riesgo previa del OGM. Conjunto de operaciones tanto prcticas como tericas, tendientes a evaluar la factibilidad de internar o no un evento transgnico al pas. Este anlisis es fundamental para una
aprobacin en este sentido y requiere que el importador entregue gran cantidad de informacin cientfica,
esencialmente basada en los ensayos tcnicos realizados en otros pases.
Exones. Nucletidos encargados de informar la secuencia
primaria de aminocidos de una protena. Los exones
estn separados por los intrones y despus del procesamiento del RNA, quedan ubicados linealmente para
que los ribosomas puedan comenzar la lectura del
mensaje que generar la protena.
Expresin transitoria. Expresin eventual de un gen que est
en el ncleo, a travs de la generacin efectiva de su
protena, sin la necesidad de que est incorporado establemente al DNA de la clula que ha sido transformada.
Explante. Trmino referido a una clula, tejido u rgano separado de la planta madre y que se cultiva aisladamente bajo condiciones in vitro.
Factor transcripcional. Protena con capacidad de unin a
zonas especficas del DNA (promotores transcripcionales), que fomentan la transcripcin de ciertos genes.
Los factores transcripcionales, en trminos prcticos,
corresponden al ltimo paso de una informacin del
mensaje que una clula recibe de su entorno y que
permiten a sta responder apropiadamente a dicho
mensaje.
197
Fenogentica. Rama de la gentica que estudia las relaciones entre el genotipo y fenotipo (sus manifestaciones).
Filotaxis. Forma de arreglo o disposicin de las hojas alrededor del tallo.
Fitocromo. Pigmento proteico que media respuestas fotoperidicas y algunas otras reacciones gatilladas por presencia de la luz.
Fotosntesis. Proceso por el cual las plantas captan la energa solar para producir poder reductor (ATP, NADPH),
fijar CO 2 y sintetizar carbohidratos.
Gen cDNA. Gen cuya secuencia nucleotdica proviene de
la secuencia del mRNA, por lo tanto es equivalente a
la informacin aportada slo por los exones del gen.
Gen de resistencia a antibitico. Gen utilizado como marcador o informador de la transformacin gentica, aportando la propiedad de resistencia a un antibitico especfico a la clula que lo contiene y expresa correctamente.
Gen genmico. Secuencia nucleotdica que codifica una
protena, que contiene tanto exones como intrones.
Gen marcado o sonda. Copia complementaria de la secuencia templado, en que a travs de su sntesis con una
DNA polimerasa in vitro (generalmente la polimerasa
Klenow), se ha incorporado un nucletido marcado (ya
sea con radioactividad u otro compuesto qumico) que
servir para detectarlo mediante pelculas fotogrficas
o procesos de tinciones. Tambin se puede incorporar
marca a un DNA a travs de fosforilaciones especficas en sus extremos mediante kinasas terminales.
Gen reportero y marcador. Gen utilizado para evidenciar el
hecho que una clula lo ha incorporado correctamente.
Esto se utiliza normalmente en experimentos de transformacin de clulas, ya sean procariotes o eucariotes.
198
GLOSARIO
Genes de resistencia. Gen reportero que especficamente

permite a las clulas transformadas crecer en medios
suplementados con antibiticos. Estos genes son especficos para cada antibitico o familias de ellos y
permiten resistir a las clulas sobrellevar dosis que en
circunstancias de no transformacin, seran letales.
Genes vir. Conjunto de genes de Agrobacterium encargados
de la virulencia de cepas especficas. Sus productos
gnicos se encargan de activar y transferir el complejo T desde la bacteria hacia la planta.
Genoma. Conjunto de todos los genes de un ser vivo. Juego
completo de cromosomas que se hereda en forma de
unidad proveniente de un solo progenitor diploide.
G e n m i c a . Trmino vago relacionado con el estudio
referencial de secuencias genmicas, variaciones dentro de un genoma especfico, microarreglos de DNA,
circuitos y sistemas biolgicos. Se considera tambin
el transcriptoma, la protemica y la metabolmica,
etc., bajo el concepto de genmica.
Glucolisis. Va metablica en que la glucosa es degradada
hasta dos molculas de piruvato en el citosol.
Grupo azcar. Grupo ribosa o desoxirribosa presente en los
nuclesidos.
Grupo fosfato. Grupo encargado de enlazar, a travs de
interaccin con oxgeno 3 de la base siguiente, a los
nucletidos en los cidos nucleicos.
Haploide. Nmero reducido de cromosomas que se presentan en las clulas germinales maduras de organismos
sexuales. Individuo conteniendo solo un representante de cada par de cromosomas.
Hebra complementaria. Hebra correspondiente al molde,
segn la complementariedad propuesta por Watson y
Crick (A-T y G-C) .
199
Heterocigosis. Carcter gentico que presenta los dos alelos

del gen diferentes.
Hidrlisis. Ruptura de una molcula en dos mediante la adicin del agua.
Histonas. Protenas de carcter bsico (H1, H2A, H2B, H3 y
H4), ricas en arginina y lisina, que se unen al DNA
aportando a su estructura a travs de la formacin de
los nucleosomas y posteriormente, cromosomas.
Homocigosis. Carcter gentico que presenta los dos alelos
del gen iguales (puede ser dominante o recesivo).
Husped. Clula u organismo que hace la funcin de alojar
a otro organismo o molcula.
Infeccin. Interaccin entre Agrobacterium y el explante vegetal sometido a la transformacin. Requiere una etapa de reconocimiento y unin, para luego gatillar eventos especficos de cada interaccin.
Integracin del T-DNA. Proceso por el cual el T-DNA se integra al genoma de una clula vegetal. El mecanismo
propuesto para este evento es el denominado como
recombinacin ilegtima.
Introgresin. Incorporacin gradual de genes de una especie a otra, mediante el cruzamiento entre dos progenitores, generando un hbrido que es retrocruzado, sucesivamente, con una de las especies parentales.
Intrones. Secuencias nucleotdicas espaciadoras entre
exones, que son transcritas hacia el transcrito primario y que son escindidas por el proceso de maduracin del RNA, para generar el mRNA.
In vitro. Literalmente en el tubo de ensayo.
In vivo. Literalmente en la clula o en un organismo.
Isopreno. Es una unidad de 5 carbonos producidos por las
plantas. Una de las caractersticas de ellos es su gran
capacidad de polimerizacin, pudiendo formar com-
200
GLOSARIO
puestos qumicos como C 10 y C 15 llamados terpenos,

los cuales, explican la fragancia de muchas plantas.
Entre ellos pueden citarse: limoneno, mentol, etc. Los
isoprenos tambin se encuentran en la va metablica
de sntesis de las citoquininas.
Juvenilidad vs Madurez: En las plantas corresponden a tejidos y rganos que evidencian hbitos, formas y zonas
asociadas a tal carcter en la planta. La condicin juvenil se da en la zona ms basal e incide notablemente en la capacidad reproductiva del material bajo condiciones in vivo e in vitro. La madurez es la condicin
alternativa que expresa otra caracterstica funcional
de parte de la planta.
Lincaje gentico. Situacin en que dos genes estn localizados cerca en el mismo cromosoma.
Lnea hbrida. Lnea vegetal producida por la cruza sexual
entre dos lneas puras (u homocigotos para algn rasgo determinado).
Lnea pura. Lnea vegetal producida por continuas
retrocruzas de filiales sucesivas procurando el enriquecimiento de un rasgo.
Marcador histolgico. Marcador que confiere un fenotipo
visible en presencia de un substrato aplicado
exgenamente.
Marcador morfolgico. Gen que codifica para una protena
que genera, en las clulas transformadas con l, un
cambio fenotpico fcilmente evaluable.
Marcador de letalidad. Gen que al ser activado mediante la
induccin de su promotor, induce la muerte de la clula que lo ha incorporado.
Marcador de seleccin. Gen marcador que, en forma similar a la resistencia a antibiticos, al ser expresado en
una clula que lo posee, permite ser detectado fcilmente en dicha clula, ya sea a travs de tinciones
especficas o por alguna caracterstica de la protena
que produce.
201
Medio Selectivo. Medio que permite el desarrollo selectivo

de ciertas clulas, inhibiendo el de otras. Estos pueden
ser por ejemplo, medios suplementados con antibiticos, qumicos txicos, suplementos metablicos, etc.
Membrana de parada. Rejilla utilizada en los equipos de biobalstica. Detiene a la membrana portadora de las partculas, sin afectar el paso de las partculas propiamente tal.
Membrana portadora. Membrana del equipo de biobalstica
que permite ubicar las partculas recubiertas con el
DNA a ser proyectado en su superficie.
Microarreglos de DNA o chips de genes. Ordenamientos
de secuencias definidas de genes u ligos en soportes
slidos de vidrio o nylon, en microespacios y debido a
la accin de robots especialmente diseados. Estos microordenamientos son utilizados en distintos experimentos de hibridain masiva con cDNAs de forma de evaluar simultneamente el nivel de expresin de varios
genes.
Mixotrfico. Poblaciones de clulas con diferente autonoma y capacidad de sntesis de compuestos orgnicos
Moratoria. Esquema administrativo que han implementado
ciertas naciones frente a la internacin para comercializacin o evaluacin de ciertos eventos transgnicos,
en espera de ms antecedentes tcnicos y/o polticos.
Morfognesis. Los cambios en el desarrollo que dan forma a
un individuo adulto a partir de un cigoto.
Morfolgico. Relativo a las caractersticas fsicas de un ser
(fenotipo).
mRNA y DNA colineales. Se refiere a que la secuencia de
DNA que origina el mRNA son correspondientes, salvo
en los loops o zonas que corresponden a los intrones.
Mutagnesis. Mtodos para introducir variaciones en la secuencia original del DNA. Estos pueden ser fsicos, qumicos o biolgicos.
202
GLOSARIO
Ncleos generativos. En angiospermas, corresponden a los

dos gametos masculinos que se forman por divisin
de la clula generativa. Ambos migran por el tubo polnico participando en el proceso de fertilizacin. Uno
se fusiona con la clula huevo para formar el cigoto;
el otro, normalmente se fusiona con los ncleos polares para formar el ncleo primario del endosperma.
Ncleo vegetativo. En el polen de angiospermas; corresponde a un ncleo de mayor tamao que los ncleos generativos. Su funcin, durante la germinacin del polen,
es controlar el desarrollo del tubo polnico, desintegrndose cuando ste penetra al nucelo.
Nuclesido. Molcula que posee un anillo heterocclico con
tomo de carbono y nitrgeno (bases nitrogenadas) y
un grupo azcar con cinco carbonos dispuestos en
forma de anillo pentosa. Las bases nitrogenadas pueden ser purinas (adenina y guanina) y pirimidinas (citosina, timina y uracilo).
Nucletido. Unidad qumica que compone el DNA. En esencia, corresponden a nuclesidos que han sido incorporados a un cido nucleico a travs de uniones fosfodister (utilizando un grupo fosfato).
Ontogenia. Todos los cambios que ocurren en la historia de
vida de un organismo.
Opern. Unidad de expresin y de regulacin gnica en
bacterias, en que un conjunto de genes es transcrito
bajo el control de un promotor nico, originando un
mRNA policistrnico.
Opinas. Compuestos aminoacdicos derivados de arginina
que permiten a Agrobacterium, una mejor interaccin
con la planta.
Organognesis. Los cambios en el desarrollo que ocurren
durante la formacin de un rgano determinado.
Organelo. Parte especializada de una clula eucaritica delimitada por una membrana, con funciones especficas.
Cloroplastos y mitocondrias son ejemplos de organelos.
203
Origen de replicacin autnomo. Secuencia de nucletidos

en la que se inicia la duplicacin (replicacin) del
DNA, de una forma autnoma de otras secuencias similares o con la misma funcin en una clula.
Partenognesis. Produccin de un embrin del gameto femenino sin la participacin del gameto masculino.
Patrones de difraccin. Conjunto de desviaciones en un haz
de rayos X al atravesar el DNA en estructura semicristalina. Estas se registran en pelculas fotogrficas.
pH. Abreviatura que expresa el logaritmo negativo de la concentracin de iones de hidrgeno de una solucin
acuosa.
Pili bacteriano. Filamento proteico que se forma en la superficie de algunas clulas bacterianas que permite su
ligacin a otras clulas bacterianas. Por ejemplo, el
pili F (canal sexual) est involucrado en la conjugacin bacteriana.
Planta transgnica. Planta modificada genticamente a travs de tcnicas biolgicas especficas que involucran
la insercin en su genoma, de un segmento de DNA
distinto al de su genoma original.
Planta transplastmica. Planta transgnica, modificada
especficamente en el genoma de sus organelos y no
en el nuclear.
Plasmidio. DNA circular extracromosomal con origen de replicacin autnomo, presente en el citoplasma bacteriano.
Plasmidio binario. Plasmidio que se utiliza para transformacin de plantas y cuyas funciones son cooperativas
con otro, para generar un complejo T funcional y transferible.
Plasmidio integrativo. Plasmidio con secuencias homlogas
al plasmidio residente de las cepas comerciales de
Agrobacterium. Al incorporarse a la bacteria, estas
204
GLOSARIO
zonas permiten la recombinacin homloga entre el

plasmidio residente y el integrativo, formado un
plasmidio Ti (o Ri) ntegro, formando as el complejo T y transformando las clulas blanco.
Plasmidio lanzadera. Plasmidio que funciona tanto en A.
tumefaciens como en E. coli y que posee los brazos
izquierdo y derecho de Agrobacterium. Esta caracterstica, permite que todas las operaciones de clonamiento de un gen de inters (en su sitio mltiple de
clonamiento) y su manipulacin para que se exprese
correctamente en la planta, son posibles de realizar
en este plasmidio utilizando bacterias tipo E. coli, tal
como si fuera un plasmidio pequeo y con todas las
herramientas que se pueden aplicar con la tecnologa
del DNA recombinante.
Plasmidio recombinante. Plasmidio que posee en su sitio
mltiple de clonamiento, un fragmento de DNA externo de inters e insertado mediante tcnicas de DNA
recombinante.
Plasmidio Ti. Plasmidio encontrado en cepas patognicas
de Agrobacterium tumefaciens. La bacteria transfiere
parte de su DNA (T-DNA) a la clula vegetal, generando la enfermedad de la agalla de la corona.
Plasmidio Ti residente. Plasmidio Ti desarmado, habitante
de A. tumefaciens y que slo posee las funciones vir.
Poliembriognesis. Produccin de ms de un embrin de
clulas gametofticas o esporofticas.
Poliembriognesis esporoftica. Cuando un embrin se genera por yemacin esporoftica del nucelo o del
integumento en plantas con flores. Los embriones son
normalmente idnticos entre s y la planta madre.
Poliembriognesis simple. Cuando varias clulas huevo se
desarrollan de una megaspora, siendo cada una fertilizada por esperma o una espora distinta, o su desarrollo puede ocurrir en forma partenognica.
205
Poliploida: 1) Clula u organismo con un nmero mltiplo

de cromosomas mayor que el normal (diploide). 2) Clula u organismo con un nmero mltiplo de cromosomas de un conjunto haploide, causado por la replicacin cromosomal sin divisin celular.
Presin osmtica. Presin inducida por el flujo osmtico
(energa libre) del agua a travs de una membrana para
una solucin en la cual el soluto est en mayor concentracin. (Sinnimo = Potencial Osmtico).
Polimorfismo gentico. Ms de una forma gentica.
Primordio. Cualquier parte inmadura de una planta destinada
a diferenciar en una cierta clula, tejido u rgano; ejemplo, un primordio foliar se diferenciar luego en una hoja.
Producto biofarmacutico. Producto de utilidad farmacutica, producido por herramientas biotecnolgicas en
organismos (plantas, clulas, animales) modificados
genticamente con el gen que fomenta (o produce directamente) una alta cantidad de l (ejemplo, insulina
o interfern producido en bacterias).
Promotor. Secuencia nucleotdica o regin de un gen, en
que una RNA polimerasa se une para dar inicio a la
transcripcin de dicho gen. Adems de la RNA polimerasa, son requeridas una serie de protenas que se
unen a DNA, a otras protenas, o a ambos.
Promotor 35S 35S-CaMV. Una de las secuencias promotoras
de la transcripcin en plantas ms fuerte conocidas hasta el momento. Se aisl del virus del mosaico de la coliflor (CaMV), en donde activa la transcripcin del RNA35S
del virus.
Protenas multimricas. Protenas que presentan ms de una
cadena de polipptidos en mltiples combinaciones.
Protocolo de Cartagena. Acuerdo legalmente vinculante para
proteger el ambiente de los eventuales riesgos que podra ocasional el movimiento transfronterizo de organismos vivos modificados (OVMs). El objetivo es que
206
GLOSARIO
los pases tengan la oportunidad de realizar el anlisis

de riesgo que involucra la internacin de los productos obtenidos mediante la biotecnologa moderna. De
esta forma, se persigue que cada pas pueda tomar decisiones de una forma lo ms informada posible con
respecto a estos organismos y sus contenedores (alimentos, granos, materias primas, etc.).
Puentes de hidrgeno. Atraccin electrosttica dbil entre
un tomo electronegativo (Oxgeno, Nitrgeno, etc.)
y un tomo de hidrgeno. Enlace que permite el apareamiento complementario de bases segn el modelo
de Watson y Crick.
Quelato (de chelos= tenazas). Compuesto qumico capaz
de capturar temporalmente un in en una solucin,
evitando su precipitacin y hacindolo de esta manera, soluble y disponible para su absorcin por las plantas.
Radiacin ionizante. Radiacin beta y o gamma, incluyendo rayos X, que provocan la ruptura de la hebra cromosomal y con ello, graves mutaciones en la clula y
organismo.
Razn estequiomtrica. Proporcin de masas entre distintos
tomos. A nivel de DNA, se refiere a que la constitucin de una clula entre adeninas y timidinas es 1:1,
de forma similar a lo que acontece con la proporcin
entre guaninas y citocinas.
Reaccin de ligacin. Reaccin in vitro en la que se intenta
ligar dos fragmentos de DNA de inters, mediante la
enzima DNA ligasa.
Recombinacin del DNA. Evento molecular en el que hebras de DNA son intercambiadas.
Recombinacin homloga. Proceso en el que se intercambian dobles hebras de DNA en zonas donde existe una
similitud substancial de las secuencias (es decir,
homologa).
207
Recombinacin ilegtima. Recombinacin de DNA en el que

se incluyen todos los eventos de recombinacin que
no caen en recombinacin homloga o sitio especfica. En esencia, este tipo de recambio o integracin
entre hebras de DNA no requiere homologa de secuencias, o si lo hace, estas son zonas de unos pocos
nucletidos de largo.
Recombinacin sitio especfica. Recombinacin del DNA
que involucra el reconocimiento entre secuencias que
son homlogas e involucran la participacin de protenas de recombinacin. Este mecanismo se ha identificado especialmente en E. coli, que posee secuencias
que son homlogas al bacterifago y que requieren
la participacin de una protena llamada integrasa.
Regeneracin. Estadio clave en el cultivo in vitro y transformacin de plantas, en donde, las clulas de un explante eventualmente sometido a transformacin
gentica, son inducidas a re-diferenciar hasta una planta nueva. Esto se procura mediante la manipulacin
hormonal especfica.
Replicacin semiconservativa. Modelo propuesto por Watson
y Crick para la replicacin (duplicacin) del DNA, en
donde cada una de las hebras molde se separan, para
dar origen a su complementaria respectiva.
Ribosoma. Complejo ribonucleoproteico encontrado en el
citoplasma de las clulas, en forma libre o unido a
membranas del retculo endoplasmtico. Poseen dos
subunidades, mayor y menor, siendo la menor la encargada de unirse al RNA y la mayor, de aportar a la
maquinaria necesaria para ingresar los aminoaciltRNAs, descargarlos y cargar otros nuevos.
RNA de transferencia (tRNA). RNA que media la traduccin
de cidos nucleicos en secuencias de aminocidos.
Sirven de molculas adaptadoras, uniendo cada aminocido especficamente (por lo que existen por lo menos 20 tRNAs distintos) y lo ubican segn la lectura
del codn respectivo, el que tambin es ledo por
otro segmento del tRNA (el anticodn).
208
GLOSARIO
RNA mensajero (mRNA). RNA que lleva la informacin que

va a ser traducida a protenas. Representa una pequea fraccin del RNA total.
Secuencias flanqueadoras (en el DNA). Secuencias de DNA
encontradas junto a la de inters.
Secuencia palindrmica. Secuencia del DNA que es reconocida por las enzimas de restriccin y que varan en
su largo (4, 6 ms nucletidos) segn dicha enzima.
Estas secuencias son repetidas invertidas, vale decir,
que son idnticas cuando ambas hebras son ledas en
la direccin opuesta (desde una hebra y su complementaria).
Seleccin. Estadio en la transformacin de plantas, en donde, las clulas regeneradas son sometidas a una comprobacin masiva de su estado efectivo de transformacin, a travs del uso de marcadores de resistencia
a antibitico, morfolgico u otro.
Semillas recalcitrantes. Son semillas que pierden rpidamente su poder germinativo durante el almacenamiento y
son posteriormente difciles de germinar. En semillas
de frutos tropicales esta caracterstica es comn. Ejemplo: caf, cacao, caucho, etc.
Simplstico (relativo a simplasto). Todo lo que implica
transporte de agua y iones por estructuras celulares
tales como membranas, citosol, plasmodesmos, excluyendo transporte por la pared celular y espacios intercelulares.
Sitio mltiple de clonamiento. Sitio especfico de un plasmidio, en donde se han posicionado sucesivamente, distintos sitios de restriccin para poder insertar all, en
varias posibilidades, un segmento externo de DNA de
inters.
Solucin hidropnica. Solucin nutritiva con aireacin para
hacer crecer plantas con inters cientfico o econmico.
209
Solucin hipotnica. Es una solucin en que el soluto est

en baja concentracin molar. Ejemplo: 0,01 molar de
NaCl. Contrariamente en la solucin hipertnica el
soluto est en mayor concentracin. Ejemplo: 2 molar
NaCl.
Suspensin celular. Conjunto de clulas aisladas creciendo
en un medio de cultivo bajo condiciones in vitro.
T-DNA o DNA de transferencia. Fragmento del plasmidio Ti
que va a ser transferido a una planta. En forma original, el T-DNA est constituido por los genes que permiten la sntesis de opinas y fitohormonas, flanqueados
por los brazos izquierdo y derecho. En los plasmidios
lanzadera o de tipo binario, estos genes se han removido y reemplazado por sitios mltiples de clonamiento
y "cassettes" de expresin para genes reportero.
Tcnica del DNA recombinante. Conjunto de tcnicas que
permiti la manipulacin y el clonamiento de fragmentos de DNA de inters.
Terminador. Secuencia de DNA localizada en el extremo 3
de la regin codificante de un gen y que obliga a la
RNA polimerasa a interrumpir la transcripcin y disociarse del DNA.
Tonoplasto. Membrana unitaria de la vacuola de una clula
vegetal.
Totipotencia celular. Capacidad que pueden expresar algunas clulas diferenciadas para regenerar plantas enteras clulas vegetales y clulas tronco-embrionarias en
animales.
Transformacin bacteriana. Evento de captacin de DNA
desde el medio externo por parte de una bacteria. En
el laboratorio, es la transferencia controlada de una
secuencia o porcin de DNA hacia una bacteria, generalmente utilizando plasmidios.
210
GLOSARIO
Transformacin estable. Transferencia controlada de una

secuencia o zona de DNA hacia un genoma receptor,
generalmente aportando nuevas caractersticas a este
genoma, que son establemente adquiridas.
Transposasa. Enzima clave involucrada en las actividades
de salto de elementos de DNA especficos llamados
transposones, hacia un nuevo sitio del genoma.
Transposn. Elemento gentico capaz de translocarse (escindirse e insertarse) a una nueva posicin.
Tubo polnico. Estructura originaria de la intina del grano
de polen que, durante su germinacin, emerge a travs de una apertura existente en la exina, creciendo
hacia la clula huevo y portando el ncleo vegetativo
y ncleos generativos.
Vacuola. En la clula vegetal, cavidad celular llena de fluido, separada del citosol, provista de una membrana
unitaria (tonoplasto). Clulas jvenes pueden tener
varias vacuolas pequeas respecto de clulas adultas
que generalmente poseen una sola. Su tamao puede
implicar el 90% del volumen celular.
Zigoto (cigoto). Producto de la fusin de dos gametos antes
que se inicie la mitosis o meiosis.
211
212
AUTORES
HUMBERTO PRIETO E.
Chileno, Bioqumico, Doctor en Bioqumica e
investigador jornada completa en INIA La Platina
desde 1998. Su principal rea de trabajo ha sido
participar e impulsar diversos proyectos de
transformacin gentica de plantas dentro del
grupo de investigacin del Laboratorio de
Biotecnologa de INIA-La Platina. Uno de los
primeros trabajos en este tema en INIA LaPlatina,
fue la generacin de melones resistentes a aislados
chilenos del Watermelon Mosaic Virus Type II,
trabajo iniciado en 1994 y culminado en 1999,
siendo a la vez su tesis doctoral. Luego, se
ha vinculado activamente al desarrollo de la
plataforma de transformacin gentica de cultivos
econmicamente importantes, como vides y
ltimamente, frutales de carozo (iniciativas
FONDEF, FDI; en conjunto con Fundacin Chile,
Agrcola Brown y ANA). En forma adicional,
desde el ao 2000, el Dr. Prieto tambin se ha
relacionado con las iniciativas de genmica
funcional de vides (en el sub-proyecto del estudio
de la respuesta vegetal frente al hongo Botrytis
cinerea) y en el desarrollo de un proyecto FIA,
que evala el flujo gnico entre cultivos
genticamente modificados y sus parientes
silvestres.
213
AUTORES
MIGUEL JORDAN
Nacido en Alemania y nacionalizado chileno.
Desde 1967, es profesor e investigador a tiempo
completo en la Pontificia Universidad Catlica de
Chile. Doctorado en 1975, Justus Liebig- Universitt,
Giessen, Alemania. Profesor Encargado del curso
de Fisiologa Vegetal. Su investigacin est referida
a aspectos de Morfognesis y Regeneracin de
Plantas, en particular al potencial de manipulacin
y regeneracin de plantas a partir de sistemas
celulares (protoplastos y suspensiones), tejidos y
rganos bajo condiciones in vitro, como igualmente
aspectos de transformacin en plantas referidos a
papa, pepino dulce y tomate de rbol (tamarillo)
(Proyectos PNUD, CONICYT, AID).
Otras actividades de investigacin corresponden a
estudios sobre germinacin, viabilidad, multiplicacin
y conservacin in vivo e in vitro a bajas temperaturas
de clones lite de diferentes especies forestales
introducidas y nativas (pino, eucalipto, raul)
(Proyectos con BIOFOREST); produccin in vitro
de diversos compuestos metablicos y regeneracin
de plantas medicinales (BMBF). Estos aspectos estn
igualmente vinculados con otras temticas, en especial
aspectos de Fitorremediacin de diversos residuos,
acumulacin de metales pesados con uso de plantas
tolerantes y sobre colonizacin de especies vegetales
en depsitos de acopio de residuos (FONDEF/DIPUC).
214
AUTORES
L. PEDRO BARRUETO CID

Nacido en Chile, investigador en el rea de cultivo
de tejidos de plantas en el Centro Nacional de
Recursos Genticos y Biotecnologa (CENARGEN)
ubicado en Brasilia-DF y dependiente de la
Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuaria
(EMBRAPA), empresa dependiente del Ministerio
de Agricultura del Gobierno Brasileo. Profesor
de Biologa y Ciencias de la Universidad de Chile.
Magister Scientiae en Fisiologa Vegetal,
Universidad Federal de Viscosa, MG Brasil;
Doctor Scientiae en Fisiologa Vegetal, Universidad
de Campinas, Sao Paulo, Brasil. Post-doctorado en
el tema de Hiperhidricidad en UC-Davis (USA).
Como investigador, es coordinador en la actualidad
de dos proyectos de investigacin en el rea del
cultivo de tejidos. Uno sobre micropropagacin
de caf (Coffea arabica) y otro sobre pia (Ananas
comosus), a travs del uso de biorreactores de
inmersin permanente. Adems, como investigador,
es consultor de varios proyectos de investigacin
de otras unidades de EMBRAPA, entre ellos
mandioca, mango y eucalypto. En CENARGEN,
es responsable del curso sobre Introduccin al
Mtodo Cientfico, para alumnos de pre y
post-grado del rea de biologa de plantas.
215
M. CRISTINA R. CORDEIRO
Brasilea nacida en Rio de Janeiro,
Biomdica, M.Sc. en Biofsica y Ph.D.
en Biologa Molecular. Ex profesora de
la Universidad Gama Filho en Rio de Janeiro.
Actualmente se desempea como investigadora
en el rea de biotecnologa (biologa molecular)
en el Centro de Pesquisa de Cerrados de EMBRAPA,
en Braslia-DF, dependiente del Ministerio de
Agricultura del Brasil. Investigadora especializada
en biologa molecular del Centro de Pesquisa
Agropecuria do Cerrado (CPAC), Brasilia, Brasil.
Sus lneas actuales de investigacin son:
Mejoramiento Gentico de Frutas con nfasis en
mango, especficamente en EMBRAPA Cerrados
(Subproyecto Uso de Marcadores Moleculares no
Melhoramento Gentico da Mangueira (Mangifera
indica, L.)) y mejoramiento en leguminosas
(Subproyecto Banco de Germoplasma de
Leguminosas com Potencial Forrageiro
para a Regio dos Cerrados).
216
AUTORES
DON DURZAN
Nacido en EE.UU., profesor del Environmental
Horticulture de la University of California en Davis.
Entre 1981 a 1986 fue Chairman del Department
of Pomology. En conjunto con Calgene, logr la
primera evidencia de introduccin de genes estables
en conferas. Gest ocho patentes en USA vinculadas
con poliembriognesis somtica, partenognesis,
drogas anticncer, mtodos de deteccin, y usos de
ciclodextrinas en formulaciones nutritivas. Junto
con NASA microgravity support ha inducido la
sobreproduccin de TaxolTM, droga anti-cancergena
generada en clulas rediseadas. Ha sido consultor
de US Agency for International Development, the
Center for Application of Biotechnology in
Agriculture, the United Nations Development
Program para Indonesia, y para gobiernos e
industrias de biotecnologa y de azcar de diferentes
pases. Cuenta con artculos en variados temas tales
como Bioqumica Analtica, Bioqumica, Botnica,
Fisiologa Vegetal, Fisiologa de Insectos y Forestal.
Co-editor de cinco volmenes de libro referidos a
cultivo de clulas y tejidos de especies forestales y
causas de envejecimiento a nivel molecular.
Editor asociado y referee en varias revistas cientficas.
217
218

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Biotecnologa Vegetal (texto bsico

Available from: Humberto Prieto

INSTITUTO DE INVESTIGACIONES AGROPECUARIAS

ISSN O717 - 4713

Santiago de Chile, 2005

COLECCIN LIBROS INIA N 15

Paulina Seplveda Ramrez.

a seleccin, mejoramiento gentico

deseado. Sin embargo, algunas selecciones son difciles de propagar (usando

zados de biotecnologa de plantas, a

La necesidad de una biotecnologa

do la alta contaminacin de los suelos,

Seleccin y propagacin vegetativa

Figuras 1.1 a 1.5. Poliembriognesis. Tipo de embriognesis somtica frecuente en conferas,

Los factores que son considerados importantes dentro de esta perspectiva,

En la actualidad, hay muchos ejemplos

ticidad genmica de estos, puede desarrollar resistencia a esta toxina (Huang

Mayor eficiencia en la produccin.

cos conforman un enfoque conveniente

cmo sern afectadas las poblaciones

Nuevas plataformas tecnolgicas

Cambios en el clima global

Una importante nueva tecnologa para

tida a variados estmulos. La tcnica genera modelos ms amplios de anlisis

Cuatro pre-condiciones podran ser sealadas para provocar estas amenazas:

Entretanto, ya a nivel de laboratorio, la

La produccin sustentable de alimentos,

levantan preocupaciones colocando lmites para los modelos propuestos de

Durzan, D. y Campbell, R. 1979. Inhibition of

Hunter, L. (ed.) 1993. Artificial intelligence and

Watson, R. y Core Writing Team (eds.) 2001.

n la teora sobre totipotencialidad

En la dcada de 1930, se logr establecer que el uso de vitaminas como B 1, B 6

el cultivo de plantas in vitro, siendo esta

presentar caractersticas superiores a

LA BASE DEL CULTIVO in vitro,

quido. En el caso del agua, este valor es

nacin alude al hecho de que los primeros, se adicionan al medio en mayor

Tabla 2.1. Composicin de algunos medios nutritivos (mg/L)

Murashige, T. y Skoog, F. 1962. Physiol. Plant. 15:473-497.

tas (ejemplo gramneas), pero no se ha

al mximo los focos de contaminacin,

mayora es proveniente de las condiciones de nutricin de las plantas en el

vina; B 3: niacina; B 6: piridoxina; biotina;

tar el fenmeno de pardeamiento

Otros carbohidratos como: glucosa, manosa, fructosa, sorbitol, etc., tambin

Tabla 2.2. Lista de algunos reguladores de crecimiento y de hormonas

Peso molecular (g)

CH 2CH 2CH 2OOH

Figura 2.2. Estructura qumica de algunas auxinas

miento y no hormonas, pues no son producidos por la planta.

Figura 2.3. Estructura qumica de algunas citoquininas.

serina (Hall, 1973). La biosntesis de las

En general, los trabajos pioneros sobre

Las citoquininas tambin son usadas en

das del tejido y estrs. En este sentido,

El efecto local o a distancia, tal vez no

etileno presente en el tejido, es a travs

El cido abscsico (ABA) es un compuesto hormonal que tiene ms accin

En cultivo de tejidos vegetales su uso es

El estrs hdrico en la planta estimula la

El cido jasmnico (JA) y los jasmonatos