TECNICAS DE CULTIVO

El proceso de colocar las bacterias u otros microorganismos cultivables en medios

de cultivo, recibe el nombre de siembra, esta operacin la podemos realizar a
partir de muestras biolgicas (orina, pus, secreciones, etc.), de anlisis de control
de calidad (alimentos, aguas, cosmticos, medicamentos, etc.), procedentes de
muestras ambientales (agua, suelo, aire, etc.) o de un cultivo microbiano a otro.
Por otro lado, si la realizamos de un cultivo a otro se denomina subcultivo o
repique. Una vez que ha sido preparado un medio de cultivo (Agar Gelatina, Agar
Mc Conkey, etc.), puede ser inoculado e inmediatamente incubado en condiciones
que favorezcan el crecimiento microbiano. En la toma de muestras de un medio
(solido, liquido o aire), mayormente se tiene una poblacin mixta, entonces si se
quiere cultivar una especie de la muestra se debe realizar tcnicas de
aislamientos que permitan obtener cultivo axnicos o puros.
Un cultivo puro o axnicos es aquel que contiene un solo tipo de microorganismo y
que procede de una sola clula, el crecimiento de esta origina, en medio slido,
una masa de clulas fcilmente reconocibles o visibles que recibe el nombre de
colonia.
La tcnica de aislamiento, fue desarrollada durante el siglo XIX. En un principio se
utiliz diluciones seriadas en medio lquido, pero la presencia de contaminantes
(microorganismos no deseados) dificulto el aislamiento. Posteriormente la escuela
de Robert Koch introdujo los medios slidos, completamente con agar y las placas
Petri para bacterias, permitiendo as la separacin de fsica de las colonias sobre
la superficie del medio de cultivo o en el interior del mismo. Esto permite tener una
visin macroscpica de las colonias y de diferenciar distintas especies
microbianas.
Tcnica de siembra en medios contenidos en tubos
Se tiene siembra en medios de cultivo contenido en tubos, ya sea caldo, caldo
nutritivo, agar inclinado, otros. As se observara en las colonias su intensidad de
enturbiamiento, aparicin de pelcula o sedimento en el tubo, tambin poder
determinar un crecimiento mvil o no. En esta siembra se debe tener mayor
cuidado, puesto que un contaminante del aire puede superar en crecimiento al
microorganismo de estudio, por lo tanto se deber tomar las siguientes
precauciones:
Mantener inclinado el tubo que contiene el cultivo que se va a transferir, de modo
que los microorganismos del aire caigan en las paredes externas del tubo y no en
la bica de este.
Los tapones se deben mantener en la mano contraria a aquella que contiene el
tubo, sostenindolos entre el dedo menique, el anular y el dedo del corazn.
Nunca deben colocarse sobre la mesa de trabajo o algn otro lugar.

Flamear la boca de tubo antes de cerrarlo despus de la siembra o inoculacin.

Esterilizar el asa adecuadamente (toda porcin que entra en contacto con el
medio de cultivo).
Sumergir el asa en el medio de cultivo, sin tocar las paredes del tubo.
Enfriar el asa en una parte del medio, sin deteriorar el mismo.
Despus de realizar la siembra, esterilizar el asa y flamear nuevamente la boca
del tubo.
Al sembrar trabajar en cmara de flujo laminar o en su defecto con mechero
Bunsen.
En las siembras por picadura y mixtas, evite romper el medio de cultivo, as
como, utilice asas totalmente rectas.
h) Siembra en tubos por estras simples
Se realiza en un tubo con medio solido inclinado (en bisel o pico de flauta), y
deslizando el asa sobre la superficie expuesta del agar de manera que se marque
con movimiento en zigzag o surcos en la superficie. El proceso se inicia en el
fondo y se va avanzando hacia arriba por el rea inclinada. Luego incubar en
estufa durante 28-48 horas a temperatura ms adecuada a 37C.

b) Siembra en tubos por picadura

Se realiza con asa recta en punta en tubos de medios slidos y semislidos
generalmente sin inclinar. Se realiza introduciendo el asa cargada con el
microorganismo al medio de cultivo por el centro de superficie, llegando con el
extremo del asa al fondo del tubo y retirndolo posteriormente por la misma
trayectoria utilizada al realizar la picadura. Una siembra con asa (de argolla) o con
cierto movimiento de vaivn podra originar un patrn de crecimiento que se
interpretara errneamente como movilidad bacteriana. Por ultimo incubar durante
24-48 horas a temperatura optima de crecimiento.

c) Siembra en tubo en medio lquido (caldo lquido)

Transferir aspticamente con el asa bacteriolgica (de argolla), o en algunos
casos, pipetas estriles o hisopos. Si se usa asas bacteriolgicas, de una
pequea muestra de microorganismos, se transfiere desde el tubo que contiene el
material problema al tubo con medio de cultivo estril, se inocula el
microorganismo en el medio lquido, sumergiendo el asa en el lquido y rotar el
mango para desprender la muestra.

Tcnicas de aislamiento
Un modo de estudiar un ecosistema microbiano consiste en aislar de l los
microorganismos y estudiar sus propiedades en cultivos de laboratorio. El
aislamiento es importante porque se obtienen cultivos para estudios
experimentales en el laboratorio y para las aplicaciones en los campos de la
biotecnologa y la microbiologa industrial y ambiental (Madigan, 2009).Hernndez
(2003) nos dice que se ha desarrollado una serie de tcnicas microbiolgicas para
aislar microorganismo y obtener cultivos puros. A continuacin se mencionan tres
de ellas:
Siembra en placas de Petri por rayado
Siembra en placa vertida
Diluciones en serie

La siembra en placas de Petri por rayado

Esta tcnica se basa en la separacin de los microorganismos al dispersar-por
rayado sobre agar- una muestra que los contiene, segn se muestra en la figura 5,
a. Para llevar a cabo la disgregacin, se recoge una porcin de la muestra con un
asa bacteriolgica y se raya sobre una seccin de una placa Petri; luego, se repite
el rayado en tres secciones ms de la placa. En cada rayado, se toma la muestra
de la seccin anterior por lo que se logra una disminucin gradual en la cantidad
de microorganismos.
Los microorganismos dispersos en la placa se incuban a la temperatura y el
tiempo recomendados; al crecer, formarn colonias separadas unas de otras en
alguna de las secciones del rayado, como se puede observar en la figura 5. En
esa figura, cada punto representa una colonia. Posteriormente, se toma una
muestra de una de las colonias separadas y se repite el procedimiento, con la
finalidad de confirmar la presencia de un solo tipo de microorganismos.

La siembra en placa vertida

En esta tcnica se hacen crecer los microorganismos en tubos, cada uno con una
concentracin diferente, y se evala el tubo en el que las colonias crecieron en
forma separada.
Como primer paso, se preparan suspensiones de la muestra en diversas
diluciones y se coloca cada una en un tubo con agar fundido, como se muestra en
la figura 6, a. Luego, se mezcla homogneamente el contenido (el agar y el
inculo) de cada tubo y se vierte (no se siembra por rayado) en una placa de Petri,
segn se muestra en la figura 6, b.
Se incuba cada placa, a la temperatura y el tiempo recomendados, y se selecciona
la dilucin en la que se haya obtenido mayor separacin de las colonias. Por
ltimo, de esta dilucin, se toma una muestra de las colonias y se siembra en una
placa de Petri, por rayado, para confirmar si el cultivo est puro. La conformacin
de pureza se puede realizar por observacin a simple vista (colonias de igual
morfologa), por observacin microscpica o mediante pruebas bioqumicas.

Diluciones en serie
Esta tcnica se aplica cuando se conoce de antemano que el microorganismo de
inters se encuentra en mayor cantidad que los dems. Para llevarla a cabo, se
preparan varias diluciones de la muestra y se incuban en el medio de cultivo
adecuado para que crezca este microorganismo; as, se logra que en alguna de
las diluciones solo l aparezca. Es necesario reconfirmar su presencia, utilizando
el mtodo de siembra en placa de Petri por rayado.
Morfologa de la colonia de bacterias
Caracterizacin del crecimiento sobre Agar Nutritivo inclinado
Los cultivos en este medio se inoculan en una sola lnea recta (sobre la superficie
del bisel), y se evalan de la siguiente manera:
Abundancia de crecimiento:
La cantidad de crecimiento es designada como ninguna, leve, moderada o
abundante.
Pigmentacin:
Los microorganismos cromo gnicos, pueden producir pigmentos intracelulares
que son responsables de la coloracin de las colonias; otros microorganismos,
producen pigmentos solubles extracelulares que son excretados en el medio y
tambin producen color, sin embargo la mayora de la los microorganismos son no
cromo gnicos y aparecern en tonalidades que van desde el blanco al gris.
Las caractersticas pticas:
Pueden evaluarse con base en la cantidad de luz transmitida a travs del
crecimiento, estas caractersticas son descritas como: opaca (ninguna transmisin
de luz), translucida (transmisin parcial), o transparente (transmisin total de la
luz).
Forma:
La apariencia del crecimiento de la siembra en una sola lnea sobre la superficie
del agar inclinado se designa de la siguiente forma (Ver figura 7).Estas pueden
ser:

a. Filiforme.-Crecimiento en forma de hilo con bordes lisos continuos.

b. Equinulado.-Crecimiento en forma de hilo con bordes irregulares continuos.
c. Barbado.-Colonias semi-confluentes o no confluentes.
d. Difuso.-Crecimiento difuso y reducido.
e. Arborescente.-Crecimiento en forma de rbol.
f. Rizoide.-Crecimiento en forma de raz.

Caracterizacin del crecimiento en caldo nutritivo

Son evaluados segn la distribucin y apariencia del crecimiento como sigue (Ver
figura 8):
a. Turbidez fina uniforme.-Crecimiento fino y totalmente disperso.
b. Floculante.-Crecimiento en agregados escamosos totalmente dispersos.
c. Pelcula.-Crecimiento en la superficie como plataforma, grueso.
d. Sedimento.-Concentracin del crecimiento en el fondo del caldo; puede ser
granular, escamoso o floculante.

Caracterizacin del crecimiento en placas de Agar Nutritivo

La descripcin se realiza sobre las colonias formadas (agrupamiento bacteriano
originado por el crecimiento y observable macroscpicamente), de forma aislada y
se evala de la siguiente manera (figura 9).
a. Tamao: Grande (dimetro mayor a 1mm), mediano (dimetro aproximado a 1
mm), pequeo (dimetro inferior a 1 mm) y puntiforme.
b. Forma: Puntiforme, circular, filamentosa, irregular, rizoide y lanceolada.
c. Borde: De borde regular (continuo), de borde irregular (ondulado, lobulado,
espinoso/dentado/lacerado, ondulado y filamentoso).
d. Elevacin: Plana o aplastada (no elevacin), elevada (convexa baja, convexa
capiliforme, mamelonada, pulvinada y umbilicada).
e. Superficie: Lisa o rugosa.
f. Consistencia: Blanda, dura o mucoide.
g. Aspecto: Brillante, opaco y mate o translucido.
h. Pigmento: De diferente color. Pueden ser pigmentos solubles en agua y que
decoloran
el
medio,
pigmentos
fluorescentes
y
pigmentos
no
difundibles confinados a las colonias.