Sie sind auf Seite 1von 42

Cintica

enzimtica
NELSON & COX
CAPTULO 6

Cintica de las
reacciones enzimticas

Estudio de velocidad de
reaccin enzimtica y
modo en que cambia en
respuesta a cambios
experimentales.

Concentracin del sustrato


([S]), factor clave en
cintica enzimtica.

[S] cambia durante la


reaccin convirtindose en
producto (P)
Nelson & Cox, 2009

Cintica de Michaelis Menten

Estudio de cintica de
reacciones catalizadas por
enzimas.

Propusieron que E se combina


de forma reversible con S
formando un complejo ES
(paso rpido).

Despus el complejo ES se
descompone dejando E y P
(paso lento).

Parmetros importantes para


el estudio de la cintica de
MM: [S], Vmax, Km, V0

Cintica de Michaelis Efecto de [S] sobre V de la


Menten
o

reaccin enzimtica.

Vo : cantidad de producto
formado en la unidad de
tiempo a [S] determinada.
Permite medir en un
momento determinado [S]
o [P] formado.
Vmax: cantidad mxima de
producto formado a una
concentracin
determinada de enzima.

Nelson & Cox, 2009

Cintica de Michaelis Menten

Enzima existe en forma libre (E) o asociada (ES).

S S S +E E E E E E E E =
E E E E E E E

ES ES ES = P P P + E E E E E E E
E E E E E E

A baja [S] velocidad de reaccin proporcional a [S]

Enzima saturada, aumento en [S] no causa efecto


en velocidad de reaccin.

S S S S S+ E E =
S S S S

ES ES = P P

E E + S S S S S = ES ES .
S S

Velocidad global de reaccin proporcional a [ES]

Cintica de Michaelis Menten


Meseta observada
(Vmax), efecto de
saturacin de E.
Cintica de saturacin.

Nelson & Cox, 2009

Cintica de Michaelis A bajas [S], aumento de [S]


Menten
promueve aumento
lineal en Vo.

Superado el punto medio


de la cintica, aumentos
de [S], provocan aumentos
menores de Vo respecto a
incremento de [S]. Luego
se alcanza un punto en
donde no se observan
cambios significativos en
Vo a pesar del incremento
de [S]

Nelson & Cox, 2009

Km: constante de Michaelis


[S] necesaria para que V0
corresponda a de Vmax.

Cintica de Michaelis Menten

Interpretacin de Km
Km funcin compleja que refleja diversas constantes de velocidad
implicadas en reaccin. En pocos casos refleja grado de afinidad de
enzima por sustrato.
Nelson & Cox, 2009

Cintica de Michaelis Menten

Vo = Vmax [ S ]

Ecuacin de Michaelis - Menten

Km + [ S ]

Estado estacionario (Briggs y Haldane): estado en el


que [ES] permanece constante en el tiempo. Vo
media generalmente refleja estado estacionario.

Nmero de recambio (kcat): nmero de molculas de


sustrato convertidas en producto en unidad de tiempo
a cargo de una molcula de E cuando est saturada.

Nmero de recambio

kcat: constante de velocidad ms general, equivale a


constante de velocidad del paso limitante de una reaccin
enzimtica.
V0 = kcat [Et] [S]
Km + [S]
Nelson & Cox, 2009

Constante de especificidad (Km/Kcat)

Valores de km y Kcat reflejan condiciones celulares de trabajo de


enzimas.
Km tiende a ser similar a la concentracin celular normal del sustrato
que modifica.
Relacin Km/kcat (constante de especificidad), es la constante de
velocidad para la conversin E + S en E + P.
Constante de especificidad de 108 o 109, perfeccin cataltica.
Nelson & Cox, 2009

Grfica de dobles
recprocos: Lineweaver - Burk

Evala valores de V0 a
diferentes [S], bajo
condiciones
constantes (T, presin).

Partiendo de los
valores de V0
establecidos, permite
calcular los
parmetros cinticos
Km y Vmax.
Nelson & Cox, 2009

Grfica de dobles
recprocos: Lineweaver - Burk

Transformacin
algebraica de
ecuacin MM.

Utiliza los inversos de


los datos cinticos.

Ecuacin de la recta.

1 = Km
Vo

Vmax [S]

y = m

+ 1
Vmax
+ b
Nelson & Cox, 2009

Transformacin
Lineweaber Burk

Calcular Km y Vmax para la siguiente serie de


datos cinticos.
S (M)
0.0012
0.0034
0.0071
0.0093
0.0128
0.0199

Vo (mM/s)
3.1
6.8
10.3
13.4
15.3
20.3

Transformacin
Lineweaber Burk
S (M)

Vo
(mM/s)

0.0012

3.1

0.0034

6.8

0.0071

10.3

0.0093

13.4

0.0128

15.3

0.0199

20.3

Transformacin
Lineweaber Burk
S (M)

S (mM)

Vo
(mM/s)

0.0012

1.2

3.1

0.0034

3.4

6.8

0.0071

7.1

10.3

0.0093

9.3

13.4

0.0128

12.8

15.3

0.0199

19.9

20.3

Transformacin
Lineweaber Burk
S (M)

S (mM)

Vo
(mM/s)

1/S mM = X

1/Vo mM/s
=Y

0.0012

1.2

3.1

0.83333333

0.32258065

0.0034

3.4

6.8

0.29411765

0.14705882

0.0071

7.1

10.3

0.14084507

0.09708738

0.0093

9.3

13.4

0.10752688

0.07462687

0.0128

12.8

15.3

0.078125

0.06535948

0.0199

19.9

20.3

0.05025126

0.04926108

Transformacin
Lineweaber Burk
y = 0.342x + 0.0402
R = 0.9962

0.35

1/Vo mM/s

0.3
0.25
0.2
0.15
0.1
0.05

0
0

0.2

0.4
0.6
1/S mM

0.8

Aplicando la transformacin
de Lineweaver - Burk
Clculo de Vmax

y = 0.342x + 0.0402
b = 1/Vmax
Vmax = 24.876
mM/s

Clculo de Km

y = 0.342x + 0.0402

m = Km / Vmax

Km = 8.507 mM

Reacciones con dos o


ms sustratos

Nelson & Cox, 2009

Inhibicin enzimtica

Inhibidor: agente molecular que interfiere la


catlisis.

Importancia en el campo farmacolgico y


conocimiento de mecanismos enzimticos de
accin.

Inhibicin reversible e irreversible.

Moduladores moleculares:

Inhibidores

Potenciadores

Inhibicin reversible

Inhibicin competitiva

Inhibidor: anlogo qumico del sustrato, fijacin de I y S mutuamente


excluyentes.
Efecto de I disminuye por incrementos en [S].
Altera nicamente Km (Km en presencia de I llamada Km aparente), el
valor de Vmax no se altera por presencia del inhibidor.
Nelson & Cox, 2009

Inhibicin competitiva

Representacin
de grfica de
dobles recprocos
de efecto de
inhibidor
competitivo.
Se altera el valor
de la pendiente,
pero el intercepto
sigue igual.
Efecto en
parmetros
cinticos?
Nelson & Cox, 2009

Inhibicin competitiva
Vo = Vmax [S]
Km + [S]

= 1 + [I]

KI

KI =

[E] [I]
[EI]

Km = valor de la Km en presencia de inhibidor (Km


aparente), refleja la forma en que inhibidor (a travs de su
constante o Ki) afecta la Km normal de la reaccin.

Inhibicin acompetitiva

S e I se une a E en sitios diferentes, I se une a complejo ES, no a E libre.


Efecto de I: disminuir valores de Km y Vmax de la reaccin.
Incrementos en [S] no disminuyen efecto de inhibidor.
Nelson & Cox, 2009

Inhibicin acompetitiva

Representacin de
grfica de dobles
recprocos de efecto
de inhibidor
acompetitivo.
El valor de la
pendiente no se
altera pero el del
intercepto s, efecto
en parmetros
cinticos?
Por qu disminuye
tanto Km como
Vmax si no altera
pendiente?
Nelson & Cox, 2009

Inhibicin acompetitiva
Vo = Vmax [S]
Km + [S]

' = 1 + [I]

KI

[ES] [I]
KI=

[ESI]

'Km = valor de la Km en presencia de inhibidor (Km


aparente), refleja la forma en que inhibidor (a travs de su
constante o Ki) afecta la Km normal de la reaccin.

Inhibicin mixta

I se une a E en sitio diferente al sitio de unin de S, pero I se puede unir a E


libre o complejo ES.
Altera tanto Km como Vmax.
Nelson & Cox, 2009

Inhibicin mixta

Cintica de
Michaelis
Menten

Vo = Vmax [S]
Km + [S]
No competitiva
clsica

No se afecta
Km solo Vmax

Nelson & Cox, 2009

Efectos de inhibidores
reversibles sobre constantes
cinticas

Nelson & Cox, 2009

Determinando el tipo de
inhibicin
Malonato (inhibidor) mM

Succinato
(sustrato)
mM

Concentracin de inhibidor
0

0.5

1.0

[S]

Vo mM/s

Vo mM/s

Vo mM/s

0.05

0.33

0.20

0.14

0.10

0.50

0.33

0.25

0.20

0.67

0.50

0.40

0.40

0.80

0.67

0.57

0.50

0.83

0.71

0.63

Determinando el tipo de
inhibicin
Succinato
(sustrato)
mM
1 / [S]
20
10
5
2.5
2

Malonato (inhibidor) mM
Concentracin de inhibidor
0

0.5

1/Vo mM/s 1/Vo mM/s


3.030
5.000
2.000
3.030
1.492
2.000
1.250
1.492
1.204
1.408

1.0
1/Vo mM/s
7.142
4.000
2.500
1.754
1.587

Colocar todos los datos en la misma dimensional.


Obtener los inversos de [S] y Vo (en presencia y ausencia
de inhibidor).

Determinando el tipo de
inhibicin
8

y = 0.308x + 0.9639
R = 0.9999

1/Vo (mM)

y = 0.2002x + 1.0043
R = 0.9999

5
4

y = 0.1016x + 0.9928
R = 0.9999

1/Vo no I

1/Vo I 0.5

1/Vo I 1

0
0

10

15

20

25

1/[S]

Notar que aunque el valor del intercepto no exactamente igual, en


la grfica se puede observar que la variacin es tan pequea que se
considera despreciable. Esto se refleja en valores de Vmax tan cercanos
que se consideran iguales.

Determinando el tipo de
inhibicin

En ausencia de inhibidor

Km 0.101

Inhibidor 0.5 mM

Vmax 1.008

Vmax 0.996

Km 0.199

Inhibidor 1 mM

Vmax 1.038

Km 0.319

Tipo de inhibicin?

Inhibicin irreversible

Inhibicin irreversible

I se combinan o destruyen una porcin de la


enzima indispensable para su funcin.

Pueden formar asociaciones no covalentes muy


estables o covalentes.

Permiten identificar aminocidos con funciones


catalticas clave en sitio de unin.

Inactivadores suicidas o basados en


mecanismo.

Penicilina

Nelson & Cox, 2009

Penicilina

Nelson & Cox, 2009

B lactamasas

Nelson & Cox, 2009

Inhibidores de proteasa
del VIH

Nelson & Cox, 2009

Efecto del pH

Nelson & Cox, 2009