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Directora
Anglica Roco Guzmn Lenis
2016
1. IDENTIFICACIN DE LA PRCTICA
Nombre del curso
Cdigo de curso
Valor de esta actividad prctica
Nombre del director de curso
CEAD al que pertenece
Contacto del director del curso
Espacio
donde
se
debe
desarrollar la prctica
Objetivos de la prctica
Justificacin de la prctica
Competencias a desarrollar
Duracin de la prctica
Mecanismo mediante el cual se
evaluar la prctica:
El bioensayo de toxicidad con semillas de lechuga (Lactuca sativa) es una prueba esttica de
toxicidad aguda (120 horas de exposicin) en el que se pueden evaluar los efectos fitotxicos de
compuestos puros o de mezclas complejas en el proceso de germinacin de las semillas y en el
desarrollo de las plntulas durante los primeros das de crecimiento. A continuacin se describe el
procedimiento.
2. METODOLOGIA
A. Actividades a desarrollar
Revisin de porcentaje de germinacin de las semillas compradas
Previamente al montaje del experimento con la muestra recolectada y los controles, es importante
hacer una prueba de germinacin inicial, para comprobar que las semillas estn en buen estado y
que tienen un porcentaje de germinacin cercano al que dice el empaque en el que vienen,
usualmente del 85%, el mnimo permitido ser del 75%.
Para esta prueba se montar una caja de Petri con agua limpia y se seguir el procedimiento que se
describe ms adelante para clculo del porcentaje de germinacin. Si el porcentaje de germinacin
est por debajo del 75% entonces se debern cambiar las semillas por unas ms nuevas.
Una vez que la prueba arroje el porcentaje de germinacin deseado se proseguir con las siguientes
actividades.
Obtencin de la muestra
Si su tema de proyecto es la contaminacin de algn cuerpo de agua con txicos podr recolectar
una muestra de esta agua para utilizarla en el bioensayo. Si el proyecto que estn trabajando es
sobre contaminacin del suelo o lodos, deben tomar una muestra y llevarla a un laboratorio de aguas
o suelos de su ciudad y solicitar que se haga un proceso de centrifugacin para extraer una solucin
liquida a partir de ese suelo o lodo, que pueda utilizarse en el bioensayo, el tamao de la muestra
lquida debe ser de 500mL.
Si el desarrollo de este procedimiento no es posible, o usted no se encuentra cerca al sitio del
proyecto elegido por su grupo, puede tomar una muestra de agua de cualquier sitio que se presuma
contaminado para efectos del desarrollo la prctica.
Toma de muestra de agua
Los materiales requeridos para el muestreo dependern del lugar donde se planee recolectar la
muestra. Se recomienda seguir el protocolo establecido por el IDEAM en la Gua de monitoreo de
vertimientos,
aguas
superficiales
y
subterrneas,
disponible
en
el
link
http://www.corponor.gov.co/control_calidad/2014/Guia_monitoreo_IDEAM.pdf
El muestreo que harn es puntual, pero deber seguir las indicaciones para preparacin del
recipiente, llenado de la botella, marcacin, preservacin y transporte de la muestra hasta el sitio
donde har el montaje de su bioensayo. Sin embargo, como materiales generales se recomienda
llevar para el muestreo: balde, soga, un recipiente limpio para recolectar 1 Litro de muestra (pueden
ser botellas de agua lavadas y desocupadas), toalla para secar, cinta de enmascarar para marcar el
recipiente donde se pondr la muestra, marcador indeleble, nevera de icopor con hielo, guantes de
caucho, formato de campo para recolectar informacin del sitio como nombre del lugar, del cuerpo de
agua, hora, fecha, etc. (En la gua del IDEAM encontrarn ejemplos de estos formatos), importante
tambin tomar fotos del sitio de muestreo y no ir solos a tomar la muestra.
Ilustracin 1. Toma de muestra de agua con un balde
B- Las muestras deben ser tomadas a una profundidad de 0-15 cm. Una vez tomada la muestra debe
homogenizarse, destruir terrones y remover material orgnico como: hojas, races y animales. Una
vez realizado esto, incorporar la muestra de aproximadamente 250 g en las bolsas ziploc,
asegurndose que queden bien selladas.
Las bolsas ziploc deben estar adecuadamente rotuladas con el nombre de quien toma la muestra,
tipo de sistema agrcola o cobertura vegetal que hubiera tenido, hora y fecha de muestreo.
Una vez tomada la muestra deber dirigirse a un laboratorio de aguas o suelos de su ciudad donde
sea posible hacer una extraccin lquida de la muestra, ya que solo de esta manera podr ser usada
en la prctica.
Nota: Recuerde que si este procedimiento no es posible de realizarlo, deber hacer el bioensayo
entonces con una muestra de agua.
Ejecucin del ensayo
A. Preparacin de las soluciones
Solucin de control positivo:
Las soluciones de control positivo estn diseadas para obtener resultados similares de los que se
obtendran con agua contaminada. Esta solucin le permitir observar cmo reaccionan las semillas
al agua contaminada.
Se preparar una solucin salina de 5g/L, se requerir 1 litro de agua limpia, puede ser agua
destilada o de bolsa que no contenga cloro ni gas, si se cuenta con una balanza o una gramera se
podrn pesar directamente los 5 gramos y adicionarlos al litro de agua. Se debe mezclar bien y luego
marcar el recipiente que diga "Control (+) 5g/L".
Si no se cuenta con gramera o balanza entonces se tendr que calcular dicha cantidad a ojo con una
cucharita de cocina, llenndola solo la mitad y se prepara la solucin.
Solucin de control negativo
Ser una muestra de agua sin gas y sin saborizante, alistar mnimo 200 mL para el bioensayo.
Soluciones de muestras contaminadas
Se utilizar la muestra recolectada, si se presume de una alta contaminacin, por ejemplo que tenga
un color u olor muy fuerte, ser mejor realizar una dilucin de la muestra para el bioensayo, la
dilucin puede ser del 50%, es decir llenar un recipiente de volumen 100mL y llenarlo con 50mL de
muestra y 50mL de agua destilada o embotellada sin gas, se mezcla bien y se marca con el nombre
de Muestra Dilucin 50%. Si por el contrario se usa la muestra sin diluir entonces se marca con el
nombre de Muestra.
Tapar las cajas de Petri, y cubrirlas de la luz inmediatamente despus de colocar las semillas en su
interior, dado que algunas variedades de semillas de lechuga requieren de oscuridad para que se
produzca la germinacin (semillas fotoblsticas negativas). Para esto debe envolverse cada caja de
Petri con papel aluminio.
Repetir el procedimiento pero utilizando el agua embotellada (control negativo) y la solucin de sal
(NaCl) como control positivo.
Marcar con cinta de enmascarar cada caja de Petri envuelta con papel aluminio. Los controles
negativos se marcarn como C(-)1 y C(-)2, el control positivo con una C(+) y las muestras como M1,
M2, M3, segn la rplica correspondiente.
Asegrese de no voltear (no dar vuelta) las cajas de Petri boca abajo, etiquetando "Parte de arriba"
en cada placa envuelta para que no se confunda.
Colocar las cajas de Petri envueltas en papel aluminio dentro de una bolsa plstica (ziploc) para
prevenir que se escape la humedad.
Colocar las cajas en un lugar seguro, a temperatura ambiente por cinco das, a resguardo de la luz
solar directa.
C. Ejecucin de las observaciones y mediciones
Despus de cinco das, o aproximadamente 120 horas:
Cada punto final se evala comparando el efecto generado en los organismos expuestos a la
muestra con respecto a la respuesta en los organismos del control negativo, sujetos a las mismas
condiciones de ensayo, excepto por la ausencia de la muestra contaminada.
Posteriormente se saca cada semilla germinada, se mide y se apunta el largo de cada raz en
la libreta de notas. Para medir el largo de la raz, puede ser ms sencillo colocando las races
contra un fondo oscuro. Pegue la regla con cinta adhesiva a ese fondo oscuro y luego,
cuidadosamente, "estire" las races a su longitud mxima, apunte la medida obtenida para
cada semilla de cada tratamiento.
La siguiente ilustracin muestra los estadios por los que atraviesa la semilla durante el ensayo de
germinacin y elongacin:
D. Expresin de resultados
1. Clculo de porcentaje de germinacin
Primero se anotaran el nmero de semillas germinadas en cada caja de Petri y se calcular el
porcentaje de germinacin:
Tabla 1. Nmero de semillas germinadas
Cajas de Petri
Variables
C(-)1
C(-)2
C(+)
M1
M2
M3
Nmero de
semillas
germinadas
Promedio de
los controles
negativos
Porcentaje
de
Se calcula con el promedio de semillas
germinacin*
germinadas en las repeticiones de Control (-)
*Se calcula dividiendo el nmero de semillas germinadas sobre el promedio del nmero de semillas
germinadas de los controles negativos, luego se multiplica por 100.
2. Clculo del porcentaje de inhibicin de la germinacin
% Inhibicin germinacin = (SgCneg - SgMR) * 100
SgCneg
SgCneg= semillas germinadas control negativo (promedio C(-)1 y C(-)2)
SgMR= semillas germinadas muestra (promedio de las 3 cajas de Petri: M1, M2 y M3)
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
Promedio
EH
Desviacin
estndar
Caja
de
Petri
C(-)2
Caja
de
Petri
C(-)1
Semilla
Coeficiente
de
variacin*
Caja
de
Petri
M3
*CV= (Desviacin estndar/promedio)*100
Es importante revisar el CV de los controles negativos, si el valor da por encima del 30% entonces el
experimento no es confiable y deber repetirse.
4. Clculo de porcentaje de inhibicin de hipocotilo
% Inhibicin Desarrollo Hipocotilo = (PromedioEHCneg - PromedioEHM) x 100
PromedioEHCneg
El promedio EH del control negativo se sacar a partir de los promedios de las dos repeticiones,
siempre y cuando ambas cumplan con el CV menor o igual al 30%.
El promedio EH de la muestra se saca de los promedios de las tres repeticiones calculados en la
tabla 2 (M1, M2 y M3)
5. Medida de elongacin de radcula (ER) en cada caja de Petri
Tabla
3.
Longitud
de
Radcula
(mm)
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
Promedio
ER
Desviacin
estndar
Caja
de
Petri
C(-)2
Caja
de
Petri
C(-)1
Semilla
Coeficiente
de
variacin*
*CV= (Desviacin estndar/promedio)*100
Caja
de
Petri
M3
Es importante revisar el CV de los controles negativos, si el valor da por encima del 30% entonces el
experimento no es confiable y deber repetirse.
El ndice de germinacin tendr valores entre 0 y 100, entre ms cerca a cero est, significar una
mayor inhibicin en crecimiento y en germinacin, mientras que si es superior a cien, se concluir
entonces que no hubo inhibicin, sino por el contrario, un mayor desarrollo con respecto al testigo
(control negativo)
Por ltimo deber concluirse si la muestra es txica o no, segn el ensayo realizado.
El informe requiere conclusiones que respondan a las siguientes preguntas:
1. Su muestra supera el porcentaje de inhibicin de germinacin, crecimiento de radcula o de
hipocotilo en un 50%?
2. Qu indica el ndice de germinacin obtenido?
3. Hay riesgo de toxicidad en la muestra tomada?
Nota: Para la participacin grupal en la wiki, cada estudiante publicar el IG calculado con su
muestra en el foro del entorno de aprendizaje prctico (Foro momento 3) y por grupo escogern la
muestra con mayor toxicidad, es decir con el IG ms bajo, y realizarn un prrafo en ingls que
describa el cuerpo de agua donde se tom la muestra, el tipo de contaminacin que le llega, el
clculo de inhibicin de crecimiento de radcula e hipocotilo y el ndice de germinacin, comparados
con los dems bioensayos realizados en el grupo. A continuacin se mencionan dos link con
artculos de estudios cientficos hechos usando el bioensayo de lechuga para que se fijen en los
trminos tcnicos que se usan:
Determination of phytotoxicity of soluble elements in soils, based on a bioassay with lettuce (Lactuca
sativa L.). Publicacin en lnea:
http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0048969707000484
Evaluation of the phytotoxicity of polycontaminated industrial effluents using the lettuce plant (Lactuca
sativa) as a bioindicator. Publicacin en lnea:
http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0147651311002120
El prrafo que se aporte en la wiki, no debe tener tablas ni datos sueltos con vietas, todo va de
manera descriptiva en un prrafo, tampoco se acepta ms de un aporte por grupo, debe mencionarse
al inicio o al final del prrafo el nmero del grupo que hace el aporte. El prrafo debe tener mnimo
100 palabras, mximo 150.
1 sobre de semillas de lechuga (Lactuca sativa L.) (Que no sean tan antiguas, ver fecha de
lote).
6 cajas de Petri (de vidrio o plstico, de 100 mm de dimetro).
3 Goteros o jeringas de 5mL que permitan medir 4mL.
1 Probeta de 250mL o un recipiente que este graduado cada 100mL o 50mL.
C. Productos a entregar
Informe de mximo de 10 hojas tamaa carta, letra Arial 11, espacio 1.15, con fotografas del
experimento (mximo 6).
Las partes del informe sern:
- Portada
- Introduccin
- Un mapa conceptual sobre los tipos de bioensayos usados en toxicologa ambiental para
muestras de agua y suelo.
- Diagrama de flujo de la prctica elaborada.
- Descripcin de la muestra llevada al bioensayo.
- Resultados.
- Anlisis de resultados.
- Conclusiones.
- Bibliografa.
Los estudiantes deben subir individualmente el informe en el entorno de Evaluacin y
seguimiento. Previo a subir el documento debern participar en el foro del entorno de aprendizaje
prctico (Foro momento 3), donde intercambiarn sus ideas e inquietudes sobre los resultados
obtenidos en la prctica y as podrn colaborarse mutuamente en el anlisis de resultados. Si la
prctica se desarroll en grupo, cada integrante del grupo debe subir al entorno de evaluacin y
seguimiento el informe desarrollado de forma grupal.
D. BIBLIOGRAFIA
Centro Internacional de Investigaciones para el Desarrollo de Canad (CIID). (2000). Aquatox 2000.
Canad: Autor. Disponible en http://idl-bnc.idrc.ca/dspace/bitstream/10625/31600/1/118283.pdf
Sobrero, M. C. & Ronco, A. (2008). Ensayo de toxicidad aguda con semillas de lechuga Lactuca
sativa L. En Ramrez, P. & Mendoza, A. (ed.). Ensayos toxicolgicos para la evaluacin de
sustancias qumicas en agua y suelo. La experiencia en Mxico. (pp. 55-68). Mxico: Secretara de
Medio Ambiente y recursos Naturales. Instituto Nacional de Ecologa. Recuperado de
http://www2.inecc.gob.mx/publicaciones/download/573.pdf
CRITERIO
EVALUADO
Participacin
en el foro del
momento 3
Prctica de
toxicologa
ambiental
Wiki con las
conclusiones
de cada
grupo sobre
la muestra
ms txica
trabajada.
Momento 3
Resultados
del
bioensayo
Mapa
conceptual
Realizacin
del Informe
final de la
prctica con
los tems
solicitados
BAJO
VALORACIN
MEDIO
ALTO
El estudiante hace
aportes significativos
para el anlisis del
bioensayo y discute
los resultados de sus
compaeros.
(Puntos = 20)
El estudiante no
particip en el
foro.
El estudiante
particip, pero no
aport a la discusin
de resultados de sus
compaeros.
(Puntos = 0)
(Puntos = 5 - 15)
El grupo no
participa en la wiki
El grupo hace un
aporte significativo,
en ingls y con la
informacin completa
solicitada.
(Puntos = 5 - 25)
El estudiante
presenta sus
resultados, pero hay
errores en los
clculos y/o un
anlisis deficiente de
stos.
(Puntos = 5 - 35)
(Puntos = 30)
Los resultados del
bioensayo y los
clculos son
correctos, adems
presenta un buen
anlisis de sus
resultados.
(Puntos = 40)
(Puntos = 0)
El estudiante no
realiz el
bioensayo o se
evidencia copypaste de otros
trabajos o de
internet.
(Puntos = 0)
No se presenta
este punto dentro
del informe o se
evidencia un copypaste de otros
trabajos o de
internet.
(Puntos = 0)
No presenta
informe individual
(Puntos = 0)
El mapa conceptual
est incompleto, o
no muestra la
informacin acorde
a los materiales del
curso.
(Puntos = 5 - 20 )
El informe contiene
los tems solicitados,
pero no son
coherentes ni
pertinentes para dar
respuesta a lo
solicitado en la gua
(Puntos = 5 - 15)
El mapa conceptual
est completo y usa
los documentos del
curso.
PUNTAJE
MXIMO
20
30
40
25
(Puntos = 25)
El informe es preciso,
pertinente y
coherente, y describe
lo solicitado en la gua
(Puntos = 20)
20
ACTIVIDAD
EVALUADA
Redaccin,
ortografa y
citacin
BAJO
El informe no es
claro, ni presenta
coherencia
interna, no tiene
buen uso de
ortografa, ni da
las citas
correspondientes
cuando se
requieren.
(Puntos = 0)
VALORACIN
MEDIO
ALTO
El informe presenta
coherencia pero
tiene fallas en
redaccin y
ortografa o citacin
El informe tiene
buena redaccin,
coherencia interna y
excelente ortografa.
La citacin se realiza
siguiendo normas
APA.
(Puntos = 5 - 10)
(Puntos = 15)
PUNTAJE
MXIMO
15
150