Comparação Dos Métodos Aplicados Na Detecção de Bactérias

UNIVERSIDADE DO ALGARVE
FACULDADE DE CINCIAS E TECNOLOGIA
Comparao dos mtodos aplicados na deteco de bactrias

coliformes, Escherichia coli e Enterococcus sp. em guas para
fins recreativos
Dissertao para obteno do grau de mestre em

Qualidade em Anlises
Especializao em Anlises de guas
Marta Sofia Mendes Valente Bernardo
Faro
2007
UNIVERSIDADE DO ALGARVE
FACULDADE DE CINCIAS E TECNOLOGIA
Comparao dos mtodos aplicados na deteco de bactrias

coliformes, Escherichia coli e Enterococcus sp. em guas para
fins recreativos
Dissertao para obteno do grau de mestre em

Qualidade em Anlises
Especializao em Anlises de guas
Faro
2007
II
Nome: Marta Sofia Mendes Valente Bernardo

Departamento: Faculdade de Cincias e Tecnologia
Orientadora: Doutora Ldia Adelina P Catalo Dionsio
Data: 18 de Dezembro de 2007
Ttulo da Dissertao: Comparao dos mtodos aplicados na deteco de bactrias
coliformes, Escherichia coli e Enterococcus sp. em guas para fins recreativos
Jri: Presidente: Doutora Isabel Maria Palma Antunes Cavaco
Vogais: Doutora Maria Leonor Faleiro
Doutora Ldia Adelina P Catalo Dionsio
Doutora Lilia Pinto de Pina Figueiredo Brinca
III
Este trabalho da exclusiva responsabilidade da sua autora

________________________________________________
IV
A ti Me.
AGRADECIMENTOS
Professora Ldia, que desde o primeiro contacto que estabelecemos se manifestou
interessada em orientar este trabalho, muito obrigado. Obrigado pela sua
disponibilidade, motivao, todo o apoio e compreenso que sempre teve para me dar.
Ao Paulo Pedro agradeo todo o interesse e acompanhamento manifestado durante o
trabalho. Obrigado por todo o material fornecido e pela enorme colaborao que deste
na realizao do trabalho de laboratrio.
Liseta quero agradecer a ajuda preciosa na familiarizao com o laboratrio de
Microbiologia. Obrigado pela total disponibilidade e por saber que poderia sempre
contar consigo!
Andreia, Teresa e ao Bruno agradeo toda a ajuda e dicas que me deram acerca do
funcionamento do laboratrio. Obrigado pelo material emprestado, que em
determinadas alturas foi determinante para a realizao do trabalho!...
Rosa, obrigado pela companhia que me fizeste no laboratrio. Obrigado tambm
pelas pequenas ajudas que me deste, mas que nos dias mais complicados me facilitaram
bastante o trabalho.
Aos meus Pais e Irmo, em especial minha Me quero agradecer o desejo de ver
atingidos com sucesso os meus objectivos. Obrigado pelo interesse e apoio
incondicional, pela fora, pela presena e pelas oraes. s sem dvida uma fonte de
inspirao e exemplo de vida.
Duzin e Tia Rita. Agradeo o interesse demonstrado pelo meu trabalho, obrigado
pela ajuda e o incentivo dado nas alturas em que me apeteceu desistir!... Muito obrigado
pelo apoio e pela energia positiva que me deu bastante fora para o culminar desta
etapa!
E a ti Shoffi, agradeo por todos os fins-de-semana, frias e tempos livres que no
pudemos partilhar nem gozar! Obrigado pela imensa compreenso, por toda a
colaborao e pelo incentivo que me deste nos momentos mais difceis. Obrigado por
todo o amor, amizade, companheirismo e principalmente por acreditares em mim!
VI
RESUMO
A avaliao da qualidade microbiolgica de guas para fins recreativos constitui uma
actividade de grande importncia, dado que necessrio garantir que a utilizao deste
tipo de guas seja feita sem colocar em risco a sade humana. A monitorizao do
estado sanitrio das guas no que respeita contaminao fecal feita, pela enumerao
dos microrganismos indicadores Escherichia coli e enterococos atravs de mtodos
normalizados. O facto destes mtodos no disponibilizarem os resultados em tempo til,
conduziu ao desenvolvimento de mtodos mais rpidos e sensveis para a enumerao
dos microrganismos indicadores. A tecnologia de substrato definido desenvolvida pela
empresa IDEXX Laboratories, Inc., permite reduzir o tempo de manipulao e de
incubao das amostras, assim como o tempo de leitura dos resultados. Com o objectivo
de estudar a relao entre os dois mtodos aplicados para a enumerao de bactrias
coliformes e enterococos, foram analisadas amostras de guas, para fins recreativos,
atravs do mtodo de referncia de filtrao por membrana e em paralelo atravs dos
testes enzimticos Colilert e Enterolert. O teste Colilert revelou resultados
equivalentes aos obtidos pelo mtodo de referncia, ao contrrio do teste Enterolert
que demonstrou ser estatisticamente diferente do mtodo normalizado. Tomando
tambm em considerao os resultados observados por outros autores conclui-se que,
devero ser analisadas mais amostras. E que a confirmao de uma maior percentagem
de presumveis positivos essencial, para se conseguir uma maior aproximao do
nmero real de bactrias a enumerar atravs de ambos os mtodos, e assim se poder
estabelecer a sua equivalncia.
Palavras-chave: Qualidade microbiolgica; Filtrao por membrana; Colilert;
Enterolert; Microrganismos indicadores; guas recreativas.
VII
Comparison of the methods used for the enumeration of coliform bacteria, Escherichia
coli and Enterococcus sp. in recreational waters
ABSTRACT
Evaluating the microbiological quality of the water that is used for recreational activities
is of great importance, since the usage of these waters must be done without
endangering human health. The monitorization of the sanitary quality of these waters,
when it comes to fecal contamination, is done by standard methods for the enumeration
of Escherichia coli and enterococci. Due to the time that classical methods need to
obtain results, other faster and more sensitive methods have been developed. The
defined substrate technology was developed by the company IDEXX Laboratories, Inc.,
and it allows the reduction of the time spent either in manipulation and incubation of the
samples, as well as the time needed for results reading. With the objective of studying
the relationship between the two methods applied to the enumeration of coliform
bacteria and enterococci, water samples were analyzed in parallel using the reference
method of membrane filtration as well as the Colilert and Enterolert enzymatic tests.
The results obtained with the Colilert test were equivalent to those obtained using the
reference method, but with the Enterolert test the results were statistically different
from those obtained with the standard method. Taking in consideration the results
observed by other authors, we concluded that more samples should be analyzed. And
that a higher number of presumptive positives need to be confirmed, so we can achieve
the real number of the enumerated bacteria by both methods and establish their
equivalence.
Keywords: Microbiological quality; Membrane filtration; Colilert; Enterolert;
Indicator microorganisms; Recreational waters.
VIII
ABREVIATURAS
ABREVIATURAS
Nvel de significncia
AGAR mENDO LES Meio de cultura selectivo para enumerao de bactrias
coliformes
AGAR mFC Meio de cultura selectivo para enumerao de coliformes fecais
ANOVA Anlise de varincia
BEAA Bile Esculin Azide Agar Agar Blis Esculina Azida
BPL Boas Prticas de Laboratrio
CNE Comit Europeu de Normalizao
CT Coliformes Totais
CF Coliformes Fecais
cDNA cido desoxirribonucleico complementar
DNA cido desoxirribonucleico
EI Enterococos Intestinais
EN European Norm Norma Europeia
EPA Environmental Protection Agency Agncia para a Proteco do Ambiente
EUA Estados Unidos da Amrica
FM Filtrao por Membrana
Fluorocult Caldo Dev Lactose Peptona
FTM Filtrao em Tubos Mltiplos
Gram - Gram negativa
Gram + Gram positiva
H0 Hiptese nula
H1 Hiptese alternativa
IPQ Instituto Portugus da Qualidade
Comparao dos mtodos aplicados na deteco

de bactrias coliformes, Escherichia coli e Enterococcus sp. em guas para fins recreativos
IX
ABREVIATURAS
IRAR Instituto Regulador de guas e Resduos

ISO International Organisation for Standardisation Organizao Internacional de
Normalizao
log Logaritmo de base 10
MLSA Membrane Lauryl Sulphate Agar Agar Lauril Sulfato
MRC Material de Referncia Certificado
MUG 4-methyllumbelliferyl--D-glucuronide 4-metil umbeliferil--D-glucurnido
NMP Nmero Mais Provvel
OCDE Organizao para a Cooperao e Desenvolvimento Econmico
ONPG ortho-nitrofenyl---galactopyranoside orto-nitrofenil---galactopiransido
PCR Polymerase Chain Reaction Reaco em cadeia da polimerase
qPCR PCR quantitativo em tempo real
Valor de significncia
RNA cido ribonucleico
S&B Slanetz & Bartley Meio de cultura selectivo para enumerao de enterococos
SPSS Statistical Package for the Social Sciences Pacote estatstico para as cincias
sociais
TSA Tryptone Soy Agar Agar Triptona Soja
TTC Cloreto de Trifenil Tetrazlio
UE Unio Europeia
UFC Unidades Formadoras de Colnias
Mestrado em Qualidade em Anlises
NDICES
NDICE GERAL
AGRADECIMENTOS ................................................................................................. VI
RESUMO..................................................................................................................... VII
ABSTRACT ...............................................................................................................VIII
ABREVIATURAS ........................................................................................................ IX
1. REVISO BIBLIOGRFICA .................................................................................. 2
1.1. QUALIDADE DAS GUAS NATURAIS ....................................................................... 2
1.1.1. Caracterizao das guas balneares ............................................................. 2
1.1.1.1. PARMETROS MICROBIOLGICOS ...................................................................... 2
1.1.1.2. PARMETROS FSICO-QUMICOS......................................................................... 3
1.2. POLUIO DAS GUAS NATURAIS ......................................................................... 4
1.3. MICRORGANISMOS PATOGNICOS TRANSMITIDOS POR VIA HDRICA ................. 5
1.4. MICRORGANISMOS INDICADORES DA QUALIDADE DA GUA ............................... 6
1.4.1. A famlia Enterobacteriaceae........................................................................ 7
1.4.2. O gnero Enterococcus ................................................................................. 8
1.5. MTODOS PARA DETECO E ENUMERAO DE MICRORGANISMOS
INDICADORES EM GUAS .............................................................................................. 9
1.5.1. Mtodos analticos clssicos.......................................................................... 9

1.5.1.1. TCNICA DE FERMENTAO EM TUBOS MLTIPLOS .......................................... 9
1.5.1.2. TCNICA DE FILTRAO POR MEMBRANA........................................................ 10
1.5.2. Mtodos analticos enzimticos................................................................... 11
1.5.2.1. TCNICA DE PRESENA / AUSNCIA .................................................................. 11
1.5.2.2. TCNICA DE MULTI-TUBOS E MULTI-POOS ..................................................... 12
1.5.3. Mtodos analticos moleculares .................................................................. 12
1.5.3.1. TCNICA DE DETECO IMUNOLGICA ........................................................... 13
1.5.3.2. TCNICA DE AMPLIFICAO DE CIDOS NUCLEICOS ....................................... 14
1.5.3.2.1. Polymerase Chain Reaction .......................................................... 14
1.5.3.2.2. PCR quantitativo em tempo real................................................. 15
1.5.3.2.3. Microarrays.................................................................................... 15
1.6. COMPARAO ENTRE OS MTODOS ANALTICOS CLSSICOS E ENZIMTICOS . 16
1.6.1. Vantagens e desvantagens dos mtodos analticos clssicos ..................... 16

XI
NDICES
1.6.2. Vantagens e desvantagens dos mtodos analticos enzimticos ................ 17

1.6.3. Mtodos analticos clssicos versus mtodos analticos enzimticos ........ 18
1.7. A QUALIDADE.................................................................................................. 18
1.7.1. Controlo da qualidade ................................................................................. 19
1.7.2. Garantia da qualidade ................................................................................. 19
1.7.3. Sistemas de qualidade.................................................................................. 20
1.7.3.1. NORMAS DA QUALIDADE ................................................................................... 20
1.7.3.1.1. Norma NP EN ISO/IEC 17025 .................................................... 21
1.7.3.2. Mtodos normalizados .............................................................................. 22
1.7.4. Qualidade em laboratrios de anlises ....................................................... 22
1.7.4.1. QUALIDADE EM LABORATRIOS DE ANLISES MICROBIOLGICAS................. 23
2. OBJECTIVOS .......................................................................................................... 25
3. PARTE EXPERIMENTAL ..................................................................................... 27
3.1. AMOSTRAGEM ..................................................................................................... 27
3.2. MATERIAL DE LABORATRIO E EQUIPAMENTO ................................................. 27
3.3. MEIOS DE CULTURA E REAGENTES ..................................................................... 29
3.3.1 Meios de cultura ........................................................................................... 29
3.3.2. Reagentes ..................................................................................................... 30
3.4. METODOLOGIA.................................................................................................... 31
3.4.1. Pesquisa de Coliformes Totais e Escherichia coli...................................... 31
3.4.1.1. ENUMERAO ................................................................................................... 31
3.4.1.1.1. Tcnica Quanti-Tray Colilert .................................................. 32
3.4.1.1.2. Tcnica de filtrao por membrana............................................ 33
3.4.1.2. CONFIRMAO .................................................................................................. 36
3.4.1.3. IDENTIFICAO ................................................................................................. 36
3.4.2. Pesquisa de enterococos .............................................................................. 40
3.4.2.1. ENUMERAO ................................................................................................... 40
3.4.2.1.1. TCNICA QUANTI-TRAY ENTEROLERT ..................................................... 40
3.4.2.1.2. Tcnica de filtrao por membrana............................................ 41
3.4.2.2. CONFIRMAO .................................................................................................. 43
3.4.2.3. IDENTIFICAO ................................................................................................. 43
3.4.3. Anlises fsico-qumicas .............................................................................. 44
3.4.3.1. DETERMINAO DE PH ..................................................................................... 44
XII
NDICES
3.4.3.2. DETERMINAO DE SALINIDADE ...................................................................... 45

3.4.4. Anlise estatstica ........................................................................................ 45
3.4.4.1. TESTES ESTATSTICOS ....................................................................................... 45
3.4.4.1.1. Comparao entre amostras emparelhadas............................... 46
3.4.4.1.2. Anlise de varincia ANOVA................................................... 46
3.4.4.2. NORMA ISO 17994:2004 PARA AVALIAO DA EQUIVALNCIA ENTRE
MTODOS MICROBIOLGICOS ....................................................................................... 46
4. RESULTADOS E DISCUSSO ............................................................................. 50

4.1. ENUMERAO DE COLIFORMES TOTAIS, ESCHERICHIA COLI E ENTEROCOCOS 50
4.2. DETERMINAO DOS PARMETROS FSICO-QUMICOS PH E SALINIDADE ........ 51
4.3. CORRELAO ENTRE OS PARMETROS MICROBIOLGICOS E FSICO-QUMICOS
.................................................................................................................................... 55
4.4. APRECIAO DA QUALIDADE DAS AMOSTRAS DE GUAS PARA FINS
RECREATIVOS ............................................................................................................. 58
4.5. COMPARAO ENTRE O MTODO NORMALIZADO FILTRAO POR MEMBRANA E

A TECNOLOGIA IDEXX.............................................................................................. 59
4.5.1. Coliformes Totais......................................................................................... 59

4.5.2. Escherichia coli ........................................................................................... 62
4.5.3. Enterococos.................................................................................................. 64
4.6. COMPARAO DOS RESULTADOS DE ENUMERAO UTILIZANDO DIFERENTES
MEIOS DE CULTURA SELECTIVOS E OS TESTES ENZIMTICOS................................... 65
4.6.1. Coliformes Totais......................................................................................... 66

4.6.2. Coliformes Fecais ........................................................................................ 68
4.6.3. Enterococos.................................................................................................. 69
4.7. TECNOLOGIA IDEXX EM USO NOS LABORATRIOS .......................................... 70
5. CONCLUSES......................................................................................................... 72
6. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS ................................................................... 75
7. ANEXOS

XIII
NDICES
NDICE DE FIGURAS
Figura 3.1 Colilert, tabuleiro de substrato definido para Coliformes Totais e E. coli.
Aps incubao a (361)C durante 18h a) poos amarelos contabilizados como
positivos para Coliformes Totais e b) poos fluorescentes luz ultravioleta
contabilizados como positivos para E. coli. ................................................................... 33
Figura 3.2 Meio de cultura MLSA selectivo para coliformes totais e E. coli. Colnias
tpicas amarelas e com mudana localizada de cor do meio aps incubao a
(36.02.0)C durante (213)h. Colnias atpicas: amarelas, laranja, brancas e rosas sem
mudana da cor do meio para amarelo. .......................................................................... 35
Figura 3.3 Colorao Gram: a) bactrias Gram+ e b) bactrias Gram- (adaptado de
Madigan, Martinko & Parker, 1997 ). ............................................................................ 37
Figura 3.4 Colnias tpicas e atpicas em meios de cultura para enumerao de
Coliformes Totais e Coliformes Fecais. a) Meio AGAR mENDO LES, aps incubao a
(44.00.5)C durante (213)h e b) Meio AGAR mFC, aps incubao a (36.02.0)C
durante (213)h. ............................................................................................................. 39
Figura 3.5 Enterolert, tabuleiro de substrato definido para enterococos, aps
incubao a (41.00.5)C durante 24h. .......................................................................... 41
Figura 3.6 Colnias tpicas em meio de cultura selectivo Slanetz & Bartley Agar,
aps incubao a (36.02.0)C durante (444)h. ........................................................... 42
Figura 3.7 Colnias do gnero Enterococcus em meio Agar Blis Esculina Azida,
com reaco positiva para a esculina aps incubao a (44.00.5)C durante 24h........ 42
Figura 3.8 Galeria API 20 Strep (bioMrieux Corporate) para identificao de
bactrias do grupo enterococos, aps incubao a (36.02.0)C durante 24h. .............. 43
Figura 4.1 Enumerao de bactrias Coliformes Totais, pelo mtodo filtrao por
membrana com os meios de cultura MLSA e AGAR mENDO LES e pelo teste
enzimtico Colilert. ...................................................................................................... 52
Figura 4.2 Enumerao de Escherichia coli, pelo mtodo filtrao por membrana com
os meios de cultura MLSA e AGAR mFC e pelo teste enzimtico Colilert. A linha
XIV
NDICES
vermelha indica o limite mximo estabelecido pela directiva 2006/7/CE para E. coli
para guas costeiras e de transio consideradas boa qualidade................................. 53
Figura 4.3 Enumerao de enterococcos, pelo mtodo filtrao por membrana com os
meios de cultura S&B e BEAA e pelo teste enzimtico Enterolert. A linha vermelha
indica o limite mximo estabelecido pela directiva 2006/7/CE para Enterococos
Intestinais para guas costeiras e de transio consideradas de boa qualidade. ......... 54

XV
NDICES
NDICE DE TABELAS
Tabela 3.I Meios de cultura usados para enumerao, confirmao e identificao das
bactrias estudadas. ........................................................................................................ 29
Tabela 3.II Reagentes utilizados nos diferentes procedimentos de identificao das
bactrias em estudo......................................................................................................... 30
Tabela 3.III Bactrias pesquisadas, respectivo mtodo de enumerao e tcnicas de
confirmao e identificao............................................................................................ 31
Tabela 3.IV Resultados dos testes para confirmao e identificao de Coliformes
Totais e Escherichia coli. ............................................................................................... 39
Tabela 3.V Resultados de testes para confirmao e identificao de enterococos. .. 44
Tabela 4.I Valores de pH e salinidade obtidos para o total de amostras analisadas... 55
Tabela 4.II Matriz de correlao. Mtodos de enumerao de Coliformes Totais e
parmetros fisico-qumicos valor de pH e salinidade..................................................... 56
Tabela 4.III Matriz de correlao. Mtodos de enumerao de Escherichia coli e
Tabela 4.IV Matriz de correlao. Mtodos de enumerao de enterococos e
Tabela 4.V Apreciao da qualidade das amostras de guas para fins recreativos com
base na enumerao de Escherichia coli e enterococos, pelos mtodos em estudo....... 58
Tabela 4.VI Comparao dos diferentes meios de cultura selectivos. ....................... 67
XVI
1. REVISO BIBLIOGRFICA
REVISO BIBLIOGRFICA
1. REVISO BIBLIOGRFICA
1.1. Qualidade das guas naturais
A poltica da Unio Europeia no domnio do ambiente tem como objectivo um
elevado nvel de proteco da sade humana e contribui para a realizao dos objectivos
de preservao, proteco e melhoria da qualidade do ambiente. Em 1975 com a entrada
em vigor da Directiva do Conselho n 76/160/CEE de 8 de Dezembro relativa
qualidade das guas balneares, a qualidade global deste tipo de guas melhorou
consideravelmente. Entretanto, os padres de utilizao das guas balneares mudaram e
os conhecimentos cientficos e tcnicos tambm evoluram. Como tal, em 2006 foi feita
uma actualizao da Directiva de 1975 no que respeita utilizao dos parmetros de
indicadores mais fiveis (Directiva 2006/7/CE do Parlamento Europeu e do Conselho),
com vista a permitir a predio dos riscos bacteriolgicos e fsico-qumicos para a sade
e atingir um nvel de proteco elevado. Nesta reviso so ainda tomados em
considerao novos tipos de guas, tais como para fins recreativos, que adquiriram
popularidade devido a alteraes sociais e a novos tipos de materiais e equipamentos de
desporto. Esta Directiva visa tambm a preservao, proteco e melhoria da qualidade
do ambiente com vista proteco da sade humana contra a contaminao qumica e
microbiolgica durante as actividades balneares ou outras utilizaes da gua para fins
recreativos. Assim, foram estabelecidas normas sanitrias, disposies para a
monitorizao, classificao e gesto da qualidade deste tipo de guas.
1.1.1. Caracterizao das guas balneares

1.1.1.1. Parmetros microbiolgicos
A classificao da qualidade microbiolgica das guas balneares divide-se em:
medocre, suficiente, boa ou excelente, de acordo com os critrios
REVISO BIBLIOGRFICA
estabelecidos para os parmetros microbiolgicos. Uma gua de classificao

excelente pode apresentar at 100 Unidades Formadoras de Colnias (UFC) de
Enterococos Intestinais (EI) por 100mL de amostra. Uma gua de classificao boa
pode apresentar at 200UFC de EI por 100mL de amostra. O mtodo de referncia para
a anlise de Enterococos Intestinais o descrito na norma ISO 7899-2 (2000). No que
respeita ao parmetro microbiolgico Escherichia coli (E. coli) uma gua considerada
excelente ou de boa qualidade quando no ultrapassado o valor 250 ou 500UFC
por 100mL de amostra, respectivamente. Este parmetro analisado pelo mtodo de
referncia descrito na norma ISO 9308-1 (2000). A classificao de qualidade
suficiente atribuda quando os valores de EI enumerados so iguais ou inferiores a
185UFC de EI por 100mL de amostra, e/ou os valores de E. coli iguais ou inferiores a
500UFC de EI por 100mL com base numa avaliao de percentil 90, ao contrrio das
classificaes excelente e boa que so avaliadas com base no percentil 95. A
classificao medocre acontece quando so ultrapassados os valores de enumerao
de EI e E. coli para gua de qualidade suficiente (Directiva 2006/7/CE do Parlamento
Europeu e do Conselho).
1.1.1.2. Parmetros fsico-qumicos

Relativamente aos parmetros fsico-qumicos uma amostra de gua classificada
como de boa qualidade quando por inspeco visual e olfactiva, se verifica a ausncia
de pelcula visvel superfcie e ausncia de odor, isto no que respeita a leos minerais.
Por inspeco visual, deve verificar-se a ausncia de resduos de alcatro e materiais
flutuantes, como madeira, plstico, vidro, borracha ou qualquer outra substncia
residual. As guas doces so ainda classificadas como de boa qualidade quando
apresentam um valor de pH entre 6 e 9 (mtodos de electrometria com calibrao de pH

REVISO BIBLIOGRFICA
7 e pH 9) e ausncia de variaes inexplicveis (Directiva 2006/7/CE do Parlamento

Europeu e do Conselho).
1.2. Poluio das guas naturais

A gua essencial vida. o constituinte mais caracterstico da Terra, e talvez
o recurso mais precioso que a Terra fornece Humanidade. Por ser um recurso natural
escasso, a gua deve ser protegida, defendida e adequadamente tratada e utilizada, em
especial as guas de superfcie, que so fontes renovveis com uma capacidade limitada
de recuperao dos impactos adversos decorrentes das actividades humanas (Directiva
2006/7/CE do Parlamento Europeu e do Conselho).
As guas naturais, sejam de carcter doce ou salgado, so cada vez mais utilizadas
para fins recreativos, como por exemplo: natao, surf, kite-surf, windsurf, pesca, entre
outras. Este tipo de guas esto normalmente sujeitas a um risco particular de poluio
seja de origem microbiana, qumica ou fsica. A poluio microbiana tem origem em
fontes naturais que retm microrganismos patognicos; descargas de guas residuais
municipais; fossas spticas particulares; guas de escorrncia e guas industriais
contaminadas com resduos humanos ou animais (Cabelli, 1989 & Andreadakis, 1997).
A poluio qumica pode ser proveniente (i) das indstrias, por exemplo os corantes,
detergentes sintticos ou fosfatos; (ii) da agricultura, os adubos e pesticidas; (iii) e das
guas domsticas, os detergentes biodegradveis e outros poluentes orgnicos. A
poluio fsica pode resultar da descarga de material em suspenso ou particulado nas
guas (Andreadakis, 1997).
Frequentemente a poluio para alm do aspecto desagradvel que provoca, pode
originar riscos para a sade humana. Principalmente quando ocorrem contaminaes
REVISO BIBLIOGRFICA
por bactrias de origem fecal, em que o risco de doenas entricas associadas

exposio a guas contaminadas com resduos fecais significativo (Cabelli, 1989).
1.3. Microrganismos patognicos transmitidos por via hdrica

A gua um dos veculos privilegiados para a transmisso de microrganismos
patognicos ao Homem. No s pelo seu consumo, mas tambm pelo contacto directo,
quando as guas naturais so usadas para fins recreativos. As bactrias patognicas de
origem entrica, animal ou humana, so excretadas nas fezes de indivduos infectados,
podendo ser ingeridas pelo consumo de gua ou alimentos contaminados (Grabow,
1996). Mas para alm das bactrias, tambm protozorios, fungos e virus so tambm
abundantes nas guas residuais e podem contaminar as guas naturais (Pelczar, Chan, &
Krieg, 1993). Estes microrganismos esto associados a numerosas doenas infecciosas
com transmisso por via hdrica, como o caso da poliomielite, a hepatite de tipo A e
outras viroses provocadas por rotavrus e vrus tipo Norwalk; gastroenterites de origem
bacteriana como salmoneloses (entre as quais a febre tifide); shigeloses e clera;
disenterias provocadas pela ingesto de cistos de protozorios, como a giardase e a
criptosporidase; otites e diversas doenas de pele provocadas por fungos (Efstratiou,
2001).
A desinfeco o tipo de tratamento de gua indispensvel em sistemas pblicos
que, conduz destruio dos microrganismos patognicos eventualmente existentes
(Souza & Daniel, 2005). Em certos tipos de gua, a filtrao e a desinfeco podem ser
inadequadas ou mesmo no aplicveis, como o caso especial da gua do mar, da gua
doce dos lagos ou rios poludos por esgotos, e da gua das piscinas e das estncias
termais (http://www.civil.ist.utl.pt/Seminarios/Viajante/MVambiente.pdf).

REVISO BIBLIOGRFICA
Uma vez que, a contaminao de guas naturais por guas no tratadas pode levar
ao aumento do risco de transmisso de doenas para os seres humanos, necessrio que
a qualidade sanitria das mesmas seja monitorizada para a presena de contaminao
microbiolgica, pelas autoridades de sade pblica (Sinton, Donnison & Hastie, 1993).
1.4. Microrganismos indicadores da qualidade da gua

A avaliao da qualidade microbiolgica da gua deve ter em conta a pesquisa de
microrganismos associados a doenas entricas e no de agentes patognicos
especficos. Estes ltimos ocorrem em nmero mais reduzido, e sobrevivem pior no
ambiente aqutico, fazendo com que o seu isolamento seja dificultado. Por isso, a
avaliao da gua atravs da pesquisa de microrganismos patognicos especficos pode
no ser a mais adequada. Desta forma, a monitorizao da qualidade microbiolgica da
gua, feita atravs da pesquisa de microrganismos indicadores (Efstratiou, 2001 &
Rompr et al., 2002).
Um microrganismo indicador de contaminao, deve apresentar caractersticas
uniformes e estveis nos vrios tipos de guas; possuir propriedades especficas de
modo a identificar correctamente o grupo a que pertence. Deve apresentar uma
metodologia de enumerao, isolamento e identificao simples e de elevada
sensibilidade, de modo a detectar concentraes pequenas do microrganismo indicador.
Deve resistir s condies ambientais e processos de desinfeco e no representar um
perigo para a sade humana. Deve sobreviver de forma semelhante ou melhor que o
agente patognico, e por um perodo de tempo superior. Deve estar presente sempre que
esteja presente o microrganismo patognico, e ausente sempre que no seja detectada
contaminao. As concentraes do microrganismo indicador devem ser superiores e
REVISO BIBLIOGRFICA
correlacionar-se com as do patognico e com o grau de poluio (Prescott, Harley &

Klein, 1996).
Uma vez que, a contaminao fecal um factor importante na avaliao da
qualidade da gua e dos riscos para a sade humana, a presena de E. coli, que
normalmente habita o intestino do Homem e de outros animais de sangue quente em
amostras de gua, evidencia contaminao fecal. A presena de bactrias coliformes
pode ser de interpretao mais difcil porque algumas destas bactrias vivem no solo e
na gua, no sendo sempre de origem intestinal. Assim, a presena de bactrias
coliformes, embora no sendo prova de contaminao fecal, poder indicar a existncia
de falhas no processo de tratamento ou no sistema de distribuio. A identificao das
estirpes isoladas pode, por vezes, dar uma indicao da origem da contaminao
(Recomendao do IRAR n05/2005).
1.4.1. A famlia Enterobacteriaceae

A famlia Enterobacteriaceae engloba as bactrias em forma de bastonete, gramnegativas (Gram-), aerbias e anaerbias facultativas que produzem cido a partir da
glucose e outros hidratos de carbono (Holt et al., 1994).
Os coliformes so um grupo de bactrias indicadoras que pertencem famlia
Enterobacteriaceae. Este grupo perfaz cerca de 10% dos microrganismos do tracto
intestinal humano e dos animais de sangue quente e caracterizam-se por no formarem
esporos, ausncia da enzima oxidase, capacidade de fermentar a lactose com a produo
de cido e gs em 48h a 35C. Dentro dos coliformes incluem-se os gneros
Escherichia, Citrobacter, Klebsiella e Enterobacter. Para alm das bactrias entricas
dos gneros acima mencionados o grupo dos coliformes engloba outras cuja origem no
o tracto intestinal (Prescott, Harley & Klein, 1996). Os coliformes fecais so um

REVISO BIBLIOGRFICA
subgrupo de bactrias do grupo coliformes totais que normalmente habitam o tracto

digestivo de animais de sangue quente, incluindo o Homem, outros mamferos e as
aves. Cada pessoa excreta cerca de dois bilies dessas bactrias por dia. Por isso, esse
grupo utilizado como indicador da contaminao fecal da gua e alimentos. Os
coliformes termotolerantes so um subgrupo de bactrias do grupo coliformes totais que
fermentam a lactose a (44.5 0.5)C em (22 2)h, tendo como principal representante
Escherichia coli. Esta bactria de origem exclusivamente fecal tem como habitat
exclusivo o tracto intestinal do Homem e de outros animais de sangue quente, sendo
este grupo tambm denominado por Coliformes Fecais (CF) (Holt et al., 1994).
Deste modo, para estabelecer os padres de qualidade da gua so pesquisados
Coliformes Totais (CT) e Fecais (CF). Dentro dos Coliformes Fecais, E. coli
considerada a bactria mais credvel, uma vez que, a sua presena est directamente
relacionada com a contaminao fecal e consequentemente com a possibilidade da
presena de outros microrganismos entricos patognicos (Rice et al., 1991).
Os Coliformes Fecais e E. coli tm sido usados para monitorizar a qualidade da
gua para fins recreativos. Estudos recentes demonstraram que concentraes elevadas
de E. coli e enterococos tm sido recuperadas neste tipo de guas e apresentam uma
maior correlao com doenas gastrointestinais que as densidades de bactrias
coliformes fecais recuperadas. Ento, a partir de 2000 para alm dos coliformes,
tambm os enterococos passaram a ser usados para monitorizar a qualidade
microbiolgica da gua, seja esta de carcter doce ou salgado (Kinzelman et al., 2003).
1.4.2. O gnero Enterococcus

O gnero Enterococcus inclui bactrias anaerbicas facultativas, cocos que se
podem apresentar isolados, aos pares ou em cadeias curtas. Gram-positivos (Gram+)
REVISO BIBLIOGRFICA
catalase negativos, com crescimento ptimo a (35-37)C, com capacidade de

crescimento a 45C, suportam concentraes de 6.5% NaCl e hidrolisam a esculina na
presena de 40% de sais biliares. A espcie Enterococcus faecalis, encontra-se quase
constantemente e em grande nmero no tracto intestinal dos animais de sangue quente.
Neste grupo incluem-se tambm E. faecium, E. avium, E. durans e E. gallinarum
(Prescott, Harley & Klein, 1996).
1.5. Mtodos para deteco e enumerao de microrganismos indicadores em

guas
Os mtodos para deteco e enumerao de microrganismos indicadores em guas
podem ser divididos em clssicos, enzimticos e moleculares.
1.5.1. Mtodos analticos clssicos

Os mtodos analticos clssicos para anlise microbiolgica de guas so: a
tcnica de fermentao em tubos mltiplos atravs da qual se estima o Nmero Mais
Provvel (NMP) de microrganismos na amostra; e a tcnica de filtrao por membrana
em que se enumera directamente o nmero de Unidades Formadoras de Colnias na
amostra.
1.5.1.1. Tcnica de fermentao em tubos mltiplos

A fermentao em tubos mltiplos uma tcnica atravs da qual se calcula o NMP
de microrganismos por 100mL de amostra, aps o seu crescimento em meio lquido.
Uma anlise completa envolve um teste presuntivo, em que so incubadas sries de
diluies decimais da amostra em grupos de 3 ou 5 tubos por diluio, num meio
moderadamente selectivo. Seguido de um passo de confirmao dos tubos com

REVISO BIBLIOGRFICA
resultado positivo em meio mais selectivo. E o teste completo implica uma srie de
etapas que permitem uma avaliao de reaces tpicas dos microrganismos por testes
bioqumicos, serolgicos ou enzimticos e uma colorao Gram. Todo o processo exige
pelo menos 4 dias de incubaes e repicagens (Prescott, Harley & Klein, 1996; Oblinger
& Koburger, 1983 e Figueras et al., 2000).
O NMP est directamente relacionado com a frequncia de ocorrncia de uma
srie de resultados positivos, que so mais provveis de acontecer quando um dado
nmero de microrganismos est presente na amostra (Prescott, Harley & Klein, 1996;
Oblinger & Koburger, 1983 e Figueras et al., 2000). Este nmero uma estimativa
estatstica da mdia de microrganismos viveis presentes na amostra. Como tal, esta
tcnica d-nos uma enumerao semi-quantitativa, em que a preciso da estimativa
baixa e depende do nmero de tubos usados para a anlise (Rompr et al., 2002).
1.5.1.2. Tcnica de filtrao por membrana

A tcnica de filtrao por membrana enumera, os microrganismos em pesquisa
numa membrana colocada superfcie do meio de cultura estabelecendo o nmero de
UFC por 100mL de amostra. A anlise consiste na filtrao de um dado volume de
amostra de gua atravs de uma membrana de ster de celulose que depois colocada
sobre um meio selectivo. Aps a incubao temperatura adequada as colnias tpicas
so contadas e transferidas para um meio de cultura confirmativo. ento feita uma
avaliao de reaces tpicas dos microrganismos por testes bioqumicos, serolgicos ou
enzimticos e tambm a colorao Gram (Bancroft, Nelson & Childers, 1989 e
(American Public Health Association, 1998).
10
REVISO BIBLIOGRFICA
1.5.2. Mtodos analticos enzimticos

Os mtodos analticos enzimticos de deteco e enumerao de microrganismos
em guas baseiam-se na tecnologia de substrato definido, e encontram-se disponveis
sob a forma de resposta presena / ausncia ou enumerao em multi-tubos e multipoos. Nestes mtodos, o substrato definido usado como fonte de nutrientes vital aos
microrganismos em pesquisa. Durante a incubao libertado do substrato definido um
cromforo ou fluorforo, indicando a presena do microrganismo alvo (Rompr et al.,
2002). Nestes mtodos pode tambm ser feita uma estimativa do NMP de
microrganismos presentes na amostra, com base nas suas propriedades bioqumicas
(Edberg et al., 1990).
1.5.2.1. Tcnica de presena / ausncia

O mtodo analtico enzimtico baseado na presena / ausncia resulta da
simplificao do mtodo clssico do NMP, com a finalidade de obter uma informao
apenas qualitativa para um volume de 100mL de amostra. Dado que, teoricamente a
gua para consumo (fornecidas por sistemas de abastecimento pblico, redes de
distribuio, camies ou navios cisterna, ou utilizada numa empresa da indstria
alimentar) no dever apresentar microrganismos por 100mL de amostra (American
Public Health Association, 1998). Assim, so homogeneizados 100mL de amostra com
uma mistura de ingredientes em p num frasco adequado. A mistura fica incolor. Aps
incubao adequada s condies de crescimento dos microrganismos em pesquisa a
alterao de cor significa que houve hidrlise do substrato logo o teste positivo. No
so necessrios testes de confirmao e possvel detectar microrganismos em stresse
fisiolgico num tempo mximo de 24h (Edberg et al., 1990 e Rompr et al., 2002).

11
REVISO BIBLIOGRFICA
1.5.2.2. Tcnica de multi-tubos e multi-poos

Os mtodos analticos enzimticos de enumerao de microrganismos podem ser
realizados em multi-tubos ou multi-poos (American Public Health Association, 1998).
Para o sistema multi-poos a empresa IDEXX Laboratories, Inc. desenvolveu a
tecnologia Quanti-Tray que se aplica a anlises de guas (Edberg et al., 1990). O meio
de cultura desenvolvido para o microrganismo em pesquisa dissolvido e
homogeneizado em 100mL de amostra ou diluio da mesma. A suspenso vertida
para um tabuleiro de incubao constitudo por 97 poos individuais, e incubada
temperatura adequada. O sistema Quanti-Tray fechado a vcuo o que impede a
ocorrncias de contaminaes da amostra. Os resultados so lidos directamente do
tabuleiro e a determinao do NMP por 100mL de amostra feita com base numa tabela
de NMP (http://www.idexx.com/water/). Esta tcnica no requer preparao de material
nem meios de cultura antes do processamento das amostras, o que a torna mais eficiente
que as tcnicas clssicas (Chihara et al., 2005).
1.5.3. Mtodos analticos moleculares

Os mtodos analticos moleculares baseiam-se na deteco imunolgica ou na
amplificao de cidos nucleicos especficos. Estes mtodos foram desenvolvidos para
aumentar a rapidez da anlise e atingir um grau de sensibilidade e especificidade
elevado, no sendo necessrios passos adicionais de cultura nem de confirmao
(American Public Health Association, 1998). Deste modo, estes mtodos permitem a
deteco de microrganismos especficos cultivveis ou no em poucas horas, ao
contrrio dos mtodos clssicos que demoram dias. Nestes mtodos a especificidade
depende do grau de conservao filogentico da sequncia nucleotdica dentro do grupo
taxonmico alvo. Oferecem informao a diferentes nveis, tais como classe, gnero,
12
REVISO BIBLIOGRFICA
espcie e subespcie. Podem mesmo ser identificados microrganismos que no seriam

detectados nas tcnicas de cultura. Para alm de poderem ser usados como ferramentas
de identificao de novas entidades patognicas (Rompr et al., 2002).
1.5.3.1. Tcnica de deteco imunolgica

Os mtodos de deteco imunolgica baseiam-se no reconhecimento especfico
entre anticorpos e antignios, e na elevada afinidade que caracterstica desta reaco
de reconhecimento. Dependendo do nvel taxonmico dos antignios alvo, os mtodos
imunolgicos permitem a deteco de antignios a nvel da famlia, gnero, espcie ou
sertipo. Estes mtodos podem ser processados directa ou indirectamente. Num
processo de imunofluorescncia directo, o anticorpo especfico conjugado
directamente com o fluorocromo. Um processo indirecto envolve a ligao do anticorpo
primrio especfico ao antignio alvo, seguido da adio de um anticorpo marcado com
o fluorocromo directamente contra o anticorpo primrio. A deteco imunolgica pode
ser feita atravs de sondas de cido desoxirribonucleico (RNA) para um gene
especfico, e anticorpos com marcao fluorescente que permitem a visualizao
microscpica directa dos microrganismos alvo. Pode tambm ser feita por sondas
especficas desenhadas para a hibridao com sequncias de cidos nucleicos que
sinalizam a presena, na amostra, de um organismos particular. uma tcnica simples e
rpida, cuja exactido depende maioritariamente da especificidade do anticorpo e em
que possvel a identificao e enumerao de uma simples clula presente numa
amostra (Rompr et al., 2002).

13
REVISO BIBLIOGRFICA
1.5.3.2. Tcnica de amplificao de cidos nucleicos

Os mtodos de amplificao de cidos nucleicos baseiam-se nas propriedades de
hibridao molecular, que envolve o reconhecimento de uma sequncia complementar
entre um cido nucleico sonda e um cido nucleico alvo. Esta reaco de hibridao
pode dar-se entre sonda de DNA (cido desoxirribonucleico) e sequncia de DNA
cromossmica (hibridao DNADNA) e entre sonda de DNA e sequncias de RNA
ribossomal ou de RNA de transferncia (hibridao DNARNA) (Rompr et al., 2002).
1.5.3.2.1. Polymerase Chain Reaction

A tcnica de amplificao de sequncias de cidos nucleicos reaco em cadeia
da polimerase (Polymerase Chain Reaction PCR) permite a amplificao in vitro ou
in situ de sequncias de DNA. Esta amplificao exponencial e possvel a partir de
poucas
cpias
da
sequncia
especfica,
chegando
em
poucas
horas,
at
aproximadamente um milho. Consiste na repetio de ciclos de replicao cuja reaco

em cadeia catalizada por uma DNA polimerase e pelo uso de oligonucletidos de
iniciao (primers). Esta tcnica completa envolve um passo de extraco de DNA
seguida de ciclos de replicao in vitro. Uma vez que, so amplificadas sequncias de
DNA especficas para os microrganismos em pesquisa, a escolha correcta da sequncia
a amplificar, assim como, o uso de condies de amplificao suficientemente
restringentes torna este tipo de deteco muito selectivo e sensvel (Kreader, 1995 e
Rompr et al., 2002). Esta tcnica tem a grande vantagem de no necessitar de cultura
dos microrganismos alvo, o que permite a sua rpida identificao (Scott et al., 2002).
Para alm disso, e uma vez que se baseia em sequncias de DNA, no est dependente
de caractersticas que podem ou no estar presentes ou a ser expressas em todas as
condies ambientais, tais como actividades enzimticas especficas ou caractersticas
14
REVISO BIBLIOGRFICA
morfolgicas. A informao codificada no DNA um meio de deteco quer haja

expresso fenotpica ou no (Kreader, 1995). Esta tcnica permite ainda a deteco de
microrganismos viveis, mas que por estarem sob condies de stresse no crescem em
meios de cultura (Gulec et al., 2002).
1.5.3.2.2. PCR quantitativo em tempo real

O PCR quantitativo em tempo real (qPCR) uma verso modificada da tcnica de
PCR, em que possvel fazer a quantificao dos microrganismos indicadores ainda
mais rapidamente, ou seja, em menos de 2h (Wade et al., 2006). Os produtos de
amplificao so marcados com fluorocromos e so detectados num termociclador que
mede o sinal de fluorescncia durante os ciclos de amplificao. O sinal est
relacionado com a quantidade de produtos de PCR amplificados. Uma vez, que
possvel detectar os produtos de amplificao durante a fase logartmica inicial
determina-se a quantidade de sequncia especfica existente no incio da reaco (Noble
& Weisberg, 2005).
1.5.3.2.3. Microarrays
Os microarrays ou microchips envolvem a ligao de uma sonda de cDNA no
slide ou array e o DNA alvo. Quando a hibridao entre a sequncia de interesse
especfica e o DNA alvo acontece, existe uma alterao de cor que indica uma reaco
positiva. A fluorescncia gerada na superfcie do slide detectada e quantificada para
determinar quantidade relativa da sequncia especfica no DNA alvo. Num nico
microarray podem ser analisados ao mesmo tempo milhares de microrganismos. (Noble
& Weisberg, 2005).

15
REVISO BIBLIOGRFICA
1.6. Comparao entre os mtodos analticos clssicos e enzimticos

1.6.1. Vantagens e desvantagens dos mtodos analticos clssicos
O mtodo analtico clssico da fermentao em tubos mltiplos apresenta como
principais vantagens a possibilidade de analisar tanto amostras lmpidas como amostras
turvas; a recuperao de microrganismos sob stresse; e um curto espao de tempo e
esforo para iniciar o processamento das amostras, o que pode realizar-se a qualquer
hora do dia (Figueras et al., 2000). No entanto, pode tornar-se uma tcnica que implica
trabalho de laboratrio intensivo, quando so necessrias fazer muitas diluies das
amostras. Trata-se de uma tcnica que pode ser realizada por tcnicos com formao
bsica em microbiologia, e relativamente barata, uma vez que, no requer
equipamento muito sofisticado (Rompr et al., 2002). O mtodo analtico clssico da
fermentao em tubos mltiplos apresenta como desvantagens o tempo, volume de
trabalho e material necessrios para analisar uma amostra. constitudo por trs fases,
em que cada uma demora 24 ou 48h leva a que sejam necessrios 3 a 5 dias at se
completar a anlise. um mtodo de enumerao indirecto muito antigo (Oblinger &
Koburger, 1983), que disponibiliza resultados com pouca preciso em termos
qualitativos e quantitativos (Rompr et al., 2002). Uma vez que, apenas permite uma
estimativa do nmero de microrganismos presentes, o valor verdadeiro (95% do limite
de confiana) pode apresentar uma variao considervel do NMP (Figueras et al.,
2000). Muitos factores interferem com a deteco dos microrganismos atravs
fermentao em tubos mltiplos especialmente durante o teste presuntivo. Por exemplo,
a interferncia do nmero elevado de microrganismos que no so alvo da pesquisa
assim como, a inibio proveniente da natureza dos meios de cultura (Rompr et al.,
2002).
16
REVISO BIBLIOGRFICA
O mtodo analtico clssico de filtrao por membrana apresenta como principais

vantagens a enumerao directa do nmero de microrganismos com elevada preciso e
exactido; a formao de uma colnia visvel a partir de um microrganismo permite o
seu isolamento para posterior caracterizao e identificao; a possibilidade de
processar grandes volumes de amostra aumentando a sensibilidade do mtodo (Figueras
et al., 2000). As principais desvantagens que o mtodo analtico clssico de filtrao por
membrana apresenta so, o facto de no se poder aplicar a amostras de guas turvas
com baixa concentrao microbiana, cuja matria em suspenso pode obstruir a
membrana ou impedir o crescimento dos microrganismos alvo; possibilidade de no
recuperao dos microrganismos que se encontram sob stresse ou enfraquecidos
(Rompr et al., 2002). Resultados falsos negativos devido incapacidade de alguns
microrganismos viveis presentes em guas naturais crescerem. Resultados falso
positivos quando microrganismos no alvo formam colnias semelhantes s colnias
alvo (Figueras et al., 2000). O mtodo da filtrao por membrana o mais utilizado,
porm, revela-se muito trabalhoso quando necessrio analisar muitas diluies da
amostra (Kinzelman et al., 2003).
1.6.2. Vantagens e desvantagens dos mtodos analticos enzimticos

Os mtodos analticos enzimticos possuem a grande vantagem de abreviar o
tempo necessrio para a obteno dos resultados. Melhoraram a produtividade
laboratorial, simplificam o trabalho e reduzem os custos. So mtodos que possuem
uma maior sensibilidade e especificidade que os mtodos clssicos, e no caso da
tecnologia Quanti-Tray uma tcnica fcil de executar, requerendo reduzida mo-deobra e pouco especializada (Rompr et al., 2002).

17
REVISO BIBLIOGRFICA
1.6.3. Mtodos analticos clssicos versus mtodos analticos enzimticos

Os mtodos analticos clssicos usados para a enumerao de microrganismos so
geralmente baseados em reaces metablicas. Por isso, no so completamente
especficos, e so necessrios testes adicionais para confirmao. O uso de perfis
enzimticos para detectar microrganismos (princpio em que se fundamentam os
mtodos analticos enzimticos) uma alternativa atractiva aos mtodos analticos
clssicos e tem sido amplamente estudada. Isto porque so reaces rpidas e sensveis,
e podem ser especficas a nvel do grupo, gnero ou espcie, consoante a enzima alvo.
Os mtodos analticos clssicos (fermentao em tubos mltiplos e filtrao por
membrana) impedem o crescimento de microrganismos no alvo atravs da
incorporao nos meios de cultura de qumicos inibidores. Os mtodos analticos
enzimticos (tecnologia de substrato definido) tm como princpio, disponibilizar
alimento apenas para os microrganismos em pesquisa (Rompr et al., 2002).
1.7. A Qualidade
Quando se fala de qualidade, pensamos em produtos ou servios de excelncia,
que satisfaam plenamente os nossos requisitos, normalmente baseados na finalidade e
preo do produto ou servio (Besterfiel, 1986). Do ponto de vista empresarial a
qualidade o conjunto de todas as caractersticas e finalidades de um produto ou
servio, que contribuem para a satisfao das necessidades do cliente (Fey & Gogue,
1983 e Besterfiel, 1986). As necessidades envolvem questes como: preo, segurana,
disponibilidade, manuteno, confiana e utilidade. O preo fcil de definir em
unidades monetrias, mas as outras caractersticas no, pois so traduzidas em
especificaes particulares no fabrico de um produto ou na prestao de um servio. A
conformidade de um produto ou servio com as respectivas especificaes possvel de
18
REVISO BIBLIOGRFICA
medir, e permite definir quantitativamente a qualidade. Ento qualidade a

conformidade de um produto ou servio com as especificaes. O grau de conformidade
a medida da qualidade (Besterfiel, 1986).
1.7.1. Controlo da qualidade

Sempre que as especificaes de um produto ou servio no satisfazem as
necessidades do cliente, estas devem ser revistas. Esta aco est inserida no controlo da
qualidade, que integra as tcnicas e actividades para alcanar, sustentar e melhorar a
qualidade de um produto ou servio (Besterfiel, 1986).
A partir das necessidades do cliente so definidas as especificaes relativas a um
determinado produto ou servio. Estes so projectados, produzidos ou instalados e
inspeccionada a conformidade com as suas especificaes. Uma vez que, o objectivo a
melhoria contnua da qualidade, tambm muito importante rever a utilizao dos
produtos ou servios, para obter informaes caso seja necessrio corrigir as
especificaes estabelecidas. Tudo isto proporciona ao cliente a obteno de um melhor
produto ou servio com menor custo (Besterfiel, 1986).
1.7.2. Garantia da qualidade

Todas as aces necessrias para confirmar que produtos ou servios iro
satisfazer as necessidades do consumidor esto contempladas na garantia da
qualidade. Esta assegura que a qualidade do produto ou servio corresponde
efectivamente ao estabelecido, e implica que haja uma contnua avaliao da adequao
e eficincia, de modo a haver medidas correctivas onde for necessrio (Besterfiel,
1986).

19
REVISO BIBLIOGRFICA
1.7.3. Sistemas de qualidade

O sistema de qualidade uma base organizacional que ajuda a entidade
responsvel pelo fabrico de um produto ou prestao de um servio a melhorar
continuamente os nveis de satisfao de seus clientes. Trata-se de um conjunto de
procedimentos, responsabilidades, processos e recursos que a empresa estabelece e pe
em prtica com vista implementao da gesto da qualidade. dentro do sistema da
qualidade de uma empresa que se encontram documentadas as tcnicas e actividades do
controlo da qualidade e as aces da garantia da qualidade. A empresa define os seus
objectivos e prova-o atravs destes documentos (Cavaco, 2004).
1.7.3.1. Normas da qualidade

Cada empresa pode desenvolver um sistema da qualidade prprio, e que mais se
adapte s suas necessidades. Mas existem normas para sistemas da qualidade com linhas
directrizes, de modo a que estas no difiram significativamente e se torne mais fcil a
comunicao entre empresas e clientes. As normas descrevem como deve ser
organizado o sistema da qualidade de uma entidade consoante a sua rea de trabalho.
Assim, existem as normas de Boas Prticas de Laboratrio (BPL) publicadas pela
Organizao para a Cooperao e Desenvolvimento Econmico (OCDE), que se
destinam a laboratrios que testam produtos sujeitos a legislao antes de serem
disponibilizados no mercado. A Organizao Internacional de Normalizao (ISO)
criou um conjunto de normas da qualidade para empresas fornecedoras de produtos ou
servios; a famlia das normas ISO 9000. Estas normas garantem a conformidade de um
produto ou servio de acordo com as especificaes estabelecidas, mas no so
suficientes para garantir a competncia de um laboratrio para realizar anlises. Para tal
a ISO criou o Guia ISO 25, uma norma especfica para os laboratrios de anlises de
20
REVISO BIBLIOGRFICA
rotina. A nvel da Europa o Comit Europeu de Normalizao (CEN) o organismo

normalizador. Este criou as normas EN 29000 baseadas nas ISO 9000 e as EN 45000
baseadas no Guia ISO 25. Mais tarde, a Norma EN 45001 foi substituda pela Norma
EN ISO/IEC 17025, mais semelhante ao Guia ISO 25. Em Portugal, o organismo
normalizador o Instituto Portugus da Qualidade (IPQ), que adapta as normas emitidas
pelo CEN mas tambm pode criar regras especficas para sistemas da qualidade. O IPQ
emitiu um guia interpretativo da norma NP EN ISO/IEC 17025 LAB/G00 que foi
actualizado em 2006 para o guia OGC001 interpretativo da norma NP EN ISO/IEC
17025 verso de 2005 (Cavaco, 2004).
1.7.3.1.1. Norma NP EN ISO/IEC 17025

A primeira edio da norma NP EN ISO/IEC 17025 resultou da vasta experincia
de aplicao do Guia ISO/IEC 25 e da norma EN 45001, que foram por ela substitudos.
Inclua todos os requisitos que os laboratrios de ensaio e calibrao tm que satisfazer
ao pretenderem demonstrar que possuem um sistema de gesto, que so tecnicamente
competentes e que so capazes de produzir resultados tecnicamente vlidos. Uma vez
que, as normas ISO 9001:1994 e ISO 9002:2000 foram substitudas pela ISO 9001:2000
e estas eram referidas na NP EN ISO/IEC 17025:2000, esta foi revista donde surgiu a
segunda edio de 2005 (Norma NP EN ISO/IEC 17025:2005).
A norma NP EN ISO/IEC 17025:2005 aplicvel a todas as entidades que
realizam ensaios e/ou calibraes, incluindo amostragem. Destina-se a ser utilizada
pelos laboratrios no desenvolvimento dos seus sistemas de gesto para a qualidade, e
para as actividades administrativas e tcnicas. Pode tambm ser usada pelos clientes dos
laboratrios, pelas entidades regulamentadoras e pelos organismos de acreditao afim

21
REVISO BIBLIOGRFICA
de confirmar e reconhecer a competncia dos laboratrios (Norma NP EN ISO/IEC

17025:2005).
1.7.3.2. Mtodos normalizados

Segundo o Guia interpretativo da NP EN ISO/IEC 17025 OGC001 de 2006,
mtodos normalizados so mtodos de ensaio que seguem uma norma, ou documento
normativo equivalente elaborado por um organismo de normalizao ou por um
organismo sectorial integrando representantes do sector tcnico. Estes mtodos aps
devidamente validados, esto sujeitos a actualizao peridica e so reconhecidos pela
comunidade laboratorial nacional e internacional (Guia Interpretativo da Norma NP EN
ISO/IEC 17025 OGC001, 2006).
O laboratrio deve utilizar mtodos de ensaio e/ou calibrao e mtodos de
amostragem adequados satisfao das necessidades do cliente. Devem ser mtodos
apropriados ao ensaio e/ou calibrao a realizar, preferencialmente publicados em
normas internacionais, nacionais ou regionais (Norma NP EN ISO/IEC 17025:2005).
1.7.4. Qualidade em laboratrios de anlises

Em laboratrios de anlises o que se produz so os resultados das anlises
realizadas, e a interpretao que se pode fazer desses mesmos resultados. A qualidade
de uma anlise no incide apenas na obteno de resultados com as especificaes
definidas pelo cliente, mas tambm se o laboratrio tem competncia para realizar essas
mesmas anlises. S assim o cliente pode confiar nos resultados (Cavaco, 2004).
22
REVISO BIBLIOGRFICA
1.7.4.1. Qualidade em laboratrios de anlises microbiolgicas

As anlises microbiolgicas incluem testes de esterilidade, pesquisa, isolamento,
contagem e identificao de vrus, bactrias, micoplasmas, fungos e protozorios, assim
como, a deteco dos seus metabolitos em diferentes materiais e produtos. Incluem-se
tambm qualquer tipo de ensaios que utilizem microrganismos como uma parte do
sistema de deteco, assim como a utilizao de microrganismos para estudos
ecolgicos (Guia RELACRE 6). Os laboratrios de anlises microbiolgicas podem
tambm implementar os seus sistemas de qualidade com base na norma NP EN
ISO/IEC 17025. Contudo, existe internacionalmente o documento EA 4/10
Accreditation for Microbiological Laboratories, assim como a nvel nacional o Guia
RELACRE 6 Acreditao de laboratrios de ensaios microbiolgicos, que permitem
um suporte mais especfico na interpretao desta norma para os laboratrios de
anlises microbiolgicas. Nestes guias, os laboratrios de microbiologia encontram as
directrizes a seguir, relativas ao pessoal; ao ambiente do laboratrio; ao equipamento;
aos reagentes e meios de cultura; aos procedimentos e mtodos de anlise, sua validao
e verificao de funcionamento; garantia da qualidade dos resultados e controlo da
qualidade. Estes documentos esto mais centrados na qualidade dos resultados e no
tanto nos aspectos da sade e segurana. Assim, os laboratrios devem seguir as
prticas de sade e segurana regulamentadas no seu pas (Ea/Eurachem, 2002 e Guia
RELACRE 6).

23
2. OBJECTIVOS
OBJECTIVOS
2. OBJECTIVOS
Pretendeu-se com este estudo contribuir para a avaliao dos testes enzimticos da
tecnologia IDEXX, semelhana do que est a ser feito por toda a Europa, no sentido
de se encontrar mtodos fiveis, rpidos e de menor custo, que possam substituir os
mtodos normalizados, actualmente em vigor.
O objectivo principal do presente trabalho consistiu na avaliao da equivalncia

entre os mtodos enzimticos da tecnologia IDEXX e o mtodo normalizado filtrao
por membrana, que so usados para analisar a qualidade microbiolgica de amostras de
guas.
O objectivo secundrio consistiu na comparao da eficincia de recuperao de

diferentes meios de cultura selectivos para enumerao de Coliformes Totais,
Escherichia coli e Enterococcus sp. atravs da tcnica filtrao por membrana.

25
3. PARTE EXPERIMENTAL
PARTE EXPERIMENTAL
3. PARTE EXPERIMENTAL
Neste trabalho foram analisadas amostras de guas naturais de diferentes
provenincias, tais como: esturios, lagos e rios.
3.1. Amostragem
As amostras de gua foram colhidas em frascos de plstico de 500mL estreis, a
30 cm da superfcie da gua, e transportadas para o laboratrio em geleiras com
acumuladores trmicos afim de se manter a temperatura na ordem dos 4C. As anlises
iniciaram-se logo aps a chegada das amostras ao laboratrio. O perodo decorrido entre
a colheita e a anlise no ultrapassou as 6h, como o exigido pelas normas NF EN ISO
9308-1 e NF EN ISO 7899-2.
3.2. Material de laboratrio e equipamento

Para a realizao deste trabalho usou-se o seguinte material e equipamento:
Ansas de platina, nquel/crmio ou plstico;
Autoclave, aparelho para esterilizao por calor hmido KYORITSU New
Recorder Model 5351 com mdulo; JP SELECTA, Barcelona, Espanha;
Balana ACCULAB VIC 1501 Mx=1500G d=0.1G; Sartorius Group;
Goettingen, Alemanha;
Bico de Bunsen;
Bomba de vcuo Gast Manufacturing Corp. Benton Harbor 1.9/2.2 Amps
MILLIPORE;
Camara de fluxo laminar Kojair KR-125 Safety; Vilppule, Finlndia;
Condutivmetro Crison GLP32; Barcelona, Espanha;

27
PARTE EXPERIMENTAL
Estufas de incubao, controladas por termstato regulado MMM Medcenter
Incucell; Munique, Alemanha;
Frascos de vidro Schott de 1L resistentes esterilizao em autoclave;
Frigorfico e congelador Fagor Elegance double fresh; Carnaxide, Portugal;
Lmpada de luz ultravioleta com comprimento de onda 365nm Long Wave
Ultra Violet 365nm Spectronics Crop; Nova Iorque, EUA;
Lminas de vidro e lamelas;
Pipetas de vidro graduadas;
Placa de agitao e aquecimento Velp Scientifica; Interface-Equipamentos e
Reparaes Tcnicas Lda; Amadora, Portugal;
Provetas de vidro graduadas;
Medidor de pH, com preciso e exactido de 0,1 Crison GLP22; Barcelona,
Espanha;
Membranas filtrantes de steres de celulose, com 47mm de dimetro, poro com
dimetro de 0,45m e com grelha GN-6 Metricel; PALL Gelman Laboratory;

EUA;
Micropipetas Gilson; Middleton, EUA;
Microscpio ptico;
culos proteco UV EN 166F CE boll;
Pina de pontas arredondadas, para manuseamento das membranas;
Placas de Petri de 60 e 90mm NORMAX; Marinha Grande, Portugal;
Rampa de filtrao por membrana MILLIPORE; Interface-Equipamentos e
Reparaes Tcnicas Lda; Amadora, Portugal;
Seladora a vcuo Quanty-Tray Sealer Model 2 IDEXX; Westbrook, EUA;
28
PARTE EXPERIMENTAL
Vrtex Velp Scientifica Zx3; Interface-Equipamentos e Reparaes Tcnicas
Lda; Amadora, Portugal.
3.3. Meios de cultura e reagentes

3.3.1 Meios de cultura
Os meios de cultura disponibilizam aos microrganismos os nutrientes necessrios
ao seu desenvolvimento e multiplicao. Cada grupo de microrganismos tem
necessidades nutricionais especficas, como tal, os meios so escolhidos de modo a
satisfazer essas necessidades. A incubao dos meios de cultura, aps a inoculao da
amostra de gua, permite o desenvolvimento dos microrganismos que resulta na
formao de colnias tpicas (no caso de meios slidos) o que facilita a identificao
dos mesmos.
Neste trabalho os meios de cultura utilizados para a enumerao e identificao
dos microrganismos pesquisados foram escolhidos de acordo com as normas em vigor e
esto discriminados na Tabela 3.I.
Tabela 3.I Meios de cultura usados para enumerao, confirmao e identificao das
bactrias estudadas.
Meio de cultura selectivo
Meio de cultura
confirmativo
Agar Lauril Sulfato

(Oxoid)
Caldo Dev Lactose

Peptona
(Merck)
AGAR mENDO LES

(Biokar Diagnostics)
Caldo Dev Lactose

Peptona
(Merck)
Coliformes
Fecais
AGAR mFC
Caldo Dev Lactose

Peptona
(Merck)
Enterococos
Slanetz & Bartley Agar

Agar Blis Esculina

Azida
Bactrias
Coliformes Totais
e Escherichia coli
Meio de cultura
no selectivo
Agar Triptona Soja

(Biokar
Diagnostics)

29
PARTE EXPERIMENTAL
Para a realizao das diferentes metodologias foram adquiridos meios de cultura

na sua forma desidratada. A reconstituio dos mesmos foi realizada no local de
preparao de meios do laboratrio, segundo as instrues do fabricante.
3.3.2. Reagentes
Para a realizao deste trabalho foram utilizados reagentes de uso comum em
laboratrio, mas tambm reagentes especficos de um laboratrio de microbiologia, que
se encontram descritos na Tabela 3.II.
Tabela 3.II Reagentes utilizados nos diferentes procedimentos de identificao das
bactrias em estudo.
Teste / Finalidade
Reagente
Bactrias
Violeta Cristal
(Merck)
Lugol
(Merck)
Colorao Gram
lcool
(Aga)
Coliformes e
Enterococos
Safranina
(Merck)
leo de imerso
Produo de indol
Kovacs
(Merck)
Escherichia coli
Presena da catalase
Perxido de Hidrognio 3%
(Fluka)
Enterococos
Presena da oxidase
Oxidase
(Merck)
Coliformes Totais e
Escherichia coli
Crescimento em meio
selectivo
cido Roslico
(Merck)
Coliformes Fecais
Diluio das amostras
Soluto de Ringer
---
Galerias API
Parafina lquida
---
(---) No aplicvel.
30
PARTE EXPERIMENTAL
3.4. Metodologia
Este trabalho foi realizado com recurso a metodologias de enumerao,
confirmao e identificao das bactrias em pesquisa, que se encontram resumidas na
Tabela 3.III.
Tabela 3.III Bactrias pesquisadas, respectivo mtodo de enumerao e tcnicas de

confirmao e identificao.
Bactrias
Enumerao
Confirmao
Identificao
Colilert
(IDEXX Laboratories, Inc.)
---
---
Mtodo baseado na
NF EN ISO 9308-1
(Setembro 2000)
Teste da
oxidase
Colilert
---
---
Teste da
oxidase
Colorao Gram
Coliformes
Totais
Escherichia coli
Mtodo baseado na
NF EN ISO 9308-1
(Setembro 2000)
Teste do indol
Enterolert
---
Mtodo baseado na
NF EN ISO 7899-2
(Agosto 2000)
Teste da
catalase
Enterococos
Colorao Gram
Galerias API 20 E
(bioMrieux Corporate)
Galerias API 20 E
--Colorao Gram
Galerias API 20 Strep
(---) No aplicvel.
3.4.1. Pesquisa de Coliformes Totais e Escherichia coli

3.4.1.1. Enumerao
As anlises para enumerao de CT e E. coli foram realizadas atravs da
tecnologia IDEXX e da tcnica de filtrao por membrana.

31
PARTE EXPERIMENTAL
3.4.1.1.1. Tcnica Quanti-Tray Colilert

A tecnologia IDEXX (http://www.idexx.com/water/quantitray/) consiste na
estimativa do Nmero Mais Provvel de bactrias presentes na amostra, aps o seu
crescimento num substrato definido e incubao a temperatura adequada. O mtodo
Colilert Quanti-Tray utiliza substratos que so hidrolizados por enzimas especficas
das bactrias coliformes e E. coli permitindo a sua deteco simultnea. Ao usar este
mtodo, o grupo dos Coliformes Totais definido como todas as bactrias que possuem
a enzima -D-galactosidase, que hidroliza o substrato cromognico resultando na
libertao do cromforo. E. coli definida como bactria que d resultado positivo para
coliformes totais e possui a enzima -glucuronidase, que hidroliza o substrato
fluorognico libertando o fluorforo (American Public Health Association, 1998).
Os dois nutrientes indicadores orto-nitrofenil---galactopiransido (ONPG) e o
4-metil-umbeliferil glucurnido (MUG) so a principal fonte de carbono no substrato
usado no mtodo Colilert. Estes nutrientes so respectivamente metabolizados pela
enzima -galactosidase presentes nos coliformes e pela enzima -glucuronidase
presente em E. coli. Ao crescerem os coliformes usam a enzima -galactosidase para
metabolizar o ONPG e a cor do meio muda de incolor para amarelo. E. coli usa a
enzima -glucuronidase para metabolizar o MUG o que cria fluorescncia na presena
de
luz
ultravioleta
(American
Public
Health
Association,
1998
http://www.idexx.com/water/).
Procedimento:
Num frasco de poliestireno estril de capacidade 100mL colocada uma dose do
substrato definido para Coliformes Totais e E. coli, em que o p constituinte contm
apenas os nutrientes ONPG e MUG. Este produto dissolvido em 100mL de uma
32
PARTE EXPERIMENTAL
diluio da amostra, normalmente 1:10. Depois de homogeneizada a suspenso vertida

para um tabuleiro de 97 poos (49 grandes e 48 pequenos). O tabuleiro selado sob
vcuo (Sealer Model 2 IDEXX; Westbrook, EUA) e incubado a (361)C durante 18h.
Aps a incubao os resultados so lidos directamente do tabuleiro, os poos amarelos
so contabilizados como positivos para CT como resultado da degradao do ONPG
(Figura 3.1 a)). O tabuleiro depois exposto a uma lmpada de luz ultravioleta de
365nm para contagem dos poos com fluorescncia brilhante que so considerados
positivos para E. coli em resultado da degradao do MUG (Figura 3.1 b)). So
contados os poos positivos grandes e pequenos para CT e E. coli e a partir da tabela do
NMP fornecida pelo fabricante, e tendo em considerao o factor de diluio da
amostra, calculado o Nmero Mais Provvel de Coliformes Totais e E. coli por
100mL de amostra. Os resultados so expressos em NMP de CT e E. coli por 100mL de
amostra de gua. No so necessrios testes de confirmao ou completos (Edberg,
1990).
a)
b)
Figura 3.1 Colilert, tabuleiro de substrato definido para Coliformes Totais e E. coli.
Aps incubao a (361)C durante 18h a) poos amarelos contabilizados como
positivos para Coliformes Totais e b) poos fluorescentes luz ultravioleta
contabilizados como positivos para E. coli.
3.4.1.1.2. Tcnica de filtrao por membrana

A tcnica da filtrao por membrana tem como finalidade a quantificao do
nmero de bactrias aps o seu isolamento a partir da amostra de gua. Estas

33
PARTE EXPERIMENTAL
distribuem-se uniformemente na superfcie da membrana, o que facilita a sua contagem

aps a incubao das membranas em meio de cultura e temperatura adequados. Este
mtodo foi realizado com base na norma NF EN ISO 9308-1, Setembro 2000 e na
Recomendao do IRAR n05/2005.
Por definio os coliformes so bactrias lactose positiva e oxidase negativa.
Dentro dos coliformes a bactria Escherichia coli produz indol a partir de triptofano a
(44.00.5)C em (213)h e/ou hidrolisa o 4-metil umbeliferil--D-glucurnido (MUG)
apresentando fluorescncia luz ultravioleta (Recomendao do IRAR n05/2005).
Procedimento:
As amostras so inicialmente homogeneizadas e posteriormente filtra-se um volume
adequado ao tipo de amostra ou sua diluio atravs de uma membrana de steres de
celulose com 47mm de dimetro e poro com dimetro de 0,45m. Aps filtrao a
membrana colocada superfcie de uma placa de Petri com meio de cultura selectivo;
com agar; lactosado e com cloreto de trifenil tetrazlio (TTC) (Membrane Lauril
Sulphate Agar MLSA), adequado ao crescimento de bactrias coliformes. As placas
de Petri so incubadas a (36.02.0)C durante (213)h. As colnias tpicas que surgem
neste meio de cultura so de cor amarela, com alterao da cor do meio de cultura que
se torna tambm amarelo (Figura 3.2). Estas colnias so consideradas como
utilizadoras da lactose (lactose positivas). Podem surgir colnias atpicas de cor
amarela, laranja, branca ou rosa sem alterao na cor do meio de cultura.
Para a caracterizao bioqumica das colnias lactose positivas realizam-se os
testes para a presena da enzima oxidase e formao de indol. Idealmente, todas as
colnias tpicas contabilizadas na membrana devem ser sujeitas a confirmao. Por
rotina devem confirmar-se pelo menos dez colnias por placa. Estas so repicadas para
34
PARTE EXPERIMENTAL
Figura 3.2 Meio de cultura MLSA selectivo para coliformes totais e E. coli. Colnias
tpicas amarelas e com mudana localizada de cor do meio aps incubao a
(36.02.0)C durante (213)h. Colnias atpicas: amarelas, laranja, brancas e rosas sem
mudana da cor do meio para amarelo.
um meio de cultura gelosado no selectivo Agar Triptona Soja (TSA) e para um meio
de cultura lquido com triptofano Caldo Dev Lactose Peptona Fluorocult. O meio de
cultura TSA incubado a (36.02.0)C durante (213)h e o Fluorocult incubado a
(44.00.5)C durante (213)h. Aps a incubao em meio TSA fez-se o teste para
determinar a presena da enzima oxidase. As colnias cujo teste da oxidase seja
positivo so quantificadas e consideradas como no sendo bactrias coliformes. As
colnias cujo teste da oxidase seja negativo so quantificadas como bactrias coliformes
e a sua cultura em meio com triptofano sujeita ao teste da produo de indol. Bactrias
oxidase negativas e positivas para a produo de indol so consideradas como E. coli.
A partir do nmero de colnias tpicas contadas na membrana, e considerando os
resultados dos testes de confirmao calcula-se o nmero de bactrias CT e E. coli
presentes em 100mL de amostra. Os resultados so expressos em UFC de CT ou E. coli
por 100mL de amostra de gua.

35
PARTE EXPERIMENTAL
3.4.1.2. Confirmao
Teste da oxidase
O teste para avaliar a presena da enzima oxidase baseia-se na reduo do
oxignio pela enzima citocromo oxidase ao longo da cadeia transportadora de electres.

Como resultado desta reaco observa-se o aparecimento de uma cor azul-escuro
resultante da oxidao do reagente da oxidase (N,N,N,N-tetrametil-p-fenilenodiamina)
(Madigan, Martinko & Parker, 1997).
Para realizar o teste, deitam-se sobre papel de filtro 2 ou 3 gotas do reagente da
oxidase. Com uma ansa de plstico coloca-se uma pequena poro da colnia subcultivada em meio TSA sobre o papel de filtro impregnado com o reagente da oxidase.
Aguarda-se 30s. O aparecimento da cor azul-escuro considerado como resultado
positivo.
Teste do indol
O teste para avaliar a formao de indol, baseia-se produo deste a partir do
triptofano pela aco da triptofanase, resultante na observao de fluorescncia sob luz

UV 365nm e/ou formao de um anel vermelho superfcie da cultura resultante da
reaco do indol com o reagente Kovacs (Madigan, Martinko & Parker, 1997).
Para realizar o teste deitam-se duas gotas de reagente Kovacs no tubo de cultura
de meio Fluorocult. A formao do anel vermelho confirma a produo de indol.
3.4.1.3. Identificao
Colorao Gram
A colorao Gram, permite subdividir as bactrias em dois grandes grupos no que
respeita estrutura e composio da parede bacteriana (Madigan, Martinko & Parker,
36
PARTE EXPERIMENTAL
1997). Assim, as bactrias designadas Gram positivas (Gram+) possuem uma parede
bacteriana com camada espessa de peptidoglicanos ao contrrio das Gram negativas
(Gram-) que possuem uma camada fina. As bactrias Gram- alm de possurem uma
camada fina de peptidoglicanos na parede celular possuem uma membrana externa
bilipdica, em que os lpidos e polissacridos se encontram intimamente ligados
formando uma camada externa com uma estrutura muito especfica. As bactrias Gram+
no possuem esta membrana externa, da que durante o procedimento de colorao a
sua parede retenha o corante violeta cristal, uma vez que, colapsa aps a desidratao
pelo lcool. Estas bactrias ficam coradas de violeta. As bactrias Gram- permitem a
sada do corante violeta cristal, e so coradas pelo contrastante safranina de cor
vermelha (Figura 3.4).
b
Figura 3.3 Colorao Gram: a) bactrias Gram+ e b) bactrias Gram- (adaptado de
Madigan, Martinko & Parker, 1997 ).
Procedimento:
As clulas para a colorao Gram so retiradas de uma cultura fresca com 18 a
24h de crescimento em meio de cultura slido no selectivo, seguindo os seguintes
passos (Madigan, Martinko & Parker, 1997):
1. Secagem e fixao do esfregao com calor;
2. Imerso do esfregao no corante violeta cristal durante 1 minuto;
3. Imerso com mordente iodo durante 3 minutos;

37
PARTE EXPERIMENTAL
4. Lavagem com solvente de descolorao etanol 90%;

5. Lavagem com gua;
6. Imerso do esfregao em contrastante safranina durante 1 minuto;
7. Lavagem com gua; secagem;
8. Observao ao microscpio ptico utilizando a objectiva de imerso.
Galerias API
As galerias API (http://www.biomerieux.pt/) so kits de testes bioqumicos
especficos, para a identificao dos microrganismos ao nvel da espcie, em 4 a 24h.

So constitudas por um conjunto de cpulas com substratos liofilizados, que permitem
o estudo especfico do metabolismo do microrganismo que se pretende identificar. As
actividades metablicas so avaliadas por mudanas de cor aps incubao. Para tal, a
colnia a identificar crescida em meio no selectivo. Aps o crescimento prepara-se
uma suspenso com densidade ptica segundo as instrues do fabricante. Esta
suspenso ento inoculada na galeria. Para determinadas reaces necessrio
adicionar reagentes fornecidos com o kit. Para outras necessrio criar um ambiente de
anaerobiose isolando as cpulas com parafina lquida estril. Os resultados dos testes
so lidos a partir da galeria com o auxlio de uma tabela fornecida pelo fabricante,
resultando da leitura uma chave numrica que corresponde a uma espcie presente na
base de dados da respectiva galeria.
Para a identificao das bactrias coliformes foram usadas galerias API 20 E
(bioMrieux Corporate), adequadas identificao de enterobactrias.
Na Tabela 3.IV esto descritos os testes e resultados que devem ser obtidos para a
posterior identificao de bactrias coliformes e E. coli, atravs das galerias API.
38
PARTE EXPERIMENTAL
Tabela 3.IV Resultados dos testes para confirmao e identificao de Coliformes

Totais e Escherichia coli.
Bactrias
Teste Oxidase
Teste Indol
Colorao Gram
Coliformes Totais
Escherichia coli
No coliformes
---
---
() Resultado negativo; (+) Resultado positivo; (---) No aplicvel.

semelhana do procedimento realizado para a enumerao de CT e E. coli
atravs da tcnica filtrao por membrana com o meio MLSA, foram tambm usados os
meios de cultura AGAR mENDO LES e AGAR mFC (Figura 3.3). Estes so
especficos para enumerar CT e CF, respectivamente. Para o meio AGAR mENDO LES
cuja incubao feita a (36.02.0)C durante (213)h, as colnias tpicas so vermelhas
podendo ter ou no um brilho metlico (caracterstico de E. coli) e as atpicas so cor de
rosa. Para o meio de cultura AGAR mFC as colnias tpicas so azuis e a incubao
feita a (44.00.5)C durante (213)h.
a)
b)
Figura 3.4 Colnias tpicas e atpicas em meios de cultura para enumerao de

Coliformes Totais e Coliformes Fecais. a) Meio AGAR mENDO LES, aps incubao a
(44.00.5)C durante (213)h e b) Meio AGAR mFC, aps incubao a (36.02.0)C
durante (213)h.

39
PARTE EXPERIMENTAL
3.4.2. Pesquisa de enterococos

3.4.2.1. Enumerao
A enumerao de enterococos foi, semelhana da enumerao de bactrias
coliformes realizada atravs da tecnologia IDEXX e da tcnica de filtrao por
membrana, descritas anteriormente.
3.4.2.1.1. Tcnica Quanti-Tray Enterolert

A tcnica Quanti-Tray Enterolert (http://www.idexx.com/water/enterolert-e/)
especfica para a deteco de enterococos (http://www.idexx.com/water/). Este mtodo
utiliza como nutriente o substrato indicador 4-metilumbeliferona--D-glucsido, que
quando metabolizado pela enzima -glucosidase presente nos enterococos liberta o
grupo fluorocromo. Os derivados metil umbeliferil possuem a vantagem de serem
bastante sensveis e especficos, facilmente detectveis sob luz UV (365nm) e no
serem carcinognicos (Budnick, Howard & Mayo, 1996).
Procedimento:
Num frasco de poliestireno estril de capacidade 100mL colocada uma dose do
substrato definido para enterococos. Este produto dissolvido em 100mL de uma
diluio da amostra, normalmente 1:10. Aps homogeneizao a suspenso colocada
para um tabuleiro de 97 poos (49 grandes e 48 pequenos). O tabuleiro selado sob
vcuo (Sealer Model 2 IDEXX; Westbrook, EUA) e incubado a (41.00.5)C durante
24h. Aps o perodo de incubao, os poos positivos para enterococos tornam-se
fluorescentes quando expostos luz ultravioleta (Figura 3.5). Contam-se os poos
positivos grandes e pequenos e determina-se o NMP a partir da respectiva tabela
40
PARTE EXPERIMENTAL
(ANEXO I) e tendo em considerao o factor de diluio da amostra. Os resultados so

expressos em NMP de enterococos por 100mL de amostra de gua.
Figura 3.5 Enterolert, tabuleiro de substrato definido para enterococos, aps

incubao a (41.00.5)C durante 24h.
3.4.2.1.2. Tcnica de filtrao por membrana
Esta tcnica baseada na norma NF EN ISO 7899-2, Agosto 2000.
As colnias de bactrias do gnero Enterococcus que tm reaco positiva
esculina e so catalase negativas podem ser consideradas como enterococos.
Procedimento:
Um volume adequado de amostra ou sua diluio, aps homogeneizao,
filtrado atravs de uma membrana de steres de celulose com 47mm de dimetro e poro
de 0.45m de dimetro. Aps a filtrao da amostra, esta colocada superfcie de uma
placa de Petri com meio de cultura selectivo, slido, com Slanetz & Bartley Agar
(S&B), adequado ao crescimento de enterococos certificando-se que no existem bolhas
de ar por baixo da membrana. As placas de Petri so incubadas em posio invertida a
(36.02.0)C durante (444)h. As colnias tpicas que surgem neste meio de cultura so
vermelhas, castanhas ou rosa (Figura 3.6).

41
PARTE EXPERIMENTAL
Figura 3.6 Colnias tpicas em meio de cultura selectivo Slanetz & Bartley Agar,
aps incubao a (36.02.0)C durante (444)h.
A confirmao das colnias tpicas feita no meio de cultura Agar Blis Esculina
Azida (BEAA). A membrana colocada na posio invertida numa placa de Petri com o
meio que tem na sua constituio os agentes selectivos esculina e azida. A placa
incubada a (44.00.5)C durante 2-24h. A hidrlise da esculina a glucose e esculetina na
presena de blis resulta no enegrecimento do meio de cultura. Bactrias positivas para
esculina so contabilizadas como pertencentes ao gnero Enterococcus (Figura 3.7). Em
complemento, realiza-se o teste da catalase que revela a presena ou no desta enzima
que catalisa a decomposio de perxido de hidrognio com libertao de oxignio
(Norma NF EN ISO 7899-2, Agosto 2000).
Figura 3.7 Colnias do gnero Enterococcus em meio Agar Blis Esculina Azida,
com reaco positiva para a esculina aps incubao a (44.00.5)C durante 24h.
42
PARTE EXPERIMENTAL
3.4.2.2. Confirmao
Teste da catalase
O teste para avaliar a presena da enzima catalase consiste na reduo do
perxido de hidrognio em gua e oxignio que se liberta sob a forma de bolhas

(Madigan, Martinko & Parker, 1997).
Para realizar o teste, deita-se uma gota de perxido de hidrognio a 3% numa
lmina de vidro. Com uma ansa de plstico retira-se parte da colnia que se coloca em
contacto com o reagente. Se ocorrer formao de bolhas de gs o teste considerado
positivo.
3.4.2.3. Identificao
Colorao Gram
Para enterococos o resultado desta colorao (j descrita anteriormente) dever ser
a observao de clulas coradas de violeta, ou seja, bactrias Gram+ (Madigan,

Martinko & Parker, 1997).
Galerias API
As galerias API 20 Strep (bioMrieux Corporate), foram usadas para a
identificao de enterococos, uma vez que, so as adequadas identificao deste grupo

de bactrias (http://www.biomerieux.pt/) (Figura 3.8).
Figura 3.8 Galeria API 20 Strep (bioMrieux Corporate) para identificao de

bactrias do grupo enterococos, aps incubao a (36.02.0)C durante 24h.

43
PARTE EXPERIMENTAL
Na Tabela 3.V esto descritos os testes e resultados que devem ser obtidos para a
posterior identificao de bactrias do gnero Enterococcus, atravs das galerias API.
Tabela 3.V Resultados de testes para confirmao e identificao de enterococos.
Bactrias
Teste catalase
Colorao Gram
Enterococos
No Enterococos
---
() Resultado negativo; (+) Resultado positivo; (---) No aplicvel.
Controlo da qualidade
Todos os reagentes utilizados incluindo os meios de cultura, estavam devidamente
identificados e armazenados de acordo com as especificaes do fornecedor. Antes de
utilizar qualquer produto foi verificado o prazo de validade assim como, o seu aspecto
para garantir que as suas propriedades no se encontravam alteradas. Os meios de
cultura foram preparados, esterilizados, utilizados e armazenados de acordo com as
instrues do fabricante e as indicaes das normas. Cada lote de meios foi previamente
testado para garantir a capacidade de desenvolvimento dos microrganismos especficos,
e tambm para garantir a supresso do crescimento de microrganismos no alvo. Foram
tambm realizadas anlises de Materiais de Referncia Certificados, para garantir a
exactido do mtodo normalizado filtrao por membrana para os parmetros
Escherichia coli (NCTC 9001- HPA) e Enterococcus faecalis (NCTC 775- HPA).
3.4.3. Anlises fsico-qumicas

3.4.3.1. Determinao de pH
O valor de pH das amostras foi determinado por potenciometria atravs do
medidor de pH Crison GLP22.
44
PARTE EXPERIMENTAL
3.4.3.2. Determinao de salinidade

O valor de salinidade (gNaCl.L-1) foi determinado por condutivimetria com o
condutivmetro Crison GLP32.
3.4.4. Anlise estatstica

A anlise estatstica usada para extrair o mximo de informao dos dados
recolhidos, assim como, para compreender melhor as situaes que esses mesmos dados
representam. A organizao dos dados resultantes das anlises e os tratamentos
estatsticos foram realizados no software SPSS verso15.0.
3.4.4.1. Testes estatsticos

possvel atravs da aplicao de determinados testes estatsticos verificar se os
resultados obtidos a partir de uma determinada experincia ou estudo esto de acordo
com consideraes tericas ou hipteses colocadas, ou se demonstram o contrrio. Num
teste estatstico deste tipo os principais passos so: (i) formular a hiptese estatstica a
ser testada, normalmente chamada hiptese nula H0. Esta hiptese expressa o conceito
de igualdade (inexistncia de diferenas). Define-se tambm uma hiptese alternativa
H1, geralmente sob a forma de complementar da H0, e contra a qual esta testada. (ii)
Decidir o nvel de significncia () para o teste, ou seja, a probabilidade de rejeitar a H0
se esta for realmente verdadeira. (iii) Definir uma estatstica de teste a aplicar aos
resultados obtidos e determinar os valores crticos. (iv) Calcular os resultados atravs da
aplicao do teste estatstico e tomar as decises de acordo com as regras estabelecidas
(Lightfood & Maier, 2003).

45
PARTE EXPERIMENTAL
3.4.4.1.1. Comparao entre amostras emparelhadas

Neste trabalho foi feita a anlise, em paralelo, de amostras atravs do recurso a
dois mtodos diferentes. O teste adequado a esta situao o teste para pares, fazendose uma comparao entre amostras emparelhadas. A H0 a testar a igualdade das
mdias de ambos os mtodos para as amostras analisadas e a H1 o contrrio, ou seja, a
diferena das mdias dos mtodos em estudo. O nvel de risco ou significncia
escolhido foi de 5%. Antes do tratamento estatstico foi feita a converso dos resultados
em logaritmo de base 10 (log), para assim garantir que a distribuio dos resultados
aproximada distribuio Normal, e possibilitar a aplicao da estatstica de teste para
amostras emparelhadas, t de Student.
3.4.4.1.2. Anlise de varincia ANOVA

As tcnicas de anlise estatstica denominadas anlise de varincia (ANOVA)
pretendem comparar diferentes grupos de dados, de modo a verificar se pertencem a
uma mesma populao. A ideia testar o efeito que diferentes tratamentos ou mtodos
tm no factor em estudo. Para usar este tipo de teste pressupem-se que os dados tm
uma distribuio normal e que existe homogeneidade de varincias.
Neste trabalho, a ANOVA a um factor foi usada para comparar o efeito de
diferentes meios de cultura na enumerao dos microrganismos para os quais so
selectivos.
3.4.4.2. Norma ISO 17994:2004 para avaliao da equivalncia entre

mtodos microbiolgicos
A norma ISO 17994:2004 descreve os critrios e procedimentos a seguir para
estabelecer a equivalncia entre dois mtodos de anlises microbiolgicas, em que um
46
PARTE EXPERIMENTAL
deles pode ser um mtodo de referncia, no sendo esta uma condio obrigatria. Os
mtodos a analisar podem ser mtodos baseados em contagem de colnias, ou mtodos
de estimativa do NMP como a FTM e mtodos de presena-ausncia. Igual volume da
amostra i retirado do mesmo frasco de amostragem analisado atravs dos dois
mtodos em estudo, a e b. A avaliao da comparao dos mtodos feita com base
num intervalo de confiana determinado para a incerteza expandida em torno da mdia
da diferena relativa. A diferena relativa (xi) determina-se a partir dos pares de
resultados obtidos (ai, bi) da seguinte forma:
xi = [ln(ai)- ln(bi)] 100%
Em que: ai o resultado obtido para a amostra i atravs do mtodo em estudo a;
bi o resultado obtido para a amostra i atravs do mtodo b assumido como
referncia.
As amostras em que ambos os mtodos do um resultado zero aps confirmao
(0,0) devero ser excludas da anlise. Para no excluir amostras em que um dos
mtodos d resultado igual a zero, a norma estabelece que o clculo da diferena
relativa dever ser feito da seguinte forma:
Se o resultado for (ai, 0)
Se o resultado for (0, bi)
xi = ln(ai+1) 100%
xi = -ln(bi+1) 100%
A mdia das diferenas relativas de todas as amostras d-nos o valor da diferena mdia
relativa:
0 = xi / n
Em que: xi a diferena relativa na amostra i;
n o nmero de amostras.
A incerteza expandida (U) determinada da seguinte forma:
U = ks/n
Em que: k igual a 2 para um intervalo de confiana de 95%;

47
PARTE EXPERIMENTAL
s o desvio-padro da diferena mdia relativa;

n o nmero de amostras.
O intervalo de confiana determinado da seguinte forma:
Limite inferior:
Limite superior:
xI = 0 U
xS = 0 + U
Os mtodos so considerados no diferentes se a diferena mdia relativa no

for significativamente diferente de zero e a incerteza expandida no se afastar do nvel
estabelecido para o desvio mximo aceitvel, ou seja:
-D xI 0 e 0 xS +D
Em que D o desvio mximo aceitvel para o intervalo de confiana, e a norma sugere
que se estabelea o valor de 10% para estudos de desempenho de mtodos a nvel
internacional ou inter-laboratorial em guas para consumo.
Os mtodos so considerados diferentes se:
xI > 0 ou xS < 0
Os resultados so considerados inconclusivos se:
xI < -D e xS > 0 ou xI < 0 e xS > +D
Neste caso a norma recomenda que sejam analisadas mais amostras, cujo nmero deve
ser estimado a partir de:
n = 4 (s/y)2
Em que: n o nmero de amostras;
s o desvio-padro da diferena mdia relativa;
y o maior valor de dois:
y1 = 0
y2 = |0| |D|
0 a mdia aritmtica da diferena relativa, em unidades de %;
D o desvio mximo aceitvel (10%) da incerteza expandida ao valor zero no
caso de os mtodos serem no diferentes, em unidades de %.
48
4. RESULTADOS E DISCUSSO
RESULTADOS E DISCUSSO
4. RESULTADOS E DISCUSSO
A tcnica de filtrao por membrana a mais usada por rotina em laboratrios
para a enumerao de bactrias coliformes e enterococos em amostras de gua. Foram j
realizados vrios estudos para comparar esta tcnica com os testes enzimticos
disponveis no mercado Colilert e Enterolert, especficos para enumerao de
Coliformes Totais e enterococos, respectivamente. Com o objectivo de comparar os dois
mtodos na enumerao de Coliformes Totais, Escherichia coli e enterococos em
diferentes tipos de guas, amostras de guas para consumo, guas naturais, guas
residuais tratadas, foram analisadas por diversos autores.
As directivas europeias decretam que todos os estados membros devem usar os
mtodos normalizados para as anlises de guas (Norma NF EN ISO 9308-1, Setembro
2000 para E. coli e Norma NF EN ISO 7899-2, Agosto 2000 para Enterococos
Intestinais), a no ser que se demonstre que outros mtodos sejam equivalentes para
analisar este tipo de amostras. Foi nesse sentido que surgiram trabalhos descrevendo as
vantagens que os testes de substrato definido possuem em relao aos mtodos de
referncia na avaliao da qualidade microbiolgica dos diferentes tipos de guas.
4.1. Enumerao de Coliformes Totais, Escherichia coli e enterococos

Para enumerao de bactrias Coliformes Totais e E. coli foram analisadas 40
amostras de guas naturais de zonas costeiras e de transio. Para a enumerao de
enterococos foi analisado um total de 44 amostras de guas dos referidos tipos. Todas as
amostras foram analisadas em paralelo atravs dos mtodos normalizados filtrao por
membrana segundo as respectivas normas, e atravs da tecnologia IDEXX segundo as
instrues do fabricante. Os resultados das anlises realizadas encontram-se
representados nos grficos 4.1, 4.2 e 4.3 sob a forma de log de modo a, tornar possvel a
50
representao de todas as amostras num s grfico e a realizar o tratamento estatstico

posterior. Tambm se encontram representados nos grficos os resultados das anlises
realizadas com meios de cultura selectivos diferentes dos estabelecidos pelas normas.
Nas Figuras 4.2 e 4.3, encontram-se tambm representados os resultados obtidos para as
duas anlises realizadas com Materiais de Referncia Certificados (MRC), amostras 41
e 42 para Escherichia coli (NCTC 9001- HPA) e amostras 45 e 46 para Enterococcus
faecalis (NCTC 775- HPA), respectivamente. Estas anlises foram realizadas para
verificar a exactido do mtodo de filtrao por membrana, que revelou uma boa
correspondncia dentro do intervalo de confiana associado a estes MRC: (3.31104
3.99104) UFC.100mL-1 para E. coli, e (1.24103 1.54103) UFC.100mL-1 para
Enterococcus faecalis. O valor mdio para E. coli era de 3.66104 UFC.100mL-1 e nas
anlises 41 e 42 foram obtidos os valores mdios 3.40104 e 3.30104 UFC.100mL-1,
respectivamente. Para Enterococcus faecalis o valor mdio era de 1.44103
UFC.100mL-1 e os resultados obtidos para as amostras 45 e 46 foram: 1.97103 e
2.33103 UFC.100mL-1, respectivamente. Estas anlises esto includas no tratamento
estatstico realizado com vista comparao dos mtodos em estudo.
4.2. Determinao dos parmetros fsico-qumicos pH e salinidade

Neste estudo, foram determinados os parmetros fsico-qumicos pH e salinidade
(gNaCl.L-1) para todas as amostras analisadas. Os valores de pH e salinidade mnimos,
mximos e mdios obtidos encontram-se na Tabela 4.I. importante medir estes
parmetros uma vez que, a pesquisa dos microrganismos indicadores se baseia em
reaces metablicas (mtodos normalizados filtrao por membrana) e em actividades
enzimticas (testes rpidos da tecnologia IDEXX), que dependem das condies
fisiolgicas das bactrias. Alteraes nas condies de irradiao, temperatura,

51
amostra
Log Coliformes Totais.100mL
-1
5
4
3
2
1
0
1 2
3 4
5 6
7 8
9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40
Amostras
M LSA
Co lilert
A GA R mENDO LES
Figura 4.1 Enumerao de bactrias Coliformes Totais, pelo mtodo filtrao por membrana com os meios de cultura MLSA e AGAR
mENDO LES e pelo teste enzimtico Colilert.
52
Log Escherichia coli .100mL -1 amostra
8
7
6
5
4
3
2
1
0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42
Am ostras
M LSA
Co lilert
A GA R mFC
Figura 4.2 Enumerao de Escherichia coli, pelo mtodo filtrao por membrana com os meios de cultura MLSA e AGAR mFC e pelo
teste enzimtico Colilert. A linha vermelha indica o limite mximo estabelecido pela directiva 2006/7/CE para E. coli para guas costeiras
e de transio consideradas boa qualidade.

53
Log Enterococos .100mL -1 amostra
4.5
4
3.5
3
2.5
2
1.5
1
0.5
0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46
Am ostras
S&B
Enterolert
BEAA
Figura 4.3 Enumerao de enterococcos, pelo mtodo filtrao por membrana com os meios de cultura S&B e BEAA e pelo teste
enzimtico Enterolert. A linha vermelha indica o limite mximo estabelecido pela directiva 2006/7/CE para Enterococos Intestinais para
guas costeiras e de transio consideradas de boa qualidade.
54
salinidade e concentrao de nutrientes no meio ambiente, podem causar situaes de

stresse s bactrias e dificultar a sua recuperao e enumerao nos meios de cultura
(Fiksdal et al., 1994).
Tabela 4.I Valores de pH e salinidade obtidos para o total de amostras analisadas.

Amostras
para
pesquisa
de:
Coliformes
Totais
Enterococos
Salinidade (gNaCl.L-1)
pH
Mnimo
Mximo
Mdio
Mnimo
Mximo
Mdio
40
6.94
8.00
7.61
0.43
1.00
0.66
44
7.23
8.38
8.02
0.28
33.80
26.87
4.3. Correlao entre os parmetros microbiolgicos e fsico-qumicos

Para perceber como se relacionam os parmetros microbiolgicos Coliformes
Totais, Escherichia coli e enterococos enumerados pelos diferentes mtodos, com os
parmetros fsico-qumicos pH e salinidade determinaram-se matrizes de correlao. O
valor de significncia o valor associado ao coeficiente de correlao da populao, e
em cuja hiptese nula H0: = 0 e a hiptese alternativa H1: 0.
Na Tabela 4.II encontram-se os resultados da matriz de correlao estabelecida
entre os mtodos de enumerao de bactrias coliformes e os parmetros fsicoqumicos pH e salinidade (gNaCl.L-1). Dos valores de correlao obtidos entre os meios
de cultura MLSA e AGAR mENDO LES e o teste Colilert, podemos concluir que
estes apresentaram uma correlao positiva (0.725 e 0.724, respectivamente) altamente
significativa para um nvel de 0.01. Em relao ao parmetro valor de pH, entre este e
os diferentes meios de cultura no existe correlao. A salinidade apresentou, uma
correlao negativa significativa (-0.386) para um nvel de 0.05 com o meio de cultura

55
AGAR mENDO LES e uma correlao negativa (-0.421) significativa para um nvel
de 0.01 com o teste Colilert.
Tabela 4.II Matriz de correlao. Mtodos de enumerao de Coliformes Totais e
parmetros fisico-qumicos valor de pH e salinidade.
pH
pH
Pearson Correlation
Salinidade
1
Sig. (2-tailed)
N
Salinidade
Pearson Correlation
Sig. (2-tailed)
N
CTMLSA
CTColilert
-.111
-.082
.238
.924
.497
.615
40
40
40
40
40
-.191
-.311
-.386(*)
-.421(**)
.051
.014
.007
.238
40
40
40
40
40
.016
-.311
.753(**)
.725(**)
Sig. (2-tailed)
.924
.051
.000
.000
40
40
40
40
40
-.111
-.386(*)
.753(**)
.724(**)
.497
.014
.000
40
40
40
40
40
-.082
-.421(**)
.725(**)
.724(**)
.615
.007
.000
.000
40
40
40
40
Pearson Correlation
Sig. (2-tailed)
N
CTColilert
CTmENDOLES
.016
Pearson Correlation
N
CTmENDOLES
CTMLSA
-.191
Pearson Correlation
Sig. (2-tailed)
N
.000
40
* Correlao significativa para um nvel de 0.05 (bilateral).

** Correlao significativa para um nvel de 0.01 (bilateral).
A correlao estabelecida entre os mtodos de enumerao de E. coli e os

parmetros fsico-qumicos est representada na Tabela 4.III. Entre o valor de pH e os
meios de cultura no existe correlao. Entre a salinidade e o meio de cultura AGAR
mFC existe uma correlao negativa significativa (-0.365) para um nvel de 0.05.
Entre os dois meios de cultura MLSA e AGAR mFC e o teste enzimtico Colilert a
correlao positiva (0.716 e 0.738, respectivamente) significativa para um nvel de
0.01.
Na Tabela 4.IV, encontram-se os resultados obtidos na matriz de correlao
entre os mtodos usados para a enumerao de enterococos e os parmetros pH e
salinidade. Dos valores obtidos verificou-se que para a maioria das relaes analisadas
existe correlao significativa para um risco de nvel de 0.01. Apenas a correlao
56
entre o meio de cultura BEAA e a salinidade apresentou um valor negativo (-0.395)

significativo para um nvel de risco de 0.05.
Tabela 4.III Matriz de correlao. Mtodos de enumerao de Escherichia coli e
pH
pH
Salinidade
Pearson Correlation
Sig. (2-tailed)
N
Salinidade
Pearson Correlation
Sig. (2-tailed)
Pearson Correlation
Sig. (2-tailed)
Pearson Correlation
Sig. (2-tailed)
Pearson Correlation
Sig. (2-tailed)
-.114
.238
.394
.179
.485
40
40
40
40
-.237
-.365(*)
-.304
.141
.021
.057
.238
40
40
40
40
40
-.138
-.237
.806(**)
.716(**)
.394
.141
.000
.000
40
40
40
40
40
-.217
-.365(*)
.806(**)
.738(**)
.179
.021
.000
N
EcoliColilert
EcoliColilert
-.217
40
N
EcolimFC
EcolimFC
-.138
-.191
N
EcoliMLSA
EcoliMLSA
-.191
.000
40
40
40
40
40
-.114
-.304
.716(**)
.738(**)
.485
.057
.000
.000
40
40
40
40
40

Tabela 4.IV Matriz de correlao. Mtodos de enumerao de enterococos e

pH
pH
Pearson Correlation
Salinidade
SEB
BEAA
.539(**)
-.730(**)
-.890(**)
-.685(**)
.000
.000
.000
.000
44
44
44
32
43
.539(**)
-.415(**)
-.395(*)
-.265
.005
.025
.085
Sig. (2-tailed)
N
Salinidade
Pearson Correlation
Sig. (2-tailed)
N
SEB
Pearson Correlation
Sig. (2-tailed)
N
BEAA
Pearson Correlation
Sig. (2-tailed)
N
Enterolert
Pearson Correlation
Sig. (2-tailed)
N
.000
Enterolert
44
44
44
32
43
-.730(**)
-.415(**)
.839(**)
.611(**)
.000
.005
.000
.000
44
44
44
32
43
-.890(**)
-.395(*)
.839(**)
.894(**)
.000
.025
.000
32
32
32
32
31
-.685(**)
-.265
.611(**)
.894(**)
.000
.085
.000
.000
43
43
43
31
.000
43


57
4.4. Apreciao da qualidade das amostras de guas para fins recreativos

Com base nas enumeraes obtidas para as amostras de guas para fins recreativos
analisadas, determinou-se a percentagem de amostras que estavam em conformidade e
acima dos valores mximos recomendados pela Directiva 2006/7/CE do Parlamento
Europeu e do Conselho para guas de boa qualidade quando analisadas atravs do
mtodo da filtrao por membrana (Tabela 4.V). De salientar, o facto de uma elevada
percentagem das amostras analisadas revelarem enumeraes de microrganismos
indicadores de contaminao fecal acima dos limites estabelecidos na Directiva
2006/7/CE do Parlamento Europeu e do Conselho. Esta directiva estabelece um valor
para E. coli de 500UFC.100mL-1 de amostra de gua, para guas costeiras e de transio
de boa qualidade analisadas atravs do mtodo descrito na norma ISO 9308-1.
Relativamente a E. coli 47.5% das amostras apresentaram valores acima desse limite.
Tabela 4.V Apreciao da qualidade das amostras de guas para fins recreativos com
base na enumerao de Escherichia coli e enterococos, pelos mtodos em estudo.
Bactrias
Mtodo
Em conformidade com o
critrio estabelecido pela
directiva 2006/7/CE para
guas costeiras e de
transio de boa
qualidade
n
Escherichia
coli
Normalizado
(FM)
ISO 9308-1:2000
IDEXX
(Colilert )
ISO 7899-2:2000
IDEXX
(Enterolert )
52.5
40
Normalizado
(FM)
Enterococos
Acima do limite
estabelecido pela directiva
2006/7/CE para guas
costeiras e de transio de
boa qualidade
%
47.5
40
57.5
42.5
38.6
61.4
44
44
50.0
50.0
A enumerao de enterococos demonstrou que, 61.4% das amostras analisadas pelo

mtodo normalizado ISO 7899-2:2000, ultrapassou o limite de 200UFC.100mL-1 de
58
amostra estabelecido pela directiva 2006/7/CE para guas costeiras e de transio de

boa qualidade.
4.5. Comparao entre o mtodo normalizado filtrao por membrana e a

tecnologia IDEXX
4.5.1. Coliformes Totais
Em 82.5% das amostras de gua analisadas para a enumerao de Coliformes
Totais obteve-se um maior nmero destas bactrias atravs da enumerao pelo teste
rpido Colilert em comparao com o mtodo normalizado, filtrao por membrana,
com o meio de cultura selectivo MLSA (Recomendao do IRAR n05/2005) (ANEXO
II). No entanto, as diferenas encontradas no foram estatisticamente significativas para
um grau de confiana de 95% (<0.05) num teste t de Student para comparao de
mdias para amostras emparelhadas. O que levaria possibilidade de os mtodos serem
equivalentes, uma vez que, a hiptese nula colocada foi a de equivalncia dos mtodos,
no foi rejeitada.
Segundo a norma ISO 17994:2004, que estabelece os critrios de equivalncia
entre mtodos de anlises microbiolgicas para a qualidade da gua, existe uma
diferena significativa entre os mtodos. Uma vez que, o intervalo determinado para a
avaliao da equivalncia dos mtodos (xI ; xS) foi de (108.9;287.6)%, positivo no limite
inferior e superior, a diferena entre os mtodos est a favor do teste rpido em
detrimento do mtodo normalizado.
Num ensaio inter-laboratorial publicado em 2006 por Ribas e seus colaboradores,
tambm se chegou concluso atravs do tratamento dos resultados segundo a norma
ISO 17994:2004, que os mtodos parecem ser significativamente diferentes, e que o
teste enzimtico apresenta resultados mais significativos que o mtodo de referncia.

59
Este estudo foi realizado em amostras de guas naturais superficiais e subterrneas

(Ribas et al., 2006).
Os autores Fricker e colaboradores em 1997, De Roubin e colaboradores em 1997
e Eckner em 1998, analisaram amostras de guas para consumo humano atravs da
enumerao de CT e E. coli. As amostras foram processadas em paralelo atravs do
mtodo normalizado filtrao por membrana, e do teste enzimtico Colilert. Os
estudos realizados pelos trs grupos de investigadores indicaram que o teste enzimtico
apresentou uma maior capacidade de recuperao de coliformes que o mtodo
normalizado. Num estudo de 2002, Schets e colaboradores analisaram amostras de
guas de superfcie, guas para consumo humano e guas para consumo artificialmente
contaminadas com gua de superfcie. Neste trabalho, o teste enzimtico Colilert foi
comparado com o mtodo de filtrao por membrana e os autores concluram que o
teste Colilert poderia ser usado para analisar todos os tipos de guas. Chao e
colaboradores, em 2003, realizaram um estudo para comparar o teste Colilert com o
mtodo normalizado filtrao por membrana, para enumerao de CT e E. coli.
Analisaram guas fluviais, guas subterrneas e guas de nascentes.
A enumerao de coliformes e E. coli pelo teste Colilert revelou ser igual ou
superior obtida pelo mtodo normalizado, consoante o tipo de gua. Niemel e
colaboradores em 2003 noutro estudo de comparao entre o teste enzimtico Colilert
e o mtodo normalizado de filtrao por membrana, analisaram amostras de guas de
vrios tipos para enumerao de coliformes totais e E. coli. Como resultado deste
trabalho, os autores obtiveram uma maior concentrao de coliformes pelo mtodo
enzimtico que pelo mtodo referncia, em que a diferena encontrada foi
estatisticamente significativa.
60
As diferenas obtidas entre os dois mtodos em estudo podero ser explicadas

com base na diferena da composio dos meios de cultura e substratos que estes
mtodos empregam, o que pode resultar na deteco de dois grupos diferentes de
bactrias coliformes. Os coliformes que crescem em meio slido necessitam de duas
enzimas para fermentar a lactose: a -galactosidase-permease, que transporta a lactose
para dentro das clulas bacterianas; e a -galactosidase que permite a utilizao da
lactose com a produo de cido e gs. Os genes que codificam para estas enzimas so o
lacY e o lacZ, respectivamente. Os coliformes que no possuam o gene lacY no
formam colnias amarelas em meio slido que contem lactose, a no ser que esta exista
em concentraes elevadas. Quando o gene lacZ est presente na clula bacteriana, o
substrato ONPG pode ser usado, mesmo que as bactrias no possuam o lacY. Bactrias
coliformes que possuam ambos os genes podem usar a lactose e o substrato ONPG.
No trabalho realizado por Schets e colaboradores em 2001, foi tambm enumerado
um nmero superior de bactrias coliformes pelo mtodo rpido que pela tcnica de
filtrao por membrana. A explicao que encontraram para estes resultados foi a
existncia de uma populao maior de coliformes que possuem apenas o gene lacZ,
resultando em contagens mais elevadas para o teste Colilert.
No trabalho de Fricker em 1997 cerca de 10% das bactrias coliformes isoladas de
gua para consumo humano no fermentavam a lactose, devido ausncia da enzima galactosidase-permease.
Outra explicao para o facto de serem enumeradas menos bactrias coliformes
pela tcnica de filtrao por membrana poder ser o efeito competitivo devido ao
crescimento excessivo de microrganismos que no so alvo de pesquisa, impedindo o
desenvolvimento das colnias tpicas. Este tipo de situao comum em amostras de
guas residuais, e acontece no s com o meio de cultura MLSA, mas tambm com o

61
Tergitol (Toze et al., 1990; Toze et al., 1994; Niemi et al., 2001 e Schets et al., 2001).
Outro aspecto importante que j foi demonstrado e que se deve ter em considerao o
facto do teste Colilert enumerar como coliformes totais Aeromonas sp. um organismo
presente em meios aquticos, sobrestimando assim o nmero de CT presente nas
amostras (Landre, Gavriel, & Lamb, 1998).
4.5.2. Escherichia coli

Nos resultados obtidos para a enumerao de E. coli, em 54.8% das amostras
analisadas o teste Colilert revelou enumeraes superiores tcnica da filtrao por
membrana (ANEXO III). Por outro lado, para 39.1% os resultados do mtodo de
filtrao por membrana foi superior aos do teste rpido. O tratamento estatstico dos
resultados atravs do teste t de Student revelou que as diferenas observadas no so
significativas para um intervalo de confiana de 95%. Isto indica que para este
parmetro os mtodos podero ser equivalentes, uma vez que, no se rejeita a hiptese
nula de equivalncia dos mtodos.
Um resultado inconclusivo foi obtido aquando da anlise dos resultados atravs
do tratamento estatstico recomendado pela norma ISO 17994:2004. O intervalo
determinado foi de (-79.2;154.0)%, revelando a necessidade de analisar um maior
nmero de amostras, uma vez que, o limite inferior menor que D (10%)e o limite
superior determinado maior que zero. No estudo inter-laboratorial realizado pelos
autores Ribas e colaboradores, publicado em 2006, os resultados de avaliao da
equivalncia entre o mtodo normalizado e o teste Colilert, revelaram diferenas entre
os dois mtodos, a favor do mtodo de referncia.
Os autores Fricker e colaboradores em 1997, De Roubin e colaboradores em 1997
e Eckner em 1998, demonstraram para amostras de gua para consumo humano, a
62
equivalncia dos mtodos para o parmetro E. coli. Estes autores concluram que no
existe diferena significativa entre a tcnica de filtrao por membrana e o teste
Colilert na enumerao destas bactrias neste tipo de guas. Embora tenham observado
uma maior recuperao de E. coli no teste enzimtico Colilert que na tcnica de
filtrao por membrana.
Num estudo realizado por Buckalew e colaboradores publicado em 2006, para a
avaliao da qualidade da gua atravs da enumerao de coliformes fecais foram
analisadas amostras de guas naturais por laboratrios certificados. Neste estudo
tambm foram aplicados em paralelo o mtodo de filtrao por membrana e o teste
Colilert, sendo idnticas as tcnicas de colheita e preservao das amostras. O teste
enzimtico Colilert produziu resultados comparveis aos da filtrao por membrana,
revelando uma equivalncia entre os dois mtodos. guas balneares foram estudadas
por Eckner em 1998, num trabalho realizado para comparar os testes enzimticos
Colilert e Enterolert com o mtodo normalizado de filtrao por membrana. Os
resultados obtidos demonstraram no existir diferenas significativas para a enumerao
de E. coli atravs dos mtodos, normalizado e enzimtico. Chihara e colaboradores, em
2005 analisaram em paralelo amostras de guas residuais atravs dos mtodos filtrao
por membrana e o teste enzimtico Colilert. Foram enumerados coliformes fecais e E.
coli em amostras de guas residuais tratadas de suiniculturas e guas residuais
municipais. Para a deteco de coliformes fecais o teste Colilert foi ligeiramente
modificado, sujeitando-se inicialmente os tabuleiros a uma incubao de 4 horas a 37C,
s depois a incubao a passou a 44.5C durante 20 horas. As diferenas encontradas
para todas as amostras foram inferiores a uma ordem de magnitude. E os resultados
mostraram uma correlao significativa entre o teste Colilert e o mtodo normalizado.
Segundo estes investigadores, apesar do teste Colilert ter revelado uma menor

63
recuperao de bactrias que o mtodo de filtrao por membrana, este teste poder ser
usado para a quantificao de bactrias coliformes fecais e E. coli em guas residuais
municipais e de agricultura. Os autores Niemel e colaboradores analisaram em 2003,
amostras de guas de vrios tipos para comparao entre o teste enzimtico Colilert e o
mtodo normalizado de filtrao por membrana, na enumerao de coliformes totais e
E. coli. Como resultado deste trabalho, estes autores obtiveram uma maior enumerao
de coliformes pelo mtodo enzimtico que pelo mtodo referncia, e uma enumerao
de E. coli equivalente em ambos os mtodos. A diferena encontrada foi
estatisticamente significativa. Chao e colaboradores em 2003, realizaram um estudo
para comparar o teste Colilert com o mtodo normalizado de filtrao por membrana
para enumerao de coliformes totais e E. coli. Analisaram guas fluviais, guas
subterrneas e guas de nascentes. A enumerao de E. coli pelo teste Colilert revelou
ser igual ou superior obtida pelo mtodo normalizado, consoante o tipo de gua.
4.5.3. Enterococos
O teste Enterolert apresentou para o parmetro enterococos valores superiores
aos obtidos pela tcnica da filtrao por membrana em 13.0% das amostras (ANEXO
IV). Uma enumerao superior foi obtida atravs do mtodo de FM em 82.6% das
amostras analisadas. O teste estatstico t de Student para amostras emparelhadas e para
uma significncia de 5% indicou, que os mtodos no so equivalentes. A mesma
concluso foi tirada da anlise segundo a norma ISO 17994:2004, em que o intervalo
calculado para avaliar a equivalncia dos mtodos negativo para ambos os limites
inferior e superior (-221.5;-88.9), revelando que os mtodos so diferentes entre si e a
diferena e a favor do mtodo normalizado.
64
No trabalho de Kinzelman de 2003, foram analisadas amostras de guas doces

para comparar o desempenho do teste Enterolert em relao ao mtodo normalizado de
filtrao por membrana. At ento a principal contestao em relao ao teste rpido era
o facto de este no apresentar uma correlao significativa com o mtodo normalizado,
para alm da dificuldade em isolar e confirmar os presuntivos positivos. No trabalho
realizado em 1996 por Budnick, os resultados das anlises de amostras de guas
balneares para enumerao de enterococos, revelaram a equivalncia entre a tcnica da
filtrao por membrana e o teste Enterolert para um limite de confiana de 95%.
4.6. Comparao dos resultados de enumerao utilizando diferentes meios de

cultura selectivos e os testes enzimticos
Os meios selectivos usados neste trabalho permitiram o crescimento das bactrias
em estudo. No entanto, registou-se o crescimento de outras espcies, o que demonstra
que para o tipo de guas analisadas os meios de cultura usados no so totalmente
selectivos e especficos. Por selectividade, entende-se a capacidade que o meio de
cultura possui para enumerar os microrganismos alvo presentes numa populao onde
os microrganismos no-alvo so abundantes. A selectividade determinada pela razo
entre o total de colnias tpicas e o total de colnias enumeradas (tpicas e atpicas). A
especificidade descreve at que ponto as colnias de microrganismos no-alvo
apresentam reaces caractersticas das colnias tpicas. A especificidade calculada
atravs da razo entre o total de colnias tpicas e atpicas confirmadas como positivas e
o total de colnias enumeradas.
Segundo as normas, todas as colnias presuntivas positivas devem ser
confirmadas. Quando este nmero elevado, a confirmao de todas as colnias
implica um aumento substancial da quantidade de trabalho e do custo da anlise. Ento

65
estabeleceu-se que um total de 10 por placa deve ser confirmado. Para todas as amostras
analisadas foi confirmado um nmero mnimo de 10 colnias tpicas e cinco colnias
atpicas, segundo procedimento descrito nas respectivas normas. No entanto, em muitas
amostras o nmero de bactrias no alvo presentes nas membranas foi muito elevado,
tornando difcil seguir os critrios estabelecidos nas normas para contabilizar e
confirmar as colnias tpicas. As contagens s so possveis de realizar adequadamente,
quando no meio de cultura o nmero de colnias alvo e no alvo reduzido. E em
muitas das amostras analisadas o nmero de colnias encontram-se acima do limite de
contagem, 100 colnias (Lightfood & Maier, 2003).
Foram feitas tambm identificaes da espcie atravs de galerias API. Na Tabela
4.VI, esto resumidas as contagens totais de bactrias, assim como, os totais de colnias
tpicas e atpicas confirmadas e no confirmadas, e ainda o clculo da selectividade e da
especificidade para cada meio de cultura selectivo usado neste estudo.
4.6.1. Coliformes Totais

O meio de cultura AGAR mENDO LES selectivo para Coliformes Totais e foi
usado atravs da tcnica de filtrao por membrana para comparao com o meio
MLSA, meio de cultura lactosado aconselhado na Recomendao do IRAR n05/2005
para pesquisa de bactrias coliformes e Escherichia coli. Pelos resultados representados
na Tabela 4.VI, podemos constatar que o meio de cultura em estudo, AGAR mENDO
LES, para alm de enumerar um total de colnias superior, apresenta uma taxa de
selectividade e especificidade superiores em relao ao meio MLSA. Os resultados da
anlise de varincia a um factor indicam que os meios de cultura so estatisticamente
diferentes para um grau de significncia de 5%. Num estudo de Hrman e
colaboradores publicado em 2006, os autores concluram que estes meios so estatstica-
66
Tabela 4.VI Comparao dos diferentes meios de cultura selectivos.

Colnias tpicas
Bactrias
Coliformes
Totais
Meio
Colnias atpicas
Total
colnias
Total
Total
Selectividade (%)
Especificidade (%)
MLSA
40
5488
1051
421
630
4437
1848
2589
19.1
41.3
AGAR
mENDO
LES
40
6791
1878
1878
4913
4913
27.7
100
MLSA
40
5488
1051
284
767
4437
4437
19.1
5.2
AGAR mFC
40
4810
2012
671
1341
2798
2798
41.8
13.9
S&B
44
6834
4126
1650
2476
2708
677
2031
60.4
34.1
BEAA
31
8840
8840
7072
1768
100.0
80.0
Escherichia coli
Enterococos
(+) Colnias confirmadas como positivas;

() Colnias no confirmadas.

67
mente equivalentes para um nvel de significncia de 99%, apesar de o meio de cultura

AGAR mENDO LES apresentar uma mdia de enumerao de coliformes totais
superior ao MLSA.
Comparando os resultados obtidos para o meio de cultura AGAR mENDO LES
com os do teste Colilert, estes no foram estatisticamente equivalentes para um nvel
de significncia de 5% atravs da comparao de mdias num teste de amostras
emparelhadas. No entanto, no trabalho realizado em 2003 os autores Chao e
colaboradores, obtiveram enumeraes equivalentes entre o teste Colilert e o meio de
cultura AGAR mENDO LES para cerca de 60% das amostras de gua para consumo
analisadas e enumeraes superiores para o teste rpido em cerca de 40% das amostras.
4.6.2. Coliformes Fecais

O meio de cultura AGAR mFC, selectivo para coliformes fecais foi usado na
tcnica de filtrao por membrana para comparao com o meio MLSA na enumerao
de E. coli. Dos resultados representados na Tabela 4.VI, o meio de cultura AGAR mFC
enumerou um nmero total de colnias inferior ao meio MLSA, mas o total de colnias
tpicas confirmadas foi bastante superior ao obtido pelo meio de cultura recomendado
pelo IRAR. Esta diferena reflecte-se quando comparamos os meios no que diz respeito
ao clculo da selectividade e especificidade. O meio AGAR mFC apresenta uma taxa de
selectividade superior do meio MLSA, assim como a taxa de especificidade. A anlise
de varincia a um factor realizada para testar a equivalncia dos resultados obtidos na
enumerao de Coliformes Fecais entre os dois meios de cultura, revelou existir uma
diferena estatisticamente significativa para um nvel de confiana de 95%.
A comparao dos resultados da enumerao de E. coli em meio de cultura
AGAR mFC com os do teste Colilert revelou a existncia de equivalncia entre os dois
68
CONCLUSES
mtodos, uma vez que, o teste estatstico t de Student para amostras emparelhadas no
rejeitou a hiptese nula. Em 2003, os autores Chao e colaboradores demonstraram que o
meio de cultura AGAR mFC no seria recomendado para enumerao de Coliformes
Fecais em guas subtropicais, uma vez que, outros coliformes termotolerantes poderiam
crescer neste meio de cultura interferindo com a enumerao de CF. No entanto, essa
situao no pareceu acontecer na quantificao de E. coli atravs do teste Colilert.
4.6.3. Enterococos
O meio de cultura S&B o recomendado no mtodo normalizado para
enumerao de enterococos intestinais. No estudo de Dinsio e Borrego em 1995,
demonstrou-se que este meio de cultura bastante especfico para a enumerao destes
microrganismos em guas naturais. Audicana e seus colaboradores em 1995
demonstraram que o meio de cultura KAEE, usado normalmente para as confirmaes,
apresentava uma taxa de especificidade e recuperao superior aos meios de cultura
S&B e KF. O meio de cultura BEAA o meio de confirmao recomendado pela norma
ISO 7899-2:2000 para enumerao de Enterococos Intestinais em guas. Este meio de
cultura foi usado atravs da tcnica da filtrao por membrana como meio de cultura
presuntivo para testar a possibilidade de reduzir as (444)h de incubao necessrias na
utilizao do meio S&B indicado no mtodo normalizado a 24h. Dos resultados
presentes na Tabela 4.VI, o meio de cultura confirmativo BEAA enumerou um nmero
total de colnias superior ao total enumerado com o meio S&B, e todas com morfologia
tpica. Este resultado levou concluso de que este meio 100% selectivo e bastante
especfico (taxa de especificidade de 80%). A comparao dos resultados da
enumerao com os dois meios de cultura, atravs da anlise de varincia a um factor
indicou que no existe homogeneidade de varincias para um nvel de significncia 5%.

69
Ao analisar os resultados obtidos para o meio de cultura BEAA em comparao com os

obtidos para o teste enzimtico Enterolert, atravs do teste t de Student para amostras
emparelhadas, a hiptese das mdias serem equivalentes para um nvel de significncia
de 5% foi tambm rejeitada. O que significa que poder no existir uma equivalncia
entre os dois mtodos.
4.7. Tecnologia IDEXX em uso nos laboratrios

O mtodo Colilert est referido no Standard Methods for the Examination of
Water and Wastewater (9223 B) como mtodo para enumerao de E. coli com
aplicao a amostras de guas de superfcie. O limite de deteco para este mtodo de
1 Nmero Mais Provvel por 100mL de amostra e a preciso de 20% RPD (Relative
Percentage of Deviation). Ainda no esto descritos procedimentos de calibrao ou
normalizao, nem esto publicados dados de avaliao do desempenho deste mtodo
(Standard Operating Procedure for: Escherichia coli and Total Coliform using the
IDEXX Quanti-Tray/2000, 2006). O teste enzimtico Colilert est aprovado ou aceite
para anlises de guas para consumo humano em 24 pases, de entre os quais esto os
quatro membros da Unio Europeia: Alemanha, Hungria, Repblica Checa e Itlia; e
dois pases no membros da UE: Islndia e Noruega. Na Dinamarca este mtodo
usado como teste suplementar em alguns laboratrios de anlise microbiolgicas
quantitativas, e parece ser bastante conhecido e robusto, embora seja reconhecida a
necessidade de validao (Jeppesen, 2007). Nos Estados Unidos da Amrica (EUA) a
Agncia para a Proteco do Ambiente (EPA) nomeou e aprovou os mtodos Colilert e
Enterolert, para a enumerao de E. coli e enterococos e guas naturais (U.S.
Environmental Protection Agency, 2003).
70
5. CONCLUSES
CONCLUSES
5. CONCLUSES
Este estudo demonstrou que a tecnologia do substrato definido mais sensvel que
o mtodo normalizado de filtrao por membrana para a enumerao de bactrias
coliformes, E. coli e enterococos. semelhana de outros trabalhos j realizados,
apenas um nmero representativo de presumveis positivos de cada amostra foi
confirmado. Este procedimento pode tornar-se limitado, uma vez que, a seleco de um
determinado nmero de colnias, poder conduzir a resultados falsos. Assim, chega-se
concluso que todas as colnias e poos positivos presuntivos devem ser confirmados.
Este ser o melhor procedimento para fornecer informao com maior segurana. No
entanto, h que considerar que ao confirmar todos os positivos retiramos ao teste rpido
uma das suas vantagens, a no necessidade de confirmao de poos positivos.
Foram j realizados vrios estudos de comparao entre os mtodos normalizados

de filtrao por membrana e os testes enzimticos da tecnologia IDEXX, com a
finalidade de estudar a equivalncia entre os dois mtodos para enumerao de bactrias
coliformes e enterococos. Ainda no foi possvel estabelecer uma correlao entre estes
mtodos. No entanto, os resultados obtidos at agora pelos diversos autores justificam a
necessidade de prosseguir com mais trabalhos de investigao que visem a avaliao da
preciso e exactido dos mtodos rpidos. O ideal ser realizar-se um estudo a nvel
inter-laboratorial semelhana do que foi j feito noutros pases da Europa. A reduo
do nmero de amostras, mas a anlise de diversos tipos de guas e com mais rplicas
poder ser uma estratgia que permite estabelecer a preciso dos mtodos.
Apesar de ainda no se ter formalizado os testes enzimticos como mtodos de

referncia a nvel da Europa, existem diversos laboratrios que esto a executar estes
72
CONCLUSES
mtodos como testes suplementares nas suas anlises de rotina. Mas de grande
importncia que se estabelea a equivalncia entre os mtodos de referncia e os testes
rpidos no que respeita enumerao de bactrias coliformes, E. coli e enterococos, e
para os diferentes tipos de guas. Isto porque, amostras com resultados acima e abaixo
dos valores legislados podero ser inadequadamente interpretadas, consoante os
mtodos utilizados para a enumerao dos parmetros microbiolgicos.

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79
7. ANEXOS
7. ANEXOS
Anexo I Tabela do Nmero Mais Provvel IDEXX Quanti-Tray
Anexo II Resultados das enumeraes e tratamentos estatsticos realizados para

bactrias Coliformes Totais
Enumerao de Coliformes Totais em MLSA, Colilert e AGAR mENDO LES:
Coliformes Totais
n Amostra
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
MLSA
69,329
639,96
60,44067
6,220667
3,335
3,779667
1795
1600
166,6667
61,33333
90,66667
156,6667
93,33333
37,33333
19
80000
90,66667
48,66667
4033,333
20500
1258,333
1258,333
80000
12666,67
80000
80000
80000
7000
80000
43426,4
1
80000
114,2933
21215,7
27733,33
1845
60333333
66666,67
50
0
log MLSA Colilert log Colilert AGAR mENDO LES

1,837447
2,767819
1,77875
0,785587
0,497856
0,565896
3,249953
3,179525
2,200687
1,780952
1,950344
2,185434
1,967334
1,571856
1,278352
4,90309
1,954869
1,680683
3,60416
4,308093
3,096562
3,096562
4,90309
4,100146
4,90309
4,90309
4,90309
3,841828
4,90309
4,635391
0
4,90309
2,050476
4,32487
4,439522
3,265867
7,77856
4,799313
1,69897
0
4100
10900
327
4100
226
1000
5794
3590
1299,7
6630
1100
1413,6
1413,6
3130
3180
241920
48840
198630
40820
44200
52260
10940
92080
20924
242000
484000
484000
24066
34658
24192
1
24200
2098
17329
51720
0
2419200
2419200
66,3
4,1
3,612784
4,037426
2,514548
3,612784
2,354108
3
3,762978
3,555094
3,113843
3,821514
3,041393
3,150327
3,150327
3,495544
3,502427
5,383672
4,688776
5,298045
4,610873
4,645422
4,718169
4,039017
4,964165
4,320645
5,383815
5,684845
5,684845
4,381404
4,539803
4,383672
0
4,383815
3,321805
4,238774
4,713659
0
6,383672
6,383672
1,821514
0,612784
1866,667
3666,667
1766,667
3433,333
2833,333
3933,333
2933,333
830
433,3333
330
110
113,3333
190
306,6667
183,3333
80000
80000
1333,333
56333,33
56333,33
63333,33
8533,333
80000
54333,33
80000
80000
80000
34000
59333,33
53000
1
50333,33
1700
33333,33
43000
3300
61166667
500000
360
10
log AGAR
mENDO
LES
3,271067
3,564271
3,247155
3,535716
3,452298
3,594761
3,467361
2,919078
2,636822
2,518514
2,041393
2,054358
2,278754
2,486667
2,263241
4,90309
4,90309
3,124939
4,750765
4,750765
4,801632
3,931119
4,90309
4,735066
4,90309
4,90309
4,90309
4,531479
4,773299
4,724276
0
4,701856
3,230449
4,522879
4,633468
3,518514
7,786515
5,69897
2,556303
1
Teste t de Student para amostras emparelhadas MLSA vs Colilert:
Case Processing Summary

Cases
Valid
Missing
MLSA
N
36
Percent
100,0%
COLILERT
36
100,0%
Total
Percent
,0%
,0%
N
36
Percent
100,0%
36
100,0%
10
-2
N=
36
36
MLSA
COLILERT
t-Test
Paired Samples Statistics
Pair 1
Mean
3,1358
MLSA
COLILERT
4,1385
Paired Samples Correlations
36
Std, Deviation
1,64466
Std, Error
Mean
,27411
36
1,08003
,18000
N
Pair 1
MLSA & COLILERT
36
Correlation
,785
Sig,
,000
Paired Samples Test
Paired Differences
95% Confidence
Interval of the
Difference
Mean
Std,
Deviation
Std,
Error
Mean
df
Lower
Upper
Pair 1
MLSA COLILERT
-1,0027
1,03977
,17329
1,3545
-,6508
-5,786
35
,000
Sig,
(2tailed)
Teste t de Student para amostras emparelhadas Colilert vs AGAR mENDO LES:

Cases
Valid
Missing
COLILERT
N
36
Percent
100,0%
AGAR
mENDOLES
36
100,0%
Total
Percent
,0%
,0%
N
36
Percent
100,0%
36
100,0%
1
N=
36
36
COLILERT
MENDOLES
t-Test
Pair 1
COLILERT
AGAR
mENDO LES
Mean
4,0921
36
Std, Deviation
1,01473
Std, Error
Mean
,16912
36
1,07034
,17839
3,8225
N
Pair 1
COLILERT & AGAR

mENDO LES
Correlation
36
Sig,
,782
,000
Paired Samples Test
Paired Differences
95%
Confidence
Interval of the
Difference
Mean
Std,
Deviation
Std,
Error
Mean
,11509
,0360
df
Lower
Upper
Pair 1
COLILERT AGAR
mENDO
LES
,2696
,69052
,5032
2,342
35
,025
Sig,
(2tailed)
Anlise de varincia a um factor para meios de cultura MLSA vs AGAR mENDO

LES:
Oneway
Test of Homogeneity of Variances
Levene Statistic
4,144
MLSA
AGAR mENDO LES
df1
df2
9,506
Sig,
37
75
,000
37
75
,000
ANOVA
Sum of
Squares
MLSA
Between
Groups
Within Groups
AGAR mENDO
LES
Total
Between
Groups
Within Groups
Total
df
Mean Square
312,448
37
8,445
,622
75
,008
313,070
112
202,339
37
5,469
,996
75
,013
203,335
112
Sig,
1018,795
,000
411,936
,000
Teste de equivalncia entre os mtodos MLSA e Colilert segundo a norma ISO

17994:2004:
Coliformes Totais
n Amostra
MLSA
1
1
69,329
2
2
639,96
3
3
60,44066667
4
4
6,220666667
5
5
3,335
6
6
3,779666667
7
7
1795
8
8
1600
9
9
166,6666667
10
10
61,33333333
11
11
90,66666667
12
12
156,6666667
13
13
93,33333333
14
14
37,33333333
15
15
19
16
16
80000
17
17
90,66666667
18
18
48,66666667
19
19
4033,333333
20
20
20500
21
21
1258,333333
22
22
1258,333333
23
23
80000
24
24
12666,66667
25
25
80000
26
26
80000
27
27
80000
28
28
7000
29
29
80000
30
30
43426,4
31
32
80000
32
33
114,2933333
33
34
21215,7
34
35
27733,33333
35
36
1845
36
37
60333333,33
37
38
66666,66667
38
39
50
39
40
0
(---) No aplicvel.
ln MLSA Colilert
4,238863
4100
6,461406 10900
4,101662
327
1,827877
4100
1,204473
226
1,329636
1000
7,49276
5794
7,377759
3590
5,115996 1299,7
4,116323
6630
4,50719
1100
5,05412
1413,6
4,536177 1413,6
3,619887
3130
2,944439
3180
11,28978 241920
4,50719
48840
3,884994 198630
8,302348 40820
9,92818
44200
7,137543 52260
7,137543 10940
11,28978 92080
9,446729 20924
11,28978 242000
11,28978 484000
11,28978 484000
8,853665 24066
11,28978 34658
10,67882 24192
11,28978 24200
4,738768
2098
9,962497 17329
10,23039 51720
7,520235
0
17,9154 2419200
11,10746 2419200
3,912023
66,3
--4,1
ln Colilert
(lnColilert -lnMLSA)100
8,318742
407,9878964
9,296518
283,5112394
5,78996
168,8298003
8,318742
649,0865171
5,420535
421,606232
6,907755
557,8119457
8,664578
117,1817877
8,185907
80,81485733
7,169889
205,3892938
8,79936
468,3036614
7,003065
249,5875681
7,253895
219,9774515
7,253895
271,7717607
8,048788
442,8901701
8,064636
512,0197497
12,39636
110,6580458
10,7963
628,9115151
12,1992
831,4204744
10,61693
231,4578993
10,69648
76,82999029
10,86399
372,6443166
9,300181
216,2637703
11,43041
14,06311297
9,948652
50,19229545
12,39669
110,6911091
13,08984
180,0058272
13,08984
180,0058272
10,08856
123,4889907
10,45328
-83,64980555
10,09378
-58,50455511
10,09411
-119,5674002
7,64874
290,9971546
9,760137
-20,2360075
10,8536
62,32094947
---752,0776415
14,69895
-321,6447836
14,69895
359,1487108
4,19419
28,21668918
-1,41099
162,924054
198,2392428
Mdia
278,8972235
Desvio-Padro
89,31859501
Incerteza expandida
108,9206478
Limite inferior
287,5578378
Limite superior
Anexo III Resultados das enumeraes e tratamentos estatsticos realizados para

Escherichia coli
Enumerao de Escherichia coli em MLSA, Colilert e AGAR mFC:
Escherichia coli
n Amostra MLSA log MLSA Colilert log Colilert AGAR mFC log AGAR mFC
1
1
34,671
1,539966
1
0
110
2,041393
2
2
320,04
2,505204
3100
3,491362
2233,333
3,348954
3
3
30,226
1,480381
41
1,612784
63,33333
1,801632
4
4
1
0
30
1,477121
1000
3
5
5
3,335
0,523096
10
1
566,6667
2,753328
6
6
1
0
10
1
1433,333
3,156347
7
7
1
0
20
1,30103
196,6667
2,293731
8
8
533,3333 2,726999
235,9
2,372728
1233,333
3,09108
9
9
16,66667 1,221849
100
2
33,33333
1,522879
10
10
1
0
18,7
1,271842
630
2,799341
11
11
11,33333 1,054358
12
1,079181
30
1,477121
12
12
31,33333 1,496007
3,1
0,491362
233,3333
2,367977
13
13
1
0
11
1,041393
166,6667
2,221849
14
14
1
0
73,3
1,865104
166,6667
2,221849
15
15
1
0
32,7
1,514548
26,66667
1,425969
16
16
80000
4,90309
13960
4,144885
80000
4,90309
17
17
22,66667 1,355388
44,1
1,644439
46,66667
1,669007
18
18
1
0
214,2
2,330819
1333,333
3,124939
19
19
80000
4,90309
6265
3,796921
55333,33
4,742987
20
20
12300
4,089905
7090
3,850646
54000
4,732394
21
21
1258,333 3,099796
21093
4,324138
72000
4,857332
22
22
1258,333 3,099796
1596
3,203033
7233,333
3,859338
23
23
80000
4,90309
104
2,017033
1666,667
3,221849
24
24
80000
4,90309
60
1,778151
566,6667
2,753328
25
25
80000
4,90309
242000
5,383815
80000
4,90309
26
26
80000
4,90309
397260
5,599075
80000
4,90309
27
27
80000
4,90309
484000
5,684845
80000
4,90309
28
28
80000
4,90309
2162
3,334856
31000
4,491362
29
29
80000
4,90309
5226
3,718169
51666,67
4,71321
30
30
27139,6
4,433603
19863
4,298045
80000
4,90309
31
31
1
0
1
0
1
0
32
32
80000
4,90309
24200
4,383815
80000
4,90309
33
33
1
0
30
1,477121
1900
3,278754
34
34
7071,9
3,849536
5172
3,713659
19000
4,278754
35
35
10400
4,017033
6440
3,808886
5333,333
3,726999
36
36
1845
3,265996
1
0
166,6667
2,221849
37
37
36200000 7,558709 2419200
6,383672
8566667
6,932812
38
38
1
0
248100
5,394627
1
0
39
39
1
0
1
0
30
1,477121
40
40
1
0
1
0
1
0
41
41
34000
4,531479
52000
4,716003
230000
5,361728
42
42
33000
4,518514
40400
4,606381
*
---
(*) Amostra no analisada neste meio de cultura; (---) No aplicvel.
Teste t de Student para amostras emparelhadas MLSA vs Colilert:

Cases
Valid
Missing
MLSA
N
42
Percent
100,0%
COLILERT
42
100,0%
Total
Percent
,0%
,0%
N
42
Percent
100,0%
42
100,0%
10
-2
N=
42
42
MLSA
COLILERT
t-Test
Pair 1
Mean
2,5095
MLSA
COLILERT
42
Std, Deviation
2,18891
Std, Error
Mean
,33776
42
1,85004
,28547
2,6217

N
Pair 1
MLSA & COLILERT
42
Correlation
,734
Sig,
,000
Paired Samples Test
Paired Differences
95% Confidence
Interval of the
Difference
Mean
Std,
Deviation
Std,
Error
Mean
df
Lower
Upper
Pair 1
MLSA COLILERT
-,1122
1,50640
,23244
-,5816
,3572
-,483
41
,632
Sig,
(2tailed)
Teste t de Student para amostras emparelhadas Colilert vs AGAR mFC:

Cases
Valid
Missing
COLILERT
N
41
Percent
100,0%
AGAR mFC
41
100,0%
Total
Percent
,0%
,0%
-2
N=
41
41
COLILERT
MFCAGAR
t-Test
Pair 1
COLILERT
AGAR mFC
Mean
2,5977
41
Std, Deviation
1,81743
Std, Error
Mean
,28383
41
1,60234
,25024
3,1789

N
Pair 1
COLILERT &
AGAR mFC
Correlation
41
,749
Sig,
,000
41
Percent
100,0%
41
100,0%
Paired Samples Test
Paired Differences
95%
Confidence
Interval of the
Difference
Mean
Std,
Deviation
Std,
Error
Mean
df
Lower
Upper
Pair 1
COLILERT
AGAR
mFC
-,5812
1,22753
,19171
-,9687
-,1938
-3,032
40
,004
Sig,
(2tailed)
Teste para equivalncia entre os mtodos MLSA e Colilert segundo a norma ISO
17994:2004:
Escherichia coli
n Amostra
MLSA
1
1
34,671
2
2
320,04
3
3
30,226
4
4
1
5
5
3,335
6
6
1
7
7
1
8
8
533,3333333
9
9
16,66666667
10
10
1
11
11
11,33333333
12
12
31,33333333
13
13
1
14
14
1
15
15
1
16
16
80000
17
17
22,66666667
18
18
1
19
19
80000
20
20
12300
21
21
1258,333333
22
22
1258,333333
23
23
80000
24
24
80000
25
25
80000
26
26
80000
27
27
80000
28
28
80000
29
29
80000
30
30
27139,6
31
32
80000
32
33
1
33
34
7071,9
34
35
10400
35
36
1845
36
37
36200000
37
38
1
38
41
34000
39
42
33000
ln MLSA Colilert
3,545903603
1
5,768445988
3100
3,408702481
41
0
30
1,204472679
10
0
10
0
20
6,27914662
235,9
2,813410717
100
0
18,7
2,427748236
12
3,444682494
3,1
0
11
0
73,3
0
32,7
11,28978191 13960
3,120895417
44,1
0
214,2
11,28978191
6265
9,417354541
7090
7,137543373 21093
7,137543373
1596
11,28978191
104
11,28978191
60
11,28978191 242000
11,28978191 397260
11,28978191 484000
11,28978191
2162
11,28978191
5226
10,20874919 19863
11,28978191 24200
0
30
8,863884464
5172
9,249561085
6440
7,520234556
1
17,40456968 2419200
0
248100
10,4341158
52000
10,40426284 40400
ln Colilert
0
8,03915739
3,713572067
3,401197382
2,302585093
2,302585093
2,995732274
5,463407986
4,605170186
2,928523524
2,48490665
1,131402111
2,397895273
4,294560609
3,487375078
9,543951376
3,786459782
5,366910158
8,742733867
8,86644062
9,956696511
7,375255778
4,644390899
4,094344562
12,39669301
12,89234626
13,08984019
7,678788998
8,561401446
9,896613984
10,09410791
3,401197382
8,55101474
8,770283819
0
14,69894746
12,42158717
10,858999
10,60658506
Mdia
Desvio-Padro
Incerteza expandida
Limite inferior
Limite superior
(ln Colilert-lnMLSA)100
-357,4338034
227,0711402
30,48695856
440,1197382
109,8112414
239,7895273
304,4522438
-81,57386331
179,1759469
298,0618636
5,715841384
-231,3280382
248,490665
430,8110952
351,7497837
-174,5830537
66,55643659
537,1567828
-254,7048046
-55,09139218
281,9153138
23,7712405
-664,5391015
-719,5437351
110,6911091
160,2564343
180,0058272
-361,0992915
-272,8380468
-31,21352113
-119,5674002
343,3987204
-31,28697241
-47,9277266
-752,0776415
-270,5622212
1242,15912
42,4883194
20,23222235
37,15376817
364,9432877
116,8753898
-79,72162163
154,029158
Nota: Foram eliminadas do tratamento as amostras 31, 39 e 40 por apresentarem para

ambos os mtodos enumeraes iguais a zero.
Anexo IV Resultados das enumeraes e tratamentos estatsticos realizados para

enterococos
Enumerao de enterococos em S&B, Enterolert e BEAA:
Enterococos
n Amostra
1
1
2
2
3
3
4
4
5
5
6
6
7
7
8
8
9
9
10
10
11
11
12
12
13
13
14
14
15
15
16
16
17
17
18
18
19
19
20
20
21
21
22
22
23
23
24
24
25
25
26
26
27
27
28
28
29
29
30
30
31
31
32
32
33
33
34
34
35
35
36
36
37
37
38
38
39
39
40
40
41
41
42
42
43
43
44
44
45
45
S&B
520
51
36
34
300
124,6667
24,66667
192,6667
0
39,33333
57,66667
72,66667
500
766,6667
900
1066,667
833,3333
350
466,6667
600
266,6667
270
100
140
866,6667
2000
20
5033,333
1666,667
8333,333
2533,333
3700
2333,333
2266,667
4300
11333,33
3866,667
3200
1966,667
3066,667
60
166,6667
1,154263
120
1966,667
log S&B Enterolert

2,714303
1374
1,70757
4360
1,548971
10
1,530977
1
2,474525
5172
2,093242
41
1,380211
41
2,28455
1
1
10
1,592577
52
1,756964
30
1,857221
41
2,660757
278
2,867353
341
2,92605
402
3,011141
457
2,916063
537
2,5
85
2,492374
110
2,751758
134
2,359727
30
2,423171
733
2
1
2,116749
1
2,937192
1
3,30103
1
1,259384
1
3,693317
909
3,214813
278
3,920141
1100
3,401717
705
3,558373
359
3,361525
638
3,355293
573
3,633155
2282
4,025182
5794
3,577459
1414
3,504716
1071
3,29031
529
3,486303
2382
1,650515
1
2,157585
1
0
1
2,075962
1
3,286979
1460
log Enterolert
3,1379867
3,6394865
1
0
3,7136585
1,6127839
1,6127839
0
1
1,7160033
1,4771213
1,6127839
2,4440448
2,5327544
2,6042261
2,6599162
2,7299743
1,9294189
2,0413927
2,1271048
1,4771213
2,865104
0
0
0
0
0
2,9585639
2,4440448
3,0413927
2,8481891
2,5550944
2,8048207
2,7581546
3,3583156
3,7629785
3,1504494
3,0297895
2,7234557
3,3769418
0
0
0
0
3,1643529
BEAA log BEAA

*
--*
--*
--*
--*
--*
--*
--*
--*
--*
--*
--*
--296,6667 2,46414
516,6667 2,71319
420
2,61705
913,3333 2,96005
2,60742
86,66667 1,92313
156,6667 2,18735
206,6667 2,31447
70
1,82571
56,66667 1,73471
1
0
10,33333 0,76701
30
1,43368
33,33333 1,49237
17
0,92605
22666,67 4,34938
3533,333
3,5407
15333,33 4,17178
6666,667 3,82309
4766,667 3,67819
4666,667 3,66847
4133,333
3,6155
7400
3,86789
23666,67 4,36935
7066,667 3,84525
5566,667 3,74259
4400
3,64292
2666,667 3,42549
33,33333 1,51877
1
0
4
0,33333
1
0
1866,667 3,26436
46
46
2333,333 3,356433
2146,67
3,3317646
(*) Amostra no analisada neste meio de cultura; (---) No aplicvel.
---
Teste t de Student para amostras emparelhadas S&B vs Enterolert:

Cases
Valid
Missing
SEBAGAR
N
34
Percent
100,0%
ENTEROLERT
34
100,0%
Total
Percent
,0%
,0%
N
34
Percent
100,0%
34
100,0%
4.5
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
.5
N=
34
34
SEBAGAR
ENTEROLE
t-Test
Pair 1
Mean
2,8441
SEB
ENTEROLERT
34
Std, Deviation
,73293
Std, Error
Mean
,12570
34
,71464
,12256
2,5950

N
Pair 1
SEB & ENTEROLERT
34
Correlation
,677
Sig,
,000
Paired Samples Test
Paired Differences
95%
Confidence
Interval of the
Difference
Mean
Std,
Deviation
Std,
Error
Mean
Lower
,09984
,0460
,4522
df
Upper
Pair 1
SEB ENTEROLERT
,2491
,58216
2,495
33
,018
Sig,
(2tailed)
Teste t de Student para amostras emparelhadas Enterolert vs BEAA:

Cases
Valid
Missing
ENTEROLERT
N
23
Percent
100,0%
BEAA
23
100,0%
Total
Percent
,0%
,0%
N
23
Percent
100,0%
23
100,0%
5.0
4.5
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
N=
23
23
ENTEROLE
BEAA
t-Test
Pair 1
ENTEROLERT
Mean
2,7783
3,2400
BEAA
23
Std, Deviation
,43703
Std, Error
Mean
,09113
23
,77687
,16199

N
Pair 1
ENTEROLERT &
23
Correlation
,689
Sig,
,000
BEAA
Paired Samples Test
Paired Differences
95%
Confidence
Interval of the
Difference
Mean
Std,
Deviation
Std,
Error
Mean
Lower
,11916
-,7089
-,2146
df
Upper
Pair 1
ENTEROLERT
- BEAA
-,4617
,57146
-3,875
22
,001
Sig,
(2tailed)
Anlise de varincia a um factor para os meios de cultura S&B vs BEAA:
Oneway
Test of Homogeneity of Variances
SEB
Levene Statistic
3,927
BEAA
df1
df2
8,455
Sig,
43
85
,000
31
62
,000
ANOVA
Sum of
Squares
SEB
Between
Groups
Within
Groups
BEAA
Total
Between
Groups
Within
Groups
Total
df
Mean Square
73,520
43
1,710
2,107
85
,025
75,627
128
137,721
32
4,304
25,333
62
,409
163,055
94
Sig,
68,977
,000
10,533
,000
Teste de equivalncia entre os mtodos S&B e Enterolert segundo norma ISO

17994:2004:
Enterococos
n Amostra
1
1
2
2
3
3
4
4
5
5
6
6
7
7
8
8
9
9
10
10
11
11
12
12
13
13
14
14
15
15
16
16
17
17
18
18
19
19
20
20
21
21
22
22
23
23
24
24
25
25
26
26
27
27
28
28
29
29
30
30
31
31
32
32
33
33
34
34
35
35
36
36
37
37
38
38
39
39
40
40
41
41
42
42
43
43
44
44
45
45
46
46
S&B
520
51
36
34
300
124,6666667
24,66666667
192,6666667
10
39,33333333
57,66666667
72,66666667
500
766,6666667
900
1066,666667
833,3333333
350
466,6666667
600
266,6666667
270
100
140
866,6666667
2000
20
5033,333333
1666,666667
8333,333333
2533,333333
3700
2333,333333
2266,666667
4300
11333,33333
3866,666667
3200
1966,666667
3066,666667
60
166,6666667
1,154263332
120
1966,666667
2333,333333
ln S&B
Enterolert
6,253828812
1374
3,931825633
4360
3,583518938
10
3,526360525
0
5,703782475
5172
4,825643509
41
3,205452805
41
5,26096158
0
2,302585093
10
3,672072336
52
4,054679306
30
4,285882774
41
6,214608098
278
6,642052113
341
6,802394763
402
6,9722938
457
6,725433722
537
5,857933154
85
6,145615227
110
6,396929655
134
5,585999439
30
5,598421959
733
4,605170186
0
4,941642423
0
6,764654435
0
7,60090246
0
2,995732274
0
8,523837734
909
7,418580903
278
9,028018815
1100
7,837291238
705
8,216088099
359
7,755053139
638
7,726065602
573
8,366370302
2282
9,335503515
5794
8,260148088
1414
8,070906089
1071
7,584095341
529
8,028346474
2382
4,094344562
0
5,11599581
0
0,143462332
0
4,787491743
0
7,584095341
1460
7,755053139 2146,666667
ln NMP Enterolert
7,225481473
8,380227336
2,302585093
--8,55101474
3,713572067
3,713572067
--2,302585093
3,951243719
3,401197382
3,713572067
5,627621114
5,831882477
5,996452089
6,124683391
6,285998095
4,442651256
4,700480366
4,8978398
3,401197382
6,597145702
----------6,812345094
5,627621114
7,003065459
6,558197803
5,883322388
6,458338283
6,350885717
7,73280753
8,664578178
7,254177846
6,97634807
6,270988432
7,77569575
--------7,286191715
7,67167153
(lnEnterolert -lnS&B)100
97,16526612
444,8401704
-128,0933845
-355,5348061
284,7232265
-111,2071442
50,81192622
-526,6138468
0
27,91713828
-65,34819242
-57,23107074
-58,69869847
-81,0169636
-80,59426747
-84,76104092
-43,94356277
-141,5281898
-144,5134861
-149,9089855
-218,4802057
99,87237429
-461,5120517
-494,875989
-676,5807616
-760,1402335
-304,4522438
-171,149264
-179,0959789
-202,4953356
-127,9093435
-233,276571
-129,6714856
-137,5179886
-63,35627713
-67,09253366
-100,5970242
-109,4558018
-131,3106909
-25,26507245
-411,0873864
-512,1977881
-76,74488237
-479,5790546
-29,79036265
-8,338160894
Mdia
Desvio-Padro
Incerteza expandida
Limite inferior
Limite superior
(---) No aplicvel.
-155,1225223
225,2571146
66,42469923
-221,5472215
-88,69782307

Comparação Dos Métodos Aplicados Na Detecção de Bactérias

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UNIVERSIDADE DO ALGARVE

FACULDADE DE CINCIAS E TECNOLOGIA

Comparao dos mtodos aplicados na deteco de bactrias

Dissertao para obteno do grau de mestre em

Marta Sofia Mendes Valente Bernardo

Comparao dos mtodos aplicados na deteco de bactrias

Dissertao para obteno do grau de mestre em

Marta Sofia Mendes Valente Bernardo

Nome: Marta Sofia Mendes Valente Bernardo

Este trabalho da exclusiva responsabilidade da sua autora

Comparao dos mtodos aplicados na deteco

IRAR Instituto Regulador de guas e Resduos

Mestrado em Qualidade em Anlises

1.5.1. Mtodos analticos clssicos.......................................................................... 9

Comparao dos mtodos aplicados na deteco

1.6.2. Vantagens e desvantagens dos mtodos analticos enzimticos ................ 17

Mestrado em Qualidade em Anlises

3.4.3.2. DETERMINAO DE SALINIDADE ...................................................................... 45

4. RESULTADOS E DISCUSSO ............................................................................. 50

4.5. COMPARAO ENTRE O MTODO NORMALIZADO FILTRAO POR MEMBRANA E

4.5.1. Coliformes Totais......................................................................................... 59

4.6.1. Coliformes Totais......................................................................................... 66

Comparao dos mtodos aplicados na deteco

Mestrado em Qualidade em Anlises

Comparao dos mtodos aplicados na deteco

Mestrado em Qualidade em Anlises

1.1.1. Caracterizao das guas balneares

Mestrado em Qualidade em Anlises

estabelecidos para os parmetros microbiolgicos. Uma gua de classificao

1.1.1.2. Parmetros fsico-qumicos

Comparao dos mtodos aplicados na deteco

7 e pH 9) e ausncia de variaes inexplicveis (Directiva 2006/7/CE do Parlamento

1.2. Poluio das guas naturais

Mestrado em Qualidade em Anlises

por bactrias de origem fecal, em que o risco de doenas entricas associadas

1.3. Microrganismos patognicos transmitidos por via hdrica

Comparao dos mtodos aplicados na deteco

1.4. Microrganismos indicadores da qualidade da gua

Mestrado em Qualidade em Anlises

correlacionar-se com as do patognico e com o grau de poluio (Prescott, Harley &

1.4.1. A famlia Enterobacteriaceae

Comparao dos mtodos aplicados na deteco

subgrupo de bactrias do grupo coliformes totais que normalmente habitam o tracto

1.4.2. O gnero Enterococcus

Mestrado em Qualidade em Anlises

catalase negativos, com crescimento ptimo a (35-37)C, com capacidade de

1.5. Mtodos para deteco e enumerao de microrganismos indicadores em

1.5.1. Mtodos analticos clssicos

1.5.1.1. Tcnica de fermentao em tubos mltiplos

Comparao dos mtodos aplicados na deteco

1.5.1.2. Tcnica de filtrao por membrana

Mestrado em Qualidade em Anlises

1.5.2. Mtodos analticos enzimticos

1.5.2.1. Tcnica de presena / ausncia

Comparao dos mtodos aplicados na deteco

1.5.2.2. Tcnica de multi-tubos e multi-poos

1.5.3. Mtodos analticos moleculares

Mestrado em Qualidade em Anlises

espcie e subespcie. Podem mesmo ser identificados microrganismos que no seriam

1.5.3.1. Tcnica de deteco imunolgica

Comparao dos mtodos aplicados na deteco

1.5.3.2. Tcnica de amplificao de cidos nucleicos

1.5.3.2.1. Polymerase Chain Reaction

aproximadamente um milho. Consiste na repetio de ciclos de replicao cuja reaco