MANUAL PRCTICO DE MICROBIOLOGA - Tomo II: Microbiologa Ambiental II

Manacorda A. M., lvarez A. S., Pezzullo S. D. & Cuadros D. P.

Ao 2014

Captulo 1
DETERMINACIN DE MICROORGANISMOS DEL AIRE
Objetivo

Poner en evidencia la presencia de los microorganismos existentes en el aire y su

relacin con su ubicacin transitoria en superficies de materiales y del cuerpo.

Introduccin
Los microorganismos se encuentran presentes en todos los ambientes: en el aire, en el agua,
en el suelo, en la superficie de los objetos e incluso sobre nuestra piel.
El aire, adems de partculas en suspensin, es portador de bacterias en forma vegetativa o
esporuladas, esporas de hongos, virus, entre otros. La poblacin microbiana del aire est
compuesta principalmente por bacterias y esporas de hongos.
El estudio de los microorganismos del aire no ha evidenciado la existencia de una verdadera
comunidad area, en el sentido de una poblacin de microorganismos que viven y se
reproducen en este medio. Los microorganismos que se identifican en el aire provienen de
ambientes terrestres, acuticos o de otros organismos vivos.
El hombre en estado sano, desde el momento de su nacimiento y a lo largo de toda su vida
aloja miles de especies de bacterias en diferentes sitios de su organismo, entre ellos: la piel,
mucosas, boca y saliva. Las bacterias ms frecuentes de estos sitios son cocos gram positivos,
como ser: Staphylococcus aureus y Staphylococcus epidermis, Streptococcus hemolticos y
Streptococcus hemolticos. Al hablar, toser o tocar objetos, los microorganismos que forman
parte de la flora de una persona pueden pasar a otro ambiente usando como va de transporte
el aire. Tambin puede ocurrir el mecanismo en sentido inverso, inhalar aire o tocar superficies
contaminadas con microorganismos.
El concepto higiene est vinculado con las condiciones que debe tener un ambiente para evitar
que ste contenga factores que afecten la salud de las personas. La falta de limpieza y
desinfeccin en un determinado sitio, por ejemplo en la produccin de alimentos, puede aportar
gran cantidad de bacterias, como tambin la falta de higiene personal de los manipuladores
puede ocasionar la contaminacin de los alimentos con microorganismos, capaces de producir
intoxicaciones e infecciones a travs de los alimentos.
Por todo ello, la correcta higiene personal, el lavado cuidadoso de las manos despus de la
utilizacin de los servicios y antes de ingerir alimentos o procesarlos, taparse la boca al toser o
estornudar, no generar polvillo al barrer, son algunas precauciones que sirven para evitar la
presencia y concentracin de microorganismo en el aire de ambientes cerrados, y como
consecuencia disminuir las probabilidades de transmisin de enfermedades.
Tcnicas para el anlisis microbiolgico del aire
Existen distintos mtodos para el anlisis del aire: sedimentacin, filtracin, choque en lquidos
y precipitacin electrosttica, entre otros.
El mtodo de sedimentacin es uno de los ms sencillos para la determinacin de
microorganismos del aire. A pesar de ello, los resultados obtenidos son orientativos de las
cifras de microorganismos presentes en el aire, ya que estos niveles varan en funcin de las
corrientes de aire y del tamao de las partculas en suspensin.
Tambin existen distintos mtodos para el examen microbiolgico de superficies planas y no
planas, probablemente contaminadas.

Captulo 1.- Determinacin de Microorganismos del Aire

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Procedimientos
1.

Anlisis de esporas de hongos y bacterias por sedimentacin

En este estudio se determinar la presencia de hongos y bacterias en el aire de sitios de

ambientes cerrados y abiertos. El anlisis se realizar en dos tiempos de sedimentacin
diferentes, 30 minutos y una hora, a fin de evaluar el volumen de sedimentacin de inculo en
un tiempo frente a otro.
Para la determinacin de hongos se utilizar un medio selectivo para el desarrollo de los
mismos, el agar Saboureau Glucosado. Mientras que para la determinacin de bacterias se
utilizar agar Nutritivo, ya que es un medio completo, sin inhibidores, que permite el crecimiento
de microorganismos poco exigenetes en sus requerimientos nutricionales.
El agar Sabouraud Glucosado es un medio de cultivo usado para el aislamiento, identificacin
y conservacin de hongos patgenos y saprofitos. Es un medio de cultivo recomendado para
el cultivo y desarrollo de hongos, particularmente los asociados con infecciones cutneas
(piel, pelo, etc). El bajo pH favorece el crecimiento de hongos sobre bacterias.
Agar Saboureau Glucosado
Pluripeptona
Glucosa
Agar
Agua destilada c.s.p
pH final: 5,6 0,2

10 gr
40 gr
15 gr
1000 ml

Agar Nutritivo
Pluripeptona
Extracto de carne
Cloruro de sodio
Agar
Agua destilada c.s.p
pH final: 7,3 0,2

5 gr
3 gr
8 gr
15 gr
1000 ml

Preparar placas con agar Saboureau Glucosado y agar Nutritivo. La cantidad de placas
con cada medio de cultivo deber ser el doble de los sitios que se requieran analizar, ya
que en cada uno se analizarn dos tiempos.
Destapar las placas con agar Sabouraud Glucosado y con agar Nutritivo, en un lugar
cuyo nivel de contaminacin se desee examinar. Dejarlas destapadas durante diferentes
intervalos de tiempo: 30 minutos y 1 hora.
Transcurrido el tiempo, tapar las placas e incubar durante 24-48 horas a 20 C.
Observar el desarrollo de colonias.

Interpretacin de los resultados:

Clasificar las placas de acuerdo al sitio de estudio, tiempo de sedimentacin y medio de cultivo.
Observar las colonias, y sus caractersticas, que desarrollan en cada medio de cultivo. Analizar
si existen correlacin entre los tiempos de sedimentacin y la cantidad de colonias
desarrolladas, como as tambin la diferencia de cantidad y tipo de colonias sedimentadas en
ambientes cerrados y abiertos.
2.

Anlisis de superficies planas por medio de placas de contacto

Para este estudio se utilizan placas de Petri especiales, llamadas placas RODAC (Replicate
Organisms Direct Agar Contac), segn APHA,1992. Son placas de 6 cm de dimetro, con una
superficie de 25 cm2, tienen grabado en la tapa una cuadrcula para favorecer el recuento de

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colonias (Fig. 1.1). El medio de cultivo a utilizar es agar Nutritivo y se usa adherido a la placa
en forma de sello, para poder apoyar el medio sobre la superficie plana a analizar.

Preparar las placas RODAC con agar Nutritivo. asegurndose que quede la superficie
elevada del borde y pueda funcionar como sello. El medio de cultivo una vez fundido y a
temperatura cercana a la de solidificar (45 C), se vierte en las placas de manera que
sobresalga del borde de la misma, sin volcar y que pueda funcionar como sello, para
facilitar el contacto con la superficie a examinar. Dejar enfriar.
Presionar suavemente la placa sobre la superficie elegida, asegurndose el contacto
de esta con el agar.
Incubar las placas durante 24-48 hs. a 20 C.
Contar las colonias presentes en la placa.

Interpretacin de los resultados:

Cada clula microbiana viable es capaz de originar una colonia macroscpica que ser
utilizada para realizar el recuento, por ello se las denomina Unidades Formadoras de Colonias
(UFC). Los cuadrantes facilitan el conteo. La placa tiene una superficie de 25 cm 2, por lo tanto
se deber realizar la conversin adecuada para expresar el resultado final como UFC/cm 2.
El principal inconveniente de este mtodo es su ineficacia en superficies muy contaminadas y
la posibilidad de no obtener todos los microorganismos presentes en la superficie. Sin
embargo, en los casos en los que la carga microbiana es baja da buenos resultados.

Fig. 1.1: Placa RODAC (Replicate Organisms Direct Agar Contac)

3.

Anlisis de superficies no planas: mtodo del hisopo

Este sistema es el ms antiguo y el ms utilizado en el examen microbiolgico de superficies,

ya que sirve para el anlisis tanto de superficies planas como de no planas.

Delimitar la superficie que se va a analizar mediante una plantilla de papel aluminio

estril con una abertura de dimensin de 9 cm 2.
Humedecer el hisopo estril en 10 ml de solucin salina estril y frotar varias veces
sobre la superficie delimitada con la plantilla.
Introducir de nuevo el hisopo en la solucin salina y dejar durante 15 - 30 minutos de
manera que los microorganismos se liberen del algodn al medio lquido.
Sembrar 0,1 ml de dicha solucin a una placa de Petri con agar Nutritivo, por extensin
en superficie.
Incubar durante 24-48 hs. a 20 C.
Observar y contar las colonias formadas.

Interpretacin de los resultados:

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La cantidad de colonias observadas corresponde a una superficie de 9 cm 2. El nmero hallado

deber ser expresado como UFC/cm2, por lo tanto deber realizarse la conversin adecuada.
4.

Anlisis de manipuladores

El objetivo de un anlisis a manipuladores es comprobar que la persona est en condiciones de

higiene adecuadas para no contaminar los alimentos durante su manipulacin.
Para este anlisis se utilizaran diferentes medios de cultivo selectivos, dado que hay diferentes
gneros bacterianos relacionados a enfermedades transmitidas por los alimentos. Si bien
pertenecen al grupo de las bacterias mesfilas totales, tienen la caracterstica de ser patgenas
para el hombre.
4.1 Para anlisis de enterobacterias
El agar Violeta Rojo Bilis Glucosa (VRBG) es un medio selectivo para el estudio de
entereobacterias totales en alimentos. La presencia de violeta cristal y las sales biliares
inhiben la flora acompaante. Las enterobacterias fermentan la glucosa con la consiguiente
formacin de cido haciendo virar el medio a rojo y eventualmente la precipitacin de cidos
biliares alrededor de la colonia.
Agar Violeta Rojo Bilis Glucosa (VRBG)
Peptona de carne
7,0 gr
Extracto de levadura
3,0 gr
Cloruro de sodio
5,0 gr
Glucosa
10,0 gr
Mezcla de sales biliares
1,5 gr
Rojo Neutro
0,03 gr
Violeta cristal
0,002 gr
Agar
15,0 gr
Agua destilada c.s.p
1000 ml
pH final: 7,3 0,1
Una vez mezclados los ingredientes se deja
reposar 5 minutos y calentar a ebullicin de 1 a 2
minutos. Enfriar a 45 C y verter en placas. Una
vez preparado debe usarse de inmediato. No
autoclavar.

Contar con placas estriles. Preparar una placa por cada superficie a evaluar.
Humedecer el hisopo estril en 10 ml de solucin salina estril y frotar la superficie a
analizar (manos, uas, lastimaduras, etc).
Introducir de nuevo el hisopo en la solucin salina y dejar durante 15 - 30 minutos de
manera que los microorganismos se liberen del algodn al medio lquido.
Introducir una alcuota de 1 ml de dicha solucin en una placa de Petri.
Aadir 15 ml del medio a 47 C y homogeneizar el medio con el inculo realizando
movimientos circulares.
Una vez solidificado el material cubrir nuevamente con 10 ml del mismo medio y dejar
solidificar.
Incubar las placas en estufa a 35 C durante 72 hs.
Observar el crecimiento de colonias en los diferentes medios de cultivo.

Interpretacin de los resultados:

La caracterizacin de las colonias tpicas de enterobacterias confirmara la presencia de dichos
organismos en la superficie de los manipuladores.
Los microorganismos que desarrollan en el agar VRBG sern gram negativos, dado que la
presencia de violeta cristal y las sales biliares inhiben la flora acompaante. Las
enterobacterias fermentan la glucosa con la consiguiente formacin de cido haciendo virar el
medio a rojo, y eventualmente, la precipitacin de cidos biliares alrededor de la colonia. Para

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estimular dicha fermentacin de la glucosa y suprimir el crecimiento de las bacterias gram

negativas no fermentadoras durante la siembra se le agreg una segunda capa de medio. Las
colonias de Escherichia coli y Salmonella spp. tienen un crecimiento bueno en este medio y sus
colonias son rojas.
4.2 Para anlisis de estafilococos
El agar Manitol Salado es un medio de cultivo selectivo recomendado para el aislamiento de
estafilococos presuntamente patgenos a partir de alimentos. Su selectividad se basa en su
alta concentracin salina. Los estafilococos coagulasa positiva hidrolizan el manitol
acidificando el medio; las colonias aparecen rodeadas de una zona amarilla brillante. Los
estafilococos coagulasa negativos, presentan colonias rodeadas de una zona roja o prpura.
Agar Manitol Salado
Extracto de carne
Pluripeptona
D-manitol
Cloruro de sodio
Agar
Rojo fenol
Agua destilada c.s.p
pH final: 7,4 0,2

1,0 gr
10,0 gr
10,0 gr
75,0 gr
15,0 gr
0,025 gr
1000 ml

Preparar las placas de Petri con agar Manitol Salado. Contar con una placa por cada
superficie a evaluar.
Humedecer el hisopo estril en 10 ml de solucin salina estril y frotar la superficie a
analizar (manos, uas, lastimaduras, etc).
Introducir de nuevo el hisopo en la solucin salina y dejar durante 15 - 30 minutos de
manera que los microorganismos se liberen del algodn al medio lquido.
Tomar un inculo de 0,1 ml de la solucin con la dilucin de los microorganismos, y
realizar una extensin en superficie.
Incubar las placas en estufa a 35 C durante 72 hs.
Observar el crecimiento de colonias en los diferentes medios de cultivo.

Interpretacin de los resultados:

La caracterizacin de las colonias tpicas de estafilococos confirmara la presencia de dichos
organismos en la superficie de los manipuladores.
Las colonias que desarrollan en agar Manitol Salado
que son caractersticas de
Staphilococcus aureus tienen un crecimiento excelente en el medio formando colonias
amarillas. Vibrio parahemolyticus, una especie halfita de este gnero, est relacionada con
contaminacin de alimentos, y tambin tiene excelente desarrollo originando una colonia
amarilla. Por lo tanto, las colonias sospechosas, se repicarn en un medio sin exceso de
cloruro de sodio para efectuarles posteriormente, la prueba de la coagulasa (S.aureus es
coagulasa positivo) o una coloracin de Gram (S.aureus es gram positivo y V. parahemolyticus
es gram negativo). En agar Manito Salado Staphilococcus epidermidis tienen un crecimiento
escaso a bueno y su colonia presenta un color rojo.
Bibliografa
American Public Health Association (APHA), American Water Works Association & Water
Pollution Control Federation. 1992. Standard Methods for the examination of Water and
Wastewater. 16 ed. Washington, D.C.USA.
Daz, R.,Gamazo C., Lpez-Goi, I. 1999. Manual Prctico de Microbiologa. Cap. 32: Cultivos
de microorganismos del ambiente. 2 Ed. Editorial Masson S.A. Barcelona, Espaa. 151 pp.
Ranken, M. D. 1993. Manual de Industrias de los Alimentos.2 Ed. Editorial Acribia. Zaragoza,
Espaa, 672 pp.

Captulo 1.- Determinacin de Microorganismos del Aire