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Universidad Autnoma del Estado de Mxico

Facultad de Qumica
Qumico Farmacutico Bilogo
Inmunologa General
Resumen de tcnicas inmunolgicas
TCNICAS UTILIZADAS EN INMUNOLOGA
TCNICA DE PRECIPITACIN
El complejo Ag-Ac precipita espontneamente o por centrifugacin cuando la
proporcin de Ags y Acs de la mezcla es equivalente. La precipitacin es mxima
all donde la proporcin entre ambos es ptima (parte central de la curva), pero va
disminuyendo a medida que predomine el Ac o el Ag (izquierda y derecha de la
curva respectivamente). Este tipo de reaccin no es muy utilizado al requerirse
grandes concentraciones de antgeno y de anticuerpo para poder medir el
precipitado formado.

TCNICA DE DIFUSIN RADIAL DOBLE DE OUCHTERLONY


Esta tcnica se realiza en placas de agar en donde se practican pocillos. En uno
de estos pozos se coloca el suero o muestras a investigar y en el resto se coloca
el anticuerpo preparado frente a la sustancia que se quiere identificar. Cuando
difunden, ambos sistemas se encontrarn y se formar en la zona de equivalencia

el complejo Ag-Ac correspondiente que se hace visible en forma de una lnea de


precipitacin. En una preparacin que contenga varios antgenos, se obtendrn
mltiples lneas de precipitado.
La tcnica de Ouchterlony permite identificar sustancias segn la forma de unirse
las lneas de precipitacin de dos o varios sistemas.

TCNICA DE INMUNOELECTROFORESIS
Es una tcnica que se realiza en dos fases. Primero se separa la mezcla de Ags
por electroforesis y posteriormente el antgeno que se desea detectar se hace
reaccionar con un anticuerpo especfico colocado en un pocillo lateral. Por difusin
llegan a encontrarse los antgenos y el antisuero, apareciendo el complejo Ag-Ac
visible en forma de lneas de precipitacin que pueden ser estudiadas por
comparacin con un sistema estndar. En Inmunologa clnica, esta tcnica puede
utilizarse en la identificacin de las protenas de mieloma.

TCNICA DE DIFUSIN RADIAL SIMPLE DE MANCINI

Esta tcnica se basa en la difusin de un antgeno colocado en un pocillo en un


gel de agarosa que lleva incorporado un anticuerpo especfico. Este anillo de
precipitacin es fcilmente visible y las concentraciones antignicas estn en
relacin directa con el rea del crculo de precipitacin. Al difundir el antgeno se
genera un gradiente de concentracin desde el pocillo donde se ha colocado.
Cuando la concentracin del antgeno es la adecuada (zona de equivalencia) el
inmunocomplejo se insolubiliza y se forma un anillo de precipitacin.

TCNICAS DE AGLUTINACIN
En estas tcnicas se hacen visibles los complejos Ag-Ac por la aglutinacin que
producen los anticuerpos cuando el Ag forma parte o se ha unido artificialmente a
la superficie de eritrocitos, plaquetas, leucocitos, partculas de ltex, etc.
Normalmente se utilizan eritrocitos (hemaglutinacin) o partculas de ltex.
Hemaglutinacin directa: La presencia de antgenos en la superficie de eritrocitos
se puede detectar por la hemaglutinacin producida cuando se aade un antisuero
con anticuerpos frente a dichos antgenos.
Esta tcnica se emplea habitualmente para la identificacin de los grupos
sanguneos y Rh, para lo cual a la sangre heparinizada se le aaden los
antisueros correspondientes: anti- A, anti-B o anti-AB (todos ellos anti-Rh
negativos). Habr aglutinacin cuando los eritrocitos posean la especificidad del
antisuero aadido. De igual manera se procede con antisueros anti-Rh para la
determinacin de los distintos grupos Rh.
Hemaglutinacin indirecta: Se basa en el principio de la inhibicin de la
hemaglutinacin. Para su realizacin se precisan eritrocitos a los cuales se les ha
unido la misma sustancia que se desea detectar o cuantificar. Si estos eritrocitos
son puestos en presencia de anticuerpos preparados frente a dicha sustancia se
producir su aglutinacin. Por el contrario, cuando se aade un suero problema
que contiene la sustancia a cuantificar entonces los anticuerpos se unirn a dicha

sustancia y no a los eritrocitos. En este caso no se producir la hemaglutinacin.


Por tanto, aglutinacin (+) indica ausencia de la sustancia a estudiar, y
aglutinacin (-) indica presencia de la misma. El diagnstico de embarazo puede
realizarse por esta tcnica.

TCNICAS DE INMUNOFLUORESCENCIA
La fluorescencia es una propiedad de ciertas molculas que, al ser irradiadas con
energa electromagntica de longitud de onda adecuada, emiten radiacin de
longitud de onda caracterstica permitiendo su cuantificacin.
La inmunofluorescencia se utiliza esencialmente en la deteccin de
autoanticuerpos y anticuerpos contra antgenos de superficie de clulas y tejidos.
Para ello se emplean anticuerpos preparados frente a la protena que se desea
detectar marcados con molculas fluorescentes. Se aprecia si hubo unin del
anticuerpo con el antgeno por la fluorescencia emitida, que se observa bajo
microscopio de luz ultravioleta. Este procedimiento (Inmunofluorescencia directa)
tiene la limitacin del marcaje con un fluorocromo de cada uno de los anticuerpos
necesarios para cada una de las sustancias a investigar. Para evitar esto, lo que
se hace es tratar el tejido o clulas con antisueros anti-antgeno producidos, por
ejemplo, en conejo y secundariamente anti-inmunoglobulinas marcadas con un
fluorocromo (Inmunofluorescencia indirecta).

CITOMETRIA DE FLUJO
Actualmente el anlisis de una suspensin de clulas vivas marcadas con un
fluorocromo se realiza mediante un citmetro de flujo. La suspensin celular se
hace circular en forma de gotas microscpicas. Las clulas pasan por un campo
de deteccin atravesado por un potente rayo lser que produce la dispersin de la
luz y la activacin de la fluorescencia. Mediante sensores especficos se analizan
y cuantifican las poblaciones en estudio en funcin de sus propiedades
fisicoqumicas y del marcaje efectuado. Para la separacin celular este aparato
lleva acoplado un sistema que carga elctricamente las clulas y con placas
deflectoras se realiza su separacin. Adems de basarse en la deteccin de la
fluorescencia emitida por las clulas marcadas, tambin lo hace en otras
propiedades diferenciales de las clulas en estudio como tamao (FSC),
complejidad (SSC), etc.
La puesta a punto de las tcnicas de citofluorometra, en las que se conjugan los
avances de informtica, rayos lser y anticuerpos monoclonales permite el anlisis
fenotpico y funcional de las clulas T, B y de todas aquellas clulas de las que se
disponga de un antisuero que las identifique.
Marcadores de linfocitos B. Para cuantificar los linfocitos B totales se utiliza el
marcador CD19. Por otro lado, en los linfocitos B activados se pierde la expresin
de las molculas CD21, CD22 y CD24, hay un incremento en la expresin de
molculas HLA-DR y de receptores de linfocinas (por ejemplo el receptor de la IL2) y aparecen marcadores nuevos, como el CD23, ausente en linfocitos B en
reposo.
Marcadores de linfocitos T. En este caso se utilizan los marcadores CD3, CD4 y
CD8 presentes de forma especfica en linfocitos T totales y en la subpoblaciones
de clulas T de colaboracin y citotxicas/supresoras respectivamente. En el

proceso de activacin celular T se expresan nuevas molculas de superficie, son


principalmente receptores para factores de crecimiento y proliferacin celular.

TECNICA DE RADIOINMUNOENSAYO
Se basa en la competencia que se establece, para unirse a anticuerpos
especficos, entre la sustancia a cuantificar y cantidades conocidas de la misma
sustancia marcada con un istopo. Al establecerse esta competicin resulta que a
mayor cantidad de sustancia a cuantificar, menor ser la cantidad de sustancia
radiactiva que se une al anticuerpo y viceversa.
La tcnica del radioinmunoensayo posee algunos inconvenientes que derivan de
la necesidad de utilizar istopos. Adems de su peligrosidad y la obligatoriedad de
disponer de instalaciones adecuadas para su utilizacin, existen istopos que
tienen el inconveniente de su pronta caducidad.

TECNICA DE ENZIMOINMUNOENSAYO.
Esta tcnica, tambin se conoce como test de ELISA (Enzyme-Linked
Immunosorbent Assay). La identificacin de los complejos Ag-Ac, se hace
mediante el empleo de enzimas, bien unidas al antgeno, o bien unidas al
anticuerpo. El test de ELISA puede ser directo o no competitivo, constando de los
siguientes pasos:
a) Se tapiza la placa con el anticuerpo especfico frente al antgeno a determinar.
b) Se aade la muestra con el antgeno.
c) Se adiciona el anticuerpo secundario marcado con la enzima que en presencia
de su sustrato da un producto coloreado soluble, este producto es cuantificado
mediante el lector de ELISA e indirecto o competitivo, se diferencia del caso
anterior en que se aaden los anticuerpos, previamente incubados con la muestra,
los anticuerpos que no se han unido a los antgenos de la muestra lo harn a los
antgenos de los pocillos. Como enzimas se suelen utilizar la peroxidasa, la
galactosidasa o la glucosa oxidasa.
Esta tcnica se utiliza para la medida de hormonas, antgenos de la hepatitis y
otras muchas sustancias que se encuentran a muy bajas concentraciones.

TCNICAS NEFELOMTRICAS
Estas tcnicas se basan en la deteccin de los complejos Ag-Ac, por la refraccin
que dichos complejos producen sobre rayos de luz que se hacen pasar por el tubo
con el antgeno y el anticuerpo correspondiente. Habitualmente se utilizan rayos
lser y se establece una relacin entre la cantidad de luz que llega y la cantidad de
complejos formados. Este procedimiento es rpido y sensible y se est utilizando
en la actualidad, sobre todo, para la cuantificacin de protenas en suero y en
otros lquidos biolgicos.

INMUNOPRECIPITACION E INMUNOBLOTTING
La inmunoprecipitacin es una de las tcnicas inmunolgicas ms tiles cuando se
asocia a electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida. De este modo se pueden
determinar la presencia y cantidad de un antgeno, el peso molecular relativo de
una cadena polipeptdica, su sntesis y degradacin, la interaccin con protenas,
cidos nucleicos u otros ligandos. La tcnica de inmunoprecipitacin se divide en
cuatro pasos:
1.
2.
3.
4.

Marcaje del antgeno (opcional)


Lisis de las clulas para liberar el Ag
Formacin del complejo Ag-Ac
Purificacin de los inmunocomplejos

En la mayora de los casos el antgeno se marca incubndolo con un precursor


radiactivo aunque muchos antgenos se pueden detectar por medios que no
requieren marcaje directo. El antgeno se extrae de las clulas mediante lisis.
Despus, los anticuerpos se aaden al lisado y se forman los inmunocomplejos
Ag-Ac. Estos se unen por adsorcin a una fase slida que contiene protena A.
Los inmunocomplejos se analizan generalmente por electroforesis en gel pero
tambin pueden ser usados en diferentes tcnicas incluyendo estudios
enzimticos, unin a ligandos, inmunizaciones, inmunoblotting, etc.
Una de estas tcnicas es el Western blot que combina la resolucin de la
electroforesis en gel con la especificidad de la deteccin inmunoqumica. Se utiliza
para determinar la presencia y cantidad de antgenos y de anticuerpos especficos.
En la actualidad es el test confirmatorio ms empleado para el diagnstico del
SIDA. Se emplean antgenos virales obtenidos por cultivo celular. Mediante
electroforesis se separan las diferentes protenas vricas por su diferente peso
molecular. Posteriormente se transfieren a papel de nitrocelulosa y
secundariamente se incuban con el suero problema. Los anticuerpos se detectan
aadiendo una anti-IgG humana marcada con una enzima (peroxidasa) que
produce una banda coloreada al aadir un sustrato. Esta tcnica identifica
anticuerpos especficos frente a las distintas protenas del VIH.
TCNICAS DE BIOLOGA MOLECULAR
Una de las ms utilizadas es la Southern Blot. Esta tcnica consiste en la
separacin de fragmentos de DNA previamente obtenidos por digestin con
enzimas de restriccin. La separacin se hace mediante electroforesis y despus
este DNA es transferido a membranas de nylon o nitrocelulosa (blot). Despus,

para la identificacin de la banda que interesa se realiza un proceso llamado


hibrizacin, en el que la membrana es "incubada" con un fragmento de DNA
complementario al gen de inters (sonda) previamente marcada, generalmente
con un istopo, lo que permite posteriormente visualizar mediante autoradiografa
la banda en la cual se ha producido unin.

REACCIN DE ARTHUS
La Reaccin de Arthus es una reaccin localizada que se define como un rea
localizada de necrosis tisular debida a una vasculitis aguda por inmunocomplejos.
Experimentalmente se produce mediante la inyeccin intracutnea de un Ag en un
animal hiperinmunizado que contiene Ac circulantes contra ese Ag. De esta forma
se producen grandes inmnocomplejos que se depositan y provocan reaccin
inflamatoria local al cabo de algunas horas con una mxima intensidad a las 4 a
10 horas. Se forma un rea de edema con intensa hemorragia y a veces
ulceracin.

Referencia:
1. Christodoulides N, Mohanty S, Miller CS, Langub MC, Floriano PN, Dharshan
P, Ali MF, Bernard B, Romanovicz D, Anslyn E, Fox PC, McDevitt JT. Application
of microchip assay system for the measurement of C-reactive protein in human
saliva. Lab Chip. 2005, 5: 261-9.
2. Morikis D, Lambris JD. Physical methods for structure, dynamics and binding in
immunological research. Trends Immunol. 2004, 25: 700-7.
3. Drake AW, Myszka DG, Klakamp SL. Characterizing high-affinity
antigen/antibody complexes by kinetic- and equilibrium-based methods. Anal
Biochem. 2004, 328: 35-43.
4. De Souza S, Bonon SH, Costa SC, Rossi CL. Evaluation of an in-house specific
immunoglobulin G (IgG) avidity ELISA for distinguishing recent primary from longterm human cytomegalovirus (HCMV) infection. Rev Inst Med Trop Sao Paulo.
2003, 45: 323-6.
5. Reaccin de Arthus. Revista de Posgrado de la VIa Ctedra de Medicina, N
167Marzo 2007; en http://med.unne.edu.ar/revista/revista167/3_167.pdf revisado
el 9 de mayo de 2012.