BIOTECNOLOGA

BIOTECNOLOGA
SISTEMAS DE CULTIVO

Ing. Jos M. Reynoso

Sistemas de cultivo

BIOTECNOLOGA

Para un componente cualquiera del cultivo, incluida la

biomasa, se puede plantear el siguiente balance de materia
en el biorreactor
Acumulacin = Ingreso Salida + Formacin Consumo

(1)
donde V es el volumen de cultivo, F1 el caudal de
alimentacin, F2 el de salida, Ci1 la concentracin del
componente i en la alimentacin y C la concentracin en
el caudal de salida, la que, si el cultivo est bien
mezclado, se puede asumir idntica a la que hay en el
biorreactor. Los restantes trminos rfi y rci se refieren a la
velocidad de formacin y consumo del componente i,
respectivamente.

Sistemas de cultivo

BIOTECNOLOGA

Por otra parte, el volumen de cultivo variar en el tiempo,

segn sean F1 y F2.

Suponiendo que la densidad del cultivo y de la alimentacin

son iguales, resulta:
(2)

De acuerdo a como son F1 y F2, puede haber, bsicamente

tres sistemas de cultivo

BIOTECNOLOGA

Cultivo continuo
Permite controlar el proceso a un valor de velocidad especfica de
crecimiento () prefijado de manera muy simple. Este punto es de suma
importancia ya que el comportamiento de la mayora de los microorganismos
se ve afectado por el valor de al que estn creciendo. Por ejemplo, es
comn que a altos valores (cercanos a m) formen diversos productos, siendo
la naturaleza de estos dependiente del microorganismo, mientras que a bajos
valores de no los formen.
Mediante el cultivo continuo es posible estudiar el efecto sobre el proceso de
variables como pH, temperatura, concentracin de nutrientes, etc.,
manteniendo constante el valor de , o bien, fijadas las anteriores, analizar el
efecto de sobre el proceso. De este modo es posible separar los distintos
efectos y obtener informacin valiosa para la mejora del proceso.

BIOTECNOLOGA

Cultivo continuo
Para poner en marcha un cultivo continuo,
se realiza previamente un cultivo batch y
en un momento dado, normalmente
cuando se agota el substrato limitante, se
comienza a alimentar el biorreactor con
medio de cultivo fresco a un caudal F

Mediante un rebalse se logra que el volumen del cultivo permanezca

constante. El caudal de salida contendr clulas, mientras que la
concentracin de nutrientes ser menor que en el caudal de entrada
debido a que en parte fueron consumidos por los microorganismos.
Eventualmente se encontrar tambin algn producto(s) proveniente de
la actividad metablica de los microorganismos.

BIOTECNOLOGA

Cultivo continuo

Cultivo continuo

BIOTECNOLOGA

1 Cultivo continuo
Ambos caudales son iguales y de acuerdo a la ec. (2), V ese
constante por lo que la ec (1), se reduce a:

(3)

Cultivo continuo

BIOTECNOLOGA

En el estado estacionario, las concentraciones dentro del

biorreactor permanecern constantes en el tiempo
se igualan a 0, las ecs (7), (8) y (9)
(7)

Teniendo en cuenta
que rx = X

(8)

(9)

(10)
D = velocidad de dilucin

Cultivo continuo

BIOTECNOLOGA

F
D
V

Teniendo en cuenta las unidades usuales de F (L. h -1)

y de V (L), las de D sern de h-1

El valor de D corresponde a las veces que se renueva el volumen del

biorreactor por unidad de tiempo, as un valor de D= 0.25 h-1 indica que en
una hora se renov un 25 % del volumen de cultivo, o bien que al cabo de 16
hs. se habr renovado cuatro veces el volumen de cultivo. Podra pensarse
que a estas alturas prcticamente ya no quedan microorganismos dentro del
biorreactor, pero no es as; debe tenerse en cuenta que estos se estn
multiplicando activamente lo cual compensa las perdidas debidas a los
microorganismos que son arrastrados fuera del biorreactor por el caudal de
salida. Bajo ciertas condiciones, que analizaremos mas adelante, ambos
procesos se compensan de modo tal que la concentracin de
microorganismos se mantiene constante en el tiempo, es decir que se habr
alcanzado un estado estacionario. En estas condiciones tambin se
mantendrn constantes en el tiempo las concentraciones de nutrientes, en
particular la del substrato limitante del crecimiento, y la de producto(s).D

Cultivo continuo

BIOTECNOLOGA

Para poner en marcha un cultivo continuo se realiza previamente

uno batch y en un momento dado se comienza a alimentar con
medio fresco con un caudal F y por un rebalse se mantiene el
volumen constante.
El caudal de salida contendr clulas, medio de cultivo
parcialmente agotado y, eventualmente, algn producto. Si
alimentamos con medio fresco y estril significa que X1=0 y P1=0,
por lo que slo debemos considerar la concentracin de
substrato limitante del crecimiento, S1, en la alimentacin.

(7)
(8)
(9)

Balances de
masa para
X, S y P
X = biomasa
S = subs limitante
P = producto

BIOTECNOLOGA

Cultivo continuo

La Fig. 16 muestra como varan la concentracin de sustrato en estado estacionario

en funcin de la velocidad de dilucin. La curva superior corresponde a la ecuacin
(13) y la inferior a la ecuacin (14), pudindose observar en este ltimo caso que el
efecto del mantenimiento celular se hace notable a bajas velocidades de dilucin.
En ambos casos puede apreciarse que existe un valor de D por encima del cual es X
= 0, con lo cual por la ecuacin (13) o (14) es S = S1 . Si se reemplaza este valor en la
ecuacin (11) se obtiene la velocidad de dilucin crtica Dc .

Cultivo continuo

BIOTECNOLOGA

Teniendo en cuenta que:

nos encontramos con que la concentracin de S en el estado
estacionario es :
(11)
De la ec (8) surge
que:

ec (12)

, pero adems sabemos

Cultivo continuo

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Por lo que la concentracin de la biomasa en estado

estacionario es:

(13)

Si en particular S es la fuente de carbono y energa,

donde
ms es el coeficiente de mantenimiento e
es el rendimiento
que se obtendra si el mantenimiento fuera nulo.
Entonces

(14)

es igual a:
Si ms =0, la ec
(14) se reduce a
la (13).

BIOTECNOLOGA

Cultivo continuo

Si como ocurre normalmente Sl Ks se tiene que Dc = m, lo cual es

un criterio muy til en el momento de seleccionar un valor de D
apropiado, ya que deber cumplirse que D <m. En caso
contrario ocurrir el "lavado" del cultivo, debido a que la
velocidad de salida de las clulas del biorreactor ser mayor que
la de crecimiento.
Debe tenerse en cuenta que la Fig. 16 se representa en caso que
est dado por la ecuacin de Monod, pero si en medio del
cultivo hay sustancias inhibidoras del crecimiento (o son formados
por microorganismos) o el sustrato limitante es el inhibidor,
debern emplearse las expresiones de correspondientes a la
presencia de este inhibidor

Cultivo continuo Estado estacionario

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En estado estacionario es = D, la pregunta que surge inmediatamente

es: cuanto tiempo demora el sistema en alcanzar este estado?.

El criterio prctico que se suele seguir es que, una vez fijado el valor de
D, debe esperarse al menos 4.tR, donde tR se conoce como tiempo de
retencin medio y puede demostrarse que :
tR = 1 / D
Por tanto si se fija un valor de D= 0.15 h-1, habr que esperar 26,7 hs.
para suponer que se ha alcanzado el estado estacionario, lo que deber
ser corroborado experimentalmente midiendo las concentraciones de X,
S, P hasta observar que no varan con el tiempo.
Usualmente con 4.tR es suficiente.

BIOTECNOLOGA

Batch alimentado
En algunos procesos industriales, tales como la produccin de levaduras
para panadera y antibiticos, el reactor puede operarse de manera
semicontinua, con una corriente de entrada de alimentacin pero sin una
corriente de salida ; este tipo de operacin permite que la concentracin
de sustrato se pueda mantener en algn valor predeterminado

El sustrato se va aadiendo a medida que se va consumiendo y se

mantiene su concentracin en valores que permitan alcanzar velocidades
de reaccin aceptables, buscando un equilibrio entre el aumento de
velocidad por incremento de concentracin de nutrientes y disminucin
causada por la inhibicin del producto.
La adicin del sustrato puede efectuarse en forma cclica o en continuo.
Se alimenta continuamente medio nutritivo fresco o alguno de sus
componentes. Si el nutriente que se alimenta es el limitante del
crecimiento, esta tcnica permite controlar la velocidad de crecimiento ()
del microorganismo.

Batch alimentado
Vo, Xo y So son las condiciones
finales de dicho batch.

F(t)
SR(t)

Vf, Xf
VR = Vf - V0
V0, X0, S0

RESERVORIO

BOMBA
BIORREACTOR

Donde
F(t): caudal de alimentacin
Sr(t):concentracin de sustrato de la alimentacin
Vf: volumen final de trabajo
Vo: volumen al inicio de la alimentacin
Xo: concentracin de biomasa al inicio de la alimentacin
So: concentracin de sustrato limitante al inicio de la
alimentacin

Es
posible
elegir
distintas
condiciones de alimentacin, ya
sea mediante el empleo de
caudales variables (F = F(t)), o bien
mediante la variacin de la
concentracin de sustrato limitante
(Sr=Sr(t)).

Batch alimentado

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El caudal de salida F2 es nulo, por lo que V aumentar en el

tiempo, de acuerdo al valor del caudal de entrada

(4)
Y en el balance de masa, se anula el trmino F2Ci resultando:

(5)
Obviamente, V queda dentro del diferencial pues vara con el tiempo segn la
ec (4). Por este motivo, el batch alimentado y a diferencia del caso anterior
tiene duracin limitada en el tiempo ya que el volumen no puede incrementarse
ms all del volumen til del biorreactor.

BIOTECNOLOGA

Batch alimentado

Para iniciar un batch alimentado valen las mismas consideraciones

que se hicieron para iniciar un cultivo continuo, salvo que en este
caso supondremos que se inicia la alimentacin del cultivo
cuando el substrato limitante se ha agotado.
Si bien este no es un requisito indispensable, permite simplificar el
tratamiento matemtico y adems es un bien punto de partida
con respecto al objetivo del batch alimentado que controlar la
velocidad de crecimiento mediante la velocidad de
alimentacin.
Tambin supondremos que alimentamos con medio de cultivo
fresco y estril, es decir que X1 = 0 y P1 = 0

Batch alimentado

BIOTECNOLOGA

Despus de estas consideraciones, los balances para X, S y P

sern (ver ec. 5)

Si en la ec. 21, reemplazamos

la ec. 20 resulta:

y se tiene en cuenta

Batch alimentado

BIOTECNOLOGA

Si deseamos que la velocidad de crecimiento est controlada por

la alimentacin, esta deber ser tal que en todo momento sea S
sea prcticamente igual a 0 y por lo tanto d(S.V)/dt =0.
Esto equivale a decir que el substrato es consumido totalmente ni
bien ingresa al reactor

donde X0 y V0 representan la concentracin de biomasa y el

volumen de cultivo en el momento de iniciar la alimentacin. La
variacin de V con el tiempo se obtiene integrando la ec (4).
ec (26)

Batch alimentado

BIOTECNOLOGA

El criterio para disear una alimentacin adecuada se obtiene

combinando las ecs 20 y 24, (con t=0)

(27)
Como criterio adicional conviene seleccionar el valor de Sl tan alto como sea posible
y F relativamente pequeo a fin de evitar la excesiva dilucin del cultivo.
La contrapartida es que la duracin del batch alimentado puede prolongarse
excesivamente, por lo que normalmente se trata de encontrar la solucin de
compromiso,
donde intervienen adems, aspectos econmicos.
El valor de durante el batch vara permanentemente, ya que por la ecuacin (20)
es:

(29)

Batch alimentado

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Reemplazando en la ec 29, las ecs 24 y 25 resulta::

Por tanto disminuye con el tiempo. Esto es vlido solamente

para el caso tratado aqu, es decir con F y Sl constantes, pero
nada impide hacer alimentaciones con F = F(t) o S1 = S1(t), con
lo cual puede lograrse, por ejemplo, que se mantenga
constante o bien que aumente hasta valores cercanos a m.

La diversidad de alimentaciones posibles que pueden

emplearse es, quizs, una de las caractersticas ms apreciables
del batch alimentado. La otra es que este sistema de cultivo es
muy apropiado para obtener altas concentraciones de
biomasa, muy superiores a las que se podran obtener en un
batch, donde la limitacin est dada por la concentracin
inicial de nutrientes del medio de cultivo que pueden tolerar los
microorganismos.

Batch alimentado

Se observa claramente que cuanto mayor es mS,

menor es la cantidad de biomasa obtenida

BIOTECNOLOGA

Batch
Estos tipos de reactores operan con una baja concentracin celular,
sobretodo en el instante inicial donde los microorganismos permanecen en
fase latente. Y por este motivo se ha de controlar la concentracin de
nutrientes en el sustrato ya que sino se poda ralentizar el proceso de
fermentacin.
Adems el proceso global es ms lento que si se operase de forma continua
ya que al no haber retirada de producto ni aporte de nutrientes, en los
instantes finales del proceso las condiciones del medio son hostiles, alta
concentracin de producto y baja concentracin de nutrientes. Al darse
fenmenos de inhibicin la fermentacin tarda en completarse.

El reactor se mezclar de forma completa siendo as la concentracin de

cada componente en un determinado tiempo es constante con la posicin
dentro del reactor. Al finalizar el proceso, cuando se ha llegado a una
conversin fijada, la concentracin a la salida de cada componente ser
la misma en el interior del reactor.

Batch

BIOTECNOLOGA

Ambos caudales son nulos por los que V es constante y en la

ec (1) se anulan los trminos F1Ci1 y F2Ci

(6)
La duracin del cultivo batch es tambin limitada en el tiempo y
depende, esencialmente de las condiciones iniciales del cultivo. Una
vez inoculado el medio, la concentracin de biomasa aumenta a
expensas de los nutrientes y cuando el substrato que limita el
crecimiento se agota, finaliza el batch.

Ventajas del cultivo en batch

Batch

menor riesgo de contaminacin

flexibilidad operacional cuando los fermentadores se utilizan para distintos

productos

control ms cercano de la estabilidad gentica del organismo (<nmero de

replicaciones)

una mejor coordinacin con estadios del proceso entre lotes previos y
posteriores

Desventajas del cultivo en batch

Improductividad en la operacin del fermentador

Los fermentadores deben ser vaciados, limpiados, esterilizados y recargados

antes de cada fermentacin, operaciones todas esenciales pero no productivas.

Existe inhibicin por altas concentraciones de sustrato

Formacin de producto

BIOTECNOLOGA

En estado estacionario, la ec. 9

Se reduce a:
(16)

o bien

Donde
representa la concentracin de producto en estado
estacionario y
es la velocidad especfica de formacin de
producto. Dependiendo de como sea la cintica de formacin
de produccin ser la forma de la curva de
vs. D.

BIOTECNOLOGA

Determinacin de los parmetros de

crecimiento
El cultivo continuo es sumamente til para determinar los
parmetros de crecimiento como

As, reordenando la ec. 11

Se obtiene:

(18)

La grfica es una recta si el cultivo puede

ser representado por una cintica como
la de Monod

Determinacin de los parmetros de

crecimiento

BIOTECNOLOGA

Tambin si reordenamos la ec. 14

Resulta:

(19)

Batch

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Aplicando la ec. 6
el producto, resulta:

a la biomasa, el substrato y

Batch

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Suponiendo que no se forma productos y que la relacin entre y S puede

ser representada por la ec de Monod, surge que:

El sistema formado por las ecuaciones (38) y (39) posee solucin analtica,
pero en sta no aparece X en forma explcita por lo que resulta de escasa
utilidad.
En cambio es posible analizar casos particulares haciendo algunas
suposiciones. Por ejemplo se puede asumir que durante una buena parte
del tiempo se cumplir que S Ks, por lo tanto las ecuaciones (38) y (39) se
reducen a:

Batch

BIOTECNOLOGA

Por tanto bajo las condiciones indicadas el crecimiento se llevar a cabo

con el mximo valor de p posible. Integrando la ecuacin (40) con la
condicin a t = 0;
X = Xo, se llega a la expresin:

La ecuacin (42) establece que para S Ks el crecimiento es exponencial

(fase exponencial), y por la ecuacin (43) es posible calcular el valor de m
graficando el lnX en funcin del tiempo.

Batch

BIOTECNOLOGA

La variacin de S con t se obtiene introduciendo la ecuacin (42) en la

ecuacin (41) e integrando con la condicin a t=0, S=S0

A medida que el cultivo transcurre, S disminuye hasta que se llega a la

condicin en que S es comparable a Ks y por lo tanto dX/dt comienza a
disminuir (fase de desaceleracin) hasta hacerse finalmente nula cuando S
= 0. En este punto se alcanza la mxima concentracin de biomasa y
finaliza el batch (fase estacionaria).
La concentracin final de biomasa, Xf , se puede calcular si se conoce el
Yx/s :

Como Sf=0, resulta:

BIOTECNOLOGA

Batch

El cultivo tipo "batch", si bien es quizs el ms difundido, es el que

menos posibilidades de control ofrece. Una vez sembrado el medio
de cultivo y fijada la temperatura, las clulas quedan "libradas a su
propia suerte" o, dicho de otro modo, a su propia potencialidad,
que se manifiesta creciendo a la mxima velocidad que le permite
el medio de cultivo empleado, siendo el operador un mero
espectador de los acontecimientos.
En este aspecto tanto el cultivo continuo como el batch
alimentado superan ampliamente al "batch".

PRODUCTIVIDAD

BIOTECNOLOGA

La productividad volumtrica est expresada como gramos de

producto (o clulas) por litro y por hora y es una medida de la
perfomance del proceso.
En un proceso batch es necesario calcular la productividad sobre
el tiempo total del proceso, el cual incluye no solo el tiempo de
fermentacin sino tambin el tiempo requerido para vaciar el
fermentador despus de la corrida anterior, limpieza del
recipiente y llenar y esterilizar nuevamente el medio.

La productividad total est dada por la pendiente de una lnea

desde el origen hasta el punto de terminacin de la
fermentacin. La productividad mxima est dada por una lnea
similar a travs del origen pero tangente a la curva de
crecimiento; esto sucede a una concentracin de producto (o
clulas) menor que el mximo.

PRODUCTIVIDAD

BIOTECNOLOGA

El tiempo total para el proceso puede ser calculado como:

(47)

Donde td involucra los tiempos improductivos.

De esta forma, obtenemos la ecuacin de productividad

(48)

BIOTECNOLOGA

PRODUCTIVIDAD

En un cultivo continuo, la productividad P (g/lh) est definida por:

(49)
Sustituyendo la ec. 49 en la ec 13, nos queda:

(50)

BIOTECNOLOGA

PRODUCTIVIDAD

La productividad P puede expresarse ahora como una funcin de la velocidad de

dilucin.
La D necesaria para obtener mxima productividad puede calcularse derivando la ec
con respecto a D e igualando a cero

Obtenemos velocidad de dilucin ptima Dopt

(51)

BIOTECNOLOGA

PRODUCTIVIDAD (Batch vs Continuo)

Se puede comparar la productividad para la produccin de masa celular, en

fermentadores batch y fermentadores continuos, examinando la relacin de la ec 48
con el producto DM XM donde XM es la concentracin celular que se obtiene la
velocidad de dilucin ptima .

(52)
Y la relacin entre la productividad en reactores continuos y la productividad en
reactores batch es:

(53)