BIOLOGIA MOLECULAR APLICADA

MEDICINA: FUNDAMENTOS TERICOS E

METODOLGICOS

Profa. Dra. Nancy Amaral Rebouas

So Paulo, fevereiro 2008

Referncias utilizadas para preparao dos roteiros e

elaborao das discusso sobre os mtodos:

- Current Protocols in Molecular Biology

F.M. Ausubel e cols - Editora: John Wiley & Sons, Inc.
Atualizaes bimensais
- Molecular Cloning - A Laboratory Manual
Sambrook - Russel

3a. Ed. - Editora: Cold Spring Harbor

Laboratory Press 2001

Imprescindvel num laboratrio de Biologia Molecular
Aqui voce pode encontrar todos os protocolos necessrios, com
excelentes explicaes.

- PCR Primer - A Laboratory Manual

C.W.Dieffenbach
G.S.Dveksler
Editora: Cold Spring Harbor Laboratory Press 2a. edio - 2003

- Nucleic Acid Hybridization - A Pratical Approach

B.D.Hames & S.J. Higgins
Editora: IRL Press 1991

- PCR - The Polymerase Chain Reaction

K.B. Mullis
F.Ferr
R.
A. Gibbs

Revisado por James D. Watson

Editora: Birkhauser 1994

- PCR Applications Protocols for Functional Genomic

Michael A. Innis
Davod H. Gelfand
John J. Sninsky
Academic Press 1999.

- PCR The Basics from Background to Bench

M.J. McPherson
S.G. Moller
Bios Spring Verlag 2000.

- PCR 2 A Pratical Approach

M.J. McPherson
B.D. Hames
G.R. Taylor
PAS A Pratical Approach Series
IRL Press 1995.

- PCR Protocols
J. M. S. Bartlett
D. Stirling
Human Press 2. Ed.- 2003

Solues Bsicas Utilizadas no Laboratrio de Biologia

Molecular:
Tris.HCl [tris(hydroxymethyl)aminomethane] - 1M
Dissolva 121g de Tris Base em 800 ml de gua MiliQ
Ajuste o ph desejado com HCl concentrado
Adicione gua at 1L
Autoclave
Cerca de 70 ml de HCl so necessrios para pH de 7,4 ; e cerca de 42 ml para pH de 8,0.
Nota importante: O pH dos tampes com Tris muda significativamente com a
temperatura, caindo cerca de 0,028 U para elevao de cada 1oC. O pH das solues
tamponadas com Tris deve ser ajustado na temperatura na qual as solues sero
usadas. Como o pK do Tris 8,08, o tampo no deve ser usado a pH abaixo 7,2 nem
acima de 9,0.
No adicione DEPC (Diethyl Pyrocarbonate) em solues com Tris, porque o Tris
inativa essa substncia. Se a soluo deve ser usada em experimentos com RNA,
prepare-a com gua previamente tratada com DEPC e autoclavada.

EDTA (ethylenediamine tetra-acetic acid) - 0,5M (pH 8,0)

Dissolva 186,1g de Na2EDTA.2H20 em 700 ml de gua
Ajuste o pH para 8,0 com NaOH 10M (cerca de 50 ml)
difcil dissolver o sal. Ele s entra em soluo quando o pH j est prximo de 8.
Adicione gua MiliQ para 1 L.
Autoclave

TE (tampo Tris/EDTA)
10 mM Tris.HCl - pH 7,4 - 7,5 ou 8,0
1 mM EDTA

SSC (sodium chloride/sodium citrate), 20X

NaCl 3M - 175g/L
Na3citrate.2H2O 0,3M - 88g/L
Ajuste o pH para 7,0 com HCl 1M

TBE(Tris/Borate/EDTA) - Tampo de Eletroforese

10X - 1L de soluo stock
108 g de Tris Base (890 mM)
55 g de cido brico (890 mM)
40 ml de EDTA 0,5M pH 8,0 (20 mM)

TAE(Tris/Acetate/EDTA) - Tampo de Eletroforese

50 X - 1L de soluo stock
242 g de Tris Base
57,1 ml de cido actico g;acial
37,2 g Na2EDTA.2H2O
gua MiliQ para 1 L
(TAE tem menor capacidade tamponante que TBE, porm mais adequadoquando sevai
extrair DNA do gel)

NaCl - 5M

SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) - 10%

Prepare todas as solues com gua da melhor qualidade possvel

Destilada - Deionizada (MiliQ).

Caso as solues sejam destinadas a uso com RNA, trate-as com DEPEC (1:1000), deixe
em DEPEC at o dia seguinte e, em seguida, autoclave.
Soluo com TRIS no deve ser tratada com DEPEC. Trate previamente a gua com
DEPEC, autoclave, e prepare a soluo.

FUNDAMENTOS TERICOS

Extrao de DNA:
Embora o DNA em forma de dupla fita seja muito estvel e resistente a condies
adversas, o DNA vulnervel mesmo a foras leves originadas durante a pipetagem ou
agitao que facilmente geram tenso na molcula e quebra das ligaes fosfodister. A
obteno de molculas de DNA com mais de 150 kb no fcil. No entanto, muito fcil
extrair molculas de DNA fragmentadas, com 50 a 100 kb.
A quantidade de DNA que se obtm usualmente a partir de 20 ml de sangue ~250 g.
A extrao de DNA inclui basicamente os seguintes procedimentos:
1. Lise das clulas (citlise)
2. Purificao do DNA, separando-o de macromolculas contaminantes, tais como
protenas e RNA, por digesto enzimtica e/ou processos fsico-qumicos.

O local no laboratrio e o material utilizados para extrao de DNA devem ser

separados daqueles dedicados ao manuseio de DNA clonado em plasmdeos ou outro tipo
de vetor. Contaminao do DNA genmico, durante o processo de extrao, com esse
tipo de DNA poder causar srios problemas em experimentos futuros. Uma possvel
fonte de contaminao o uso comum de centrfugas e banhos.

Extrao de DNA de sangue:

Anticoagulante:
1 - citrato: (soluo ACD)
0,48% (peso/volume) - cido ctrico
1,32% - citrato de sdio
1,47% - glicose
Use 3,5 ml para cada ~20 ml de sangue.
2 - EDTA - pode ser usado.

A soluo ACD ideal, se o objetivo preparar DNA genmico a partir de sangue total,
pois preserva melhor molculas de DNA de elevado peso molecular.
Tanto em citrato como em EDTA, o sangue pode ser estocado por vrios dias a 0oC ou
indefinidamente a -70oC, antes da extrao do DNA. O sangue no deve ser coletado
em heparina, pois heparina pode inibir a reao de PCR que eventualmente poder ser
realizada mais tarde. No um impedimento absoluto; caso a heparina esteja diluda o
suficiente na amostra, a PCR pode funcionar bem.

1 - Tranfira o sangue para um tubo de centrfuga e centrifugue a 1300 g por 15 minutos a

4 oC.
2 - Remova o sobrenadante. Transfira, com uma pipeta Pasteur ou ponteira P-1000, a
camada superior de clulas, correspondente aos leuccitos, para um outro tubo. Descarte
o pellet de hemcias.
3 - Centrifugue novamente a poro correspondente aos leuccitos. Remova o
sobrenadante residual. Ressuspenda o pellet em 15 ml de tampo de lise.
Incube a soluo a 37oC por 1 hora.

Soluo de lise:
Tris-HCl, pH 8,0 - 10 mM
EDTA, pH 8,0 - 10 mM
SDS - 0,5%
RNase-DNase free - 20 g/ml
A soluo sem a RNase preparada e deixada em temperatura ambiente. RNase
adicionada em uma alquota s no momento do uso.

Se for sangue congelado:

1 - Descongele o sangue em um banho maria a temperatura ambiente. Adicione igual
volume de uma soluo salina tamponada com fosfato (PBS), temperatura ambiente.
2 - Transfira a mistura para um tubo para centrifuao. Centrifugue a 3.500g, po 15
minutos, a 4 oC.

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3 - Remova o sobrenadante que contm as hemcias lisadas. Ressuspenda o pellet em 15

ml de tampo de lise.
Incube a soluo a 37oC por 1 hora.
Na fase de lise essencial que toda a amostra entre em contato com o tampo de lise.
Este deve estar sempre em quantidade suficiente e a homogeneizao deve ser tal que
garanta realmente o contato de todas as clulas com o tampo de lise.

4 - Transfira o material lisado para outros tubos de centrifugao, de tal modo que ocupe
apenas 1/3 do tubo.
Adicione proteinase K (20 mg/ml) a uma concentrao final de 100 g/ml. Misture
delicadamente. Pode-se usar um basto de vidro para isso.
Certifique-se de que a proteinase K de boa procedncia (genomic grade livre de
DNases e RNases), est dentro do tempo de validade e no foi estocada de forma de
incorreta. O melhor preparar a soluo estoque de proteinase K (20 mg/ml) a partir do
liofilizado quando for usar. Se for estocar, separe em alquotas e guarde a 20oC.
5 - Incube em um banho maria a 50oC por 3 horas. Misture algumas vezes durante este
perodo.
6 - Resfrie a soluo at a temperatura ambiente e adicione igual volume de fenol
equilibrado com Tris-HCL - 0,1 M (pH 8.0). Misture delicadamente as duas fases para isso ponha o tubo com boca para baixo em um agitador de tubos por cerca de 10
minutos (agitao leve - no vortex). Alternativamente, inverta o tubo vrias vezes,
delicadamente.
importante que o pH do fenol seja ~ 8,0. Se for mais cido, o DNA poder ficar na
interface.
A qualidade do fenol outro ponto crtico. Aps ter sido equilibrado com Tris o fenol
no pode ser estocado por anos. Ele tende a ser oxidado, e neste estado levar a quebras
na cadeia de DNA, alm disso, o rendimento da extrao ser muito ruim.
7 - Separe as fases por centrifugao a 5.000 g, 15 minutos, temp. ambiente.
8 - Com uma pipeta graduada larga, transfira o sobrenadante (que uma soluo viscosa)
para um outro tubo. Faa isso delicadamente, sem perturbar a interface e sem submeter o
DNA a choques mecnicos.

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9 - Repita a extrao com fenol por mais duas vezes.

Se for necessrio obter molculas na faixa de 150-200 kb, purifique o DNA por dilise:
- Transfira a fase aquosa do procedimento anterior para um saco de dilise. Feche o saco,
deixando espao para que o volume possa aumentar 1,5 a 2 vezes durante a dilise.
-

Dialise a soluo a 4 oC em 4 L de tampo de dilise. Troque o tampo 3 vezes, a

cada 6 horas. Para dilise completa necessrio cerca de 24 horas.

Tampo de dilise:
Tris-HCl (pH 8,0) - 50 mM
EDTA (pH 8,0) - 10 mM

Se no for necessrio DNA com tamanhos to elevados, precipite o DNA com etanol.
10 - Adicione fase aquosa do passo anterior (extrao com fenol) 0,2 volume de acetato
de amnium 10 M. Adicione 2 volumes de etanol (100%), a temperatura ambiente.
Misture bem, porm delicadamente.
11 - Imediatamente se forma um precipitado de DNA. Usando uma pipeta Pasteur com
ponta selada em forma de ala, remova o DNA e transfira para outro tubo.
Se o DNA j estiver muito fragmentado e no for possvel pesc-lo desta maneira,
centrifugue a 5.000 g, por 5 minutos, em temperatura ambiente.
Despreze o sobrenadante aps a centrifugao.
12 - Lave o DNA precipitado com etanol 70%. Centrifugue novamente e remova o
mximo possvel sobrenadante.
Deixe o tubo aberto at que se evapore todo o etanol (alguns minutos). No deixe o pellet
secar, pois ser difcil dissolv-lo.
13 - Adicione 1 ml de TE (pH 8.0) para cada 0,1 ml de clulas iniciais.
Deixe agitando levemente a 4 oC, at que o pellet se dissolva completamente.

Quantifique e verifique a qualidade do DNA em gel de agarose 0,6 %.

Existem numerosos protocolos para extrao de DNA, das mais diversas fontes.

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Os kits comerciais, com utilizao de resinas, so muito convenientes e fornecem DNA

de boa qualidade.

A purificao de cidos nucleicos com fenol e clorofrmio um procedimento rotineiro

em laboratrios de biologia molecular. Descreveremos o procedimento a seguir.

Tcnica de extrao com fenol-clorofrmio-alcool isoamlico

Fundamentos
O mtodo mais comumente utilizado para desproteinizao do DNA a extrao
com fenol, que desnatura as protenas de modo eficiente e, provavelmente, as solubiliza.
O clorofrmio tambm um bom desnaturante de protenas com propriedades um pouco
diferentes, que determinam maior estabilidade da interface entre o solvente e a fase
aquosa; a interface fenol puro-gua bastante instvel. A mistura fenol-clorofrmio
reduz o volume da soluo aquosa retida na fase orgnica (comparada ao fenol puro),
aumentando o rendimento final. O lcool isoamlico previne a formao de espuma
quando a mistura agitada em vrtex, o que torna mais fcil a separao das fases
orgnica e aquosa. A protena desnaturada forma uma camada na interface das duas fases,
separando-se do DNA que se mantm na fase aquosa.
Em seguida o DNA precipitado por etanol absoluto, na presena de concentraes
relativamente altas (100 a 500 mM) de um sal de ction monovalente. Etanol depleta
a camada de hidratao dos cidos nuclicos e expe as cargas negativas dos grupos
fosfato. Contra-ons, como Na+ se ligam, aos grupos carregados reduzindo a fora
repulsiva entre as cadeias polinucleotdicas, at o ponto em que possa se formar um
precipitado. O precipitado se formar apenas se houver ctions monovalentes em

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quantidade suficiente para neutralizar das cargas dos grupos fosfato.

A precipitao com etanol absoluto necessria para concentrar o DNA e para
remover resduos de fenol e clorofrmio da soluo aquosa desproteinizada. Como
a maioria dos solutos inorgnicos e molculas orgnicas pequenas so solveis em
etanol 70%, a lavagem do precipitado com etanol-70% ir dessalinizar o DNA de forma
eficiente. Embora tanto cloreto de sdio, como acetato de sdio e acetato de amnio
sejam eficazes para precipitao do DNA, mais difcil remover NaCl, devido a sua
menor solubilidade em etanol.

O processo, ao final, fornece uma soluo de DNA

praticamente livre de eletrlitos (sais) o que ser necessrio quando o DNA for utilizado
na presena de tampes cuja composio bem definida fundamental para o sucesso do
procedimento.
Finalmente o DNA, precipitado pelo etanol, dissolvido em gua.

Roteiro para a extrao com fenol-clorofrmio-lcool isoamlico

Todo o processo dever ser executado em tubos de polipropileno (leitosos). Os de
poliestireno (transparentes) no resistem ao fenol-clorofmio.
a) Adicione soluo de DNA, resultante dos processos de extrao, um volume

igual da mistura fenol-clorofrmio-lcool isoamlico (10:10:1). Misture bem, porm

gentilmente, e centrifugue por 2 a 5 min (o tempo depender do volume: volumes
menores, tempos mais curtos).
b) Remova com cuidado a fase aquosa, que fica por cima, e a transfira para outro
tubo. Se houver precipitado branco na interface repita a extrao com fenol-clorofrmioisoamil, exatamente como no passo anterior.
c) Adicione fase aquosa, separada no passo anterior, um volume 10 vezes
menor de soluo de acetato sdio 3M, pH 5,2, ou volume 10 vezes menor de NaCl
5M, ou ainda igual volume de acetato de amnia 4M. O acetato de amnia favorece a
precipitao de fragmentos maiores de DNA, e deve ser usado quando se quer eliminar

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da amostra de DNA pequenos oligonucleotdeos (< 30 pb) que possam estar presentes1.
c) Ao volume obtido aps a adio do acetato de sdio adicione agora 2 a 2,5
volumes de etanol absoluto gelado 2.

Misture e incube em gelo seco por 5 min ou a -

70oC por 15 minutos ou a -20oC por 30 min (esses so os tempos mnimos, sem limite
para o mximo).
d) Centrifugue por 5 minutos em centrfuga com rotor de ngulo fixo, em alta
velocidade de rotao (10.000 a 14.000 rpm); remova o sobrenadante.
e) Adicione 1 ml de etanol 70%. Misture invertendo a tubo vrias vezes e
centrifugue como no passo anterior. Se o DNA a ser precipitado for pequeno (menos de
200 pares de base) faa a lavagem do pellet com etanol 95%.
f) Remova o sobrenadante e seque o pellet de DNA
g) Dissolva o pellet de DNA em um volume adequado de gua (a concentrao
dever ser menor do que 1 mg/ml) para uso em outras manipulaes enzimticas;
dissolva em TE, pH 8,0, para estocagem por por tempo indeterminado.
Desproteinizao por prolas de vidro ou por slica-gel
.

A desproteinizao do DNA pode ser feita tambm com a utilizao de prolas de

vidro (glass beads) ou partculas de slica-gel ativadas (5l para at 5g de DNA), que
ligam o DNA na presena de iodeto de sdio (NaI, 6M, 3 volumes para 1 volume de
soluo de DNA).

O DNA ligado s prolas de vidro ou s partculas de slica-gel

lavado com soluo contendo Tris.Cl 20 mM, EDTA 1 mM, NaCl 100 mM, pH 7,4, trs
a quatro vezes para remover protenas, e em seguida eludo com gua ou TE pH 8.0
(0,5 g/l).

Referncias para protocolos de extrao de DNA na INERNET:

http://www.stratagene.com/
1

No use acetato de amnia quando o DNA tiver que ser fosforilado, porque o NH4+ inibe a enzima T4PNK.
2 A precipitao do DNA pode ser tambm feita com isopropanol (2-propanol). Neste caso usa-se volume
de lcool igual ao da soluo aquosa. Iso pode ser vantajoso quando o volume de soluo aquosa grande
e, com a adio do etanol, o volume final excede a capacidade do frasco. O isopropanol menos voltil
e, com a adio do etanol, o volume final excede a capacidade do frasco. O isopropanol menos voltil
que o etanol, levando mais tempo para evaporar. Alguns sais por serem menos solveis em isopropanol se
precipitaro juntamente com os cidos nucleicos. Sero necessrias lavagens adicionais em etanol a 70%
para a remoo dos sais contaminantes.

15

http://www.promega.com/tbs
http://www.highveld.com/protocols.html
http://www.dynal.no/

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Extrao de RNA
Fundamentos
A maior dificuldade no processo de extrao de RNA evitar a ao das
ribonucleases (RNases). Estas enzimas so muito estveis e no requerem cofatores para
suas atividades. O primeiro passo para extrao de RNA, portanto, envolve a lise das
clulas em um ambiente qumico que resulte em desnaturao de ribonucleases. Em
seguida o RNA separado de outras macromolculas constituintes das clulas
Alm de impedir a ao de ribonucleases provenientes das clulas das quais
estamos extraindo o RNA, tem-se de evitar a introduo acidental de traos de RNAses,
de outras fontes. O uso de luvas imprescindvel, pois a pele frequentemente contm
bactrias e fungos que podem contaminar a preparao de RNA e serem fontes de
RNAses. Evitar a contaminao com microorganismos obrigatrio quando se trabalha
com RNA.
Todo material de plstico utilizado tem de ser esterilizado, livre de RNases e no
deve ser reutilizado. O material de vidro deve ser muito bem lavado, (tratado com
DEPEC opcional), autoclavado e deixado em estufa a 180oC por pelo menos 8 horas ou
220oC por 2 horas. Caso os recipientes a serem utilizados sejam tratados com DEPEC,
preencha-os com gua contendo dietil-pirocarbonato (DEPC) a 0,1%, que um potente
inibidor de RNAses. Aps serem preenchidos com soluo de DEPC, esses recipientes
devem ser incubados a 37C por pelo menos 2 horas, lavados vrias vezes com gua
estril (gua-DEPC autoclavada) e aquecidos a 100C por 15 minutos ou autoclavados.
Com estes procedimentos o DEPC removido por evaporao.

Traos de DEPC

indevidamente persistentes nos frascos podem modificar resduos de purinas no RNA por
carboximetilao, e, assim, inteferir na traduo do RNA in vitro. Traos de DEPC
tambm podem inibir algumas enzimas.
As cubas para eletroforese do RNA devem receber o seguinte tratamento:
lavagem com soluo contendo detergente
enxague com gua (Mili-Q)
secagem com etanol (96%)

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preenchimento com soluo de gua oxigenada (H2O2) 3%. O contacto com

gua oxigenada deve se estender por 10 min, em temperatura ambiente.
enxague repetido bem com gua tratada com DEPC (0,1%) e autoclavada.

Os pipetadores devem ser reservados para uso exclusivo em preparaes de RNA.

Se a exclusividade no for possvel, os pipetadores devem ser desmontados e tratados
com um dos procedimentos acima para remoo de RNAses.
As ponteiras e tubos Eppendorfs devem ser autoclavados e sem contaminao
por RNAases; no devem ser reutilizados.
A gua e todas as solues usadas para preparao de RNA devem ser tratadas
previamente com DEPC (0,1%) e autoclavadas. Solues contendo Tris no devem ser
tratadas com DEPC, porque Tris reage com DEPC, inativando-o. No entanto, as solues
com Tris devem ser preparadas com gua previamente tratada com DEPC e autoclavada.
A criteriosa observncia dos procedimentos que evitam a contaminao com
RNAase e microorganismos garante a obteno de RNA ntegro e de boa qualidade ao
final do processo de extrao.

Tcnicas para extrao de RNA

I. Extrao de RNA de clulas em cultura, leuccitos ou clulas de lavado bucal:
A tcnica utiliza um detergente suave para promover a lise das clulas. O roteiro
o que se segue
1. Lavar as clulas com PBS gelado (por 3 vezes) para remover meio de cultura ou outra
soluo em que as clulas estiveram previamente. Para formar o pellet de clulas,
centrifugue a 300g por 5 min. Partindo de clulas em cultura deve se ter um nmero de
clulas em torno de 2 x 107.
2. Ressuspender as clulas em 375 l de soluo de lise gelada (composio dada
abaixo). Aps agitao cuidadosa, mas vigorosa, a suspenso deve ficar transparente,
indicando citlise.
Composio da soluo para lise:
Tris.Cl 10 mM

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NaCl 100 mM
MgCl2 5 mM
0,5% (vol/vol) Nonidet P-40
pH 8
(Prepare com gua-DEPC autoclavada e filtre para esterilizar)
Se as clulas forem particularmente ricas em RNAses, use um inibidor de RNases,
o inibidor de RNase de origem placentria (RNAsin), na concentrao de 1000 U/ml, ou
o complexo vanadyl-ribonucleosideo, na concentrao de 10 mM.

3. Transferir as clulas lisadas para um tubo de microcentrfuga (1,5 ml) e centrifugue por
2 min a 4oC (14.000 rpm).
4. Transferir o sobrenadante para um outro tubo de microcentrfuga contendo 4 l de
SDS 20%. Misture em um vtex.
(O fluido sobrenadante o extrato citoplasmtico. levemente turvo, de cor
tendendo a um branco amarelado. O pellet, que contm os ncleos e alguns debris
celulares, deve ser branco e bem menor que o pellet de clulas inteiras)
5. Adicionar 2,5 l de proteinase K (20mg/ml). Incubar por 15 minutos a 37oC.
6. Adicionar 400 l de fenol-clorofrmio-lcool isoamlico (5:1:0,04). Agitar em vrtex
vigorosamente. Centrifugar por 5 min ou mais a 4oC (14.000 rpm)
(Se houver a formao de um precipitado muito espesso na interface, com
escassa fase aquosa sobrenadante, centrifugar por mais alguns minutos; se ainda assim
no for possvel separar a fase aquosa, remover a fase orgnica (de baixo) e adicionar
mais 400 l de clorofrmio-lcool isoamlico (sem fenol). Agitar em vrtex e centrifugar
por 2 minutos. Transferir a fase aquosa sobrenadante para outro tubo).
7. Repetir uma vez o procedimento de extrao com fenol-clorofrmio-lcool-isoamlico.
8. Fazer extrao com 400l de clorofrmio-lcool isoamlico. Transferir a fase aquosa
sobrenadante para outro tubo.
9. Adicionar fase aquosa obtida (cerca de 400 l), 40 l (1/10 do volume de material)
da soluo de acetato de sdio 3M, pH 5,2. Acrescentar 1 ml de etanol absoluto e
misturar por inverso do frasco.

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10. Incubar em gelo por 30 minutos ou deixar no freezer, a -20oC durante a noite.
11. Recuperar o RNA centrifugando por 15 min a 4oC a 14.000 rpm.
12. Lavar o pellet com 1 ml de etanol 75%
13. Secar o pellet e ressuspend-lo em um volume de 50 a 100 l de gua-DEPC
autoclavada.
14. Quantificar por espectrofotometria (A260).
15. Guardar o RNA em soluo em freezer a -70oC .

2. Extrao de RNA de clulas em cultura ou em tecidos

Nesta tcnica as clulas ou tecidos so homogeneizados em meio com tiocianato
de guanidina, um dos mais potentes desnaturantes de protenas. O mtodo se baseia na
caracterstica do RNA de permanecer na soluo aquosa, contendo guanidine thyocianate
4M, pH 4, na presena da fase orgnica fenol/clorofrmio. Neste pH baixo, a maioria das
protenas e pequenos fragmentos de DNA (5 a 10 kpb) permanecero na fase orgnica,
enquanto que os fragmentos maiores de DNA e algumas protenas ficaro na interface.
A fragmentao do DNA durante o processo de homogeneizao (em geral feito com
Polytron) ajuda a remover o DNA da fase aquosa.
Aps a homogeneizao em tiocianato de guanidina, o RNA pode tambm ser
separado do DNA e das protenas por centrifugao em gradiente de cloreto de csio,
explorando o fato de o RNA ser mais pesado que DNA e protenas. uma tcnica
simples, com pouca manipulao da amostra, mas requer ultracentrifugao.

Tcnica
Soluo de tiocianato de guanidina (GIT) 4M:
GIT para 100 m de soluo: 47,26g
Citrato de Sdio 1M, pH 7.0 - 2,5 ml
Sarkosyl (N-laurylsarcosine) ) - 0,5%
Completar para 100 ml com gua-DEPC autoclavada
No momento do uso adicionar 8 l/ml de BetaMercapto Etanol (BME - Sigma)

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1. Adicionar 1 ml de GIT para cada 100g de tecido ou 107 clulas (cultura de clulas) e
homogeneizar em Polytron (16.000 rpm/15 sec).
2. Adicionar 0,1 ml de acetato de sdio (2M, pH 4,0) para cada 1 ml de GIT adicionado
anteriormente. Misturar muito bem. Adicionar 1 ml de fenol saturado com gua (pH 4,0)
para cada 1 ml de GIT, e misturar vigorosamente. Adicionar 0,2 ml (para cada 1 ml de
GIT) de clorofrmio-lcool isoamlico (24:1). Misturar muito bem em vrtex e incubar
essa suspenso por 15 minutos em temperatura de 0 a 4 oC.
3. Centrifugar por 20 minutos a 4 oC, 10.000 rpm (alternativamente, 5.000 rpm por 45
minutos) . Transferir a fase aquosa sobrenadante (que deve ter o mesmo volume de GIT
adicionado no incio) para um outro tubo.
4. Precipitar o RNA adicionando um volume igual de isopropanol 100%. Incubar a
amostra por 20 min a -20oC. Centrifugar por 10 min a 4 oC, a 10.000 rpm. Desprezar o
sobrenadante.
5. Dissolver o pellet de RNA em 0,3 ml de soluo desnaturante (GIT) e transferir para
um tubo Eppendorf de 1,5 ml (se j no estiver em um Eppendorf).
6. Precipitar o RNA com igual volume (0,3 ml) de isopropanol 100% (20 min a -20oC).
Centrifugar novamente por 10 min a 4 oC, 10.000 rpm. Descarte o sobrenadante e seque
o pellet.
7. Dissolver o RNA em 50-100 l de H2O-DEPC autoclavada. Quantificar e armazenar a
-70C.

Para verificar a pureza do RNA determinar a razo de absorbncia 260/280

(260 nm para cidos nucleicos e 280nm para protenas), que deve ser 1,8-1,9.
Ao secar o pellet no permitir que esse seque completamente, o que dificultar
muito a dissoluo do RNA. Se secar exageradamente, as protenas ainda presentes como
contaminantes se dissolvero com maior facilidade que o RNA, o que resultar em baixas
razes 260/280.
A gua utilizada para diluir o RNA para espectrofotometria deve ter pH 7,5.
pH cido afeta o espectro de absoro UV do RNA e diminui significativamente a razo
260/280. Ajuste o pH da gua para valores levemente alcalinos adicionando Na2HPO4
para uma concentrao final de 1 mM.

21

3. Extrao de RNA de sangue:

1.100 l de sangue anticoagulado com 1 mL de tampo de lise de hemceas.
Tampo de lise de hemceas:
- Sacarose 1,6 M
- Triron X-100 5%
- MgCl2 25 mM
- Tris.HCl 60 mM - pH 7,5

2. Deixe em temperatura ambiente agitando de vez em quando at que as clulas

vermelhas tenham sido lisadas.
3. Centrifugue por 30s a 13.000g para separar leuccitos no pellet. Remova e descarte o
sobrenadante.
4. Adicione 200 L de tampo de extrao e ressuspenda o pellet aspirando e ejetando de
uma seringa com agulha fina, vrias vezes.
Tampo de extrao:
- Guanidinium tiocianato 5,25 M
- Tris.HCl 50 mM, pH 6,4
- EDTA 20 mM
- Triton X-100 1%
- -mercaptoethanol 0,1 M
5. Adicione 20 L de acetato de sdio (2 M, pH 4,0) e misture por inverso.
6. Adicine 220 L de phenol e misture por inverso.
7. Adicione 60 L de chloroform/isoamyl alcohol (24:1) e vortex vigorasamente.
8. Ponha no gelo por 15min.
9. Centrifugue a 12.000g por 5 min e transfira a o sobrenadante para um novo tubo.
10. Adicione 200 L de isopropanol gelado, misture e ponha no freezer a -20oCpor 30
min.
11. Centrifugue a 12.000g por 15 min e descarte o sobrenadante.
12. Ressuspenda o pellet em 200 L de tampo de extrao.

22

13. Repita os passos de 3 a 9.

14. Lave o pellet com 400 L de etanol-70% gelado.
15. Centrifugue a 12.000g por 5 min e descarte o sobrenadante.
16. Remova o etanol completamente (com micropipeta e secando o restante com leno de
papel para laboratrio).
17.Ressuspenda em 100 mL de H2O (deixe a 50oC por 15 min para dissolver o pellet).
Como pode ser observado, os diferentes protocolos tm muito em comum.
Certamente, voc poder fazer adaptaes no protocolo dependendo dos resultados que
obtiver.

Eletroforese em gel de agarose:

Sob influncia de uma diferena de potencial eltrico tomos, molculas e partculas
com carga, em soluo aquosa, migram na direo do eletrdio com carga oposta. Como
as molculas tm cargas e massas variveis, a migrao em um meio de viscosidade
definida se dar em diferentes velocidades, com separao das vrias fraes de uma
mistura.
A mobilidade eletrofortica, que a velocidade de migrao por unidade de
campo eltrico, um parmetro caracterstico da molcula em um determinado meio
de eletroforese.

Este parmetro depende da densidade de cargas da molcula e do seu

tamanho. Depende, portanto, do pK do grupo ionizvel e do pH do tampo que disssolve

a amostra. Como a viscosidade do gel determina o atrito, limitando a velocidade
de propagao, a mobilidade eletrofortica ser dependente da temperatura. O que
normalmente analisamos a mobilidade eletrofortica relativa da molcula, comparandose as distncias de migrao com as de uma substncia padro, aplicada na mesma
corrida eletrofortica. Estas substncias constituiro marcadores que tornam a avaliao
da separao eletrofortica relativamente independente de variaes na diferena de
potencial eltrico e do tempo de eletroforese.

23

As amostras para eletroforese no podero conter partculas grandes ou gotculas

de leo em suspenso, pois estas interferem com a separao por bloquear os poros da
matriz de eletroforese. Pode-se centrifugar as solues antes de coloc-las no gel.
Separar substncias que tm ou cargas positivas ou cargas negativas, como os
cidos nucleicos, que s tm cargas negativas, no constitui, em geral, problema. As
molculas como as protenas cuja carga resultante dependente do pH do meio tero as
migraes eletroforticas fortemente influenciadas pelo pH do tampo.
A fora inica (concentrao total de ons) do tampo utilizado deve ser to baixa
quanto possvel (o mnimo que garanta um pH constante), reduzindo-se, desta forma, as
correntes inicas que fluem pelo gel e a dissipao trmica excessiva (lembrar que os
ons que constituem o tampo tambm migram eletroforeticamente, contribuindo para a
corrente total). Quem j se confundiu com os tampes, colocando na cuba de eletroforese
2 X SSC (SSC - tampo usado para Nothern e Southern blot), sabe o quanto aquece o gel
e do tampo.
A voltagem deve ser 1 a 5 Volts/cm (distncia entre os dois eletrodos).
Para se avaliar o progresso da separao e reconhecer o fim da corrida, corantes
com alta mobilidade eletrofortica so adicionados juntamente com a amostra.
A matriz do gel de eletroforese deve ter poros de tamanhos regulares e ajustveis,
deve ser quimicamente inerte. A eletro-osmose, que o arraste do solvente pela migrao
eletrofortica do soluto, quando os poros so pequenos, no deve ocorrer, pois alteraria a
mobilidade dos ons.
Os gis de agarose, um polissardeo extrado de algas marinhas, so adequados
para separar molculas com dimetro igual ou superior a 10 nm. Com a remoo da
agaropectina, se obtm tipos de agarose com diferentes graus de pureza e de eletrosmose.
As diferentes agaroses se caracterizam pelo seu ponto de fuso (melting point), que pode
variar entre 35oC e 95oC e pelo grau de eletrosmose (mr), que depende do nmero de
grupos polares que persistem aps a purificao.
O tamanho dos poros depende da concentrao de agarose. A concentrao
em geral dada como peso de agarose por volume de gua. Em geral, gis a 1% tm
poros em torno de 150 nm e gis a 0,16% tm poros em torno de 500 nm. A agarose
dissolvida em gua fervendo e forma um gel quando esfria. Durante esse processo h

24

formao de duplas hlices que se juntam lateralmente, de modo a formar filamentos

finos. Durante a geleificao h formao de polmeros.
Eletroforese em gel de agarose o mtodo de escolha para separao,
purificao e identificao DNA e RNA. So utilizados, para isso, gis horizontais,
submarinos: o gel fica diretamente mergulhado no tampo. O nvel do tampo deve ser 3
a 5 mm acima do gel. Excesso de tampo resulta em aquecimento. O gel de agarose tem
menor resoluo que o de acrilamida (que veremos posteriormente), mas tem uma faixa
de separao maior (entre 200 pb e cerca de 50 kpb).

Colorao de cidos nuclicos no gel de agarose:

O DNA ou o RNA podem ser facilmente visualizados pela colorao com
brometo de etdeo (EthB) em baixas concentraes. O brometo de etdeo um corante
flourescente, excitado por luz ultravioleta, que se intercala entre as fitas da dupla hlice
de DNA ou de segmentos antiparalelos complementares dentro de uma mesma molcula
de RNA (que fita simples). Quando desejamos diferenciar a migrao eletrofortica
de fragmentos de DNA parecidos, melhor fazer a colorao do gel aps amigrao,
porque o EthB intercalado na fitas de DNA modificam levemente a migrao.
O DNA ou o RNA podem ser revelados colocando-se o gel no transiluminador
com luz ultravioleta (254 nm). De 1 a 10 ng de DNA ou RNA so necessrios para um
sinal que se possa perceber a vista desarmada.
Justamente por se intercalar entre fitas da dupla hlice, o brometo de etdeo um
agente mutagnico e deve ser sempre manuseado com luvas, evitando-se qualquer tipo
de contaminao do pesquisador. O lixo contendo brometo de etdeo tambm necessita
tratamento especial, que comentaremos posteriormente.
Uma alternativa ao brometo de etdeo o corante SYBR Green I (para DNA) e
SYBR Green II (para RNA) - da Molecular Probes, que pode ser utilizado tanto em gel
de agarose como de poliacrilamida. Este corante pode detectar at 20 pg de DNA-dupla
fita e at 100 pg de RNA ou de DNA-fita simples. A excitao mxima obtida a
497nm; em 254 nm a sensibilidade cerca de 3 a 5 vezes menor. A emisso tem o pico
em 520 nm. O que torna o SYBR green superior ao brometo de etdeo a sensibilidade
de 50 a 100 vezes maior, podendo detectar 1-2 ng de oligonucleotdeos em gel de

25

poliacrilamida 5% (UV/450 nm). O SYBR Green tem excepcional afinidade por DNA e
apresenta um grande aumento de fluorescncia aps a ligao. muito menos
mutagnico que o brometo de etdeo, mas como ainda so poucos os dados referentes a
sua mutagenicidade.

Tcnica para eletroforese de DNA

Tampes:
Podem ser usados o TBE (Tris/base-Borato-EDTA) ou TAE (Tri/AcetatoEDTA).

Utilizamos na rotina de nosso laboratrio o TBE que tem maior capacidade

tamponante.
Ao preparar as solues de tampo use gua destilada e deionizada, proveniente
de um sistema de purificao tipo Nono-Pure ou MiliQ.
Soluo estoque de TBE concentrada em 10 vezes (por litro):
108g de Tris base/l (890 mM)
55g de cido brico/l (890 mM)
40 ml de EDTA 0,5 M - pH 8,0 (20 mM)
Concentrao de trabalho: diluir 10.
diluies de 20 vezes, sem problemas.
tende a produzir precipitao dos sais.

Para gel de agarose pode-se usar

A concentrao elevada da soluo estoque

Pode-se, para evit-la, preparar solues

estoque 5 vezes concentrado.

Soluo estoque de TAE concentrada 50 vezes (para 1 l):

242g de Tris base
57,1 ml de cido ctico glacial (Tris.acetato 2M)
37,2g de Na2EDTA.2H20 (100 mM)
H2O para 1 l
Concentrao de trabalho: diluir 50 vezes (40 mM Tris.acetato; 2 mM
Na2EDTA.2H2O; pH ~8,5)
TAE tem menor poder tamponante, e a capcidade de tamponamento pode se esgotar se o
tempo de eletroforese for muito longo.

26

Preparao do gel de agarose a 1 %

1. Adicione 100 ml de TBE ou TAE a 1g de DNA Typing Grade Agarose.
2. Misture e aquea no forno de micro-ondas por tempo de 1 min a 1 min e 30 seg.
3. Misture, agitando levemente o frasco, e verifique se no h fragmentos ntegros de
agarose. Se houver aquea por mais alguns segundos.
4. Coloque a agarose fundida num cilindro graduado de 100 ml e complete o volume
com gua (alguma gua ter evaporado)
5. Retorne a agarose para o frasco anterior e adicione 5 l de soluo de Brometo de
Etdeo (10mg/ml). Se for corar com SYBER Green, no execute este passo.
6. Coloque a agarose na bandeja de eletroforese previamente vedada e com o pente que
formar as pocinhas onde sero colocadas as amostras de DNA.
7 . Deixe esfriar.
Prepare 1 l de TBE ou TAE para cobrir o gel de agarose na cuba de eletroforese.

Preparo da amostra de DNA:

1. Separe o volume da amostra de DNA a ser colocado no gel de eletroforese (de acordo
com a quantificao feita previamente)
2. Acrescente gua (MilliQ-autoclavada) at o volume final desejado (por ex.: 18 l)
3. Acrescente o loading buffer concentrado 10 vezes, de modo a dilu-lo para
concentrao de trabalho (no exemplo: 2 ul).
Loading Buffer:
Para que a amostra de DNA permanea nas poas do gel de agarose (visveis
quando se retira o pente que serve de molde), necessrio que se acrescente a ela algo
que a torne mais densa que o tampo de corrida (ex: Ficoll 400, glicerol ou sacarose).
Alm disso, acrescentamos um ou dois corantes de elevada mobilidade eletrofortica,
que nos fornecer informao sobre o andamento da eletroforese, indicando o
momento de interromp-la.
Se sua banda migra junto com o corante dificultando sua visualizao, dilua
o "loading buffer" em glicerol-30, 1:5.

Protocolos

27

1- 5ml de loading buffer concentrado 10 vezes:

1 ml de EDTA 0,5 M - pH 8,0 (100 mM EDTA)
2,5 ml de glicerol (50%)
0,025g de azul de bromofenol (0,5%)

ou
2- loading buffer com TAE - concentrado 2 vezes:
2X TAE buffer pH 8,3
20 Mm EDTA
5% Ficoll 400
0,1% azul de bromofenol

Coloque a amostra no gel, sempre ao lado de um marcador de peso molecular

que deve ser preparado do mesmo modo que sua amostra. Desligue a eletroforese
quando o azul de bromofenol tiver percorrido cerca de 2/3 do gel ou mais.
Se tiver colocado brometo de etdeo no gel, visualise o DNA no transiluminador
UV e fotografe (Polaroid, filme 667 branco e preto). Utilize uma rgua transparente a
UV durante a fotografia, para marcar a posio dos marcadores de peso molecular aps
transferncia do DNA para a membrana, no passo posterior (Southern blot).
Se utilizar SYBR Green, dilua-o a 1:10.000 em TE (10 mM Tris.HCl, 1
mM EDTA, pH 8,0), em TBE ou emTAE, pH entre 7,5 e 8,0 (preferencialmente
8,0). Cubra o gel com o corante diludo por 10-40 min, dependendo da espessura do
gel. Remova o gel do corante, visualise o DNA no transiluminador UV (254 nm) e
fotografe, ou faa o scanning do gel no STORM (Molecular Dynamic), se dispuser
desse equipamento.

Quando se pretende fazer uma anlise posterior dos fragmentos de DNA,

separados por eletroforese, necessrio transfer-los para uma membrana (nylon) para
posterior hibridizao com sonda especfica (ver protocolo de Southern blot mais
adiante).

28

Tcnica para eletroforese de RNA:

Fundamentos
Para a eletroforese de RNA o tampo usualmente utilizado o MOPS (3-(Nmorpholino)-propanesulfonic acid), pH 7,0 (o RNA facilmente hidrolizado em meio
alcalino). Como o objetivo mais freqente transferir o RNA para uma membrana
(northern-blot), para posterior anlise com sondas especficas, a eletroforese efeita
em condies desnaturantes, porque embora a molcula de RNA tenha uma nica
fita, dupla hlice de segmentos antiparalelos complementares so freqentes e sua
persistncia ir dificultar a ligao do RNA membrana, assim como a hibridizao
da sonda com a molcula de RNA que est sendo analisada. O agente desnaturante
mais freqentemente utilizado o formaldedo (embora existam outras opes, como o
glioxal).

Tcnica
Soluo estoque de MOPS (10X):
0,4M MOPS, pH 7,0
0,1M acetato de sdio
0,1M EDTA
Preparao da soluo
A 400 ml de H20-DEPC (autoclavada) adicione
20,9g de MOPS
8,3 ml de acetato de sdio 3M - pH 5,2 (soluo tratada com DEPC e
autoclavada)
Ajuste o pH para 7,0 com pellets de NaOH
Eleve o volume final para 500ml
Esterilize por filtrao ou autoclave (se autoclavar, a soluo ficar amarelada,
o que normal).
Armazene a soluo protegida da luz (envolva o frasco em papel alumnio)

Gel de agarose:

29

1. 1,0 a 1,5 g de agarose

2. 10 ml de 10X MOPS
3. 87 ml de H2O-DEPC autoclavada
4. Dissolva a agarose, aquecendo em forno de micro-ondas
5. Deixe esfriar em banho-maria a 50oC
6. Adicione 5,1 ml de formaldedo a 37% (em capela para produtos qumicos
txicos)
7. Homogeinize muito bem evitando formar bolhas
8. Coloque na bandeija de eletroforese, j com o pente, e deixe esfriar.
(A cuba de eletroforese, a bandeja o pente devem ser previamente tratados para
eliminar quaquer contaminao com RNase, como previamente descrito).

Loading buffer para RNA (1 ml)

1. 0,75 ml de formamida pura (deionizada)
2. 0,15 ml de 10X MOPS
3. 0,24 ml de formaldedo 37%
4. 0,1 ml de H2O-DEPC autoclavada
5. 0,1 ml de glicerol (autoclavado)

Preparo da amostra para eletroforese:

1. Separe as alquotas de RNA a serem submetidas a eletroforese, de acordo com a
quantificao feita previamente.
2. Se o volume por superior a 5 l, reduza-o a 5l no dessecador a vcuo. Se for
inferior a 5 l, complete com gua para 5 l.
3. Adicione 25 l de loading buffer
4. Aquea a 65C por 15 min (para desnaturar) e ponha em seguida no gelo.
5. Se for corar com brometo de etdeo, acrescente amostra 1 l de soluo de brometo
de etdeo (1mg/ml) em H2O-DEPC autoclavada. Se for corar com SYBR Green,
coloque a amostra nas poas do gel, previamente coberto com tampo MOPS 1X
(diludo em H2O-DEPC autoclavada), sem a adio do brometo de etdeo.

30

6. No obrigatrio o uso de marcador de peso molecular para RNA, porque como se

trata de RNA total, os RNAs ribossmicos, muito abundantes, servem para indicar o
tamanho das molculas em cada posio (rRNA 28S ~ 5kb; rRNA 18S ~ 2kb).
7. Corra a eletroforese at o corante percorrer 2/3 a 3/4 da extenso do gel.
8. Visulize no transiluminador UV e fotografe (utilize uma rgua transparente a UV
durante a fotografia, para definir a posio das molculas de RNA), ou
9. Core com SYBER Green II, do mesmo modo descrito para DNA. visualize no
transiluminador ou faa o scanning no STORM.

Se desejar, transfira o RNA para membrana de nylon (northern-blot).

O gel til para se verificar a integridade do RNA (avaliada pelo aspecto do
RNA ribossomal) que, na rea de diagnstico, quase sempre ser usado para transcrio
reversa e PCR (RT-PCR).

Transferncia para membrana (Southern-blot):

Southern-blotting a transferncia de fragmentos de DNA do gel de
eletroforese para uma membrana que serve de suporte. A transferncia e o tratamento
subseqente (secagem e exposio a luz ultravioleta) resultam em imobilizao de
fragmentos de DNA na membrana, de forma semi-permanente. Aps a imobilizao,
o DNA pode ser submetido a anlise por hibridizao, que permite a identificao de
bandas contendo molculas de DNA similares molcula de cido nucleico utilizada
como sonda.
Os tipos de membrana mais comumente utilizadas so as de nitrocelulose e as
membranas de nylon, com ou sem cargas positivas. As membranas de nylon so mais
freqentemente empregadas porque so mais resistentes, permitindo o uso sucessivo de
vrias sondas. A membrana de nitrocelulose, no entanto, em algumas situaes pode
fornecer menos background (ligao inespecfica da sonda).

31

O mtodo bsico de transferncia a transferncia por capilaridade, usando um

tampo com elevada concentrao de sal, o que permite a ligao do DNA membrana.
Na presena de elevada concentrao de sal o DNA fica preso membrana durante a
transferncia, mas no de forma permanente. A imobilizao permanente (ou semipermanente) obtida pela exposio a luz UV (membrana de nylon, com a qual o DNA
estabelece ligaes covalentes) ou secagem prolongada (2 horas) em forno vcuo a
80oC (membrana de nitrocelulose, com a qual o DNA estabelece interao hidrofbica
relativamente fraca, no covalente).
O protocolo de transferncia dividido em trs etapas:
1. O gel de agarose tratado com solues que promovem a despurinao
(necessria apenas quando se pretende transferir eficientemente molculas maiores
que 5 kpb; esse procedimento remove purinas introduzindo nicks nas fitas de DNA),
desnaturao (separao das fitas da dupla hlice, fundamental para que o DNA se ligue
membrana e sonda) e neutralizao (quando o pH do gel cai a valores menores que
9, o que fundamental para que o DNA se ligue membrana).
2. A segunda etapa a transferncia propriamente dita.
3. Finalmente, o DNA imobilizado na membrana.

Despurinao: tratamento com HCl - 0,25M.

Deixe o gel mergulhado nessa soluo, sob agitao leve e contnua, por 30 minutos,
temperatura ambiente (TA).

Desnaturao: tratamento com soluo de NaCl 1,5M/NaOH 0,5M

Deixe o gel mergulhado nessa soluo, sob agitao leve e contnua, por 20 minutos
(TA)

Neutralizao: tratamento com soluo de NaCl 1,5M/Tris.Cl 0,5M, pH 7,0.

descarte a soluo denaturante e enxague o gel com gua MiliQ. Em seguida deixe o
gel mergulhado na soluo de neutralizao por 20 minutos. Troque a soluo e lave
por mais 20 minutos.

32

A transferncia propriamente dita feita promovendo o fluxo de um tampo

(20X SSC ou 10X SSC) atravs do gel, em direo membrana, de modo que o fluxo
dessa soluo arraste as molculas de DNA que ficam depositadas na membrana, j que
no a podem atravessr (poros de 0,45 um). Esse fluxo induzido aplicando-se uma
camada espessa de papel absorvente sobre a membrana que est em contado com o gel
(ver esquema da montagem), ou por aplicao de presso negativa que fora a
passagem do tampo atravs do gel e da membrana.
20X SSC:
NaCl - 3 M
Na3-citrato - 0,3 M
Ajuste o pH PARA 7,0 com 1 N HCl
Autoclave e estoque em temperatura ambiente.

A transferncia por capilaridade demora de 15 a 16 horas e a transferncia por

presso negativa, bem menos demorada, demanda 1 hora. Concluda a transferncia, a
membrana removida aps a marcao das posies correspondentes s poas do gel de
agarose (assim se poder medir a distncia de migrao e comparar com a fotografia do
gel, que foi feita com este ao lado de uma rgua), e lavada em soluo 2X SSC por 5
min, para remover o excesso de sal e vestgios de agarose. Em seguida a membrana
colocada entre dois pedaos de papel de filtro (3MM-Watmann) e submetida a secagem
em forno, a 80oC, por 20 minutos, para fixao por UV, ou por 2 horas, se no se usar
UV. Terminado esse passo, a membrana est pronta para hibridizao com uma sonda
especfica, e pode ser guardada por tempo indeterminado, em ambiente bem sco.
Fixao por UV: Expe-se a membrana a 70.000 microjoules/cm2 de radiao UV, 254
nm, por 2 a 3 minutos (UV crosslinker - Amersham).

33

Estratgias de Hibridizao:
Definies importantes:
DNA com cpia nica: so as seqncias de DNA que ocorrem uma s vez no genoma
haplide (na verdade, nessa definio podem estar includas seqncias com um nmero
muito pequeno de cpias).
Seqncias repetidas de DNA: seqncias que ocorrem vrias vezes.
Complexidade: descreve o total de seqncias diferentes em uma amostra de cidos
nuclicos; isto , seqncias que no pareiam entre si nas condies experimentais
utlizadas.
Quando se trata de RNA, complexidade tem o mesmo significado, independente da
abundncia de cada transcrito.
Desnaturao: separao de seqncias complementares de cidos nuclicos.
Reassociao ou renaturao: o restabelecimento de pontes de H+ entre duas seqncias
complementares, previamente separadas.
Estringncia: se refere s condies fsicas em que a desnaturao ou a renaturao
ocorre. Os fatores fsicos que interferem com a estringncia sero discutidos adiante.
Zippering: descreve o fenmeno que ocorre logo aps o incio da reassociao. H
formao de um ncleo de reassociao seguida de rapidssimo pareamento do restante
da seqncia.
Hibridizao: utilizado atualmente para descrever o pareamento de bases (formao de
duplexes) entre seqncias especficas, a partir de qualquer combinao de fragmentos de
cidos nuclicos (DNA ou RNA), usualmente in vitro.
Melting Temperature (Tm): a temperatura na qual as fitas de cidos nuclicos que
se pareiam entre si esto desnaturadas em 50%. um parmetro til para avaliao da
estabilidade da dupla-fita (seja DNA-DNA, DNA-RNA ou RNA-RNA).

Fatores que afetam a velocidade de reassociao

1. Temperatura: a velocidade mxima alcanada a cerca de 25oC abaixo do Tm.
2. Concentrao do sal: em concentrao NaCl abaixo de 0,1 M, um aumento de 2 vezes
na concentrao aumenta a velocidade de reassociao entre 5 e 10 vezes. A velocidade

34

continua a subir at concentrao de sal de cerca de 1,2 M, que corresponde a cerca de 7

vezes a concentrao numa situao padro. Ctions divalentes, que esto frequentemente
presentes como impurezas nas solues, tm um efeito muito mais intenso que os ctions
monovalentes, tornando necessrio o uso de EDTA como quelante em situaes em que
se deseja uma estringncia elevada.
3. Pareamentos imperfeitos (mismatch): para cada 10% de pareamentos imperfeitos
a velocidade de reassociao reduzida de um fator de aprox. 2 vezes, quando a reao
ocorre em temperaturas 25oC abaixo do Tm.
4 .Comprimento do fragmento:
4.1. Reassociao de DNA-DNA: a velocidade de zippering muito rpida quando
comparada velocidade de formao do pareamento inicial (nucleao). Se os
fragmentos complementares so do mesmo tamanho, a velocidade de reassociao
se eleva com a raiz quadrada do comprimento (nmero de bases), relao vlida para
fragmentos entre 100 e 100.000 pb. Isso aparentemente se relaciona com o maior
nmero de possibilidades de nucleao, contrabalanado pela maior restrio espacial
oferecida pelos fragmentos maiores. Quando os dois fragmentos so de tamanhos
diferentes, o efeito do comprimento sobre a velocidae de reassociao depende de qual
fragmento est presente em excesso. Se fragmento em excesso o curto, a velocidade
de reassociao aumenta com o tamanho do fragmento escasso. Se ocorre o contrrio,
h uma inesperada reduo na velocidade de reassociao.
4.2. Reassociao de RNA-DNA: na reao com excesso de DNA, a velocidade de
reassociao cerca de 4 a 5 vezes menor do que a da interao DNA-DNA.
5. Viscosidade: quando se considera o efeito da viscosidade, deve-se distinguir entre
viscosidade microscpica e macroscpica. Viscosidade microscpica se refere ao micro
ambiente em torno do DNA e comumente alterada pela adio de sacarose, glicerol
ou perclorato de sdio. A macroviscosidade depende da presena de polmeros (entre
eles o prprio DNA). Aa viscosidade, medida em viscosmetro, inclui ambas, a micro
e a macroviscosidade. Na presena de sacarose, glicerol, etilenoglicol e perclorato de
sdio, a velocidade de reassociao do DNA inversamente proporcional viscosidade.
O aumento da macroviscosidade (presena de ficoll ou dextran sulfato), por outro
lado, aumenta a velocidade de reassociao, porque provoca um aumento efetivo na

35

concentrao de cido nucleico em soluo.

6. Composio de bases: praticamente no tem efeito sobre a velocidade da reassociao.
7. Agentes desnaturantes: em soluo aquosa, a velocidade ideal de reassociao de
cidos nuclicos ocorre em temperaturas entre 60oC e 75oC. No entanto, extensos
perodos de incubao nessas temperaturas podem levar a considervel quebra das
molculas de cidos nucleicos, por agitao trmica. Para reduzir a temperatura,
mantendo a estringncia, pode-se introduzir agentes desnaturantes, como a formamida,
que desestabilizam a dupla hlice, o que reduz a velocidade de reassociao. Adio de
1% de formamida reduz o Tm em 0,72 oC e a velocidade de reassociao em cerca de
1,1%. A reduo na velocidade de reassociao se deve a aumento da microviscosidade.
A comparao da taxa de degradao de DNA observada em soluo aquosa, em
temperatura elevada, com a observada com formamida a baixa temperatura, mostra que
a reduo na degradao compensa, em muito, a reduo na velocidade de renaturao.
Para hbridos RNA-DNA a relao entre concentrao de formamida e reduo no Tm
no linear. Na presena de formamida 50%, a estabilidade do hbrido RNA-DNA
maior que a da dupla hlice de DNA. Essa uma vantagem que pode ser explorada em
tcnicas de microscopia, nas quais se pretende a pareamento in situ com RNA mas no
com DNA.

Fatores que interferem com a estabilidade da dupla hlice

1. Pareamentos imperfeitos (mismatch): 1% de mismatch reduz a estabilidade trmica
em cerca de 1oC (avaliado pelo Tm).
2. Comprimento do fragmento: Quanto maior o fragmento, maior a estabilidade da dupla
hlice.
3. Concentrao de sal: na faixa de concentrao de 0,01-0,1M, o Tm muda cerca de
16C para cada 10 vezes de variao na concentrao de sal. O efeito menor em
concentraes mais elevadas (1M). Os ction divalentes tm um efeito muito mais
intenso que os monovalentes sobre o Tm.
4. Composio das bases: como o pareamento GC mais estvel (3 pontes de H) que
o pareamento AT (2 pontes de H), o Tm de uma dupla-hlice est realcionado com
contedo de GC de acordo com a equao emprica:

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Tm = 0,41 (%GC) + 69,3

O efeito da composio das bases, no entanto, pode ser eliminado na presena de alguns
solventes caotrpicos (por exemplo, o: cloreto de tetrametilamnio 2,4 M).
5. Criterion: essa palavra descreve o limite mnimo de fidelidade do pareamento de
bases e comprimento da duplex, estabelecido pelas condies de incubao. Na presena
de tetrametilamnio, situao em que variaes no Tm, decorrentes da composio das
bases, so eliminadas, o criterion pode ser definido com preciso de 1oC.
A temperatura de incubao (Ti) para a hibridizao ideal de uma sonda pode ser
calculada pela equao emprica:
Ti = Tm - 15C
Tm = 16,6 log[M] + 0,41[Pgc] + 81,5 - Pm - B/L - 0,65[Pf]
Onde:
M - concentrao molar de Na+, at um mximo de 0,5M (1 X SSC contm
0,165M de Na+)
Pgc - a porcentagem de bases G e C na sonda
Pm - a porcentagem de mismatched bases
Pf - a porcentagem de formamida
B - 675 para sondas de at 100 bases
L - o comprimento da sonda em nmero de bases
Obviamente, essa frmula serve como uma orientao incial, no substituindo o
teste empirico, no laboratrio.

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Marcao de cidos nucleicos a serem utilizados como sondas:

Marcao com istopo radioativo:
Escolha do istopo:
32P

meia-vida: 14,3 dias

tipo de decaimento: beta
energia: alta

33P:

meia vida:
tipo de deacimento: beta
energia: mdia

35S:

meia vida - ~75 dias

tipo de decaimento: beta
energia: baixa

125I:

meia-vida - 60 dias
tipo de decaimento: gama
energia: mdia

3H:

meia-vida: 12,35 anos

tipo de decaimento: beta
energia: baixa

Mtodos de marcao:
1- Nick-translation:
Esse processo utiliza DNAase I para gerar quebras (nicks) em cada fita da
dupla fita de DNA. As aes de exonuclease 5-> 3 e de polimerase 5->3da DNA
polimerase I de E. coli so usadas para remover trechos de DNA a partir das quebras e
substitu-los por segmentos de DNA-fita nica, marcados pela incorporao de
desoxirribonucleotdeos

com

tomos

desoxirribonucleotdeo marcado com

125I, 3H

radioativos.

32P, 35S

3- Marcao com T4 DNA polimerase:

utilizar

qualquer

na posio alfa. Nucleotdoes marcados

ou biotina tambm podem ser incorporados.

2- Random oligonucleotide-primed labelling

Pode-se

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A T4 DNA polimerase possui atividade de exonuclease 3->5 e atividade de

polimerase 5->3. Na ausncia de fosfato de desoxirribonucleosdeos exgenos verificase apenas a atividade de exonuclease que, em condies normais (temperatura e tampo
adequados), remove cerca de 25 nucletdeos/min. Quando os nucleotdeos so
adicionados, a atividade de polimerase predomina, e a extremidade previamente
removida preenchida, agora com um ou mais desoxirribonucleotdeos marcados.

4- Marcao da extremidade com T4 polinucleotdeo quinase (T4 PNK):

A polinucleotdeo quinase usada para transferir o fosfato gama do ATP para o
grupo 5OH livre na extremidade da molcula de DNA ou RNA. Essa enzima tem
tambm uma atividade fosfatsica. Duas reaes so, portanto, possveis: a)forward
reaction em que a enzima cataliza a fosforilao, aps remoo do fosfato do terminal 5
com fosfatase alcalina, e b) exchange reaction em que a enzima cataliza a troca de um
fosfato 5 previamente existente pelo fosfato gama do ATP. A reao de troca tem que
ser realizada na presena de excesso de ATP e ADP, para que se consiga uma
fosforilao adequada. Ambas as reaes so mais eficientes quando o DNA tem
extremidade 5 protusa. A extremidade 5 recuada fosforilada com muito menor
eficincia. Extremidades rombas (blunt) so marcadas com eficincia intermediria.
O RNA mais eficientemente marcado pela T4 PNK aps clivagem da base com
NaOH.

5- Marcao da extremidade com desoxinucleotidil transferase terminal (Terminal

Deoxynucleotidyl Transferase - TDT)
Essa enzima adiciona desoxinucleotdeos na extremidade 3 dos fragmentos de
DNA. Tanto DNA-fita dupla como DNA-fita nica so substratos, na presena de
cobalto como co-fator. At mesmo a extremidade 3 recuada substrato. Para evitar a
formao de caudas de homopolmeros com comprimento varivel pode-se usar um
anlogo do nucleotdeo que tenha o oxignio do grupo 3OH removido (alfa32Pcordycepin trifosfato).

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6- Marcao da extremidade com o fragmento grande da DNA polimerase I de E. coli

(Klenow fragment)
O fragmento Klenow da DNA polimerase I de E. coli, que tem atividade de
polimerase 5-> 3, pode ser usada para preencher extremidades 3 recuadas, que ocorram
naturalmente, ou que foram geradas por enzimas de restrio, tornando a extremidade
romba. Para isso se usa um ou mais dos desoxirribonucleotdeos marcados a serem
incorpoarados.

7- Uso de exonuclease III para criar extremidades 5 protusas (ou 3 recuadas):

uma alternativa utilizao de T4 DNA polimerase.

Sistemas especiais de clonagem para marcao de cidos nucleicos com alta

atividade especfica:
1- Sonda universal com plasmdeo M13:
O DNA a ser utilizado como sonda deve ser clonado nas sries pares dos
vetores M13 (por ex.: M13mp8), pelas tcnicas usuais de clonagem em plasmdeo.. Um
oligonucleotdeo de 13 mer (5 GAAATTGTTATCC 3), complementar a um segmento
do plasmdeo, localizado na regio 5 que flanqueia o stio de mltiplos pontos de
clonagem deste (multiple cloning site), usado como primer universal para sntese
da fita marcada complementar (fita (-)) seqencia da fita (+) do plasmdeo, feita pelo
fragmento Klenow da DNA polimerase I de E. coli. A sntese da fita minus (-) no
completa, de tal modo que a insero especfica no stio de clonagem permanece como
fita nica, e, portanto, disponvel para a hibridizao com a seqncia complementar que
se deseja localizar.
2 - Sistema utilizando T3 e T7 RNA polimerase ou SP6 RNA polimerase
O fragmento de DNA a ser utilizado como sonda inserido no vetor plasmdeo
SP6, derivado do pBR322, no qual foi inserido o gene da RNA polimerase SP6 (fago de
Samonella) e seu promotor. Algumas bases adiante do promotor est o mltiplo stio de
clonagem, onde inserido o DNA de interesse.

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Outra possibilidade, mais verstil que a anterior devido existncias de dois

promotores, a insero do segmento de interesse no plasmdeo Blue Script, cujo
mltiplo stio de clonagem flanqueado pelos promotores das RNA polimerases T3 e T7.
Uma vez inserido o fragmento de DNA que servir como sonda, o plasmdeo
linearizado, utilizando uma enzima de restrio que corte imediatamente aps, ou bem na
extremidade da seqncia especfica clonada, e em seguida porcede-se sntese do RNA
complementar, marcado com [alfa 32P]rNTP.
Esse sistema porque fornece uma grande quantidade de transcrito marcado (at
10 g para cada 1g de template), com elevada atividade especfica. O inconveniente
a instabilidade do RNA. A sonda deve ser tratada com todos cuidados dispensados ao
manuseio de molculas de RNA. No se presta tambm a hibridizao in situ, devido
facilidade de degradao.

Marcao no radioativa de cidos nucleicos:

Essas sondas eliminam os cuidados relacionados ao uso de radioistopos e tm a
vantagem adicional de serem estveis, podendo ser estocadas por perodos de 6 meses a
2 anos.
Embora vrios tipos de marcadores no radioativos tenham sido descritos na
literatura, a biotina (GIBCO-BRL e outros) e digoxigenina (Boehringer Mannhein) so
os mais comumente utilizados e esto disponveis comercialmente. Ambos podem ser
facilmente incorporados em sondas de DNA e ser detectados com os sistemas de
deteco que comentaremos em seguida.
Os desoxinucleotdeos marcados com biotina podem ser detectados por
complexos contendo avidina ou streptavidina, molculas que apresentam alta afinidade
por biotina. A avidina uma glicoprotena (68.000 Da) derivada da clara do ovo, e
a streptavidina uma protena (60.000 Da) do Streptomyces avidinii. A avidina ou a
streptavidina podem estar ligadas a uma enzima, como a fosfatase alcalina, podendo esta
ser detectada pela adio de um substrato que resulte em um produto colorido, insolvel.
O sistema de deteco pode envolver, alternativamente, a utilizao de um anticorpo

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anti-biotina, anti-avidina, anti-streptavidina, ou ainda anti-digoxigenina, seguida de um

anticorpo secundrio conjugado a um fluorocromo ou a uma enzima.
Quando se usa anticorpo anti-biotina, o bloqueio da membrana no pode ser feito
com leite desnatado, porque este contm biotina e causar intenso background.
DNA a ser marcado pode ser um fragmento isolado, ou, como nas sondas para
hibridizao in situ, um clone no fago, cosmdeo ou plasmdeo intacto.

Sondas Biotiniladas:
A incorporao de nucleotdeos biotinilados (bio-11-UTP ou bio-16-UTP no
lugar de dTTP e bio-14-dATP no lugar de dATP) feita atravs das tcnicas previamente
discutidas para marcao de cidos nucleicos com istopos radioativos. Os mtodos
comumente empregados so nick-translation ou sntese com oligonucleotdeos
aleatrios biotinilados na extremidade 5(random primed labelling).
A Biotina uma vitamina hidrossolvel, que pode ser covalentemente ligada
posio C5 do anel pirimidnico por meio de um linker alilamina: bio-11-dUTP, ou
bio-16-dUTP, no lugar de dTTP e bio-14-dATP no lugar de dATP (os nmeros referemse ao nmero de grupos CH2 presente no linker). O linker propicia uma distncia
razovel entre a biotina e a base marcada, o que diminui a restrio espacial decorrente da
presena da biotina.
A tcnica deNick Translationresulta em incorporao, em condies normais,
de cerca de 50 nucleotdeos biotinilados por cada 1000 pb.
Para Random Primed Labelling com oligonucleotdeos no biotinilados
normalmente se usam hexmeros. Com oligonucleotdeos biotinilados so usados
octmeros, pois a adio de mais dois nucleotdeos necessria para a estabilizao
do annealing, devido instabilidade decorrente da restrio espacial dada pela biotina
na posio 5terminal. Nesse ltimo mtodo, comum adicionar-se reao de sntese
pelo menos um desoxinucleotdeo biotinilado (bio-16-dUTP, por ex.), para aumentar a
eficincia da marcao. O DNA que serve de template ( com 200 pb ou mais) tem que
estar linearizado e removido do vetor onde foi clonado, para maior eficincia. Podem ser
marcados de 25ng a 2 g de DNA, mas a eficncia da marcao maior com 25 a 50ng
de DNA.

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Digoxigenina-11-dUTP tambm pode ser incorporada ao DNA tanto por Nick

Translation como por random oligonucleotide primed synthesis. Os protocolos so
basicamente os mesmos utilizados para marcao com biotina.
Essas sondas podem ser manuseadas normalmente, evitando-se apenas extrao
com fenol e desnaturao alcalina (a desnaturao deve ser feita pela incubao em
temperatura elevada, seguida de transferncia imediata da sonda para o gelo).
Deteco por mtodo colorimtrico:
A biotina detectada atravs de incubao com avidina ou streptavidina, ou ainda
com um anticorpo anti-biotina, quimicamente acoplados a uma enzima que cataliza uma
reao cujos produtos podem ser quantificados por colorimetria (fosfatase, luciferase,
peroxidase).
Um exemplo de sistema de deteco a streptoavidina conjugada a fosfatase
alcalina, que se liga fortemente biotina e visualizada quando se adiciona um substrato
da fosfatase alcalina que produz um precipitado colorido (NBT/BICP - nitroblue
tetrazolium/5-bromo-4-chloro-3-indoyl phosphate). O limite mnimo de deteco com
esse mtodo colorimtrico cerca de 2 pg de DNA.

Deteco por quimiluminescncia:

O advento de tcnicas de quimiluminescncia e de fluorescncia tem tornado
essas sondas quase to sensveis quanto as marcadas com istopos radioativos (mtodos
de deteco com quimiluminescncia so cerca de 5000 vezes mais sensveis que os
colorimtricos).
A fosfatase alcalina reage com um substrato quimiluminescente que resulta na
deteco altamente sensvel do DNA alvo. O substrato fluorescente o DIOXETANE.
Este clivado pela fosfatase alcalina o que resulta na emisso localizada de luz que pode
ser detectada por um filme de raio-X.
Os sistemas comerciais so vrios, mas o princpio o mesmo em todos eles.
O fragmento de DNA marcado com biotina, aps hibridizao com a sequncia alvo
imobilizada em membrana de nylon, ligado a fosfatase alcalina biotinilada e, em
seguida exposto, ao substrato de deteco.

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Outra possibilidade a utilizao de sondas de cidos nucleicos marcadas com

a prpria fosfatase alcalina (ACES - GIBCO/BRL). Nesse caso, aps a hibridizao da
sonda, passa-se diretamente ao sistema de deteco (LUMI-PHOS PLUS - GIBCO/BRL).
A deteco com quimiluminescncia deve ser feita em membrana de nylon.
Membranas de nitrocelulose no so indicadas, porque estas promovem o esmaecimento
do sinal luminoso (quenching).

Sondas marcadas com substncias fluorescentes - deteco por

fuorescncia e quimifluorescncia:
Para sntese se sondas fluorescentes, se utiliza um desoxinucleotdeo marcado
com fluorescena (ex.: fluorescena-11-dUTP - Fl-dUTP). O sistema de marcao pode
ser Nick Translation ou Radom Primed Labelling. O sistema comercialmente
disponvel at o momento por Random Primed Labelling (Vistra Florescence AMERSHAM). So utilizados monmeros aleatrios como primers para a reao de
sntese da fita marcada pela Klenow DNA-polimerase. A sonda sintetizada (com
rendimento de cerca de 7ng/l por 25ng de DNA-template) pode ser estocada a -20oC por
6 meses ou mais.
Aps a hibridizao, a deteco pode ser feita imediatamente, sem amplificao
do sinal, em FluorImager (ex.: STORM - Molecular Dynamics). Se for necessrio, a
membrana pode ser tratada com reagentes que amplificam o sinal. O sistema de
amplificao consiste de um anticorpo anti-fluorescena conjugado a fosfatase alcalina.
Aps a ligao do anticorpo, adiciona-se o substrato da fosfatase alcalina (AttoPhos
reagent - Amersham - fosfato orgnico aromtico, cuja estrutura confidencial), podendo
a membrana ser submetida a scanning em FluorImager. Embora o sinal mais intenso
seja observado 24 horas aps a adio do substrato, aps 1 a deteco j possvel.