EL RIG-I SENSOR DE ARN CON FUNCION DOBLE COMO SENSOR INATO

Y FACTOR ANTIVIRAL DIRECTO PARA EL VIRUS DE LA HEPATITIS B

En breve
El mecanismo de deteccin de virus de la hepatitis B (HBV) y los eventos de
sealizacin posteriores quedan por totalmente aclarado. Sato y colegas
demuestran que la RIG-I sensor ARN no slo detecta ARN de HBV pregenmico
para inducir preferentemente la produccin de interfern tipo III, sino que
tambin contrarresta la interaccin de la polimerasa viral con el ARN
pregenmico para la defensa antiviral contra el VHB.
Aspectos ms destacados

IFN tipo III se induce predominantemente en hepatocitos humanos

durante la infeccin HBV
RIG-I detecta el genotipo del VHB A, B, y C para la induccin de IFN tipo
III
La regin 5'- del VHB pgARN es un elemento clave para el
reconocimiento inmediato de RIG-l
RIG-I contrarresta la interaccin de VHB P con pgARN para suprimir la
replicacin viral

RESUMEN
El reconocimiento innato del husped desencadena la respuesta inmune clave
para la eliminacin viral. El mecanismo de deteccin de virus de la hepatitis B
(HBV), un virus de ADN, y la forma de sealizacin an no se han aclarado
completamente. Aqu, se encontr que el tipo III, pero no el tipo I de
interfern se inducen predominantemente en hepatocitos primarios humanos
en respuesta a la infeccin por VHB, mediante el cido retinoico se induce el
gen -I (RIG-I) (Los receptores tipo RIG (gen inducible por cido retinoico),
deteccin mediada por la regin 5 - de ARN pregenmico del HBV. Adems,
RIG-I podra tambin contrarrestar la interaccin de la polimerasa del VHB
(protena P) con la regin 5 - de una manera dependiente de unin al ARN,
que suprimiendo consistentemente la replicacin viral. La liberacin mediada
por lisosomas y la expresin basada en el vector de esta regin derivada RNA
en el hgado abolieron la replicacin del VHB en hepatocitos humanosquimricos de ratn. Estos hallazgos identifican un mecanismo de
reconocimiento innato por el cual RIG-I tiene funcin doble como un sensor de
HBV en
la activacin de la sealizacin innata y para contrarrestar la
polimerasa viral en hepatocitos humanos.
INTRODUCCIN
Virus de la hepatitis B (VHB) es un virus hepatotropos de la familia
Hepadnaviridae y contiene un genoma de ADN circular, parcialmente de doble
hebra de aproximadamente 3,2 k pares de bases que se replica a travs de la
transcripcin inversa de un ARN pregenmico (pgARN). VHB causa inflamacin
heptica asociada a una elevada morbilidad en todo el mundo. Alrededor de
cuatrocientos millones de personas en todo el mundo estn infectadas
persistentemente con el VHB, el cual es un importante factor causal asociado
no slo con la inflamacin, sino tambin la cirrosis e incluso cncer de hgado.
Actualmente, el interfern (IFN) y nuclesidos/nucletidos anlogos estn
disponibles para el tratamiento del VHB. Sin embargo, las tasas de respuesta a
largo plazo todava no son satisfactorios. La elucidacin (explicacino) de la
respuesta inmune del husped contra la infeccin por VHB es crucial para una
mejor comprensin de los procesos patolgicos y la eliminacin viral para
controlar la infeccin por VHB.
Los INFs tipo I, IFN- e IFN-, son citoquinas representativas que provocan una
respuesta inmune del husped contra las infecciones virales. Adems, otra
familia de IFN, INFs tipo III (IFN-, tambin conocido como IL-28 y IL-29) exhibe
potente actividad antiviral similar a la de IFN-a y IFN-b. La produccin de IFNs
tipo I y de tipo III es inducida masivamente en muchos tipos de clulas despus
de la infeccin con diversos virus, se sabe que es mediada por la activacin de

los receptores de reconocimiento de patrones (PRR). Durante la infeccin por

virus, cidos nucleicos derivados de un virus (ARN y ADN) se detectan
principalmente por ciertos PRRs, tal como el gen-I (RIG-I) inducible por el cido
retinoico, la diferenciacin asociada del melanoma al gen 5 (MDA5), cclico
sintasa GMP-AMP (CGA) y el IFN- inducible por la protena 16 (IFI16) En
particular, RIG-I es un PRR clave que puede detectar ARNs derivados de virus
en el citoplasma durante la infeccin, como el virus de la gripe, virus de la
hepatitis C (VHC) y virus del sarampin, que estn estrechamente relacionadas
a la enfermedad humana. La unin de RIG-I de su ARN ligando, tal como ARN
5-trifosforilada o ARNs cortos de doble cadena, activa las vas de sealizacin
de una manera dependiente de la protena adaptadora mitocondrial antiviral
protena de sealizacin (MAVS; tambin conocidos como IPS-1, VISA, o Cardif),
lo que lleva a la induccin de la expresin del factor regulador 3 del IFN (IRF-3)
y la expresin del gen NF-kB dependiente (factor nuclear potenciador de las
cadenas ligeras kappa de las clulas B activadas) y la subsecuente produccin
de IFN tipo I y tipo III y citoquinas inflamatorias. Por lo tanto, el RIG-I
detectando ARN viral es un proceso crucial para activar las respuestas innatas
antivirales para limitar la replicacin viral y la activacin de la inmunidad
adaptativa.
En cuanto a los virus que se sabe que son la principal causa de la inflamacin
heptica, RIG-I es la principal PRR que inicia la respuesta inmune innata contra
HCV. RIG-I de deteccin de VHC est mediada a travs de su reconocimiento de
poli-U/UC motivo de la regin 3 no traducida del genoma de ARN del VHC, lo
que conduce a la activacin de respuesta del IFN de tipo I. Por otro lado,
estudios anteriores han demostrado que la activacin del sistema inmune
innato se deteriora y la induccin de IFN tipo I, tales como IFN- o IFN- es en
modelos animales de infeccin por VHB, en comparacin con la infeccin por
VHC. Sin embargo, todava no est aclarado completamente cmo HBV es
reconocido por los hepatocitos humanos y el papel del IFNs tipo III.
Aqu mostramos que la infeccin por el VHB induce predominantemente de tipo
III, pero no de tipo I, IFN induccin de genes, que est mediada por RIG-I a
travs de su reconocimiento de la regin 5- de pgARN del HBV derivado.
Tambin mostramos que RIG-I puede contrarrestar la interaccin de la
polimerasa del VHB (protena P) con la regin 5 - de pgARN de una manera
dependiente de ARN de unin, lo que resulta en la supresin de la replicacin
del VHB. Adems, la liberacin mediada por lisosomas y la expresin de la
regin 5 - RNA derivada en el hgado suprimen la replicacin del VHB in vivo
en ratones quimricos con hgados humanizados. Por lo tanto, nuestros
resultados demuestran los mecanismos de defensa innatos basados en la
interaccin ARN-RIG-I, por lo cual las funciones de RIG-I no slo como un
sensor de HBV para la activacin de la respuesta de IFN, sino tambin como un
factor antiviral directo.

RESULTADOS
IFNS DE TIPO III PREDOMINANTEMENTE SE INDUCEN EN LOS HEPATOCITOS
DURANTE LA INFECCIN CON HBV
Para investigar la activacin inmune innata durante la infeccin por VHB, se
examinaron IFN de tipo I y de tipo III y su respuesta en hepatocitos humanos.
Consistente con los informes anteriores, casi no se observ la induccin de
IFNs tipo I, IFN-4, y IFN- en respuesta a la transfeccin con plsmidos que
portan 1.24 veces el genoma del VHB de los tres principales genotipos, Ae
(VHB-Ae), Bj (VHB-Bj), y C (VHB-C) (Figura 1A y Figura S1) al menos hasta siete
das despus de la transfeccin, aunque la expresin de ARN de HBV era
detectable (Figura S1B). Por otro lado, el tipo IFN III, IFN-1, fue inducido en
todos los tres tipos de lnea celular probado de hepatocitos humanos (Figuras
1A y S1A). En las clulas HepG2, HBV-C muestra la ms alta respuesta de IFN1, que tambin fue confirmado por ELISA, aunque dbilmente (figuras 1A y
1B). Por otra parte, IFN-1 en sobrenadante de cultivo podra inhibir virus de la
estomatitis vesicular replicacin (VSV) en el ensayo de reduccin de placas, as
como la replicacin del VHB (Figura S1C), indicando la importancia fisiolgica
de la IFN-1 inducida a las actividades antivirales. De acuerdo con estos
resultados, se observ la induccin significativa no slo de IFN-1 sino tambin
IFN-2 y -3 en hepatocitos humanos primarios (PHH) in vitro 24 horas despus
de la infeccin con HBV-C (Figura 1C); Sin embargo, ninguno de tipo de IFN I ni
de tipo II fue inducido (Figuras S1D y S1E). Aunque es difcil simplemente
comparar la cantidad de IFN inducida por diferentes tipos de virus, la induccin
de IFN- 1, 2, y mRNAs 3 en respuesta a la infeccin por HBV era mucho ms
dbil que la infeccin del virus de la enfermedad de Newcastle (NDV), (Figura
1C). En este sentido, con el fin de descartar la posibilidad de que la respuesta
de IFN- es debido a los contaminantes en los inculos, se utiliz Lamivudina
(LAM), un inhibidor de HBV, en este ensayo. El tratamiento con LAM inhibi IFN induccin de ARNm en respuesta a infeccin por el VHB en PHH (Figura 1C),
lo que sugiere que la respuesta de IFN es en realidad inducida por la
replicacin del VHB. Adems, se analizaron la lnea celular HepG2
cotransportador polipptido taurocolato de sodio (NTCP) C4 que expresan
establemente NTCP humana, un receptor funcional para el VHB, y se confirm
que el IFN-1 y genes de IFN-inducible como OAS2 y RSAD2, pero no IFN-, son
inducidos en estas clulas despus de la infeccin con HBV-C, y que estas
inducciones fueron abolidas por tratamiento con LAM (Figura 1D). Para evaluar
la siguiente respuesta inmune innata en vivo durante la infeccin por HBV,
hemos explotado la inmunodeficiencia combinada grave en los ratones que
transportan el tipo uroquinasa activador del plasmingeno transgn controlado
por un promotor de albmina (uPA + / + / SCID ratones), en la que ms de 70%
de los hepatocitos murinos fueron reemplazados por hepatocitos humanos (en
lo sucesivo ratones quimrico). Despus de que los ratones quimricos se
infectaron por va intravenosa con HBV-C, que se deriv de los pacientes con

hepatitis crnica, la expresin de IFN mRNAs tipo III aument en el tejido

heptico, mientras que los IFN-a4 e IFN-b mRNAs no se incrementaron (Figura
1E). En paralelo con esta respuesta de IFN de tipo III, tambin se observ la
expresin de los genes de IFN-inducible, como CXCL10, OAS2, y RSAD2, en el
hgado humano de estos infectados los ratones (Figura 1E). Estos hallazgos
indican que un tipo moderado III, pero no de tipo I o tipo II IFN da reaccin
activa en hepatocitos humanos en respuesta a la infeccin por HBV.
HBV INDUCIDO EXPRESA IFN TIPO III DEPENDIENTEMENTE DE RIG-I
A continuacin se determin que la va de sealizacin mediada por sensor es
responsable de HBV inducidir INF tipo lll en respuesta. Como HBV es un virus
de ADN, se evalu la contribucin de los informes anteriores sensores de ADN
citoslicas incluyendo RIG-I, IFI16 y los CGA en hepatocitos humanos. Anlisis
Desmontables revelaron que la induccin de IFN-1 en HepG2 o Huh-7 clulas
por transfeccin de plsmidos para el VHB-C o VHB-Ae, respectivamente, fue
suprimida por la cada de RIG-I, pero no la de los otros sensores (Figuras 2A,
S2A y S2B). Para confirmar an ms la participacin de RIG-I en el tipo HBV
desencadenando una respuesta del IFN III, se midi la expresin de ARNm de
IFN-1 inducida por la expresin del plsmido en clulas Huh-7.5 que portan un
alelo RIG-I mutante dominante negativo que previene la RIG-I de sealizacin,
en comparacin con Huh-7 las clulas que tienen una va intacta RIG-I. Las
clulas Huh-7.5 fallaron en inducir la expresin de ARNm de IFN-1 en
respuesta a VHB-Ae plsmido genoma de la transfeccin, como en el caso de la
estimulacin con 5 trifosfato RNA (3pRNA), un ligando RIG-I. (Figura 2B). En
concordancia con este resultado, desmontables de la protena que contiene
motivo tripartito 25 (TRIM 25), MAVS, la unin TANK-quinasa 1 (TBK1), y IRF-3,
todos los cuales son molculas de sealizacin esencialmente implicados en la
va de IFN mediada RIG-I, dio como resultado la supresin de la induccin de
IFN-1 induccion ARNm en clulas HepG2 en respuesta a la transfeccin con el
genoma del HBV-C. Por otra parte, tal efecto no se observ en las clulas
tratadas ya sea con TRIF (tambin conocido como tICAM-1) o MYD88 siRNA
(Figuras 2C y S2C). Adems, se confirm que la cada de RIG-I y MAVS aboli la
induccin de IFN-1 en la HPP infectados con cada genotipo (Figura 2D). Por
otra parte, tambin se confirm mediante el ensayo de cada que la induccin
de IFN-1 y OAS2 ARNm en las clulas HepG2-hNTCP-C4 en respuesta a la
infeccin por el VHB-C dependa de RIG-I (Figura S2E). Estos datos indican que
la induccin de genes de IFN-1 durante la infeccin HBV depende en gran
medida de RIG-I va de sealizacin.

Figura 1. Induccin de IFN- en los hepatocitos humanos en respuesta a la

infeccin por HBV
(A) RT-PCR cuantitativa (QRT-PCR) anlisis de IFN1 (izquierda), IFN4 (centro)
y IFN1 (derecha) mRNA en los tiempos indicados despus de la transfeccin
con 1,24 veces el genoma del VHB (genotipo Ae, Bj, o C) o vector vaco (Mock)
en las clulas HepG2.
(B) ELISA de IFN-l1 a 48 o 72 horas despus de la transfeccin con el genoma
del HBV en las clulas HepG2. La lnea de puntos indica la cantidad mnima
detectable (31,2 pg / ml) de IFN-1 por el kit de ELISA. ND, no se detecta,
indica debajo de la cantidad mnima detectable.

(C) QRT-PCR anlisis de IFN1, IFN2, y IFN3 mRNA a las 24 horas despus de
la infeccin con HBV, NDV (multiplicidad de infeccin = 10) o mock (-), o
medios Lamivudina tratados (LAM) como control en hepatocitos humanos
primarios (HPH). El nmero de copias de mRNA ( SD) de cada subtipo de tipo
IFN III por 1 mg de ARN total en el momento de la infeccin HBV-C es la
siguiente: IFN1 (83,197.6 6,241.4) y IFN2 / 3 (409,280.6 119,676.2).
(D) Tiempo de anlisis por QRT-PCR de IFN1, OAS2, RSAD2, IFN1 ARNm, y
pgARN en los tiempos indicados despus de la infeccin por VHB en clulas
HepG2-hNTCP-C4. Tambin se analiz el efecto del tratamiento con lamivudina.
(E) Anlisis de QRT-PCR de IFN1, IFN2, IFN3, IFN4, IFN1, CXCL10, OAS2, y
RSAD2 mRNA de tejidos de hgado en 4 o 5 semanas despus de la infeccin
con HBV-C en ratones quimricos. (-), ratones no infectados. Las lneas rojas
representan la media de cada conjunto de datos. * P <0,05 y ** p <0,01 frente
al control. RE, expresin relativa. (A-D) Los datos son presentan como media y
SD (n = 3) y son representativos de al menos tres experimentos
independientes. Vase tambin la figura S1.
LA REGIN 5 - DE VHB pgARN ES UN ELEMENTO CLAVE PARA LA RIG-IDEPENDIENTE DE INDUCCIN IFN-1
RIG-I puede reconocer no slo el ARN derivado de un virus, sino tambin ADN
en el citoplasma. Para aclarar an ms cmo RIG-i reconoce a HBV, primero se
examinaron uno o ambos cidos nucleicos (ADN y ARN) de los cuales el
derivado de las clulas infectadas por el VHB puede activar la expresin de
genes IFN-1. La transinfeccin de fracciones de cidos nucleicos extrados de
infeccin por VHB en clulas Huh-7 despus del tratamiento previo con RNasa
A, pero no DNasa I result en una marcada inhibicin de la activacin del
promotor IFNL1, lo que sugiere que los ARN derivados de virus podran ser
candidatos de ligando RIG-I durante la infeccin HBV (Figura 3A). El genoma de
HBV comprende un DNA de cadena parcialmente doble 3,2 kb. Durante un ciclo
de vida de HBV en los hepatocitos, covalentemente ADN circular cerrado
(cccDNA) se transcribe para generar cuatro principales especies de ARN: el 3.5,
2.4, 2.1, y 0.7 kb transcripciones de ARN viral. Hemos creado un ARNsi para
suprimir la expresin de todos estos transcritos de ARN y se prob su efecto
sobre la expresin de IFN-l1 HBV-inducida. Como se muestra en la Figura 3B,
desmontables con este siRNA (Figura S3A) suprimi la induccin de IFN-L1 en
clulas Huh-7 afectadas con HBV-Ae. Lo Siguiente,para determinar cul de
estas transcripciones de ARN del VHB est / estn involucrados en la induccin
de IFN-L1 mediada por RIG-I, preparamos vectores de expresin para expresar
cada uno de estos cuatro transcripciones virales en clulas HEK293T que a
menudo se utilizan para analizar RIG-I de sealizacin de la va en las clulas
humanas. Como resultado, slo es la transcripcin ms larga 3,5 kb, es decir,
pgARN, que tiene el potencial para provocar una induccin significativa de IFN-

l1 mRNA (Figuras 3C y S3B). Tambin se confirm por anlisis de cada con

pgARN orientada siRNA, que mostr una supresin significativa de la induccin
de IFN-L1 en clulas HepG2 afectadas con HBV-Ae (Figura S3C). Estos
resultados sugieren que la regin 50 -1,1 kb de HBV pgARN es crtica para la
activacin de la va de RIG-I para inducir la expresin de IFN-l1. Por otro lado, el
tres transcripciones, restante que Tambin contiene la misma secuencia de
parte de esta regin de 1,1 kb del VHB pgARN en el 30 final de sus
transcripciones, no indujeron IFN-L1 ARNm (Figura 3C). Una forma delecionada
artificialmente de pgARN, que carece de esta secuencia de solapamiento en la
regin 30 (D3), demostr la induccin de IFN-L1, que dicha respuesta no fue
observado por otro pgARN mutante que carece al 50 -region (D5) (Figura 3D).
Estos datos tambin apoyan un posible papel importante de la 50 secuencia de
overlapping del VHB pgARN de RIG-Imediated la induccin de IFN-L1. El 50 -fin
del VHB pgARN se sepa que contienen la secuencia de encapsulacin, llamado
'' psilon () '', que tiene una estructura secundaria del tallo-bucle.

Por lo tanto, la hiptesis de que este 5- estructura podra conferir un

posible patrn molecular (PAMP) motivo asociado a patgenos para el
reconocimiento de RIG-I. Para probar esta hiptesis, se estimul clulas
HEK293T y HepG2 con la regin derivada ARN (en lo despus llamada
RNA). En consecuencia, IFNgamma1 mRNA fue significativamente
inducida, que era dependiente de RIG-I, mientras que no se detect
respuesta a la estimulacin con el equivalente longitud de RNA que se
deriva de HBV pgARN pero que no contiene ningn elemento
(ContRNA) (Figura3 E y S3 RE). Tambin confirmamos que RIG-Idependiente de la activacin de la IRF-3 en respuesta a la estimulacin
con RNA (figuras S3 D y S3E). Debido a la superposicin en la secuencia
de 5 y 3 de HBV pgARN como se mencion anteriormente, este
elemento se encuentra en ambos extremos de pgARN. A continuacin
generamos varias formas mutantes de HBV pgARN, cada uno de los
cuales lleva mutaciones dentro de regin 5 o 3- o ambosf para
interrumpir la estructura de bucle tallo (5STM, 3STM, o 5 y 3STM,
respectivamente). En concordancia con los resultados mostrados en las
Figuras 3 C y 3D y S3 B, se detect la induccin del ARNm de IFN-l1
despus de la expresin de la transcripcin 3STM que tiene una regin
5- intacta, es similar a la intacta de pgARN 3,5-kb ( figura 3F). Por el
contrario, ya sea
5STM o 5 y 3STM no mostraron respuesta significativa. Estas hallazgos
indican que el 5 - regin de HBV pgARN es crtica para la induccin de
IFN-gamma1 posiblemente a travs del reconocimiento por parte de RIGI.

Figura 2. RIG-I dependiente de IFN-l de induccin en respuesta a la infeccin

por HBV (A) clulas HepG2 tratadas con ARNsi de control (Control) o siRNA
dirigidos RIG-I, IFI16, o cgas fueron afectadas con el genoma del HBV-C para 48
o 72 horas. La cantidad de IFN-l1 se midieron por ELISA. La lnea de puntos
indica la mnima expresin de citoquinas detectada (31,2 pg / ml) de IFN-l1 por
el kit de ELISA. ND, no se detecta, indica a continuacin Las concentraciones
detectables (izquierda), y la eficiencia desmontables se analizaron por
inmunotransferencia (IB) (derecha).
(B) anlisis de QRT-PCR de ARNm en IFNL1 Huh-7 o Huh-7.5 clulas
transfectadas con el genoma de HBV-Ae (a las 24 horas despus de la
transfeccin) o estimulados con 3pRNA (1 mg / ml) durante 6 hr. clulas
(C) HepG2 tratadas con ARNsi de control (Control) o los siRNAs indicadas
fueron afectadas con el genoma del HBV-C. En 48 horas despus de la
infeccin, los ARN totales se sometieron a anlisis de QRT-PCR para IFNL1.

(D) QRT-PCR anlisis de mRNA en IFNL1 siRNA tratados PHH a 24 despus de

la infeccin con el genotipo del VHB hr indicado. Mock, el vector vaco. No
infectada. Los datos se normalizaron a la expresin de GAPDH. Los datos se
presentan como media y SD (n = 3) y son representativos de al menos tres
experimentos independientes. * P <0,05 y ** p <0,01 frente al control en (B) o
el grupo de control infectado por el VHB en (A, C, y D). NS: no significativo.
Vase tambin la figura S2.

RIG-I interacta con la Regin- de pgARN

A continuacin, se evalu la interaccin de RIG-I con la regin de HBV
pgARN, que es, RNA. Ensayos desplegables de ARN mostraron que la
bandera de etiquetado RIG-I fue coprecipitado con RNA, pero no con
ContRNA, en las clulas HEK293T (Figura 4 A, arriba). Del mismo modo,
RIG-I endgena interactuaba con RNA aunque dbilmente (Figura 4 A,
parte inferior). Se demostr adems la localizacin intracelular de RIG-I
con RNA en las clulas Huh-7.5 (Figura 4 B). Adems, el ensayo de
inmunoprecipitacin de protenas de unin a ARN (RIP) revel que se
detect la longitud total del HBV pgARN en el RIG-I-inmunoprecipitacin
complejo, y 5 3 de pgARN eran tambin detectado (Figura S4 A), que es
aparentemente incompatible con los resultados del ensayo funcional
(Figuras 3C, 3D, 3F y S3C). Estos resultados sugieren que se requiere la
regin para su interaccin con RIG-I, pero slo la regin 5- es
necesaria activar la via RIG-I. Intentamos determinar qu regin del
RIG-I media su interaccin con el VHB pgARN. Tanto el ensayo de RIP y
el ensayo de ARN desplegable con varios mutantes de delecin de RIG-I
mostr que la porcin C-terminal de RIG-I (C-RIG) incluyendo su helicasa
de dominio y dominio represor (RD), excepto para las CARDS puede
unirse a HBV pgARN (Figura 4C; Figuras S4B y S4C). Adems, el ensayo
de desplazamiento de gel mostr que la interaccin de HBV RNA o
pgARN se deterioran con el RD o mutante C-RIG, respectivamente, cada
uno de los cuales lleva una mutacin puntual (K888E) que suprime su
actividad de unin al ARN (Figure 4D). Un resultado similar se obtuvo
tambin mediante el ensayo de RIP, en donde la de tipo salvaje (WT) CRIG, pero no el mutante K888E, era co-inmunoprecipitacion con HBV
pgARN (Figura S4 D), al igual que el ARN del HCV que se haba
informado anteriormente para interactuar con RIG-I (Figura S4E).
Tambin confirm la interaccin de HBV pgARN con RIG-I endgena en
las clulas HepG2, mientras que su interaccin con otros sensores de
cido nucleico, como IFI16 y MDA5, no se detect (Figura 4E). Estos
datos indican que la regin 5 - viral de pgRNA tiene funciones como

un patrn molecular asociado al HBV para ser reconocido

especficamente por RIG-I y puede desencadenar la respuesta de IFNgamma.

Figura 3. Activacin del RIG-I es mediada por el reconocimiento de la Regin 5

del VHB pgARN
(A) La actividad de luciferasa de un reportero de IFN-L1 plsmido despus 24
hora de estmulo con cidos nucleicos (2 mg / ml) extrados de Huh-7 clulas
transfectadas con el plsmido de control (Mock) o el genoma HBV-Ae con o sin
RNasa A o el tratamiento DNasa. RLU (unidades relativas de luz) de luciferasa.
(B) clulas Huh-7 tratadas con el control o el VHB RNA-dirigida siRNA fueron
transfectadas con el Genoma del VHB-Ae o fingida. Despus de 24 horas de
transinfeccin, ARN totales se sometieron a QRT-PCR para IFNL1.

(C y D) una representacin esquemtica de cuatro tipos ARN de HBV, pgARN

(3,5 kb), 2,4 kb, 2,1 kb, y 0,7 kb ARN en (C), y dos formas de borrados pgARN,
D5 y D3, en (D). La regin de superposicin se muestra en azul. QRT-PCR
anlisis de IFNL1 ARNm de las clulas HEK293T despus de 24 horas de la
transfeccin con los vectores de expresin indicados. Los datos se
normalizaron a la cantidad de cada ARN de HBV expresin (C y D).
(E) Una representacin esquemtica de pgARN, RNA, u control de ARN
(ContRNA) (izquierda). Las clulas HEK293T fueron tratadas con control o RIG-I
siRNA sin estimular (Mock) o estimulados con RNA durante 12 h. Los ARNs
totales se sometieron a QRT- PCR para IFNL1 (en el centro). QRT-PCR anlisis
de IFNL1 mRNA en clulas HEK293T despus de 12 h de estimulacin con RNA
o ContRNA (derecha). Cada uno de los ARN fue preparado mediante
transcripcin in vitro.
(F) Las clulas HEK293T fueron transfectadas con cada plsmido de mutantes
de tallo-bucle de pgARN (5STM, 3STM, o 5 y 3STM), y despus se sometieron a
anlisis de QRT-PCR como se describe en (C). * p <0,05 y ** p <0,01 frente al
control en (A, B, y E) o frente a 3.5K en (C, D, y F). NS: no significativo. Vase
tambin la Figura S3

RIG-I ejerce una actividad antiviral al contrarrestar los

Interaccin de la polimerasa del HBV con pgARN
A continuacin se evalu la contribucin de la va de RIG-I en defensa
antiviral contra la infeccin HBV. RIG-I bloqueado en PHH dado como
resultado un nmero de copias del genoma del VHB superior a los 10
das despus de la infeccin por el VHB-C, en comparacin con PHH
tratado con Control de siRNA (Figura 5A). Una observacin similar se
hizo con RIG-I siRNA-tratada para clulas HuS-E/2 ( Figura S5A). Estos
resultados indican el papel implicado de RIG-I como un sensor innato
para la respuesta antiviral contra la infeccin por el HBV. Por otra parte,
se ha informado anteriormente de que la regin 5 HBV pgARN es
importante para servir como un sitio de unin de la protena viral P para
iniciar la transcripcin inversa. Consistente con esto, hemos demostrado
que la P protena interacta con RNA en las clulas Huh-7.5 y HEK293T,
por la transferencia de energa por resonancia de fluorescencia (FRET)
anlisis (Figura 5B) y ensayo desplegable de ARN (Figura S5B),
respectivamente. Estos resultados nos facilitaron para examinar si RIG-I
podra bloquear el acceso de la protena P hacia la regin . Tal y como
esperbamos, la protena de RIG-I recombinante suprimi la interaccin
de la protena P con pgARN de una manera dependiente de la dosis
(Figure 5C). Tal efecto inhibidor se observ tambin en las clulas Huh7.5 por la expresin de WT RIG-I, as como su T55I o K270A mutante
(Figuras 5D y S5C), los cuales no son capaces de inducir la activacin
dependiente de ligando de la sealizacin descendente pero conservan

su actividad de unin a ARN. Por otra parte, la K888E mutante no poda

inhibir la unin de Protena P con pgARN (Figuras 5D y S5C). Adems, el
tratamiento con IFN-gamma1 recombinante en clulas Huh-7.5 aumenta
la cantidad de la protena mutante RIG-I (T55I) (Figura S5D), lo que
resulta en una inhibicin parcial de la interaccin de la protena P con
pgARN, y este efecto inhibidor fue revocado por la reduccin de RIG-I
(Figura E). De hecho, el anlisis FRET mostr que la interaccin de la
protena P-RNA se suprimi significativamente mediante la expresin
de la RIG-I RD (WT) solo, pero no el RD mutante (K888E) (Figura S5E).
Por otra parte, la replicacin del HBV tambin fue suprimida por la
expresin de la RIG-I RD (WT) en las clulas Huh-7.5, en donde cualquier
induccin de IFN no se observa, mientras que el RD mutante (K888E) no
afect la replicacin viral (Figura 5F). Estos resultados revelaron otro
aspecto de RIG-I como un factor antiviral directo a travs de su
interferencia con la unin de la protena de P de HBV con pgARN en un
va de IFN de manera independiente.

Figura 4. RIG-I interacta con la Regin de pgARN

(A) Ensayo desplegable de ARN que muestra la actividad de unin de los
ARN indicados a la Bandera de etiquetado RIG-I (Bandera-RIG-I) en

clulas HEK293T (arriba) o endgeno RIG-I en las clulas HepG2 (parte

inferior).
(B) FRET anlisis de la interaccin de etiquetado YFP-RIG-I (YFP-RIG-I)
con rodamina (ROX) y conjugado con RNA (RNA-ROX) o ContRNA
(ContRNAROX). Imgenes de fluorescencia representativos de YFP, ROX,
y FRETC / YFP (la relacin de FRET corregido (FRETC) para YFP). Las
puntas de flecha indican el rea que muestra una alta eficiencia de FRET.
La barra de escala representa 20 micom. Derecha, grfico de puntos de
relacin FRETC / YFP (pequeas franjas horizontales, significan).
(C) Ensayo RIP con lisados de clulas HEK293T que expresan varios
mutantes de delecin de la bandera (flag) de etiquetado de RIG-I y
vector de expresin pgARN mediante el uso de un anticuerpo anti-Flag.
Inmunoprecipitaron pgARN se cuantific mediante qRT-PCR y se
normaliz a la cantidad de protenas inmunoprecipitadas (Figura S4C) y
se representa como fraccin de ARN de entrada antes de la
inmunoprecipitacin (entrada de porcentaje).
(D) Anlisis de gel de cambio de la formacin de complejos entre RNA y
RIG-I recombinante RD (WT) o RD (K888E). Las puntas de flecha indican
la posicin de los ARN no unido y los complejos de ARN-RIG-I.
(E) Ensayo RIP con lisados de clulas HepG2 preparadas despus de 48
h de transfeccin del genoma del HBV-C mediante el uso de anti-RIG-I,
anti-IFI16, anti-MDA5, o control inmunoglobulina G. La
inmunoprecipitacin pgARN se midi mediante QRT PCR (parte superior)
como se describe en (C). La expresin de clulas enteras y cantidades
inmunoprecipitadas de RIG-I, IFI16, y MDA5 (parte inferior). Los datos se
presentan como media y SD (n = 3) y son representativos de al menos
tres experimentos independientes. * P <0,05 y ** p <0,01 frente al
control en (B y E). NS: no significativo. Vase tambin la figura S4.
El RNA Restringe la replicacin del VHB en Humana,
hepatocitos-quimricos de ratn
(Un ratn quimrico es un ratn combinado con genes humanos, cuyo sistema
inmunolgico responde al ser humano)

Por ltimo, con base en los resultados anteriores, tratamos de

aprovechar el potencial teraputico de la interaccin con la protena P
con RNA para el control de la infeccin por HBV. Un vector fue diseado
para incluir un oligo ADN de 63 pb, que se transcribe en un RNA. Los

experimentos in vitro nos confirmaron que usando clulas Huh-7.5 que

inducen RNA, por la expresin del vector- impulsado capaz de funcionar
como un seuelo de
ARN que interfiera con la unin de la protena P del HBV a pgARN y para
inhibir la replicacin viral de una manera independiente de IFN
(Figura 6A y 6B, izquierda). Por otro lado, RNA no mostr ninguna
diferencia en la replicacin del VHC en comparacin con el control
(Figura 6B, derecha). Con el fin de evaluar la eficacia teraputica de
RNA in vivo, hemos aprovechado el modelo de infeccin HBV de
humanos en ratones con hepatocitos quimrico. Ratones infectados por
el VHB se someti a la administracin intravenosa con el vector de
expresin RNA cargado en un vehculo liposomal, un dispositivo
multifuncional tipo envoltura nanometrico (MEND) para la entrega
eficiente, durante 2 semanas. El tratamiento con RNA-MEND suprimi
significativamente la elevacin del nmero de copias del genoma viral
en el suero por menos de un dcimo de los de los ratones de control
(Figura 6C). Consecuentemente, Los anlisis de inmunofluorescencia
mostr que la expresin de antgeno core de HBV (HBcAg) en los tejidos
del hgado de ratones quimricos con el tratamiento de RNA-MEND se
redujo notablemente en comparacin con los de control de los ratones
(Figura 6D).

Figura 5. Funciones RIG-I como un Factor antiviral contrarrestando la

interaccin de la protena P de HBV con pgARN
(A) anlisis de qPCR de nmero de copias de encapsuladas del ADN del
VHB (izquierda) y QRT-PCR de RIG-I (centro) y IFNL1 ARNm (derecha) en
el control o RIG-I-siRNA tratada PHH despus de 10 das de la infeccin
con el VHB-C.
(B) Anlisis FRET para la interaccin entre YFP-bandera protena P (YFPP) o YFP y RNA-ROX como se describe en la Figura 4B. La barra de
escala representa 20 microm. Las puntas de flecha indican el rea que
muestra una alta eficiencia de FRET.

(C) Lisados de clulas HEK293T que expresan pgARN y HA-etiquetados

protena P (HA-P) se incubaron con la cantidad indicada de RIG-I
recombinante (rRIG-I). La interaccin de pgARN con HA-P era analizada
por ensayo RIP y anlisis de QRT-PCR como se describe en la Figura 4C.
(D) Los lisados celulares a partir de clulas Huh-7.5 que expresan VHB
pgARN, HA-P, y la bandera-RIG-I o sus mutantes como indicadores fueron
sometidos al ensayo RIP para la caracterizacin de la capacidad de RIG-I
de contrarrestar la interaccin de pgARN con HA-P, como se describe
en la Figura 4C.
(E) El efecto del tratamiento rIFN-gamma1 en la interaccin de pgARN
con HA-P en las clulas Huh-7.5 era evaluada por el ensayo RIP. En las
clulas Huh-7.5 que expresan tanto pgARN y HA-P fueron tratados con
rIFN-gamma1 (100 ng/ml) durante 24 horas, y se someti a ensayo RIP
como se describe en la Figura 4C. Tambin se determin la dependencia
RIG-I por anlisis RIG-I bloqueado.
(F) La clulas Huh-7.5 se transfectaron con un vector de expresin de
RIG-I RD (WT) o RD (K888E), junto con el genoma del HBV-Ae. Despus
de 72 h de transfeccin, el nmero de copias de ADN HBV encapsuladas
se midieron (a la izquierda), como se describe en (A). La expresin de la
bandera-RIG-I RD (WT) y RD (K888E) (derecho). * P <0,05 y ** p <0,01
frente al control. NS, insignificante. Vase tambin la figura S5
DISCUSIN
El sistema inmune innato acta como una primera lnea de defensa del
husped contra la infeccin viral. En este paso, la PRRs juegan un papel
crucial en el reconocimiento de la invasin de los virus. En particular, la
deteccin del cido nucleico del virus es fundamental para el inicio de la
respuesta inmune antivira. En este estudio, hemos tratado de buscar un
sensor de cido nucleico relevante (s) para el HBV y para caracterizar la
respuesta del IFN durante la infeccin por HBV. Como resultado, hemos
identificado RIG-I como un importante sensor innato del HBV inducido
predominantemente tipo IFNs de tipo III en hepatocitos a travs del
reconocimiento de 5 tallo bucle de HBV pgARN (Figuras 1,2,3 Y 4). En
este sentido, tambin ha habido varios informes que muestran que el
HBV X o protena P interacta con MAVS o compite por la unin con
DDX3, TBK1 respectivamente, e inhibe el RIG-I va mediada por IFN tipo
I, que posiblemente permite evadir al BHV la respuesta antiviral inmune
innata. Esto reflejara el importante papel de la sealizacin mediada de
RIG-I, para la defensa antiviral contra la infeccin por HBV, aunque ser
necesario realizar ms investigaciones para determinar si otra deteccin
de molculas a excepcin de RIG-I estn involucrados en la activacin
respuestas de innatas en otros tipos de clulas, incluyendo subconjuntos
de clulas dendrticas. Curiosamente, han mostrado recientemente que

la genotipo D de HBV es detectado por MDA5, pero no RIG-I, que es

basada nicamente en los anlisis con el plsmido genoma del VHB (2
veces) transfeccin en una nica lnea de clulas Huh-7. En este sentido,
suponemos que estos resultados aparentemente contradictorios pudiera
surgir principalmente de la diferencia en el genotipo del VHB: Se ha
informado de que el genotipo D es filogenticamente diferente de los
genotipos A, B, y C, que hemos analizado en este estudio.
Adems, de acuerdo con nuestros resultados (La figura 1C y S1C), HBV
induce un respuesta de IFN tipo III que no parece ser eficaz en
comparacin con el caso de la infeccin por NDV. Especulamos que la
debilidad de la respuesta del IFN durante la infeccin VHB podra atribuir
al menos en parte a estas evasivas virales de la clula husped de
control, que se apoya en nuestros datos preliminares mostrando que
mutante HBV, que genera ARN virales incluyendo pgARN pero carece de
la capacidad de expresar toda viral protenas, incluyendo VHB X y
protenas P, pueden inducir una mayor cantidades de IFN-gamma1 de
VHB intacta (Figura S1G). En relevancia con esto, nuestros datos
actuales indican que la interaccin de la protena P de HBV con el 5
tallo-bucle afecta a la reconocimiento de pgARN viral mediado por RIG-I
y la posterior sealizacin descendiente d eventos, lo que
probablemente podra suprimir la induccin de IFN-s. Esto puede
proporcionar un aspecto de la protena de HBV P en trminos de
la evasin viral a partir de la activacin de RIG-I. Como para el
mecanismo de la induccin preferencial del IFNs tipo III en hepatocitos
en respuesta a HBV, as como en el HCV, Podramos especular la
existencia de un hepatocito especfico del factor (s), que participa
selectivamente en la induccin del gen del IFN tipo III, aunque esta
cuestin merece mayor investigacin incluyendo la evaluacin
epigentica de hepatocitos humanos. Tambin se encontr que una de
las regiones 5 o 3 - de pgARN poda interactuar con RIG-I pero fue solo
la regin 5- que contribuy a la induccin de IFN-1 (Las figuras 3D
y S4A). En relevancia con esto, suponemos que algunos cofactor(s)
podran determinar, adicionalmente, la utilizacin preferente de la
regin 5- para la activacin RIG-I; sin embargo, sera el siguiente
problema interesante que hay que resolver. En adicin a esto, nuestros
datos demuestran una funcin hasta ahora no identificado de
RIG-I como un factor antiviral directa contra la infeccin por el VHB
(Figura 5). Mecnicamente, RIG-I se ha encontrado para contrarrestar la
accesibilidad de la protena P de HBV al 5- tallo-bucle de pgARN, que
es una proceso importante para la iniciacin de la replicacin viral. Como
es el caso con esto, varios PAMPs virales conocidos, son reconocidos por
RIG-I, por ejemplo, la poli-U/UC tracto en la regin 3 no traducida del
genoma del VHC y la regio terminal 5 del genoma del virus de la
influenza, se inform anteriormente ser directamente o indirectamente
crtico para la replicacin viral. En relevancia con esto, se podra prever

que dichas sean elegidas como blanco por RIG-I conferira un mecanismo
nico para asegurar la actividad eficaz antiviral de RIG-I. Por lo tanto,
RIG-I es probable que desempee un papel doble como un sensor innato
y como un efector antiviral directo para la defensa del husped durante
la infeccin viral.
En relacin con la evaluacin de los experimentos se muestra en la
Figura 6C y 6D, se analizaron, adems, los siguientes puntos: Cuando se
trataron clulas HepG2 con RNA-MEND o Control El MEND, en ambos
casos casi no detect la induccin masiva e citoquinas tales
como TNF , IL-6 , y CXCL10 (datos no mostrados). Esto fue confirmado
por el anlisis de los ratones SCID inyectados con RNA-MEND o ControlMEND (datos no mostrados). Adems, RNA-MEND tiene un efecto
especfico sobre la replicacin de HBV, pero no HCV en las clulas Huh7.5 (Figura 6B). Estos datos sugieren que los resultados (Figuras 6C y
6D) podran no ser influenciado principalmente por la produccin masiva
de citoquinas antivirales, aunque la reactividad cruzada de las
citoquinas debe ser tomada en cuenta cuidadosamente. Por lo tanto, se
presume que el efecto de RNA podra basarse en no slo su actividad
antagonista sino tambin en la actividad de citoquinas que
inducen. Estos hallazgos podran permitirse una nueva modalidad
teraputica en sustitucin de la medicacin antiviral convencional
medicamentos que han sido reportados a tienen un riesgo de desarrollar
drogas la resistencia del VHB. El presente estudio podra proporcionar
una mejor aproximacin a la estrategia para el desarrollo de medicina de
cido nucleico y ofrecer no slo una opcin atractiva para la terapia
clnica contra el VHB, sino tambin posiblemente a la infeccin por otros
virus.

Figura 6. Inhibicin de la replicacin de HBV por RNA

(A) Clulas Huh-7.5 se transfectaron con la expresin vectores para HA-P
y RNA, junto con el genoma del VHB-Ae. El ensayo RIP se realiz para
evaluar el efecto de RNA en la interaccin entre HA-P y pgARN, como se
describe en Figura 5D.
(B) Los nmeros de copia de ADN del VHB encapsulado en clulas Huh7.5 que expresa el genoma del VHB-Ae y RNA, determinado por qPCR
(izquierda). La replicacin del VHC en las clulas Huh-7.5.1/Rep-Feo-1b
expresando RNA, como se determina por ensayo de luciferasa
(derecha).
(C) Los ratones infectados con VHB se les administrado va intravenosa
con el vector de expresin RNA (RNA- MEND) o vector vaco (ControlMEND) cargada en portador liposomal a una dosis de 0,5 mg/kg de
cuerpo peso cada 2 das durante 14 das. En el suero de ratones
quimricos infectados por el VHB se determin el ADN HBV por qPCR (n
= 3 por grupo). Da 0 indica el momento del inicio de la administracin.
(D) Las imgenes de inmunofluorescencia fue realizado para la
deteccin de HBcAg (rojo) y albumina humana (verde) en las secciones
de hgado en la infeccin de ratones quimricos a los 14 das despus

del tratamiento con RNA-MEND o Control-MEND como se describe en

procedimientos experimentales. Los datos se presentan como media y
SD (n = 3) y son representativos al menos tres experimentos
independientes. ** P <0,01 versus control. NS: no significativo.
PROCEDIMIENTOS EXPERIMENTALES
La infeccin de los hepatocitos humanos de ratones quimricos con el
VHB e in vivo
Tratamiento con RNA
Para generar hepatocitos humanos de ratones quimricos, UPA+/+/SCID,
eran trasplantados con hepatocitos humanos crio conservados
disponibles comercialmente (Una mujer hispana 2 aos de edad; BD
Bioscience) como se describi previamente. Los ratones quimricos se
infectaron por va intravenosa con HBV-C (106 copias por ratn)
derivadas de paciente con hepatitis crnica. ARN totales se aislaron de
los tejidos del hgado a las 0, 4, o 5 semanas despus de la infeccin y
se sometieron a RT-PCR cuantitativa (QRT- PCR). En preparacin para el
tratamiento RNA, la infeccin por VHB a las 3 semanas despus de la
infeccin se confirm mediante la medicin del nmero de copias del
genoma viral en el suero de ratones quimricos HBV infectados por
anlisis de qPCR, y en 4 semanas despus de la infeccin, la expresin
del vector RNA o el vector vaco cargado en una portadora liposomal,
un multifuncional de tipo envolvente nanometrico (MEND), fue
administrado por va intravenosa a una dosis de 0,5 mg / kg de peso
corporal (n = 3 por grupo) cada dos das durante 14 das. Las muestras
de suero se sometieron a qPCR para la cuantificacin de ADN nmero de
copias de HBV como se describe anteriormente. Todos los protocolos con
animales descritos en esta estudio se realiz de acuerdo con la Gua
para el Cuidado y Uso Animales de Laboratorio y aprobado por el Comit
de Proteccin de los Animales Phoenix Bio Co., Ltd.
La infeccin por el VHB en hepatocitos humanos y cuantificacin de ADN
HBV encapsulado
La infeccin por el VHB en PHH (Primary human hepatocytes) o clulas
HepG2-hNTCP-C4 se realiz a los 10 o 100 equivalentes de genoma por
clula, respectivamente, en presencia de 4% PEG8000 a 37 C durante
24 h como se describi previamente. Lamivudina (Sigma 50 mM) Se
aadi en Huh-7 medios de cultivo durante la produccin de HBV. El ADN
del VHB se purific partculas intracelulares de core como se describi
anteriormente. Brevemente, las clulas se suspendieron en tampn de
lisis que contiene 50 mM Tris-HCl (pH 7,4), EDTA 1 mM, y 1% de NP40. Los ncleos se sedimentaron por centrifugacin a 4C y 15.000 rpm
durante 5 min. El sobrenadante se ajustado a 6 mM MgOAc y se trat
con DNasa I (200 mg / ml) y de RNasa A (100 mg / ml) durante 3 horas a
37 C. La reaccin se detuvo mediante la adicin de 10 mM EDTA y la

mezcla se incub durante 15 min a 65C. Despus de tratamiento con

proteinasa K (200 mg / ml), 1% de SDS, y 100 mM NaCl durante 2 horas
a 37 C, los cidos nucleicos virales se aislaron por fenol: cloroformo:
alcohol isoamlico (25:24:1) extraccin y precipitacin de etanol con 20
mg de glucgeno. El nmero de copias de ADN del VHB se midieron por
qPCR con los cebadores indicados (S3 Tabla).
QRT-PCR anlisis
ARN totales se aislaron a partir de clulas de cultivo de tejido heptico o
congelados utilizando Isogen (Nippon Gene) y se trataron con DNasa I
(Invitrogen). Se prepar ADNc a partir de ARN totales utilizando ReverTra
Ace (Toyobo). La QRT-PCR fue realizada usando SYBR Premiex Ex Taq
(Takara) y se analizaron StepOnePlus en sistema de PCR en tiempo real
(Applied Biosystems). La informacin detallada acerca de los primers
utilizados se muestra en la Tabla S3. Los datos se normalizaron a la
expresin de GAPDH o VHB ARN para cada muestra.
Ensayo RIP
Despus de 2 h de incubacin con el anticuerpo como se indica para
inmunoprecipitacin precipitacin, los lisados celulares se mezclaron con
la protena-G Dynabeads (Invitrogen) y se incub adicionalmente
durante 1 h con agitacin suave. Despus de lavar tres veces, los ARN
precipitados se analizaron mediante qRT-PCR con apropiado cebadores
para detectar el ARN diana. La cantidad de ARN inmunoprecipitado se
representa como el percentil de la cantidad de ARN de entrada
(porcentaje entrada de edad). El detalle se describe en Procedimientos
experimentales suplementarios