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UNIVERSIDADE DE SO PAULO

FACULDADE DE CINCIAS FARMACUTICAS DE RIBEIRO PRETO

Isolamento, caracterizao bioqumica e avaliao do potencial


inflamatrio de uma protena secretada rica em cistena (CRISP) da
peonha de Bothrops jararaca

Marina Escoque Lodovicho

Ribeiro Preto
2015

UNIVERSIDADE DE SO PAULO
FACULDADE DE CINCIAS FARMACUTICAS DE RIBEIRO PRETO

Isolamento, caracterizao bioqumica e avaliao do potencial


inflamatrio de uma protena secretada rica em cistena (CRISP) da
peonha de Bothrops jararaca

Dissertao de Mestrado apresentada


ao Programa de Ps-Graduao em
Toxicologia para obteno do Ttulo
de Mestre em Cincias.

rea de concentrao: Toxicologia

Verso corrigida da Dissertao de Mestrado apresentada ao Programa de PsGraduao em Toxicologia no dia 06/11/2015. A verso original encontra-se
disponvel na Faculdade de Cincias Farmacuticas de Ribeiro Preto/USP.

Orientada: Marina Escoque Lodovicho


Orientadora: Profa. Dra. Suely Vilela

Ribeiro Preto
2015

FICHA CATALOGRFICA

AUTORIZO A REPRODUO E DIVULGAO TOTAL OU PARCIAL DESTE


TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRNICO, PARA
FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.

Lodovicho, Marina Escoque


Isolamento, caracterizao bioqumica e avaliao do potencial
inflamatrio de uma protena secretada rica em cistena (CRISP) da peonha de
Bothrops jararaca. Ribeiro Preto, 2015.
103p. : il. ; 30 cm

Dissertao de Mestrado apresentada Faculdade de Cincias


Farmacuticas de Ribeiro Preto/USP - rea de concentrao: Toxicologia.

Orientadora: Vilela, Suely

1. Bothrops jararaca, 2. BJ-CRP, 3. CRISP, 4.Caracterizao bioqumica,


5. Potencial inflamatrio, 6. Sistema complemento

FOLHA DE APROVAO

Nome do aluno: Marina Escoque Lodovicho

Ttulo do trabalho: Isolamento, caracterizao bioqumica e avaliao do


potencial inflamatrio de uma protena secretada rica em cistena (CRISP) da
peonha de Bothrops jararaca.

Dissertao de Mestrado apresentada


ao Programa de Ps-Graduao em
Toxicologia para obteno do Ttulo
de Mestre em Cincias.
rea de Concentrao: Toxicologia
Orientadora: Profa. Dra. Suely Vilela

Aprovado em:

Banca Examinadora

Prof. Dr. ____________________________________________________________


Instituio:_____________________________Assinatura:_____________________

Prof. Dr. ____________________________________________________________


Instituio:_____________________________Assinatura:_____________________

Prof. Dr. ____________________________________________________________


Instituio:_____________________________Assinatura:_____________________

RESUMO

LODOVICHO, M. E. Isolamento, caracterizao bioqumica e avaliao do


potencial inflamatrio de uma protena secretada rica em cistena (CRISP) da
peonha de Bothrops jararaca. 2015. 103f. Dissertao (Mestrado). Faculdade de
Cincias Farmacuticas de Ribeiro Preto Universidade de So Paulo, Ribeiro
Preto, 2015.
Envenenamentos por serpentes do gnero Bothrops provocam reaes sistmicas e locais
como coagulopatias, hemorragias, reao inflamatria, dor e mionecrose. Protenas
secretadas ricas em cistenas (CRISPs) esto presentes nas peonhas de serpentes e esto
amplamente distribudas entre mamferos, rpteis e anfbios. Esto envolvidas em algumas
reaes biolgicas, porm muitas funes ainda so desconhecidas. O presente trabalho
objetivou o isolamento, a caracterizao bioqumica/estrutural, enzimtica e funcional, a
avaliao do potencial inflamatrio e avaliao da atividade sobre o sistema complemento
de uma CRISP isolada da peonha de Bothrops jararaca. A CRISP denominada BJ-CRP, foi
isolada da peonha de Bothrops jararaca atravs da combinao de trs etapas
cromatogrficas: excluso molecular em Sephacryl S-200, cromatografia de troca aninica
em coluna Source 15Q e cromatografia de fase reversa em coluna C18. O grau de
homogeneidade foi determinado e confirmado por eletroforese SDS-PAGE, que mostrou
uma banda nica de 25,19 kDa, e por MALDI-TOF/TOF que apresentou a massa molecular
de 24,6 kDa. A sequncia N-terminal e a anlise dos peptdeos trpticos por MALDI
TOF/TOF demonstrou a presena de 100 resduos de aminocidos, os quais apresentaram
at 96% de similaridade com sequncias de outras CRISPs j descritas, porm de outros
gneros e espcies de serpentes, pois ainda no h CRISPs isoladas do gnero Bothrops.
A BJ-CRP no possui atividade proteoltica sobre a azocasena, o fibrinognio e a fibrina.
Tambm no apresentou atividade coagulante e hemorrgica, e no demonstrou atividade
quando testada na concentrao de 1M em 13 diferentes canais para potssio
dependentes de voltagem. Por outro lado, esta toxina foi capaz de induzir um processo
inflamatrio agudo (tempos de 1 e 4 horas), observado pelo recrutamento de neutrfilos e
aumento da citocina pr-inflamatria IL-6 na cavidade peritoneal de camundongos. Ensaios
realizados com a BJ-CRP e a peonha de Bothrops jararaca mostraram modulao na
atividade hemoltica promovida pela via clssica do sistema complemento. A BJ-CRP
tambm promoveu ao direta sobre alguns componentes isolados do sistema
complemento, como C3 e C4, conforme avaliado por SDS-PAGE e Western blot. O presente
trabalho descreve a purificao da BJ-CRP, a primeira CRISP isolada da peonha da
serpente do gnero Bothrops. Os resultados obtidos so promissores e abrem perspectivas
para o melhor entendimento desta classe de protenas, e para a compreenso do
mecanismo de ao desta classe de toxinas na resposta inflamatria induzida pelo
envenenamento botrpico.

Palavras Chave: CRISP, BJ-CRP, Bothrops jararaca, caracterizao bioqumica, potencial


inflamatrio, sistema complemento.

ABSTRACT

Lodovicho, M. E. Isolation, biochemical characterization and evaluation of the


inflammatory potential of acysteine rich secretory protein (CRISP) from Bothrops jararaca.
2015. 103f. Dissertation (Master). Faculdade de Cincias Farmacuticas de Ribeiro
Preto Universidade de So Paulo, Ribeiro Preto, 2015.
Envenomation by snakes from Bothrops genus is characterized by systemic and local effects
such as coagulopathies, bleeding disorders, inflammation, pain and myonecrosis.The
cysteine rich secretory proteins (CRISPs) are present in snake venoms and are widely
distributed mammals, reptiles and amphibians. They are involved in certain biological
activities, however many of their functions are still unknown. The aim of the present study
was to isolate a CRISP from Bothrops jararaca and to biochemically/functionally characterize
it by evaluating its involvement on inflammatory responses and on the complement system.
The CRISP named BJ-CRP was isolated from Bothrops jararaca crude venom through the
combination of three chromatographic steps: molecular exclusion on Sephacryl S-200
column, anion exchange chromatography on Source 15Q and reverse phase
chromatography using C18 column. A high purity degree was obtained as confirmed by SDSPAGE, showing a single band of 25.19 kDa, and by MALDI-TOF/MS showing a molecular
mass of 24.6 kDa. The N-terminal sequence and analysis of tryptic peptides by MALDI TOF/
MS resulted in the determination of 100 amino acid residues, which had up to 96% similarity
to sequences from other snake venom CRISPs that were previously described, but from
other genus and snake species. The BJ-CRP did not have proteolytic activity on azocasein,
fibrinogen or fibrin. It did not show coagulant or hemorrhagic activity, and also did not show
activity on 13 different voltage dependent potassium channels when tested at a
concentration of 1M. Moreover, this toxin was able to induce an acute inflammatory
response (1 and 4 hours after injection), observed by the recruitment of neutrophils and
increase of interleukin-6 into the peritoneal cavity of mice. BJ-CRP and B. jararaca crude
venom were capable of modulating the hemolytic activity promoted by the classical pathway
of the complement system, and BJ-CRP also showed direct action on some complement
system components, such as C3 and C4 as evaluated by SDS-PAGE and Western blot. The
present work describes the purification of BJ-CRP, the first CRISP isolated from a Bothrops
snake venom. The results obtained showed to be promising and open up prospects in order
to better understand the involvement of this class of toxins in the inflammatory response
induced by Bothrops envenomation.

Keywords: CRISP, BJ-CRP, Bothrops jararaca, inflammatory potential, complement system.

1. INTRODUO

1.1. Ofidismo
Acidentes ofdicos afetam milhes de pessoas anualmente, sendo que no Brasil,
segundo dados do Ministrio da Sade, no perodo de 2000 a 2013 foram notificados 360.506
acidentes e 1.487 bitos. A maior incidncia de casos concentra-se nas regies Norte e
Sudeste ultrapassando o nmero de 90.000 casos, porm o maior nmero de bitos est
registrado nas regies Norte e Nordeste, ficando em torno de 500 bitos no perodo
mencionado (MINISTRIO DA SADE, 2014). Esse contraste pode ocorrer devido s
diferenas de acesso ao tratamento em cada localidade, pois encontramos os mesmos gneros
distribudos em todo o territrio nacional e, sendo o gnero o meio pelo qual se baseia o
tratamento.
Em 2009 a Organizao Mundial de Sade (OMS) acrescentou o envenenamento por
serpentes lista de doenas tropicais negligenciadas, pois assim como a malria, a
tuberculose, a dengue e algumas doenas parasitrias, o risco de um acidente com serpentes
est sempre presente, sendo que a mortalidade associada a acidentes peonhentos muito
maior quando comparada a outras doenas tropicais negligenciadas (WILLIAMS et al., 2010).
Em uma anlise de mbito mundial, sabe-se que o maior nmero de acidentes por
serpentes encontra-se no Sul e no Sudeste da sia e na frica subsaariana (CHIPPAUX,
1998; KASTURIRATNE et al., 2008). O DALYs (Disability Adjusted Life Years) um
indicador conhecido mundialmente que avalia a carga de uma doena. Na avaliao do
envenenamento por serpentes, constatou-se um impacto elevado, pois a maioria dos
acometidos so crianas ou jovens trabalhadores agrcolas que devido ao envenenamento
evoluem com sequelas permanentes, sejam elas fsicas e/ou psicolgicas (HARRISON et al.,
2009). Estimativas sobre a incidncia, a morbidade e a mortalidade por acidentes ofdicos so
baseadas muitas vezes em dados hospitalares que no retratam o verdadeiro impacto deste
agravo, pois muitas pessoas acometidas no procuram atendimento adequado e utilizam-se de
tratamentos tradicionais (WHO, 2010).
O animal causador do acidente sempre deve ser identificado, pois ajudar no
reconhecimento de espcies de importncia mdica em nvel regional, auxiliando na indicao
mais precisa do antiveneno a ser administrado. O tratamento para acidentes ofdicos consiste
na infuso endovenosa de soro especfico que depende do gnero da serpente, e quando h
falta de soros especficos, o tratamento pode ser realizado por meio das associaes de outros

soros, porm este pode no ser capaz de neutralizar de maneira eficiente a ao da peonha
(BRASIL, 1998). A terapia com antiveneno baseia-se na neutralizao das aes txicas dos
diversos componentes da peonha, reduzindo os efeitos sistmicos causados pelo
envenenamento (CARDOSO et al., 1993; JORGE; RIBEIRO, 1997).
As toxinas presentes nas peonhas de serpentes podem induzir uma srie de efeitos
fisiolgicos no indivduo acometido, como distrbios neurotxicos, cardiotxicos, miotxicos
hemorrgicos, hemostticos, coagulantes, aes nefrotxicas e hepatotxicas, que combinados
podem levar a digesto/morte da presa ou vtima (CHIPPAUX; WILLIAMS, 1991;
CALKOSINSKI et al., 2010).
Os efeitos clnicos observados no envenenamento humano causado por peonha de
serpentes podem ser agrupados em categorias de acordo com a sua significncia clnica: (1)
paralisia flcida; (2) milise sistmica; (3) coagulopatia e hemorragia; (4) falhas e danos
renais; (5) cardiotoxicidade e, (6) danos teciduais no local da picada (WHITE, 2004). Cada
um desses efeitos pode causar diversos efeitos secundrios, contribuindo potencialmente para
danos locais do envenenamento e mortalidade (WHITE, 2005).

1.2. Serpentes
As serpentes constituem um grupo de rpteis que apresentam um longo corpo flexvel,
cabea recoberta de escamas ou placas; olhos redondos, com pupila vertical ou circular; uma
narina de cada lado da cabea; boca com grande extensibilidade e fosseta loreal, um orgo
termorreceptor posicionado entre os olhos e a narina (FRANCO, 2003). Serpentes
peonhentas apresentam pupilas em fenda; presas anteriores com orifcio central ou sulco;
fosseta loreal, sendo a cabea destacada do corpo. A maioria possuem hbitos noturnos e so
vagarosas (PINHO; PERREIRA, 2001).
O Brasil apresenta uma fauna rica em serpentes, as quais esto atualmente divididas
em 10 famlias: Anomalepididae (6 espcies), Leptotyphlopidae (14), Typhlopidae (6),
Aniliidae (1), Tropidophiidae (1), Boidae (12), Colubridae (34), Dipsadidae (237), Elapidae
(27) e Viperidae (28) (BERNARDE, 2011), contudo apenas as famlias Viperidae e Elapidae
so consideradas peonhentas, sendo os gneros Bothrops, Crotalus e Lachesis pertencentes
famlia Viperidae e o gnero Micrurus pertencente famlia Elapidae (MELGAREJO, 2003).
Costa e Brnils (2012) discutiram alguns argumentos contrrios nomenclatura de
gneros e famlias sumarizada por Bernarde (2011). Dos argumentos utilizados contra a
nomenclatura, esto o fato da futura necessidade da republicao de materiais educativos e
banco de dados, uma possvel confuso de assimilao dessas alteraes pelos profissionais

no familiarizados com a taxonomia e os erros j existentes quanto ao uso de nomes populares


para as serpentes brasileiras.
A classificao das serpentes sofreu modificaes nos ltimos anos, devido
descoberta de novas espcies e novas informaes taxonmicas (WHO, 2010; CARRASCO et
al., 2012). Fernwick e colaboradores (2009) propuseram uma nova classificao para as
serpentes do gnero Bothrops da famlia Viperidae. Esta foi dividida em cinco gneros:
Bothriopsis, Bothrocophias, Bothropoiodes, Bothrops e Rhinocerophis baseada em
informaes taxonmicas, dados moleculares e morfolgicos, porm esta nova classificao
ainda no est bem aceita na comunidade cientfica. A rvore filogentica de Fernwick e
colaboradores (2009) semelhante de outros autores, como Parkinson e colaboradores
(2002) e Wster e colaboradores (2005), os quais concordam que Bothrocophias um gnero
vlido, entretanto os autores tambm possuem opinies divergentes. Parkinson e
colaboradores (2009) preferem no realizar mudanas que afetem a nomenclatura e
argumentam que so necessrios maiores estudos. J Wster e colaboradores (2005) optaram
por invalidar o gnero Bothriopsis.
Serpentes da famlia Viperidae apresentam um complexo sistema de produo e
estocagem da peonha devido ao maior grau de especializao no aparelho venenfero
(PINHO; PERREIRA, 2001). Nos acidentes ofdicos, a peonha injetada na vtima via seus
dentes afiados e causa danos de forma grave. As serpentes usam a peonha para imobilizar e
matar suas presas, sendo o mecanismo de defesa de menor importncia quando consideramos
a composio do veneno (KARLSSON, 1979).
As peonhas de serpentes so constitudas por uma mistura de componentes biolgicos
que compreendem enzimas hidrolticas, protenas no enzimticas, molculas orgnicas e
inorgnicas (AIRD, 2002). As toxinas presentes na peonha de serpentes so resultados da
duplicao de genes de protenas ou peptdeos tipicamente usados em outras regies do corpo
e que so expressos na glndula de veneno (FRY, 2005). Os componentes da peonha variam
de acordo com a localizao geogrfica da serpente, as estaes do ano, tambm em relao a
espcie e a idade da serpente (CHIPPAUX; WILLIAMS, 1991; SHASHIDHARAMURTHY
et al., 2002).

1.3. O gnero Bothrops


O gnero Bothrops compreende diversas espcies, como: Bothrops jararaca
(jararaca), Bothrops jararacussu (jararacussu), Bothrops alternatus (urutu-cruzeiro), Bothrops

neuwiedi (jararaca-pintada), e Bothrops moojeni (caiara) (MELGAREJO, 2003), e esto


amplamente distribudas por todo o territrio nacional (BRASIL, 2001).
Peonhas de serpentes do gnero Bothrops possuem ao proteoltica, coagulante e
hemorrgica. A atividade proteoltica derivada de fraes heterogneas da peonha, como
proteases, hialuronidases e fosfolipases, que atuam promovendo alteraes no local da picada
e proximidades, caracterizando uma atividade inflamatria aguda com a presena de edema,
bolhas e necrose. A ao coagulante caracterizada por distrbios na coagulao atravs da
ativao de fatores como protrombina e Fator X. O consumo de fatores de coagulao e a
gerao de produtos de degradao de fibrinognio e fibrina podem ocasionar a
incoagulabilidade sangunea. Na peonha de filhotes, a atividade coagulante predominante,
assim, manifestaes locais podem no existir ou serem discretas. A atividade hemorrgica
ocorre devido s hemorraginas presentes na peonha que provocam leses na membrana basal
dos capilares (FRANA; MLAQUE, 2003; FUNASA, 2001).
O envenenamento botrpico causa inflamao, equimose, bolhas e necrose na regio
da picada. Sistemicamente ocorrem alteraes na coagulao sangunea e sangramento
(RIBEIRO; JORGE,1997). Alm do quadro clnico citado, podem ocorrer complicaes
locais, como necrose do local afetado e formao de abscesso; complicaes sistmicas, como
choque e insuficincia renal aguda (IRA) (BRASIL, 2001). Os acidentes botrpicos so
clinicamente classificados como leve, moderado ou severo, de acordo com as manifestaes
clnicas apresentadas. A classificao baseia-se no tamanho do edema local, no tempo de
coagulao que se apresenta normal ou alterado, e na presena/ausncia e grau de hemorragia
apresentada (CARDOSO et al., 2009). O gnero Bothrops responsvel pela maioria dos
acidentes ofdicos por serpentes peonhentas no pas. Apesar do gnero Crotalus apresentar
maior porcentagem de letalidade, a maior porcentagem de morbidade fica atribuda ao gnero
Bothrops (PINHO; PERREIRA, 2001; BERNARDE, 2011).
A deteco sistmica do envenenamento por Bothrops pode ser feita pelo ensaio
imunoenzimtico ELISA (THEAKSTONet al., 1992), e tambm pelos testes de tempo de
coagulao sangunea (TC), tempo de protrombina (TP), tempo de protrombina parcial
ativada (TPPA), tempo de coagulao ativado (TCA) e aumento dos produtos de degradao
de fibrinognio/fibrina (PDF) devido aos distrbios relacionados com os fatores de
coagulao ocasionados por esses acidentes (TAKAHIRA, 1999). O hemograma completo do
paciente pode ajudar a detectar variaes provenientes do envenenamento e avaliar a eficcia
do tratamento. A dose de antiveneno administrada baseada de acordo com a severidade dos
sinais e sintomas apresentados pelo paciente (FRANA; MLAQUE, 2003), no entanto, o

tratamento no 100% eficaz no controle das manifestaes locais, mas se mostra eficaz no
controle de sintomas sistmicos (GONALVES; MARIANO, 2000). Em casos de
hemorragias locais ou sistmicas a administrao do antiveneno estabelece os nveis normais
de plaquetas (SANTORO et al., 2008). O soro utilizado no tratamento botrpico constitudo
pela mistura da peonha de 5 espcies do gnero Bothrops: B. jararaca (50%), B. alternatus
(12,5%), B. moojeni (12,5%), B. neuwiedi (12,5%) e B. jararacussu (12,5%), produzido a
partir da imunizao em cavalos (CARDOSO; YAMAGUCHI; SILVA, 2003).

1.4. Bothrops jararaca


A serpente Bothrops jararaca popularmente conhecida como jararaca e pertence
famlia Viperidae. Possui colorao variada, desde tons castanhos claros a preto, com
manchas em forma de v invertido ao longo do corpo. Possuem tamanho mdio de
aproximadamente 1 metro. So vivperas, alimentam-se de pequenos roedores e possuem
hbitos noturnos. caracterstica das regies sul e sudeste do Brasil, sendo responsvel pela
maioria dos casos de acidentes ofdicos (FRANA, MLAQUE, 2009) (Fig.1A).
encontrada em algumas localidades das regies Nordeste, Sudeste e Sul do Brasil (Fig.1B).
Apresentam dentio do tipo solenglifo, como qualquer serpente da famlia Viperidae, sendo
capazes de injetar a peonha armazenada em duas glndulas localizadas na parte posterior da
mandbula (JACKSON, 2007; VONK et al., 2008).

Figura 1. Foto da espcie Bothrops jararaca e distribuio da espcie Bothrops jararaca no

Brasil. (A) Bothrops jararaca. Fonte: http://www.cobrasbrasileiras.com.br/viperidae.html; (B)


Distribuio da espcie Bothrops jararca no Brasil. Fonte: BRASIL, 2001.

A peonha de Bothrops jararaca constituda por diversos componentes, sendo que


mais de 80% do peso seco constitudo pela frao proteica (ESCALANTE et al., 2003). A
frao no proteica representada por carboidratos, lipdeos, metais, aminas biognicas,
nucleotdeos e aminocidos livres (FRANA; MLAQUE, 2009).
A peonha da serpente de B. jararaca pode provocar leses no local da picada, tais
como sangramento local, dor, aparecimento de bolhas e edema. Complicaes tambm podem
ocorrer levando a necrose do local. Os sinais sistmicos incluem sangramentos,
incoagulabilidade sangunea e plaquetopenia (SANTORO et al., 2008). O indivduo
acometido tambm pode apresentar quadros de vmitos, sudorese, hipotenso arterial,
insuficincia renal e choque (SANTORO et al., 2008; FRANA, MLAQUE, 2003;
CARDOSO et al., 1993).
Os primeiros estudos sobre a composio da peonha de B. jararaca datam de 1949,
quando pesquisadores observaram que ao incubar o plasma com a peonha de B. jararaca,
ocorria a gerao de um fator hipotensor e espasmognico para a musculatura lisa, o qual foi
denominado bradicinina (ROCHA e SILVA; BERLADO; ANDRADE, 1949). A partir disso,
vrias toxinas foram identificadas na peonha de B. jararaca e divididas em diferentes
classes.
Na tabela 1 podemos destacar algumas toxinas de diferentes classes presente na
peonha de B. jararaca.

Tabela 1. Diferentes classes de toxinas encontradas na peonha de Bothrops jararaca.


Classes
1

Classificao
Fosfolipase A2

Serinoprotease

Protena

Referncia

BJ-PLA2

Serrano et al.,1999,

BJ-PLA2-I

Arajo, 2014

KN-BJ1 e KN-BJ2

Serrano et al.,1998

Bothrombina

Nishida et al., 1994

TL-BJ

Serrano et al., 2000

Lectina like

Bothrojaracina cadeia A

Zingali et al.,1993

Lectina do tipo C

Protena de ligao ao fator IX/X

Mizuno et al.,1997

Lectina

-GPIb-BP

Fujimura et al.,1995

Metaloprotease

Jararagina

Maruyama et al., 1992a

Bothrojaractivase

Berger et al., 2008

Jararafibrase I
7

Nucleotidase

NPP-BJ

Maruyama et al., 1992a


Santoro et al., 2009

Cada uma das famlias de protenas presentes nas peonhas do gnero Bothrops
possuem caractersticas especficas. As metaloproteases, por exemplo, possuem participao
nas atividades hemorrgica, fibrinogenoltica e colagenoltica (MARUYAMA et al., 1992b).
As serinoproteases so capazes de agir na agregao plaquetria, coagulao sangunea e na
fibrinlise (SANO-MARTINS, SANTORO, 2003). O grupo das fosfolipases A2 presentes no
gnero Bothrops desencadeiam uma reao inflamatria intensa com liberao de mediadores
inflamatrios (OLIVEIRA, 2009) e tambm possuem atividade miotxica (TEIXEIRA et al.,
2003). Lectinas tipo-C esto relacionadas s atividades pr-coagulante e anticoagulante,
tambm podem ser agonistas e antagonistas da ativao plaquetria (MORITA, 2004).
Embora a peonha de Bothrops jararaca seja alvo de vrios estudos, a composio da
peonha ainda pouco estudada. Estudos mostraram que o veneno de filhotes apresenta uma
atividade coagulante sobre o plasma 12 vezes maior do que a observada em serpentes adultas
dessa espcie (FURTADO et al., 1991). Menezes e colaboradores (2006) avaliaram de forma
individual o proteoma da peonha de 18 espcimes de Bothrops jararaca, de uma nica
ninhada, utilizando tcnicas de eletroforese e avaliao da atividade proteoltica,
demonstrando assim que a peonha de fmeas possui um perfil eletrofortico mais

homogneo e uma maior atividade proteoltica sobre a casena, quando comparada com a
peonha dos machos. Zelanis (2011) em uma anlise protemica demonstrou que a
porcentagem de toxinas na peonha de Bothrops jararaca possui variaes dependentes do
sexo e da idade das serpentes. Metaloproteases por exemplo, esto presentes na porcentagem
de 53,2% nos filhotes, 29,9% nas serpentes adultas, 25,4% em adultos machos e 33,1% em
fmeas adultas; j as serinoproteases esto presentes na porcentagem de 3,3% nos filhotes,
8,1% nos adultos, sendo 8,6% nos adultos machos e 7,7% em fmeas adultas. Em relao s
CRISPs que sero abordadas posteriormente, foi demonstrado que as maiores porcentagens
so encontradas nos filhotes (2,7%) e nas fmeas adultas (1,5%) (ZELANIS, 2011).
Uma anlise transcriptmica da glndula da serpente Bothrops jararaca demonstrou
1,6% de CRISPs; 53,1% de metaloproteases; 28,5% de serinoproteases; 0,5% de LAAOs;
8,3% de lectina tipo-C; 0,7% de PLA2; 0,9% de inibidor de PLA2;6,2% de precursor de
peptdeo potenciador de bradicinina (PPB) e 0,2% de svVEGF (fator de crescimento vascular
endotelial de peonha de serpentes) do total de transcritos (CIDADE et al., 2006).
Toxinas presentes em peonhas de serpentes j foram descritas como agentes
teraputicos. No caso da serpente Bothrops jararaca, um peptdeo potenciador de bradicinina
foi descoberto atravs do estudo do envenenamento desta serpente, dando origem ao frmaco
captopril utilizado para tratar a hipertenso (CUSHMAN, ONDETTI, 1991). Porm devido a
escassez da peonha e suas variaes de composio, a alternativa foi sintetizar uma
substncia com a mesma frmula da toxina para a produo do medicamento em massa.
Peonhas de serpentes so ricas em compostos bioativos, os quais podem ser
estudados e posteriormente contriburem para o desenvolvimento de novos frmacos,
entretanto a ao conjunta das toxinas que compem a peonha de animais pode exercer
intoxicao e afetar o sistema fisiolgico de um indivduo, no sendo adequada para o uso
teraputico (KOH; ARMUGAN; JEYASEELAN, 2006).
A maioria das toxinas j descritas, isoladas da peonha de Bothrops jararaca
pertencem s classes das fosfolipases, metaloproteases e serinoproteases, sendo que at o
presente momento no h dados na literatura referentes ao isolamento de uma CRISP da
peonha de Bothrops jararaca.

1.5. Protena secretada rica em cistena (CRISP) de peonha de serpentes


As CRISPs so protenas amplamente distribudas entre mamferos, rpteis e anfbios.
Apresentam massa molecular entre 20 e 30 kDa e uma sequncia homloga de aminocidos
contendo 16 resduos de cistena conservados que formam 8 pontes dissulfeto, sendo que dez

desses resduos de cistena esto localizados na sua poro C-terminal (YAMAZAKI,


MORITA, 2004; GUO et al., 2005).
O nome CRISP devido ao conjunto de resduos de cistena que residem na sua
poro C-terminal, formando um domnio compacto (EBERSPAECHER et al., 1995).
Com base em algumas estruturas tridimensionais j estudadas, as CRISPs apresentam
dois domnios: o domnio N-terminal e o domnio C-terminal rico em cistena (CRD)
(GIBBS, O BRYAN, 2007). O domnio N-terminal faz parte da superfamlia de protenas
CAP (CRISPs, Antigen 5, Pathogenesis Related (PR-1) Proteins) e est envolvido na
formao de uma estrutura em forma de fenda formando um stio ativo que contm trs pontes
dissulfeto intramoleculares (HENRIKSEN et al, 2001; SHIKAMOTO et al., 2005), no entanto
a funo deste domnio ainda no est bem definida. Sabe-se que algumas CAPs esto
relacionadas com agentes antifngicos em plantas (NIDERMAN et al., 1995) e significantes
alergenos em humanos (KING et al., 1978; LU et al., 1993). J o domnio CRD contm duas
sub-regies, uma regio dobrvel composta por duas pontes dissulfeto cruzadas que formam
um elo com o domnio CAP, e a regio reguladora de canais inicos (ICR) (GUO et al.,2005;
SHIKAMOTO et al., 2005; GIBBS et al., 2006), a qual parece ser essencial para a atividade
de bloqueio de canais dessas protenas (WANG et al., 2005, 2006; ZHOU et al., 2008;
SHIKAMOTO et al., 2005; GUO et al., 2005; GIBBS et al., 2006). A regio N-terminal
mais conservada quando comparada com outras regies da CRISP (OSIPOV et al., 2005). So
protenas de natureza bsica, com exceo de uma CRISP (CRVP-25h-A) isolada da peonha
de Naja haje (OSIPOVet al., 2005), a qual apresenta carter cido.
As CRISPs encontradas nos mamferos esto distribudas em 4 classes baseando-se na
similaridade da sequncia dos aminocidos (CRISP 1; CRISP 2; CRISP 3 e CRISP 4
(KRATZSCHMAR et al., 1996; JALKANEM et al., 2005), porm autores como Sunagar e
colaboradores (2014) descreveram somente trs tipos, pelo fato da CRISP 4 ter sido descrita
somente em ratos. A CRISP foi identificada pela primeira vez em epiddimo de mamferos e
recebeu o nome de glicoprotena epididimal cida (AEG), tambm conhecida como CRISP 1
(KIERSZENBAUM et al., 1981), podendo ser encontrada tambm nos testculos, sendo sua
funo sugerida como maturao do esperma (KASAHARA et al., 1989) e inibio da fuso
dos gametas (ELLERMAN et al., 2002).
Estudos demonstraram que a CRISP 1 quando incubada com gametas de
camundongos, ratos e humanos, seja ela nativa ou recombinante, capaz de se ligar na
superfcie do ovo impedindo a fuso dos gametas (COHEN et al., 2000b, 2001; ELLERMAN
et al., 2002), porm a CRISP 1 no afeta a ligao dos gametas, sugere-se que ela possui ao

em eventos subsequentes que levam fuso (COHEN, ELLERMAN, CUASNICU, 2000a,


COHEN et al., 2001). Em experimentos com a epididymal sperm protein DE isolada por
Cameo e Blaquier (1976) semelhante s outras CRISPs 1, foi demonstrado que as pontes
dissulfeto so necessrias para a atividade biolgica da protena, pois quando a protena foi
reduzida e alquilada para evitar a restaurao das pontes dissulfeto, observou-se a diminuio
da capacidade da protena de inibir a fuso dos gametas (ELLERMAN et al., 2002). Estudos
mais recentes tambm demonstraram que a CRISP 1 de humanos pode ser futuramente
considerada um mtodo imunocontraceptivo, pois a imunizao com a protena em primatas
produziu um elevado ttulo de anticorpos, os quais demonstraram capacidade de entrar no
trato reprodutivo masculino e tambm de se ligar s clulas in vivo, podendo assim interferir
no processo de fertilizao (ELLERMAN et al., 2010).
A CRISP 2, tambm conhecida como TPX-1 e testis-specific protein 1 (KASAHARA
et al., 1989) expressada somente nos testculos, produzida e secretada a partir de clulas
espermatogncias nos vrios estgios de diferenciao, a qual pode estar envolvida com a
interao entre clulas espermatognicas e clulas de Sertoli, pois observou-se uma reduo
de 50% na interao dessas clulas na presena de um anticorpo anti- TPX-1 (MAEDA,
1998), sendo esta interao necessria para que as clulas espermatogncias se diferenciem,
uma vez que as clulas de Sertoli proporcionam todas as condies necessrias para que
ocorra a diferenciao de clulas durante a espermatognese (FRANA, RUSSELL, 1998).
Em uma anlise de estrutura-funo foi observado que resduos de aminocido da poro Nterminal dessa protena eram suficientes para a atividade de adeso celular, enquanto a regio
rica em resduos de cistena da poro C-terminal eram dispensveis (MAEDA, NISHIDA,
NAKANISHI, 1991).
A CRISP 3 (specific granule protein of 28 kDa; SGP 28) (KJELDSEN et al., 1996)
indica uma possvel relao com a defesa inata do hospedeiro, pois sua distribuio inclui:
glndulas salivares (HAENDLER et al., 1993), grnulos de neutrfilos humanos (KJELDSEN
et al., 1996), epiddimo, ovrio, timo e clon (KRATZSCHMAR et al., 1996), tambm pelo
fato de sua expresso estar aumentada no cncer de prstata (KOSARI et al., 2002) e na
pancreatite crnica (LIAO et al., 2003), no entanto seu papel na fisiopatologia dessas doenas
ainda no foi confirmado. Recentemente, a CRISP 3 foi descrita por apresentar uma possvel
relao com o vrus da hepatite C (VHC), onde constataram que esta protena inibe a fase
inicial da infeco, ou seja, a entrada do vrus na clula hospedeira. Porm o mecanismo pelo
qual ocorre essa inibio ainda no foi definido. Acredita-se que ela pode se ligar ao envelope
do vrus impedindo assim sua fixao receptores da clula hospedeira, ou pode se ligar a

superfcie da clula hospedeira interferindo com o processo de endocitose do vrus (LEE et


al., 2014).
A CRISP 4 isolada de ratos expressada exclusivamente no epitlio do epiddimo de
uma forma andrgeno dependente que comea na puberdade juntamente com a maturao do
esperma. Possui alta similaridade com a CRISP-1 de humanos, podendo estar envolvida nos
mesmos processos, porm a comparao dos padres de expresso das CRISPs entre ratos e
humanos torna-se complicado, uma vez que a estrutura dos epiddimos de cada um so
diferentes (JALKANEN et al., 2005).
A primeira CRISP identificada em rpteis foi a Helothermine (HLX), isolada da saliva
do lagarto mexicano Heloderma horridum horridum (MOCHCA-MORALES, MARTIN,
POSSANI, 1990) responsvel por modular canais inicos, como canais de clcio e potssio
dependentes de voltagem, e receptores rianodina (MORRISSETTE et al., 1995; NOBILE et
al., 1994 e 1996).
Em relao s serpentes, Yamazaki e colaboradores (2003), isolaram CRISPs de
diferentes espcies de serpentes, demonstrando assim que esta protena possui grande
distribuio entre as serpentes das famlias Viperidae e Elapidae de diferentes continentes. Na
tabela 2 esto representadas algumas CRISPs isoladas de peonha de serpentes.

Tabela 2. CRISPs isoladas de peonhas de serpentes.


Protena isolada

Espcie

Referncia

Ophanin

Ophiophagus hannah

Yamazaki et al., 2003

catrin-1/ catrin-2

Crotalus atrox

Yamazaki et al., 2003

Triflin

Trimeresurus flavoviridis

Yamazaki et al., 2002b

Piscivorin

Agkistrodon p. piscivorus

Yamazaki et al., 2003

NA-CRVP1/NA-CRVP2

Naja atra

Jin et al., 2003

Tigrin

Rhabdophis t. tigrinus

Yamazaki et al., 2002b

Ablomin

Agkistrodon blomhoffi

Yamazaki et al., 2002b

Latisemin

Laticauda semifasciata

Yamazaki et al., 2002b

pseudechetoxin (PsTx)

Pseudechis australis

Brown et al., 1999

pseudecin (Pdc)

Pseudechis porphyriacus

Yamazaki et al., 2002a

Stecrisp

Trimeresurus stejnegeri

Tu et al., 2004

TJ-CRVP

Trimeresurus jerdonii

Jin et al., 2003

CRVP-25h-A

Naja haje

Osipov et al., 2005

CRVP-23K

Naja kaouthia

Osipov et al., 2005

CRVP-24K

Naja kaouthia

Osipov at el., 2005

Inflamin

Aipysurus eydouxii

Barnwal e Kini, 2013

Natrin

Naja atra

Wang et al., 2010

Peonhas de serpentes j demonstraram um potencial como novos agentes para o


combate de doenas negligenciadas. Podemos citar a peonha da serpente Bothrops moojeni,
que demonstrou ser capaz de matar as promastigotas, mas no as amastigotas da leishmaniose
in vitro devido a ao do perxido de hidrognio da L-aminocido oxidase (LAAO)
(TEMPONE et al., 2001) e a peonha de Bothrops jararaca que demonstrou potencial para
inibio do crescimento dos parasitas de Trypanosoma cruzi e de Leishmania major
possivelmente relacionado com o comprometimento mitocondrial (GONALVES et al.,
2002). Adade e colaboradores (2014) testaram a CRISP crovirin isolada da peonha da
serpente Crotalus viridis viridis quanto a sua atividade nos parasitas de Leishmania
amazonensis, Trypanosoma cruzie Trypanosoma brucei rhodesiense, e constataram a
atividade leishmanicida e tripanomicida principalmente contra as formas intracelulares,
podendo ento futuramente ser usada para o tratamento da Leishmaniose e da doena de
Chagas, uma vez que ela tambm apresenta baixa toxicidade para as clulas hospedeiras.
Lecht e colaboradores (2015) demonstraram que a CRISP denominada ES-CRISP, isolada da

peonha de Echis carinatus sochureki capaz de inibir a angiognese por meio da interao
direta com clulas endoteliais, inibindo alguns fatores reguladores deste processo, podendo
contribuir para a compreenso de mecanismos envolvidos na progresso da angiognese.
Em relao a outras possveis atividades biolgicas das CRISPs de serpentes, podemos
citar a CRISP patagonin isolada da peonha de Philodryas patagonienses, a qual demonstrou
atividade miotxica, pois quando injetada em ratos via intramuscular causou danos ao
msculo gastrocnmio, uma atividade ainda no descrita para as CRISPs. Quando
administrada uma dose mais elevada, observaram fibras musculares necrosadas com
desorganizao do material miofibrilar juntamente com edema e uma reao inflamatria,
devido presena de um infiltrado polimorfonuclear, porm no foi observado hemorragia. A
injeo de patagonin tambm no causou danos nos tecidos do crebro, cerebelo, corao,
fgado, bao e pulmo (PEICHOTO et al., 2009).
Estudos sugerem que a maioria das CRISPs com funes j descritas esto envolvidas
com o bloqueio de canais inicos. Por exemplo, a helothermine (HLX) de Heloderma
horridum horridum bloqueia canais para clcio (NOBILE et al., 1996) e potssio dependentes
de voltagem (NOBILE et al., 1994) e, receptores rianodina (MORRISSETTE et al., 1995). As
CRISPs ablomim (Agkistrodon blomhoffi), latisemin (Laticauda semifasciata) e triflin
(Trimeresurus flavoviridis) esto relacionadas ao bloqueio de canais para clcio tipo-L, j
tigrin (Rhabdophis t. Tigrinus) no demonstrou essa atividade. Opanin (Ophiophagus
hannah), catrin-2 (Crotalus atrox) e piscivorin (Agkistrodon p. piscivorus) possuem uma
baixa, mas significante inibio da contrao das clulas do msculo liso devido s altas
concentraes de potssio (YAMAZAKI et al., 2002b, 2003). Em relao aos canais CNG
(canais dependente de nucleotdeos cclicos), as CRISPs PsTx (Pseudechetoxin) de
Pseudechis australise e Pseudecin (Pdc) de Pseudechis porphyriacus podem atuar como
bloqueadoras, enquanto triflin (Trimeresurus flavoviridis), latisemin (Laticauda semifasciata),
piscivorin (Agkistrodon piscivorus piscivorus) e tigrin (Rhabdophis t. tigrinus) no bloqueiam
esse canal (BROWN et al., 1999; YAMAZAKI et al., 2002a; YAMAZAKI et al., 2003;
ZAGOTTA, SIEGELBAUM, 1996).
A comparao entre PsTx e Pdc demonstrou que elas se diferem em apenas sete
resduos de aminocidos e bloqueiam o canal CNG com afinidades diferentes (YAMAZAKI
et al., 2002a), o que sugere a existncia de uma regio especfica nessas protenas que pode
ser crtica para a inibio do canal. Estudos demonstraram que algumas toxinas que inibem
canais apresentam o resduo Glu 186. Quando essas toxinas apresentam o resduo Phe 189

alm do Glu 186 elas so consideradas fortes bloqueadoras, porm outros estudos ainda so
necessrios para confirmar tal suspeita (YAMAZAKI et al., 2003).
Estudos com a toxina PsTx demonstraram que ela inibe o fluxo de corrente atravs dos
canais CNG, funcionando como um bloqueador de alta afinidade pelo poro do canal
(BROWN et al. (1999); (2003). Yamazaki e colaboradores (2002b) demonstraram que a
CRISP ablomin capaz de bloquear canais para potssio devido inibio do potencial
eltrico, bem como a contrao, promovida pela interao de protenas com receptores.
O presente trabalho traz contribuies para o conhecimento mais aprofundado dessa
famlia de protenas amplamente distribuda, mas pouco caracterizada, e ainda destacar
funes como induo do processo inflamatrio e modulao do sistema complemento.

1.6. O processo inflamatrio e peonhas de serpentes


A inflamao constitui um processo homeosttico desencadeado pelo organismo com
o objetivo de reduzir a leso, isolar ou destruir o agente agressor aps uma leso tecidual ou
infeco local (LEVY, 1996). Desencadeado o processo inflamatrio, ocorre a ativao de
mecanismos de reparo necessrios para garantir o restabelecimento das funes normais do
organismo (ROCHA e SILVA, 1978). A resposta inflamatria aguda pode ser dividida em
imunidade inata, no imunolgica, englobando os eventos que ocorrem localmente no interior
dos tecidos, como os eventos vasculares e celulares; e a imunidade adquirida que contribui
com a defesa do organismo por meio da produo de anticorpos, clulas T auxiliares e
linfcitos T citotxicos (TLASKALOVA-HOGENOVA et al., 2005).
A imunidade inata a primeira linha de defesa do organismo contra agentes
infecciosos e suas principais clulas efetoras so os macrfagos, neutrfilos, clulas
dendrticas, clulas NK (natural killers), protenas do sistema complemento e citocinas
(CRUVINEL et al., 2010). Macrfagos e neutrfilos possuem receptores responsveis pelo
reconhecimento de molculas como lipopolissacardeos, resduos de manose e cidos
teicicos, conhecidos como PAMPS (Padres Moleculares Associados a Patgenos) que esto
presentes na superfcie dos microorganismos, ativando assim a resposta imune inata e
conduzindo a fagocitose dos microorganismos (CRUVINEL et al., 2010; MEDZHITOV,
JANEWAY, 1997). Esses receptores tambm podem ser encontrados nas clulas dendrticas,
as quais so responsveis pela captura e apresentao de antgenos para os linfcitos, j as
clulas NK reconhecem e lisam clulas infectadas e tambm so responsveis pelo
recrutamento de macrfagos e neutrfilos (CRUVINEL et al., 2010).

As alteraes decorrentes do processo inflamatrio so reguladas pela liberao


imediata e sequencial de mediadores inflamatrios, os quais so produzidos principalmente
por clulas inflamatrias (SHARMA, BUCHANAN, 1994). Os mediadores so responsveis
por promoverem os sinais caractersticos da resposta inflamatria: dor, calor, rubor e tumor,
que podem vir acompanhados ou no de perda de funo do tecido ou rgo afetado (ROCHA
e SILVA, 1978). Os mediadores inflamatrios so classificados em: aminas vasoativas
(histamina e serotonina), neuropeptdeos, mediadores derivados de lipdios (eicosanoides,
leucotrienos e prostaglandinas), xido ntrico, citocinas e quimiocinas, cascata de protenas
plasmticas (fatores do complemento) e fator de ativao plaquetria (PAF) (KING, 2007).
Em relao sua liberao, so classificados como intermedirios e finais. Mediadores
intermedirios so liberados no nicio e durante o processo inflamatrio, incluem as citocinas
TNF- e IL-1, a quimiocina IL-8 (CUNHA et al., 2008), fatores do complemento C3a e C5a
(JANG et al., 2010), e bradicinina (FERREIRA et al., 1965; TONUSSI, FERREIRA, 1997),
sendo responsveis pela liberao de outros mediadores, sejam eles intermedirios e/ou finais.
Os mediadores finais so representados pelas prostaglandinas e eicosanoides, responsveis
pela dor (FERREIRA, 1973), tais como: histamina, serotonina, fator de agregao plaquetria
(CEVIKBAS, STEINHOFF, IKOMA, 2010) e leucotrienos (CUNHA et al., 2003).
As citocinas constituem um grupo de protenas solveis de curta atividade, so
glicoprotenas e peptdeos produzidos por vrias clulas imunes e clulas vasculares, que
atravs de uma baixa concentrao so capazes de ativar receptores especficos e modular as
funes de clulas e tecidos. Diferentes tipos de clulas podem secretar algumas citocinas, e
uma citocina especfica tambm pode agir em vrios tipos de clulas e desencadear vrias
atividades biolgicas dependendo do tipo de clula, tempo e contexto (HIRANO, 1999). As
citocinas podem ser divididas em pr inflamatrias, como o caso da IL-6, IL-1 e TNF- , as
quais se caracterizam como uma potente defesa contra patgenos exgenos; e as citocinas
anti-inflamatrias, como a IL-10 que so importantes para a regulao do processo
inflamatrio e manuteno da homeostasia do organismo (HOWARD et al., 1993).
Concomitantemente com os eventos celulares, ocorrem os eventos vasculares que
compreendem a vasodilatao e o aumento da permeabilidade da vnula com consequente
exsudao plasmtica, promovendo um aumento local da concentrao de mediadores de
origem plasmtica (ROCHA e SILVA, 1978). Inicialmente ocorre uma vasoconstrio,
seguida de uma vasodilatao favorecendo o aumento do fluxo sanguneo no local e
promovendo sinais como calor e vermelhido local. Mudanas estruturais na parede do vaso
levam ao aumento da permeabilidade vascular e ao extravasamento de protenas, evento pelo

qual forma o edema (KOWAL-VERN et al., 1997; RANKIN, 2004; ROITT, BROSTOFF,
MALE, 1999). Ocorre o aumento da viscosidade do sangue e a reduo do fluxo sanguneo,
fazendo com que os leuccitos circulantes no interior do vaso migrem para a periferia, dando
incio ao processo de migrao leucocitria (CONTRAN, KUMAR, COLLINS, 1999).
Como dito anteriormente, a vasodilatao decorrente da inflamao faz com que o
fluxo sanguneo diminua, assim as clulas circulantes colidem mais frequentemente com as
clulas endoteliais ativadas que expressam molculas de superfcie capazes de se ligarem aos
leuccitos. Estes so ento atrados para a periferia do vaso e entram em contato com o
endotlio (CRUVINEL et al., 2010) e, posteriormente participam da fagocitose e destruio
de agentes patognicos, levando resoluo do processo inflamatrio (BROCHE,
TELLADO, 2001). A migrao dos leuccitos circulantes para o local da inflamao
dependente de molculas endoteliais e mediadores quimiotticos (SPRINGER, 1994;
WEBER, 2003).
Por outro lado, a resposta imune adquirida estimulada pela exposio a certos
agentes, aumentando a capacidade de defesa aps cada exposio sucessiva e sempre
lembrando do agente que o organismo entrou em contato (LAROSA, ORANGE, 2008). A
imunidade adaptativa se divide em humoral, na qual anticorpos so secretados pelos linfcitos
B, reconhecendo antgenos e os neutralizando, impedindo que infectem outras clulas, porm
este tipo de imunidade atua somente contra patgenos extracelulares e toxinas, e a imunidade
adquirida, a qual mediada por linfcitos T que atuam contra patgenos intracelulares,
osquais sobrevivem e se proliferam dentro dos fagcitos, no podendo, portanto, serem
alcanados por anticorpos (MESQUITA et al., 2010).
Peonhas de algumas serpentes esto relacionadas com o processo inflamatrio. As
serpentes do gnero Bothrops apresentam diversos componentes na sua peonha, que
contribuem para os efeitos hemorrgicos e coagulantes (NEIVA et al., 2009; DE
ALVARENGA et al., 2011). As fosfolipases A2 (PLA2) presentes na peonha so capazes de
desencadear alguns efeitos inflamatrios como: aumento da permeabilidade microvascular,
recrutamento de leuccitos nos tecidos, nocicepo e liberao de mediadores inflamatrios
(TEIXEIRA et al., 2003). As metaloproteases so responsveis pelos efeitos de origem
inflamatria, mediada por metablitos do cido araquidnico (prostaglandinas e leucotrienos)
no edema induzido pelo envenenamento (TEIXEIRA et al., 2005). Zychar e colaboradores
(2010) demonstraram que metaloproteases, fosfolipases e serinoproteases presentes na
peonha de serpentes possuem participao na resposta inflamatria, sendo que a maior ao
se deve s metaloproteases, que contribuem para os efeitos inflamatrios locais e

nociceptivos. As fosfolipases A2 apresentaram um efeito menor, limitado a nocicepo, j as


serinoproteases no contriburam significativamente para a resposta inflamatria, mas seu
papel no deve ser descartado.
Em relao s CRISPs, Barnwal e Kini (2013) identificaram a CRISP inflamin a partir
da biblioteca de cDNA da glndula da serpente Aipysurus eydouxii. Inflamin foi injetada na
cavidade peritoneal de camundongos e demonstrou a ativao de cPLA2 (fosfolipase A2
dependente de clcio) conduzindo a biossntese de prostanides e a induo de edema quando
injetada na pata de camundongos. Wang e colaboradores (2010) isolaram a CRISP natrin da
peonha da serpente Naja atra, a qual demonstou atuao na regulao da expresso de
molculas de adeso em clulas endoteliais, participando assim do processo inflamatrio.
Contudo, ainda pouco se sabe sobre a participao das CRISPs no processo
inflamatrio causado pelo envenenamento por serpentes. Como h outros componentes na
peonha que tambm participam deste processo, suas funes precisam ser estudadas
isoladamente.

1.7. O sistema complemento e peonhas de serpentes


O sistema complemento (SC) consiste em um conjunto de mais de 30 protenas que
interagem com outras molculas do sistema imune de uma maneira altamente regulada para
gerar componentes ativos com funes de promover a inflamao e destruir microorganismos
invasores (WAGNER; FRANK, 2010; WALPORT, 2001). Suas protenas so sintetizadas
principalmente nos hepatcitos e nos moncitos (BURGER, 1988; COLE, COLTEN, 1988),
j protenas reguladoras ligadas membrana so sintetizadas nas clulas que so expressas
(CAMPBELL, 1988). A ativao do SC leva formao de produtos de clivagem, como as
anafilatoxinas C3a e C5a, que so importantes na iniciao da resposta inflamatria contra
microorganismos invasores e na quimiotaxia dos leuccitos (HAAS, STRIJP, 2007). Alm
das anafilatoxinas, a ativao do sistema complemento tambm leva formao do MAC
(membrane attack complex), atravs da ligao de C5b a C6 e posteriormente a ligao com
as ltimas protenas do SC (SIM, 1992).
A ativao do sistema complemento pode ocorrer por trs vias distintas dependendo
do estmulo, so elas: via clssica (VC), via alternativa (VA) e via das lectinas (VL)
(WAGNER; FRANK, 2010) (Fig. 2). Na via clssica (VC) um antgeno e um anticorpo
especfico (IgM ou IgG) se interagem formando um imunocomplexo que reconhecido pelo
componente C1. A ativao da via das lectinas (VL) ocorre pela ligao de uma lectina tipo-C
ligante de manose (MBL, mannose-binding lectin) a glicoprotenas ou polissacardeos

encontrados na superfcie de microorganismos. A ligao de MBL a serinoproteases


circulantes associadas (MASP) forma um complexo que leva clivagem dos componentes C4
e C2, resultando na gerao de uma C3 convertase similar da VC. A via alternativa (VA)
iniciada por hidrlise espontnea do componente circulante C3, independente do
reconhecimento de patgenos por anticorpos. A ligao de protenas especficas da VA levam
a ativao de C3 que ir interagir com polissacardeos e protenas de superfcie de clulas
alteradas ou microorganismos para gerar o MAC (WAGNER; FRANK, 2010).
As trs vias tornam-se iguais e segue-se uma via comum quando o complexo C3
convertase formado. Assim, ocorre a clivagem de mais molculas de C3 e a formao do
complexo C5 convertase que capaz de clivar molculas de C5 dando origem aos fragmentos
C5a e C5b. Enquanto o fragmento C5a uma importante anafilatoxina, o C5b se liga s
ltimas protenas do SC (C6, C7, C8 e C9), resultando na formao do complexo de ataque
membrana (MAC) (ABBAS, LICHTMAN, PILLAI, 2011). As protenas C6, C7, C8 e C9 no
possuem atividade enzimtica, apenas fazem parte da estrutura de formao do MAC, que se
deposita na superfcie das clulas, onde forma poros permitindo a livre passagem de gua e
ons, resultando no aumento do volume osmtico e a consequentemente ruptura das clulas
(CARROLL; SIM, 2011). O sistema complemento caracterizado como uma cascata
enzimtica capaz de gerar complexos que esto envolvidos com a anafilaxia, quimiotaxia,
opsonizao, remoo de imunocomplexos e a modulao da resposta imune (WALPORT,
2001).
fundamental que haja uma regulao precisa desse sistema a fim de evitar o
consumo exagerado de protenas do complemento e a ocorrncia de danos s clulas
hospedeiras, portanto paralelo ativao do SC ocorre tambm o processo de regulao. A
regulao pode ocorrer por meio de fatores plasmticos, como o fator C4b Binding Protein
(C4BP) que atua na via clssica e na via das lectinas; o Fator H (FH) que atua na via
alternativa, os quais impedem a continuidade das trs vias, pois aceleram o decaimento das
C3 convertases e atuam como co-fatores do Fator I (FI) na clivagem dos fragmentos C3b e
C4b (BLOM et al., 2002; MORGAN, HARRIS, 1999; RODRGUEZ DE CRDOBA et al.,
2004), e tambm por meio de reguladores presentes na membrana das clulas, como o
complement receptor 1 (CR1), o membrane co-factor protein (MCP), que atuam como cofatores do Fator 1 na clivagem dos fragmentos C3b e C4b; o decay accelerating factor (DAF),
responsvel pelo decaimento de C3 e C5 convertase e a protectina (CD59) que inibe a
incorporao do C9 ao complexo que posteriormente formaria o MAC (KIM; SONG, 2006).

Figura 2. Vias de ativao do sistema complemento (WAGNER; FRANK, 2010).

Alguns compostos das peonhas de animais so capazes de modular o sistema


complemento, seja pela clivagem direta de um componente especfico ou pela formao de
complexos capazes de ativar a cascata do complemento (DIAS DA SILVA et al., 1995),
porm essa atividade ainda pouco estudada. A literatura nos mostra alguns exemplos de
toxinas ou peonhas que possuem atividades sobre o sistema complemento. A serinoprotease
flavoxobin, isolada da peonha da serpente Trimeresurus flavoviridis demonstrou ser capaz de
ativar o sistema complemento, atrves da clivagem da molcula de C3 em dois fragmentos
(YAMAMOTO et al., 2002). A glicoprotena oxiagin da peonha de Naja oxiana demonstrou
atravs de ensaios, que inibe a lise de eritrcitos e a formao da C3 convertase, pois impede
a interao de C2 com C4b (SHOIBONOV et al., 2005). J a peonha de Crotalus atrox

demonstrou ser capaz de gerar anafilatoxinas C3a a partir do componente C3 e C5a a partir
dos componentes C5 (MAN, MINTA, 1977).
Pidde-Queiroz e colaboradores (2013) demonstraram que a metaloprotease P-I de
Bothrops pirajai ativa preferencialmente a via clssica do sistema complemento pela
clivagem direta dos componentes C3, C4 e C5, gerando fragmentos biologicamente ativos.
Na literatura no encontramos estudos de CRISPs relacionadas com o sistema
complemento, sendo assim de grande importncia o seu isolamento e a caracterizao
funcional, bem como os estudos sobre o processo inflamatrio e sobre a modulao do
sistema complemento.

1.8. Canais inicos e toxinas animais


Os canais inicos so formados por glicoprotenas de membrana que permitem a
passagem seletiva de ons atravs de um poro. Esses canais respondem a estmulos eltricos,
qumicos, mecnicos, alteraes da concentrao de ligantes (neurotransmissores, peptdeos e
hormnios) e mudanas de voltagem (HILLE, 1992). Canais inicos sensveis voltagem so
responsveis pela gerao e propagao de sinais eltricos em neurnios e outras clulas
excitveis; mudam sua conformao (abertos, fechados ou inativos) em funo do potencial
de membrana. Assim, ocorre a despolarizao ou repolarizao da membrana devido
passagem de correntes inicas para dentro ou para fora das clulas (CATTERALL, 1984).
Os canais para clcio (Ca+) dependentes de voltagem esto presentes no sistema
nervoso, endcrino e cardiovascular. Atuam regulando processos intracelulares, como:
neurotransmisso e expresso gnica, liberao de hormnios e contrao da musculatura
cardaca por meio do influxo do on clcio em resposta a despolarizao da membrana
(McDONOUGH, 2007). So canais formados por uma subunidade 1 tetramrica,
responsvel pela formao do poro do canal e por vrias subunidades reguladoras que so
responsveis pelas propriedades eletrofisiolgicas e cinticas do canal (BELEBONI et al.,
2004, ESCOUBAS, DIOCHOT, CORZO, 2000).
Os canais para sdio (Na+) dependentes de voltagem so responsveis pela gerao e
propagao do potencial de ao. So encontrados na maioria das clulas excitveis
(BELEBONI et al., 2004). So constitudos por protenas transmembrana compostas de uma
subunidade e pelo menos 3 subunidades . A subunidade o local onde existem stios
receptores para os agentes farmacolgicos que agem nesse tipo de canal. As subunidades
so responsveis pela dependncia de voltagem e pela cintica de abertura do canal
(CESTLE, CATTERALL, 2000).

Os canais para potssio (K+) so protenas que permitem o movimento de ons K+


atravs da membrana plasmtica (JAN, JAN, 1992). Quatro tipos distintos de canais de K+ so
identificados no msculo liso arterial, entre eles: canais para potssio sensveis ao clcio
(Kca), canais para potssio dependentes de voltagem (Kv), canais de potssio de retificao
interna (Kir) e os canais de potssio sensveis ao ATP (KATP). Canais para potssio
dependentes de voltagem (Kv) so importantes em alguns processos fisiolgicos, como:
ativao de linfcitos, liberao de neurotransmissores e excitabilidade celular (GUTMAN et
al., 2005), so capazes de regular o potencial de membrana do msculo liso em resposta
estmulos despolarizantes, promovendo a repolarizao do potencial de ao nas clulas
excitveis (NELSON, QUAYLE, 1995).
Os canais para potssio so formados por mais de 40 tipos diferentes de canais, e
classificados de acordo com sua homologia na sequncia de aminocidos em pelo menos 12
subfamlias (Kv1-Kv12) (GUTMAN et al., 2005). A subfamlia Kv1 (Shaker) e seus subtipos
(Kv1.1-Kv1.8) so os mais estudados, e encontrados no crebro, corao, rim, pncreas,
pulmo, sistema nervoso perifrico, retina, linfcitos, osteoclastos e clulas hematopoiticas.
A subfamlia Shaw (Kv3.1-Kv3.4) pode ser encontrada principlamente no crebro e interage
com toxinas de anmonas do mar. A subfamlia Kv7 (Kv7.1-Kv7.5) encontrada no corao,
msculo esqueltico e sistema nervoso central. J a subfamlia hERG (Eag) (Kv10, Kv11,
Kv12) pouco estudada, e encontrada principlamente no sistema nervoso central (MOUHAT
et al., 2008).
As toxinas animais possuem alta especificidade por certos subtipos de canais inicos
ou receptores de membrana. Como existem poucas drogas com ao especfica sobre canais
inicos, esse mecanismo de ao das toxinas animais serve como ferramenta para elucidar o
papel fisiolgico ou patologias relacionadas aos canais inicos e receptores de membrana
(HARVEY et al., 1998). Existem dois mecanismos nos quais as toxinas animais atuam nos
canais inicos dependentes de voltagem. A toxina pode se ligar em alguma regio do canal
provocando mudanas conformacionais que alteram a abertura, fechamento e inativao do
canal (WANG, STRICHARTZ, 1983), ou a toxina pode se ligar na poro extracelular do
canal, causando obstruo do poro condutor e impedindo o fluxo de ons (GARCIA et al.,
1991).
A peonha de aranhas do gnero Lasiodora j foi descrita com aes farmacolgicas,
como o bloqueio do canal para clcio (Ca2+) do tipo-L e alterao da cintica e voltagem de
canais para sdio (Na+) (KUSHMERICK et al., 2001). Alguns exemplos de toxinas de
aranhas ativas em canais para sdio (Na+), so as -agatoxinas (-Aga I a -Aga VI), isoladas

da peonha da espcie Agelenopsis aperta (SKINNER et al., 1989). A toxina Argiotoxina 636
(Argiope sp.), que capaz de inibir canais para potssio dependentes de ligantes e
dependentes de voltagem (LEE, JOHN, WEISS, 1999). E a toxina denominada stromatoxina
(ScTx1) isolada da peonha da aranha caranguejeira africana Stromatopelma calceata
(ESCOUBAS et al., 2002), que um potente inibidor de canais para potssio dos subtipos
Kv4.2 e Kv2.2.
Toxinas presentes na peonha do escorpio Tityus serrulatus tambm j foram
descritas pela capacidade de atuar em canais para potssio (K+), como: Ts6, Ts7, Ts8, Ts9 e
Ts15 (COLOGNA et al., 2001, MARCUSSI et al., 2011). As toxinas IpTxA e IpTxi
(Pandinus imperator) isoladas por Valdivia e Possani (1998), e a toxina maurocalcina (Mca)
do escorpio Maurus palmatus, isolada por Fajloun e colaboradores (2000) so exemplos de
toxinas especficas para canais de clcio (Ca+), elas ativam o receptor de rianodina (Ryr), um
canal de liberao de clcio intracelular. As toxinas escorpinicas que atuam em canais para
sdio (Na+) so divididas em dois grupos de acordo com seus efeitos farmacolgicos, as
toxinas que agem diminuindo ou bloqueando o mecanismo de inativao desses canais, e as
toxinas que afetam a ativao do canal (JOVER, COURAUD, ROCHAT, 1980;
COURAUD et al., 1982; CATTERALL , 1986).
Em relao s serpentes, a toxina crotamina isolada da peonha da serpente Crotalus
durissus terrificus, demonstrou atividade sobre canais de sdio (Na+) dependentes de
voltagem (CHEYMOL, 1978a, 1978b; CHANG, TSENG, 1978). Ainda na peonha de
Crotalus durissus terrificus, a toxina isolada crotoxina demonstrou ser capaz de modular a
corrente em canais de clcio do tipo-L (ZHANG et al., 2010). Em relao s CRISPs, a toxina
Natrin purificada da peonha de Naja atra conhecida por bloquear canais para potssio do
subtipo Kv1.3 (WANG et al., 2006) e tambm canais para potssio ativados por clcio (BKCa)
(WANG et al., 2005). Yamazaki e colaboradores (2003) testaram a atividade de algumas
CRISPs (ophanin, piscivorin, catrin-1 e catrin-2) sobre a contrao da artria caudal de ratos,
e observaram que as CRISPs ophanin, piscivorin e catrin-2 demonstraram uma inibio dos
canais para potssio em diferentes graus.

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