PCR (Polymerase Chain Reaction)

- Chiroque Paz Grecia Olga

- Juarez Ioan Juan
- Tocas Ordemar Alonso

TABLA DE CONTENIDO
Contenido
Introduccion_______________________________________________________________1
Objetivos__________________________________________________________________2
Materiales y Reactivos____________________________________________________2
Procedimiento_____________________________________________________________2
Conclusiones _____________________________________________________________2
Cuestionarios_____________________________________________________________2
Bibliografia_____________________________________________________________________2

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Introduccin
La reaccin en cadena de la polimerasa fue desarrollada en 1983 por el
Doctor Kary Mullis perteneciente a la Cetus Corporation en California. El Dr.
Mullis recibi en 1993 el Premio Nobel de Qumica por este descubrimiento.
El PCR es una tcnica que sirve para amplificar un fragmento de ADN; su
utilidad es que tras la amplificacin resulta mucho ms fcil identificar con
una muy alta probabilidad, virus o bacterias causantes de una enfermedad,
identificar personas (cadveres) o hacer investigacin cientfica sobre el
ADN amplificado. Estos usos derivados de la amplificacin han hecho que
se convierta en una tcnica muy extendida, con el consiguiente
abaratamiento del equipo necesario para llevarla a cabo.
Reactivos de la tcnica PCR
dNTP:
Los
4 desoxirribonucletidos-trifosfato ,
para polimerizar nuevo ADN.

sustratos

Cebadores o
iniciadores
(en
ingls, primers):
Dos oligonucletidos s cada uno, complementarios a una de las dos
hebras del ADN. Son secuencias cortas, de entre seis y cuarenta
nucletidos, normalmente de dieciocho a veintids, que permiten que
la polimerasa inicie la reaccin. Deben estar enfrentados y no a
mucha distancia. Delimitan la zona de ADN a amplificar, es decir,
corresponden a los nucletidos que definen los extremos de la
secuencia que se desea replicar.
Iones Divalentes: Se suele usar magnesio (Mg2+), agregado
comnmente como cloruro de magnesio (MgCl2), o algn otro catin
divalente.
Tambin
se
puede
emplear manganeso (Mn2+),
para mutagnesis de
ADN
mediante
PCR,
ya
que
altas
2+
concentraciones de Mn incrementan la tasa de error durante la
sntesis de ADN. Actan como cofactores de la polimerasa.
Buffer: Una solucin tampn que mantiene el pH adecuado para el
funcionamiento de la ADN polimerasa.

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ADN polimerasa o mezcla de distintas polimerasas con temperatura
ptima alrededor de 70 C (la ms comn es la polimerasa Taq).
ADN molde, que contiene la regin de ADN que se va a amplificar.

Los cambios de temperatura constituyen la base para que se completen los

pasos necesarios. El proceso se lleva a cabo en tres fases:
desnaturalizacin, hibridacin y elongacin.

Inicio
Este paso consiste en llevar la reaccin hasta una temperatura de 94-96 C
( 98 C si se est usando una polimerasa termoestable extrema), que se
mantiene durante 1-9 minutos. Esto slo es necesario para ADN
polimerasas que requieran activacin por calor.
Desnaturalizacin
En primer lugar, se desnaturaliza el ADN (se separan las dos cadenas de las
cuales est constituido). Este paso puede realizarse de diferentes modos,
siendo el calentamiento (94-95 C) de la muestra la forma ms habitual. La
temperatura a la cual se decide realizar la desnaturalizacin depende, por
ejemplo, de la proporcin de G+C que tenga la cadena, como tambin del
largo de la misma. Otros mtodos, raramente empleados en la tcnica de la
PCR, seran la adicin de sales o agentes qumicos capaces de realizar la
desnaturalizacin.
Hibridacin
A continuacin se producir la hibridacin del cebador, es decir, el
cebador se unir a su secuencia complementaria en el ADN molde. Para ello
es necesario bajar la temperatura a 40-68 C durante 20-40 segundos
(segn el caso), permitiendo as el alineamiento. Los puentes de
hidrgeno estables entre las cadenas de ADN (unin ADN-ADN) slo se
forman cuando la secuencia del cebador es muy similar a la secuencia del
ADN molde. La polimerasa une el hbrido de la cadena molde y el cebador,

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y empieza a sintetizar ADN. Los cebadores actuarn como lmites de la
regin de la molcula que va a ser amplificada.
Extensin o Elongacin
Acta la ADN polimerasa, tomando el ADN molde para sintetizar la cadena
complementaria y partiendo del cebador como soporte inicial necesario
para la sntesis de nuevo ADN. La polimerasa sintetiza una nueva hebra
de ADN complementaria a la hebra molde aadiendo los dNTP
complementarios en direccin 5' 3', uniendo el grupo 5'-fosfato de los
dNTP con el grupo 3'-hidroxilo del final de la hebra de ADN creciente (la cual
se extiende). La temperatura para este paso depende del ADN polimerasa
que usemos. Para la polimerasa Taq, la temperatura de mxima actividad
est en 75-80 C (comnmente 72 C). El tiempo de extensin depende
tanto del ADN polimerasa usada como de la longitud del fragmento de ADN
que se va a amplificar. Hay una regla comnmente usada: en su
temperatura ptima, la polimerasa de ADN polimerizar mil bases en un
minuto.
Elongacin Final
Etapa nica que se lleva a cabo a una temperatura de 70-74 C durante 515 minutos tras el ltimo ciclo de PCR. Con ella se asegura que cualquier
ADN de cadena simple restante sea totalmente ampliado.
Conservacin
Este es un paso que se lleva a cabo a 4-15 C durante un tiempo indefinido
para conservar la reaccin a corto plazo.
La PCR normalmente se realiza con un volumen de reaccin de 15-100 L,
en pequeos tubos de 0.2-0.5 mL que se colocan en el termociclador.
Para verificar que la PCR ha generado el fragmento de ADN previsto, se
emplean tcnicas de electroforesis, que separan los fragmentos de ADN
generados de acuerdo a su carga, esto es, longitud, y, en menor medida y
dependiendo de la matriz empleada, a su tamao: tpicamente se emplean
la electroforesis en gel de agarosa, para fragmentos grandes;

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en acrilamida, para los ms pequeos; y, de forma ms rpida y aplicable
a la PCR asociada a marcaje fluorescente, la electroforesis capilar. El/los
tamao/s de los productos de la PCR vienen determinados por un marcador
de peso molecular de ADN, el cual contiene fragmentos de ADN de
tamao conocido, y que se corre en el gel junto con los productos de PCR.

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Objetivos:
Describir el proceso del PCR.
Detallar los componentes necesarios para llevar a
cabo un PCR.
Manipular los instrumentos y reactivos
correctamente para la preparacin de las soluciones
y la realizacin de las experiencias.
Aprender la importancia y utilidad que se le da a
estas tcnicas en los diversos estudios de biologa
molecular.
Materiales :

Muestras de ADN.

Tubos Eppendorf de 0,2 ml.

Micropipetas.

Cabina esterilizada para PCR.

Termociclador.

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69 uL de Agua destilada.

25 uL de Buffer.

10 uL de MgCl2.

10 uL de dNTP.

2,5 uL de cada Primer.

1 uL de Taq Polimerasa.

Procedimiento
1. Esterilizar la cabina donde se trabajar.
2. Codificar las muestras.
3. Preparar 120uL de Master Mix con el agua destilada, el buffer, MgCl 2,
los dNTPs, los primers y la Taq polimerasa.
4. Repartir el Master Mix en cada tubo Eppendorf (22.5uL en cada uno).
5. Agregar 2.5uL de ADN a cada tubo.
6. Llevar al termociclador previamente configurado, programarlo para
treinta ciclos.

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Conclusiones
La tcnica de la Replicacin en Cadena de Polimerasa es
muy importante para la biologa molecular debido a la
posibilidad que brinda de obtener numerosas muestras
de secciones de ADN que deseamos estudiar y por sus
diversas aplicaciones en diversos campos como la
medicina, antropologa, ciencias forenses, etc.

Cuestionarios

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Bibliografia y Linkografia
EELES, ROSALIND A.. 1993. Polymerase chain reaction (PCR) : The
technique and its application. R. G. Landes, Austin.
PCR Applications. Protocols for functional genomics. Captulo 14.
Edited by Michael A. Innis, David H. Gelfand, John J. Sninsky. ISBN: 012-372186-5, Academic Press 1999.
Griffiths, J.F. A. et al. (2002). Gentica. McGraw-Hill Interamericana.
http://acasti.webs.ull.es/docencia/practicas/9.pdf
http://es.slideshare.net/harveymondragon/prctica-de-laboratorio-pcr

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