Copyright 1995. Depsito legal pp. 76-0010 ISSN 0378-1844.

INTERCIENCIA 20(4): 194-203

Forma correcta de citar este articulo: RAMON F. MONTAO y EGIDIO L. ROMANO. 1995.
ANTICUERPOS MONOCLONALES Y SU APLICACION EN HEMATOLOGIA.. INTERCIENCIA
20(4): 194-203. URL: http://www.interciencia.org.ve

ANTICUERPOS MONOCLONALES Y SU
APLICACION EN HEMATOLOGIA.
RAMON F. MONTAO y EGIDIO L. ROMANO.
Ramn Montao, bilogo venezolano con postgrado en Inmunologa. Profesional de Investigacin del
IVIC, en el Centro de Medicina Experimental. Actualmente finaliza estudios a nivel de Doctorado en
Inmunologa en el IVIC y su ms reciente rea de trabajo ha sido el desarrollo, la produccin y
caracterizacin de anticuerpos monoclonales humanos. Direccin: Centro de Medicina Experimental,
IVIC, Apartado 21827, Caracas 1020-A, Venezuela.
Egidio Romano: Mdico venezolano con postgrado en Bioqumica e Inmunologa. Investigador Titular
del IVIC, en el Centro de Medicina Experimental Sus campos principales de trabajo son la
Inmunohematologa y la Inmunoqumica aplicadas fundamentalmente a enfermedades de la sangre.
Direccin: Laboratorio de Fisiopatologa, Centro de Medicina Experimental, IVIC, Apartado 21827,
Caracas 1020-A.

RESUMEN
Desde su descubrimiento hacia finales del siglo pasado, los anticuerpos han
sido considerados molculas con una enorme potencialidad analtica debido a
su exquisita especificidad. Pero fue solo despus de la introduccin por Khler
y Milstein en 1975 de la tcnica para producir in vitro anticuerpos con una
especificidad predeterminada, que estos reactivos pusieron de manifiesto su
tremenda versatilidad prctica. La posibilidad de producirlos en grandes
cantidades y en forma pura y adems el estar bien caracterizados
qumicamente ha permitido que los anticuerpos monoclonales (as se llama al
producto obtenido de la aplicacin de la mencionada tcnica) sean objeto de
mltiples aplicaciones. Las ms tempranas, afines de los aos setenta y
principios de los ochenta, se relacionaron con pruebas de histocompalibilidad y
reconocimiento de molculas de diferenciacin en clulas normales o
tumorales y con el reconocimiento de eptopos especficos en virus, bacterias y
otros microorganismos, o en molculas individuales de protenas,
carbohidratos, cidos nucleicos, etc. Ello redund en un conocimiento ms
detallado de distintas subpoblaciones celulares, de los diferentes estadios de
diferenciacin celular en diversos tejidos, en un mejor tipeaje celular, en una
mejor identificacin de microorganismos y de sus variedades tanto para
diagnstico como para epidemiologa y en una gran cantidad de pruebas
diagnsticas tipo ELISA y radioinmunoensayo. En su versin original la tcnica
descrita por Khler y Milstein permite la produccin de anticuerpos
monoclonales de origen mrido, los cuales han sido y son actualmente de gran
utilidad dentro del campo de la hematologa y medicina en general.
Desgraciadamente, su uso en aplicaciones teraputicas y en el diagnstico in

vivo de enfermedades humanas se ha visto limitado. La presencia de

anticuerpos "naturales" anti-inmunoglobulina de ratn y la aparicin de una
respuesta inmune humoral secundaria a la administracin de estos reactivos en
el ser humano parecen ser los principales responsables de esta limitacin. Lo
anterior se ha constituido en la motivacin fundamental que ha impulsado el
desarrollo de tcnicas para la produccin de anticuerpos monoclonales de
origen humano, con la fundada esperanza de que stos, al ser administrados
en protocolos de profilaxia, terapia o en aplicaciones diagnsticas, sean mucho
menos inmunognicos que los de ratn . El alcance potencial de utilizacin de
los anticuerpos monoclonales es tremendamente amplio e incluye campos
como el tratamiento del cncer, facilitamiento de transplantes de rganos,
imagenologa de tumores, entre otros. Desafortunadamente, la aplicacin de
esquemas anlogos a los utilizados en el modelo del ratn para la generacin
de anticuerpos monoclonales humanos no ha rendido los frutos anticipados; un
sinnmero de dificultades tcnicas han tenido que ser enfrentadas y la literatura
en el rea est llena de diferentes mtodos de produccin y de "mejoras" a los
procedimientos. De forma general, dos caminos principales se utilizan
actualmente para la produccin de anticuerpos monoclonales humanos. Uno es
la inmortalizacin de las clulas productoras de anticuerpos, lo cual se logra
mediante la transformacin con el virus de Epstein-Barr y/o la generacin de
hibridomas y, ms recientemente, por medio del uso de tcnicas A Ingeniera
Gentica, las cuales se han revelado como una herramienta tremendamente
poderosa y promisoria para la preparacin, modificacin y mejoramiento de los
anticuerpos monoclonales, tanto de origen mrido como humano. Estas dos
aproximaciones, independientemente o en forma combinada, son utilizadas en
numerosos laboratorios en el mundo para producir reactivos monoclonales
humanos que eventualmente puedan ayudar de manera efectiva a la
prevencin, el tratamiento y diagnstico de las enfermedades humanas. /
PALABRAS CLAVE /Anticuerpos monoclonales/ hematologa /

El trabajo pionero de Landsteiner a principios de siglo, que desemboc en el

descubrimiento de los grupos sanguneos y fue la base de lo que hoy
conocemos como "Bancos de Sangre", ilustr el potencial de los anticuerpos
como herramientas analticas. Pero fue solamente hacia la mitad de este siglo
que estas molculas comenzaron a ser utilizadas eficientemente para la
identificacin de subpoblaciones celulares. Esta aplicacin analtica de los
anticuerpos, es decir, el poder distinguir poblaciones de clulas funcionalmente
distintas pero morfolgicamente similares, de tanta importancia en
hematologa, experiment un avance sustancial con el advenimiento de la
metodologa que permiti el cultivo continuo, en condiciones de laboratorio, de
las clulas productoras de los anticuerpos.
La clula responsable de la produccin de los anticuerpos es un tipo particular
de glbulo blanco denominado "linfocito B". Un principio esencial en
inmunologa es que cada linfocito B es capaz de producir anticuerpos con una
especificidad nica (Burnet 19591 As mismo, toda la descendencia de ese
linfocito B, es decir el "clon" que de l se derive, tambin producir
exactamente el mismo anticuerpo. Por lo tanto, para producir anticuerpos

idnticos unos a otros, "monoclonales", todo lo que hace falta es poder cultivar
en forma continua, en condiciones de laboratorio, un clon de linfocitos B. En el
sobrenadante de esos cultivos, se tendrn secretados los anticuerpos
monoclonales deseados.
Desgraciadamente, dada su naturaleza "mortal", los linfocitos B son incapaces
de crecer en cultivo ms all de una semana. De esta manera, el obstculo
fundamental para producir anticuerpos en el laboratorio reside en lograr cultivar
en forma continua los linfocitos B. A principios de los aos setenta ya se
dispona de la capacidad tcnica para el cultivo in vitro de ciertas clulas
malignas, entre ellas los linfocitos B provenientes de un tipo de tumor llamado
mieloma mltiple o plasmacitoma. Estas clulas tienen la capacidad de crecer
continua y cionognicamente, es decir, de forma que una sola clula puede
multiplicarse y originar muchas otras idnticas. En 1975, George Khler y
Csar Milstein, en un trabajo seminal que les vali posteriormente el Premio
Nobel, demostraron que es posible fusionar o hibridar clulas de mieloma con
linfocitos B, que los hbridos resultantes heredan la capacidad para crecer
indefinidamente en cultivo y para producir anticuerpos, y que adems es
posible aislar del producto heterogneo de fusin. aquellos hbridos
productores del anticuerpo en el que se est interesado (Khler y Milstein,
1975).
En su forma inicial, la tcnica descrita por Khler y Milstein permite la obtencin
de anticuerpos monoclonales de ratn. Mediante el uso de tcnicas similares
se han preparado reactivos monoclonales provenientes de otras especies e
incluso de origen humano (James y Bell, 1987; Glassy, 1993). La presente
revisin pretende desarrollar, en una forma accesible al lector no especialista,
los aspectos ms resaltantes de estas metodologas, haciendo nfasis en las
tremendas posibilidades prcticas de estos reactivos y en los avances
recientes para su produccin.
El proceso de produccin de un anticuerpo monoclonal implica entonces la
generacin de los hbridos o, ms apropiadamente, de los hibridomas
productores del mismo y ello involucra una serie de pasos o etapas esenciales,
las cuales se describen a continuacin.
Produccin de Anticuerpos Monoclonales de origen Mrido
Inmunizacin
En teora, es factible producir anticuerpos monoclonales especficos para
cualquier antgeno capaz de ser reconocido por los linfocitos B. Para la
inmunizacin es conveniente el uso de preparaciones puras de antgeno en las
cuales el peligro de competencia antignica, que pudiese desviar la respuesta
inmune humoral hacia una molcula irrelevante, no existe. Pero en muchos
casos el antgeno de inters se encuentra en una molcula de la superficie
celular difcil de aislar, lo que obliga a la utilizacin de clulas Completas o
extractos de membranas para la inmunizacin (Goding, 1980). En otros casos,
por ejemplo cuando se trata de drogas o molculas pequeas, stas deben ser

conjugadas a portadores, y son estos conjugados las preparaciones usadas

para la inmunizacin (Hudson y Hay, 1989).
A menos que se trate de molculas poco inmunognicas, la inmunizacin se
realiza rutinariamente mediante la inyeccin M antgeno por va subcutnea o
intraperitoneal y en la forma de una emulsin. Ello permite la liberacin lenta y
constante del antgeno, asegurando una estimulacin permanente. Esta
inmunizacin se efecta en mltiples ocasiones, normalmente en intervalos de
dos semanas, para asegurar una buena estimulacin y amplificacin de los
clones de linfocitos B especficos para el antgeno de inters (Harlow y Lane,
1988). La ltima estimulacin usualmente se hace tres das antes de la fusin y
por va intravenosa para as obtener, en el bazo del animal inmunizado, una
mxima respuesta y una poblacin de clulas respondientes en fase de
divisin.
Fusin
Luego de culminado el protocolo de inmunizacin y que se tiene la certeza de
que el mismo ha sido efectivo, el animal experimental es sacrificado y se le
extrae el bazo. Los linfocitos B, bien como parte del total de la suspensin de
clulas esplnicas o previamente purificados, se mezclan con un nmero
apropiado de clulas de mieloma que se mantienen creciendo
exponencialmente in vitro. Lo que sigue a continuacin es el proceso de fusin
en s, el cual debe realizarse a 37 y consiste en aadir a la mezcla de clulas
un pequeo volumen de un agente fusgeno denominado polietilenglicol
(PEG), mezclando suavemente por espacio de uno a tres minutos. En estas
condiciones, las membranas de algunas de las clulas se fusionan, unindose
los citoplasmas y formndose los hibridomas. El PEG luego se elimina por
lavado y las clulas fusionadas se siembran en microplacas de cultivo
(Yokoyama, 1992).
El proceso de fusin es muy ineficiente: en general, menos del 1% de las
clulas terminan fusionndose (Johnstone y Thorpe, 1987; Harlow y Lane,
1988). Esto trae como consecuencia que se requiera de un nmero de clulas
relativamente alto para el proceso de fusin (un bazo de ratn contiene del
orden de 101 clulas). En algunas circunstancias es posible enriquecer la
poblacin de linfocitos B especficos para el antgeno, lo cual se logra
asociando el antgeno a una fase slida y utilizando procedimientos de
aislamiento como separacin inmunomagntica (Ossendorp et al., 1989
Lundkvist et al., 1993) o roseteo con glbulos rojos recubiertos con el antgeno
de inters (Myers et al., 1986). De tenerse el equipo necesario, en los casos en
los que se dispone de pocas clulas, es preferible realizar la fusin mediante el
proceso denominado electrofusin, el cual resulta mucho ms eficiente (Foung,
1990).
Seleccin
Dado que la fusin es un evento completamente al azar, la mezcla de clulas
obtenidas luego de la misma estar formada por esplenocitos, clulas de
mieloma, esplenocitos fusionados entre s, clulas de mieloma fusionadas entre

s y adems por los hibridomas linfocito B-clula de mieloma. En cultivo, los

esplenocitos no fusionados mueren con el tiempo por ser clulas normales. Sin
embargo, las mielomatosas al ser clulas tumorales pueden vivir
indefinidamente y como se replican con mayor rapidez que los hibridomas,
creceran en forma predominante, "ahogando" al resto de las clulas.
De lo anterior se desprende la necesidad de disponer de un mecanismo de
seleccin que permita solamente el crecimiento de los hibridomas, eliminando a
las clulas mielomatosas. Esto se obtiene con el llamado medio HAT y el
fundamento en que se basa es el siguiente: Las clulas eucariotas disponen de
dos vas para la sntesis del ADN. Una es la llamada "va principal o de novo" y
la otra es la "va de rescate", en la cual se requiere la enzima hipoxantinaguanina-fosforibosil-transferasa (HGPRT) (Harlow y Lane, 1988). La clave de la
seleccin est en que las clulas de mieloma que se utilizan para la fusin son
deficientes en la enzima HGPRT, es decir, que sintetizan su ADN nicamente
por la va principal. Esta va principal puede ser bloqueada por la adicin de la
droga aminopterina (Hudson y Hay, 1989). De manera que, si al medio de
cultivo en el que crece el producto de fusin se aade aminopterina, las clulas
mielomatosas no fusionadas o fusionadas entre s morirn, ya que sern
incapaces de sintetizar ADN. Si consideramos ahora las clulas hbridas, stas
tienen la capacidad de crecimiento tumoral heredada de las clulas
mielomatosas, pero tambin tienen el gen que codifica la enzima HGPRT,
heredado de los linfocitos normales, pudiendo sintetizar ADN por la va de
rescate. De esta forma, en presencia de Hipoxantina-Aminopterina-Timidina
(HAT) las nicas clulas con capacidad de crecimiento, "seleccionadas" gracias
a un fenmeno de complementacin gnica, son las hbridas.
Existe an otro evento de seleccin, el cual est destinado a identificar y aislar,
del total de hbridos producidos, a los hibridomas productores de los
anticuerpos de inters. La identificacin se logra con un mtodo apropiado para
la evaluacin de los sobrenadantes de cultivo y el aislamiento se realiza
mediante el clonamiento.
Evaluacin de los sobrenadantes de cultivo
Luego de unos siete a diez das post-fusin, en cada pozo de cultivo habr
varios hbridos creciendo, cada uno produciendo un anticuerpo distinto y ser
necesario aislarlos para obtener anticuerpos de una sola especificidad. Para
determinar en cules cultivos se encuentran los anticuerpos con la
especificidad deseada, y por ende las clulas productoras de los mismos, se
realizan ensayos de evaluacin o "screening" en los sobrenadantes de cultivo.
La forma que toman estos ensayos de identificacin es variada y depende en
buena medida del antgeno emulado. Las ms usadas son pruebas tipo ELISA,
"dot-blot" o radioinmunoensayo cuando se trata de antgenos solubles, y
pruebas de inmunofluorescencia, inmunohistoqumica o de aglutinacin si el
antgeno est asociado a la membrana celular. En todo caso, embarcarse en la
tarea de producir anticuerpos monoclonales de una especificidad dada sin
antes tener un procedimiento de prueba o screening para dicho anticuerpo que
sea rpido, sencillo, especfico, sensible y aplicable a un nmero elevado de
muestras, es una tarea destinada al fracaso.

Clonamiento
Para obtener una preparacin monoclonal de anticuerpos, es necesario aislar
clones de clulas, en los que cada una es rplica exacta de la otra. El
procedimiento mediante el cual se obtienen muchas clulas idnticas por
replicacin a partir de una sola se denomina clonamiento. El mtodo ms
comn consiste en sembrar suspensiones celulares a gran dilucin de manera
que en un volumen dado pueda haber en promedio de ninguna a unas pocas
clulas. Una dificultad de este mtodo llamado de dilucin al lmite (Harlow y
Lane, 1988), es que las clulas no crecen bien cuando estn aisladas. La
manera usual de resolver este problema es utilizar clulas nodrizas,
generalmente fibroblastos o macrfagos, que proveen la ayuda necesaria para
el crecimiento a baja densidad (James y Bell, 1987). Otro procedimiento menos
empleado para el aislamiento de los hibridomas es la siembra en medios
semislidos de cultivo, la posterior toma de las colonias y su siembra en medio
lquido (Freshney, 1987).
Escalamiento de la produccin de anticuerpos monoclonales
Una vez que se han superado todos los inconvenientes y se ha logrado obtener
el hibridoma productor del anticuerpo deseado, el prximo paso es su cultivo a
escala para obtener el anticuerpo en las cantidades deseadas. La produccin a
mediana escala de los anticuerpos se puede efectuar inoculando el hibridoma
correspondiente en la cavidad peritoneal de ratones singnicos a la lnea de
mieloma utilizada para la fusin y hacindolo crecer como un tumor
mielomatoso, obtenindose el anticuerpo en forma de lquido asctico
(Gavilondo, 1990). A ora escala de produccin, el cultivo se puede hacer en
botellas rotatorias, en fibras huecas o en fermentadores especiales diseados
para tal fin (Freshney, 1987; Corrigan, 1988; Lubiniecki, 1990). Para
aplicaciones clnicas el anticuerpo debe estar caracterizado tanto qumica como
funcionalmente y con un alto grado de pureza (Sullman, 1989; Lucas, 1989;
Ronneberger, 1989). Otro aspecto de importancia para la produccin es et
almacenaje de los hibridomas. Esto se logra mediante congelamiento en
tanques especiales de nitrgeno lquido, en los cuales las clulas son
congeladas cuando se encuentran creciendo en fase exponencial y con un alto
ponerle de viabilidad. (Daggett y Simione, 1987).
Resumen del Proceso de Produccin de un Anticuerpo Monoclonal
Mrido
En la figura 1 se esquematizan los pasos necesarios para el desarrollo de
hibridomas productores de anticuerpos monoclonales de ratn.

FIGURA 1. PROCEDIMIENTO PARA LA OBTENCION DE ANTICUERPOS MONOCLONALES DE RATON. TOMADO DE

MILSTEIN (1980)

Aplicaciones de los Anticuerpos Monoclonales de origen Mrido

Generalidades
Debido a que los anticuerpos monoclonales son reactivos qumicamente bien
definidos, susceptibles de ser producidos en forma pura y en grandes
cantidades, su uso potencial es muy extenso.

Las aplicaciones ms tempranas, a fines de los aos setenta y principios de los

ochenta, se relacionaron con pruebas de histocompatibilidad y reconocimiento
de molculas de diferenciacin en clulas normales o tumorales, con el
reconocimiento de eptopos especficos en virus, bacterias y otros
microorganismos, o en molculas individuales de protenas, carbohidratos,
cidos nucleicos, etc. Esto redund en un conocimiento ms detallado de
distintas subpoblaciones celulares, de los diferentes estadios de diferenciacin
celular en diversos tejidos, en una mejor tipificacin celular, en una mejor
identificacin de microorganismos y de sus variedades tanto para diagnstico
como para epidemiologa y en una gran cantidad de pruebas diagnsticas tipo
radioinmunoensayo y ELISA. En esta revisin slo se detallarn algunas
aplicaciones en el campo de la hematologa y de ndole general en medicina.
Anticuerpos monoclonales como reactivos de identificacin eritrocitaria
Desde principios de siglo se han utilizado sueros tipificadores para el sistema
sanguneo ABO que contienen una mezcla policlonal de anticuerpos
especficos para los antgenos A y B. A principios de los aos ochenta, tanto en
Inglaterra como en Canad, se produjeron anticuerpos monoclonales Igm-AntiA y Anti-B con las caractersticas adecuadas para ser buenos reactivos de
identificacin eritrocitaria (Voak et al., 19821 Su posterior produccin en escala
industrial con la consiguiente disminucin en los costos ha hecho que hoy en
da sean de uso casi universal (Rouger y Anstee, 1918).
En aos ms recientes, tambin se 'han producido -reactivos monoclonales
que reconocen los grupos sanguneos A1, A2, H, Le(a) y Le(b),P y P1, M, N,
Kell y Lutheran (Hughes-Jones y Parsons, 1992). Curiosamente, para el
sistema Rh no se ha logrado obtener hasta el presente anticuerpos
monoclonales mridos. Por razones desconocidas, ratones y ratas no
reconocen adecuadamente las distintas especificidades dentro de este sistema.
No obstante, s se dispone de reactivos monoclonales Anti-Rh de origen
humano, aspecto ste sobre el cual volveremos ms adelante.
Reactivos para la prueba de Coomhs o anti-globulina
Reactivos monoclonales especficos para el fragmento Fc de la IgG humana
(anti-IgG), bien sea solos o en mezcla con monoclonales anti-complemento
(anti-C3d y anti-C3c), tambin han sido producidos y son de uso extendido por
ser ms econmicos que los reactivos policlonales, aunque no necesariamente
de mejor calidad (Engelfriet y Voak, 1987).
Reactivos para tipificacin de histocompatibilidad
Reactivos monoclonales especficos para formas allicas del complejo principal
de histocompatibilidad humano HLA Clase I y Clase II se encuentran
comercialmente disponibles y han reemplazado en muchos casos a sueros
policlonales y a clulas homocigotas (Pistillo et al., 1988). No obstante, es
bueno sealar que ms recientemente la tipificacin

HLA-Clase II ha evolucionado hacia el uso de sondas de ADN y amplificacin

por reaccin en cadena de polimerasa (PCR) (Oka et al., 1994; Versluis et al.,
1994).
Inmunofenotipificacin
Anticuerpos monoclonales contra molculas de la superficie de clulas de
numerosos tejidos han sido preparados. Muchas de estas molculas de
superficie son utilizadas como marcadores especficos, bien sea de la
naturaleza de la clula o del estado de diferenciacin en el que se encuentra.
Corno ejemplo citaremos anticuerpos monoclonales especficos para un
complejo molecular llamado CD3 que se encuentra en todos los linfocitos T
pero no en los linfocitos B, contra las molculas CD4 y CD8 que son
marcadores especficos para linfocitos T cooperadores y T citotxicos
respectivamente y contra la molcula llamada CD34, presente en clulas
pluripotenciales hematopoyticas (Horejsi, 1991; LDAD, 1993).
Mediante el uso de anticuerpos monoclonales tambin se han podido identificar
molculas asociadas a ciertos tumores, por ejemplo variantes mutantes del
oncogen P53 en tumores del tracto gastrointestinal (Odgen et al., 1994) y de la
mama (Jacquemier et al., 1994) y algunos carbohidratos asociados a tumores
linfohematopoyticos (de Vries y van den Eijnden, 1992; Sell, 1993). La
identificacin de estos marcadores en biopsias y en aspirados de tejidos
tumorales, secreciones, etc., permite la tipificacin del tumor. Muchas veces
esto es de gran inters porque no slo ayuda al diagnstico sino que tambin la
presencia o no de ciertas molculas de diferenciacin puede estar asociada a
un mejor o peor pronstico (Geisler et al., 1991; Porter-Jordan y Lippman,
1994). Usualmente la identificacin se realiza empleando los anticuerpos
monoclonales especficos, seguido de anticuerpos anti-ratn conjugados a
fluorescena y usando luego microscopa de fluorescencia o ms
modernamente con los aparatos llamados citofluormetros (Drouet y Lees,
1993; Macey, 1993). Algunos ejemplos recientes de este tipo de aplicaciones
se esbozan a continuacin.
Inmunofenotipijicacin de leucemias
Anticuerpos monoclonales son utilizados para la caracterizacin del fenotipo
del blasto leucmico (De Waele et al., 1991; Traweek, 1993). Algunos de los
marcadores ms utilizados son: CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD 11,
CD13, CD14, CD16, CD19, CD20, CD21, CD22, CD30, CD33, CD34, CD45,
CALLA, la enzima TdT, inmunoglobulinas de superficie, RABI, diversos
eptopos del TCR, FcR, CR1, y en general, los marcadores relacionados a
clulas primitivas indiferenciadas, linfoblastos, blastos relacionados a linfocitos
T y linfocitos B, clulas mielomatosas, blastos relacionados a la serie
granuloctica, blastos relacionados a monocitos, blastos indiferenciados de tipo
mielomonocticos, etc. La caracterizacin por la presencia o no de
determinados marcadores, como se dijo antes no slo permite un diagnstico
ms preciso del tipo de malignidad sino que tambin ayuda a establecer
parmetros pronsticos (Mirro 1992) Adicionalmente, puede obtenerse

informacin acerca del grado de eficacia de un tratamiento determinado y del

grado de enfermedad residual mediante la estimacin del porcentaje de blastos
leucmicos remanentes (De Rossi et al., 1993). Estudios similares a los
anteriores tambin se efectan en el caso de linfomas (Perkins y Kjeldsberg,
1993).
Diagnstico e Inmunotipificacin de Cncer
La deteccin de cncer es quizs una de las aplicaciones ms importantes y de
mayor potencial de los anticuerpos monoclonales. Estos pueden ser usados in
Ovo para la localizacin de tumores o de sus metstasis cuando se dispone de
reactivos especficos para antgenos presentes en la membrana de la clula
tumoral (Goldenberg y Schlom, 1993), o in vitro utilizndolos en ensayos tipo
ELISA para la deteccin, en muestras de suero u otros fluidos biolgicos, de
molculas como la gonadotropina corinica (Yoshimura et al., 1994), la
alfafetoprotena (Sell, 1993) o el antgeno prosttico especfico (Sell, 1993;
Ploch y Brawer, 19941 En el caso de antgenos asociados a membrana, los
anticuerpos monoclonales son conjugados a elementos trazadores radioactivos
tales como radioistopos del indio, tecnecio, iodo o bismuto, son administrados
en el paciente y luego se procede a tomar gammagrafas permitiendo la
localizacin y adems dando una idea de la masa tumoral. El campo de esta
aplicacin incluye multitud de tumores entre los cuales se destacan: el de la
mama, el uterino, el ovrico, el del colon, el del recto, el prosttico, el del
pulmn, el del hgado, y muchos otros ms (Goldenberg y Schlom, 1993).
Diagnstico de trombosis
Una aplicacin potencial parecida a la anterior es la del diagnstico de
trombosis usando anticuerpos monoclonales con especificidad por molculas
asociadas al proceso de coagulacin, los cuales han sido previamente
radiomarcados (Wu et al., 1992). Estos anticuerpos, mediante tcnicas de
radioinmunoensayo e incluso ELISA, tambin permiten el diagnstico de
procesos patolgicos como por ejemplo la coagulacin intravascular
diseminada (Lill et al. 1993).
Aplicaciones teraputicas
Para ser utilizado como tratamiento, un anticuerpo monoclonal debe
combinarse directamente a un antgeno dado y causar la destruccin de la
clula portadora de dicho antgeno o ser conjugado a un compuesto teraputico
el cual es dirigido por el anticuerpo a un sitio especfico. En este segundo caso,
el anticuerpo puede ser conjugado a una droga, un agente quimioteraputico, a
un compuesto radioactivo, a una toxina, o ser asociado genticamente a una
toxina, formando las as llamadas inmunotoxinas. Algunos ejemplos
importantes de este grupo de aplicaciones son los conjugados de anticuerpos
monoclonales con la cadena alta del ricino y con la toxina diftrica (LeMaistre
et al., 1993; Li y Ramakrishnan, 1994) y la utilizacin de inmunoliposomas
llenos con drogas como metotrexato y adriamicina (Jones y Hudson, 1993;
Uyama et al., 1994). Este tipo de conjugados ha sido usado para dirigir la droga

o la toxina al sitio propicio en pacientes con tumores de mama, de ovario, de

pulmn, colorectal y melanomas, entre otros (Skolnick, 1993; Vitetta, 1994).
Anticuerpos monoclonales especficos para linfocitos T, B, para linfocitos de
leucemias linfoides crnicas de clulas T y de linfomas han sido y son
evaluados actualmente para el tratamiento de estas enfermedades (Faguet y
Agee, 1993; Grossbard y Nadler, 1994). Anticuerpos similares son usados en
procedimientos in vitro para la eliminacin de clulas tumorales y de clulas Tcitotxicas. La eliminacin de stas ltimas se ha asociado con una menor
frecuencia de reaccin injerto contra husped en casos de trasplantes de
mdula sea (Champlin et al., 1990). El problema de la enfermedad injertocontra husped es quizs la complicacin ms seria de los trasplantes de
mdula sea. En este sentido, anticuerpos monoclonales especficos para el
receptor, de la IL-2 han sido usados con xito en aquellos casos en los cuales
la terapia con corticosteroides ha fallado (Sykes, 1993). Estas preparaciones
tambin han sido empleadas con xito en algunos casos de anemia aplsica
(Schinger et al., 1993).
Otras aplicaciones
En el campo de la industria farmacolgica los anticuerpos monoclonales
tambin han sido de gran utilidad. Por ejemplo, empleando procedimientos de
cromatografa de afinidad, estos reactivos se usan ampliamente en la
purificacin de hormonas, citocinas y de otros productos biolgicos
destacndose el interferon alfa, beta y gamma, los factores VIL VIII, IX y von
Willebrandt de la coagulacin la uroquinasa, las interleucinas IL-2 e IL-3, la
gonadotropina corinica y algunas beta-glicoprotenas especficas del
embarazo. As mismo, anticuerpos monoclonales dirigidos contra agentes
patgenos tales como bacterias gram-negativo, Hemophilus influenza, virus de
la hepatitis A y B, o contra productos bacterianos como el lipopolisacrido de la
pared de bacterias gram-negativo y toxinas como la diftrica o tetnica pueden
su usados en protocolos de inmunizacin pasiva (Ziegler et al, 1991; Lang et
al., 1993; Gustafsson et al., 1993).
Anticuerpos Monoclonales Humanos
Generalidades
como hemos podido apreciar, los anticuerpos monoclonales de origen mrido
han sido y son actualmente de gran utilidad dentro del campo de la
hematologa y medicina en general. Desgraciadamente, su uso en aplicaciones
teraputicas y de diagnstico in vivo se ha visto limitado por una serie de
obstculos. En primer lugar y como era de esperarse, la administracin de
inmunoglobulinas (Igs) de ratn al humano induce una respuesta inmune en
contar de estas protenas (la llamada respuesta HAMA: "Human Anti-Murine
Antibodies") que limita por una parte su eficacia y utilidad, y por la otra la
posibilidad de incrementar la dosis y/o extender o repetir el tratamiento (Schroff
et al., 1985; Larrick y Gavilondo, 1989). A eco se suma el descubrimiento
reciente de que los seres humanos poseen en abundancia y de forma "natural"
ciertos anticuerpos llamados anti-Gal que son especficos para el azcar

"galactosa (alfa 1-3) galactosa" (Galili et al., 1984). El problema con los
anticuerpos anti-Gal es que el azcar galactosa (alfa 1-3) galactosa se
encuentra presente en el componente glicosdico de las Igs de ratn (Thall y
Galili, 1990; Borrebaeck et al., 1993; Lund et al., 1993). En consecuencia, se ha
postulado que las Igs de ratn, al ser administradas pasivamente en un ser
humano, seran rpidamente reconocidas por los anticuerpos anti-Gal,
pudiendo neutralizarse los efectos teraputicos buscados, incluso antes de la
aparicin de la mencionada respuesta HAMA (Borrebaeck et al., 1993).
Estudios recientes indican que la enzima responsable de la incorporacin del
azcar Gal (alfa 1-3) Gal en glicoprotenas y otras biomolculas no es activa en
los seres humanos y en consecuencia las Igs humanas no poseen esta
estructura (Galili y Swanson, 1991).
Ahora bien, las diferencias en el patrn de glicosilacin de las Igs entre el
humano y el ratn pudieran ser importantes en otro contexto, el de la fisiologa
y las funciones efectoras de estas molculas. Un nmero considerable de
evidencias indica que el componente glicosdico de los anticuerpos es un
elemento modulador de su capacidad para mediar la activacin de la cascada
del Complemento, la actividad citotxica dependiente de anticuerpos (ADCC), y
parmetros como la vida media biolgica en tejidos y en la sangre (Koide et al.,
1977; Walker et al., 1989; Tao y Morrison, 1989; Wright et al., 1990; Lund et al.,
1990; Dorai et al., 1991; Morrison, 1992; Wawrzynczak et al., 1992; Hand et al.,
1992). Por esta razn los anticuerpos de ratn pudieran resultar ineficientes
para mediar, en el cuerpo humano, las mencionadas funciones efectoras y/o
verse alterada su fisiologa.
Otro obstculo lo constituye la forma cmo el sistema inmune del ratn
"reconoce" a los antgenos. Cuando un ratn es inmunizado con una molcula,
su sistema inmune reconoce ciertas regiones llamadas eptopos, hacia las
cuales va dirigida la respuesta de anticuerpos. Ahora bien, para una molcula
dada estos eptopos no necesariamente son los mimos que reconoce el
sistema inmune humano y por tanto no siempre es posible obtener anticuerpos
de ratn con la especificidad requerida. Es as como por ejemplo, hasta los
momentos nadie ha logrado obtener anticuerpos monoclonales de ratn anti-Rh
(bien sea anti-D u ola especificidad dentro del sistema) (Thompson y HughesJones, 1990). Otra consecuencia de lo mencionado anteriormente se ilustra
con los anticuerpos monoclonales murinos dirigidos a especificidades dentro
del complejo principal de histocompatibilidad humano, HLA. Con frecuencia
stos carecen de la especificidad fina, restringida, que se observa con los
reactivos humanos (Pistillo et al., 1988).
Estas dificultades se han constituido en las motivaciones principales para el
desarrollo de los anticuerpos monoclonales humanos ya que, en principio,
stos deben ser mucho menos inmunognicos que los de origen mrido y
adems estarn exentos de los problemas funcionales antes mencionados. El
alcance potencial de utilizacin de estos reactivos es tremendamente amplio e
incluye campos como el tratamiento del cncer, facilitamiento de trasplantes de
rganos, imagenologa de tumores, entre otros. Adems, como ya se
mencion, los anticuerpos monoclonales humanos seran herramientas tiles
para la identificacin de antigenos que el sistema inmune del ratn reconoce en

forma diferente del sistema inmune humano, como es el caso del grupo
sanguneo Rh y los antgenos del complejo principal de histocompatibilidad
HLA.
Produccin de anticuerpos monoclonales humanos
La produccin de anticuerpos monoclonales humanos ha sido abordada desde
dos frentes principales. Uno es a travs de la inmortalizacin de las clulas
productoras de anticuerpos, aspecto que detallaremos a continuacin, y el otro
mediante el uso de tcnicas de biologa molecular y ADN recombinante, el cual
se describe ms adelante, en la seccin que hemos titulado "Anticuerpo de
segunda generacin"
Inmortalizacin de las clulas productoras de anticuerpos
La preparacin de anticuerpos monoclonales humanos mediante la
inmortalizacin de las clulas productoras de stos ha tenido que enfrentar dos
escollos importantes que vale la pena mencionar antes de detallar las tcnicas
por las cuales se ha abordado este objetivo. Uno es la fuente de donde obtener
los linfocitos B humanos. En la mayora de los casos, la sangre perifrica ha
sido la fuente prcticamente obligada (James y Bell, 1987). Desgraciadamente,
en la sangre perifrica la proporcin relativa de linfocitos B es baja si se
compara con rganos linfoides como el bazo y los ganglios. Adems, se cree
que en la sangre perifrica son pocos los linfocitos B que se encuentran en el
estadio adecuado de diferenciacin para rendir hbridos productores de
inmunoglobulinas (Schwaber et al., 1984).
El otro aspecto es la inmunizacin. A menos que uno cuente con la suerte de
tener individuos inmunizados de forma "natural", son pocos los casos en los
que deliberadamente se puede inmunizar a un ser humano para luego obtener
una muestra de sus linfocitos B inmunes y utilizarlos para la produccin de
anticuerpos monoclonales. Resultados obtenidos por Melamed en 1987
realizando estudios para la produccin de anticuerpos monoclonales humanos
con especificidad por el grupo sanguneo Rh ilustran la importancia que la
inmunizacin tiene para la generacin de un anticuerpo monoclonal. En estos
estudios se encontr que el tiempo para la obtencin de los linfocitos desde el
momento M ltimo "contacto con el antgeno" resulta crtico para el xito o
fracaso (Melamed et al, 1987).
La utilizacin de esquemas de inmunizacin in vitro se mantiene como una
alternativa promisoria para la resolucin de este problema. Haciendo uso de los
avances en el conocimiento de los mecanismos y seales solubles que se
ponen en juego durante la aparicin de la respuesta inmune humoral, como por
ejemplo la interaccin de linfocitos B con linfocitos T cooperadores activados
que expresan el ligando para CD40 (Banchereau et al., 1991) y con clulas
dendrticas foliculares, el efecto de ciertas interleucinas como las IL-2, IL-4, IL-5
(Phillips y Klaus, 1992; Morikawa et al., 1993), la IL-6 (Hirano y col., 1987;
Tosato et al., 1988), la IL-10 (De Waal et al., 1992; Briere et al., 1993; Burdin et
al., 1993) y la forma soluble de CD23 (Thorley-Lawson, 1988), en conjunto con
los avances en el desarrollo de nuevos agentes adyuvantes tipo P3C-X

(Hoffman et al., 1990) y muramil-dipptido (Carrol et al., 1990) y la

caracterizacin de las influencias que ejercen in vitro las poblaciones celulares
presentes en la sangre perifrica que, como se mencion, es la fuente principal
para la obtencin de los linfocitos B en la mayora de los casos (eliminacin de
la poblacin de linfocitos T CD8+) (Borrebaeck, 1988), es probable que pronto
se disponga de una manera confiable de inmunizar linfocitos B humanos in
vitro.
La inmortalizacin de las clulas humanas productoras de anticuerpos se ha
hecho bsicamente por tres vas. Una es la transformacin de los linfocitos B
humanos con el virus de Epstein-Barr (VEB); otra la fusin de clulas
somticas para generar horno o heterohibridomas y una ltima que combina las
dos primeras; es decir, transformacin con el VEB seguido de fusin celular.
Inmortalizacin por transformacin con el VEB
Desde 1968 se conoce que la infeccin de linfocitos B humanos con el VEB
induce en ellos un proceso de transformacin que les faculta para crecer por
perodos prolongados en cultivo, generndose las, as llamadas lneas
linfoblastoides (Pope et al., 1968). El primer reporte de tina lnea linfoblastoide
productora de anticuerpos de especificidad conocida fue hecho por Steinitz en
1977, quien obtuvo anticuerpos monoclonales humanos especficos para el
hapteno NNP (Steinitz et al., 1977). La tcnica es relativamente sencilla:
consiste en aislar la fraccin de clulas mononucleares (CMN) a partir del
"buffy coat" de una muestra de sangre, obtenida de un donante en cuyo suero
se hayan detectado los anticuerpos deseados. Estas CMN son luego incubadas
con una fuente de VEB, lo cual permite que ocurra la infeccin viral con la
subsecuente multiplicacin celular y produccin de anticuerpos. Dado que las
clulas B infectadas expresan antgenos virales en su superficie (ThorleyLawson, 1988) y ms del 95% de los seres humanos posee inmunidad contra
el VEB (es el agente causal de la mononucleosis infecciosa o enfermedad del
beso) (Henle et al, 1968), es necesario eliminar o inactivar los linfocitos T
citotxicos especficos presentes en las CMN. Esto se logra comnmente
aadiendo a los cultivos fitohemaglutinina o ciclosporina A. Al cabo de unos 710 das se examina el sobrenadante de los cultivos en busca de aquellos que
contengan los anticuerpos deseados y se procede a aislar o clonar las clulas
linfoblastoides productoras de stos. Dicho aislamiento se ha realizado
mediante tcnicas de roseteo, "panning" o "FAC-sorting" (Kozbor y Roder,
1983) y es necesario debido a que las clulas linfoblastoides obtenidas
constituyen una poblacin heterognea en la cual, por lo general, terminan
predominando las clulas B no productoras de las inmunoglobulinas de inters.
A pesar de su simplicidad, muchos investigadores han encontrado numerosos
inconvenientes al tratar de producir anticuerpos monoclonales mediante la
transformacin con VEB. Quizs el ms importante de estos inconvenientes es
la manifiesta incapacidad que exhiben las clulas linfoblastoides para clonarse
a baja densidad celular (James y Bell, 1987). Como mencionamos, este
clonamiento es fundamental para minimizar el riesgo de sobrecrecimiento de
las clulas en las que no estamos interesados por encima de las que s, pero
adems es importante para garantizar la clonalidad de una preparacin dada

de anticuerpos. De manera que, aun teniendo xito en la fase de aislamiento o

seleccin, en muchos casos el producto obtenido es oligoclonal, no
monoclonal. Adems, la experiencia acumulada indica que las clulas
linfoblastoides tienden con el tiempo a disminuir e incluso a detener la
produccin de anticuerpos y a dejar de crecer (Thompson, 1988).
Preparacin de hibridomas
Otra manera de inmortalizar las clulas productoras de anticuerpos ha sido
mediante la fusin de clulas somticas para generar hibridomas humanos
(Abrams et al., 1986). Por diversas razones, algunas de ellas no del todo
entendidas, la produccin de hibridomas humanos ha resultado bastante ms
dificultosa que la obtencin de los homlogos hibridomas de ratn. Entre estas
razones se encuentra la no disponibilidad de una pareja (o parejas) de fusin
adecuada. La obtencin de lneas mielomatosas humanas equiparables a las
existentes en el modelo murino ha resultado difcil. Las clulas de mieloma
humano se adaptan pobremente a crecer en cultivo y adems exhiben baja
fusogenicidad y eficiencia de clonamiento. As mismo, las pocas lneas que se
han generado son productoras, ya sea de cadenas livianas o pesadas (Kozbor
y Roder, 1983: James y Bell, 1987; Thompson, 1988; Larrick y Gavilondo,
1989).
Estos inconvenientes han provocado la utilizacin de las lneas mielomatosas
mridas en la construccin de "heterohibridomas" humano-ratn. Sin embargo,
con este sistema se ha presentado el problema de la inestabilidad de los
hbridos. Esta inestabilidad radica, fundamentalmente, en la ocurrencia de un
fenmeno denominado segregacin (prdida preferencial de los cromosomas
de una especie que ocurre cuando se hibridizan clulas somticas de
diferentes especies). Desafortunadamente, en el caso de los heterohibridomas
humano-ratn los cromosomas que se segregan son los humanos (James y
Bell, 1987). Tratando de disminuir este problema se ha optado por preparar
hbridos humano-ratn (los llamados "heteromielomas") para usarlos como
pareja de fusin, con la esperanza de que al tener un componente humano
previo, el nuevo hbrido no segregue tan vigorosamente los cromosomas
humanos (Foung et al., 1986; Grunow et al., 1988; Jahn et al., 1990).
Transformacin con el VEB + fusin celular.
La otra forma cmo se ha abordado el problema de producir anticuerpos de
manera continua en el laboratorio es mediante la combinacin de las dos
tcnicas antes mencionadas, es decir transformacin con VEB y posterior
fusin con mieloma o heteromieloma. Este enfoque ha resultado ms exitoso
que cualquiera de las dos tcnicas por separado. En esencia, el esquema
bsico de ambas tcnicas es respetado: luego de la transformacin y
enriquecimiento de las clulas transformadas productoras del anticuerpo, stas
se fusionan con una poblacin de clulas de mieloma o heteromieloma. El
producto de fusin es ahora sometido a un proceso de doble seleccin negativa
en un medio que contiene una droga para eliminar las clulas mielomatosas
(por lo general aminopterina, ya que ordinariamente las clulas de mieloma
utilizadas son deficientes en la enzima HGPRT) y una droga para eliminar las

clulas linfoblastoides humanas no fusionadas (se emplea Ouabaina, un

inhibidor de la ATP-asa Na-K de la membrana celular, para el cual las clulas
humanas exhiben una mayor susceptibilidad que las de ratn). Esta variante
fue introducida en 1982 (Kozbor et al., 1982) y ha sido ampliamente utilizada
para la produccin de anticuerpos monoclonales humanos contra distintos
antgenos.
Mediante el uso de estas tcnicas varios laboratorios en el mundo, incluyendo
el nuestro ubicado en el Instituto Venezolano de Investigaciones Cientficas,
han producido anticuerpos monoclonales humanos anti-Rh. El inters
fundamental en esta rea reside en su posible utilidad como reactivos de
clasificacin eritrocitaria y en su potencial uso como sustitutos de la
preparacin policlonal anti-Rh que actualmente se utiliza para prevenir la
inmunizacin materno-fetal en los casos de incompatibilidad Rh. No obstante,
estos anticuerpos tambin han ayudado enormemente a definir los detalles
finos de la antigenicidad del antgeno D y a la identificacin y caracterizacin de
la(s) molcula(s) en la(s) que reside el factor Rh.
Resumen del Proceso de Produccin de un Anticuerpo Monoclonal
Humano
En la figura 2 se esquematizan los pasos necesarios para el desarrollo de
hibridomas productores de anticuerpos monoclonales humanos.

FIGURA 2. ESQUEMA PARA LA PRODUCCIN DE ANTICUERPOS MONOCLONALES HUMANOS TOMADO Y

MODIFICADO DE KOZBOR Y RODER, 1983.

Anticuerpos monoclonales de segunda generacin

En esta seccin se tratar lo relativo a dos modalidades de produccin de
anticuerpos monoclonales que tienen una perspectiva tremenda en el campo
de la teraputica y el diagnstico in vivo. Son stas la produccin de
anticuerpos biespecficos y de anticuerpos recombinantes.

Anticuerpos biespecficos
Es bien sabido que una molcula de inmunoglobulina reconoce dos
determinantes antignicos iguales, gracias a la existencia en su estructura de
dos puntos de combinacin idnticos. Pero sera muy til disponer de
inmunoglobulinas en las cuales cada sitio de unin (o punto de combinacin)
reaccione con un determinante antignico diferente, permitindoles as
interactuar simultneamente con dos antgenos distintos. Son estas molculas
las que han sido llamadas anticuerpos biespecficos. Su preparacin se ha
logrado mediante la fusin de, ya sea un hibridoma especfico para uno de los
antgenos con linfocitos de un animal inmunizado contra el otro antgeno
(generndose clulas hbridas llamadas triomas), o de dos hibridomas cada
uno con especificidad por un antgeno distinto (dando lugar a los llamados
cuadromas). Tanto los triomas como los cuadromas expresan los genes de las
inmunoglobulinas provenientes de ambas clulas progenitoras y en ambos
ocurre la combinacin aleatoria de los productos proticos de estos genes. Por
lo tanto, estas clulas producen anticuerpos monoespecficos para cada
antgeno pero adems producen molculas de anticuerpos especficas para
ambos antgenos (Gavilondo, 1990), A ttulo de ejemplo, en 1993 Kaneko y col.
publicaron en la revista "Blood" la generacin de un anticuerpo biespecfico de
uso potencial en el tratamiento en humanos de la leucemia mieloide aguda.
Este anticuerpo es especfico para la molcula CD3 presente en los linfocitos T
humanos y para la molcula CD13, la cual se expresa abundantemente en las
clulas leucmicas. In vitro, este monoclonal hbrido fue capaz de estimular la
lsis de clulas leucmicas provenientes de pacientes con leucemia mieloide
aguda, por parte de clulas mononucleares de sangre perifrica autlogas,
estimuladas con interleucina 2 o interleucina 7. Los autores proponen a este
monoclonal como una herramienta para la eliminacin de clulas CD13+ en
trasplantes de mdula sea autloga en pacientes con este tipo de leucemia
(Kaneko et al., 1993).
Anticuerpos recombinantes
Las tecnologas de ADN recombinante se han revelado como una herramienta
tremendamente poderosa y promisoria para la preparacin, modificacin y
mejoramiento de los anticuerpos monoclonales, tanto de origen mrido como
humano. Esto ha sido posible gracias al conocimiento detallado que se tiene en
la actualidad sobre la estructura y organizacin de los genes que codifican a las
molculas de inmunoglobulina (Max, 1993). La combinacin de este
conocimiento y estas tecnologas ha permitido hacer verdadera ingeniera
molecular para preparar molculas de inmunoglobulina en las que las regiones
que determinan la especificidad por el antgeno provienen de genes de ratn y
el resto de la molcula es codificado por genes humanos. Virtualmente todo el
trabajo de ingeniera molecular, cuyos detalles escapan de los alcances de esta
revisin, se realiza a nivel del ADN. El producto de este trabajo son genes
hbridos o, ms apropiadamente, recombinantes que ahora pueden ser
insertados en vectores adecuados los cuales permiten su expresin
(transcripcin a ARN mensajero y traduccin a protena) en bacterias o en
clulas eucariotas como ciertos hongos unicelulares o lneas celulares de
mamferos. Han surgido as los llamados anticuerpos "quimricos" y

"humanizados" como una alternativa tecnolgica en los intentos de evitar o

disminuir la respuesta inmune humana anti-inmunoglobulina de ratn, que se
genera cuando inyectamos un anticuerpo murino, pero sin perder la
especificidad que ste nos brinda (Winter y Milstein, 1991 ). A ttulo de ejemplo
se puede mencionar el trabajo de Hale y col., publicado en 1988 por a revista
"Lancet" donde se seala la utilizacin de ese tipo de reactivos humanizados
en el tratamiento de pacientes con linfomas, obtenindose mejores resultados
que con el uso de los monoclonales murinos (Hale et al., 1988).
Estas tecnologas tambin han permitido la preparacin de genes que codifican
molculas hbridas en las que el fragmento Fc del anticuerpo ha sido sustituido
por una enzima, una toxina o una droga. Estos genes recombinantes pueden
tambin ser expresados apropiadamente, obtenindose molculas con la
capacidad de reconocer especficamente a un antgeno (mediante el fragmento
de inmunoglobulina) y con una propiedad funcional nueva, distinta de la del
anticuerpo "natural", conferida por la actividad enzimtica, de toxina o de droga
que le ha sido artificialmente incorporada. Un ejemplo interesante y con una
enorme potencialidad prctica lo constituye un gen recombinante preparado por
Schnee en 1987, en el cual se combinaron los segmentos gnicos que
codifican la cadena beta del activador tisular del plasmingeno y la regin de
combinacin de la cadena pesada de un anticuerpo monoclonal con
especificidad por la fibrina. Al ser expresado este gen, se obtuvo una protena
recombinante capaz de reconocer especficamente cogulos de fibrina y
participar en su disolucin (Schnee et al., 1987). As mismo, una serie de
inmunotoxinas (as se llaman las protenas recombinantes anticuerpo-toxina)
han sido preparadas y estn siendo evaluadas para su uso como agentes
profilcticos en la enfermedad injerto contra husped que aparece con
frecuencia luego de un transplante de mdula sea (Antin et al, 1990), en la
eliminacin de clulas leucmicas u en el tratamiento de linfomas (Amlot et al.,
1993; Grossbard y Nadler, 1994).

Conclusin
El advenimiento de los anticuerpos monoclonales ha sido, en el mbito de las
ciencias biomdicas, uno de los desarrollos metodolgicos ms importantes de
los ltimos 20 aos. Su utilizacin parece no tener ms lmites que aquellos
que se imponga el usuario, como bien lo ha ilustrado la generacin de los
llamados anticuerpos monoclonales catalticos (Danishefsky, 1993; Janda et al.,
1993). El detallado conocimiento de la organizacin de los genes que codifican
estas protenas, en conjunto con las avanzadas tecnologas para la
manipulacin gentica de las que se dispone en la actualidad, ha permitido el
desarrollo de tcnicas para la elaboracin de genotecas combinatorias tanto de
origen humano como mrido (Winter y Milstein, 1991), las cuales se anticipa
sean de gran unidad en el entendimiento de enfermedades autoinmunes
relacionadas con la respuesta inmune humoral (Rapoport et al., 1995) y en la
elaboracin de reactivos teraputicos aplicables a una variedad de patologas
(Glassy, 1993).

REFERENCIAS:

Abrams P.G., G.L. Rossio, H.C. Stevenson y K.A. Foon (1986): Optimal
strategies for developing human-human monoclonal antibodies. Meth. Enzymol.
121:107.
Amlot P.L. et al. (1993): A phase study of an anti-CD22 deglycosylated ricin A
chain immunotoxin in the treatment of B cell lymphomas resistant to
conventional therapy. Blood 82:2624.
Antin J.H., B.E. Bierer, et al (1990): Depletion of bone marrow T-lymphocytes
with an anti-CD5 monoclonal immunotoxin (ST-1 immunotoxin): effective
prophylaxis for graft-versus-host disease. Prog. Clin. Biol. Res. 333:207
Banchereau J., P. De Paoli, A. Valle, E. Garcia y F. Rousset (1991): Long-term
human B cell lines dependent on interleukin-4 and antibody to CD40. Science
251:70.
Borrebaeck C.A.K. (1988): Human mAbs produced by primary in vitro
immunization. Immunol. Today 9:355.
Borrebaeck C.A.K., A. Malmborg y M. Ohlin (1993): Does endogenous
glycosylation prevent the use of mouse monoclonal antibodies as cancer
therapeutics? Immunol. Today 14:477.
Briere F., J.M. Bridon, C. Servet, F. Rousset, G. Zurawski y J. Banchereau.
(1993): IL-10 and IL-13 as B cell growth and differentiation factors. Jour. Exp.
Clin. Hematol. 35033.
Burdin N., C. Pronne, J. Banchereau y F. Rousset. (1993): Epstein-Barr Virus
Transformation induces B lymphocytes to produce human interleukin 10. Jour.
Exp. Med. 177:295.
Burnet F.M. (1959): The clonal selection theory of acquired immunity.
Cambridge, Cambridge University Press.
Carrol K., E. Prosser y R. O'Kennedy (1990): Parameters involved in the in vitro
immunization of tonsilar lymphocytes: Effects of rIL-2 and muramyl dipeptide.
Hybridoma 9:81.
Cobb P.W. y C.F. LeMaistre (1992): Therapeutic use of immunotoxins. Semin.
Hematol. 29:6.
Corrigan A.H. (1988): Large-scale in vitro, current status. Biotechnology 6:784.
Champlin R, W. Ho, J. Gajewski, et al. (1990): Selective depletion of CD8+ T
lymphocytes for prevention of graft-versus-host disease after allogeneic bone
marrow transplantation Blood 76:418
Daggett P.M. and F.P. Simione (1987): Cryopreservation manual, Nalge
Company.

Danishefsky S. (1993): Catalytic antibodies and disfavored reactions. Science

259:469.
De Rossi G., D. Zarcone et al. (1993): Adhesion molecule expression on B cell
chronic lymphocytic leukemia cells: malignant cell phenotypes define distinct
disease subsets. Blood 81:2679.
de Vries T. y D.H. van den Eijnden (1992): Occurrence and specificities of alpha
3-fucosyltransferases. Histochem. Jour. 24: 761
De Waele M., W. Renmans, et al. (1991): Leukemia and lymphoma
immunophenotyping in cell smears with immunogold-silver staining. Am. Jour.
Clin. Pathol. 96:351.
De Waal Malefyt R., H. Yssel, M. Roncarolo, H. Spits y J. E. De Vries. (1992):
Interleukin-10. Curr. Opinion Immunol. 4:314.
Dorai H., B. Mueller, R.A. Reisfel y S.D. Gillies (1991): Aglycosylated chimeric
mouse-human IgG1 antibody retains some effector function. Hybridoma 10:211.
Drouet M y O. Lees (1993): Clinical applications of flow cytometry in
hematology and immunology. Biol. Cell. 78:73.
Engelfriet C.P. y D. Voak (1987): International reference polyspecific anti-human
globulin reagents. Vox Sang. 53:241.
Epstein M.A. y Achong, B.G. (1986): The Epstein-Barr Virus, recent advances.
John Wiley & Sons.
Faguet G.B. y J.F. Agee (1993): Four ricin chain A-based immunotoxins directed
against the common chronic lymphocytic leukemia antigen: in vitro
characterization. Blood 82:536.
Foung S.K.H., E.G. Engleman y C. Grumet (1986): Generation of human
monoclonal antibodies by fusion of EBV-activated B cells to a human-mouse
hybridoma. Meth. Enzymol. 121:168.
Foung S.K.H., S. Perkins, K. Kadafar, P. Gessner y U. Zimmermann (1990):
Development of microfusion techniques to generate human hybridomas. Jour.
Imm. Meth. 134:35
Freshney R.I. (1987): Culture of animal cells, a manual of basic technique.
Second edition, Willey-Liss.
Galili U., E.A. Rachmilewitz, A. Peleg, I. Recliner (1984): A unique natural
human IgG antibody with anti -galactosyl specificity. Jour. Exp. Med. 160:1519.

Galili U. y K. Swanson (1991): Gene sequences suggest inactivation of alfa 1-3

galactosyl-transferase in catharrines after the divergence of apes from
monkeys. Proc. Nat. Acad. Sci. 88:7401.
Gavilondo J.V. (1990): Anticuerpos monoclonales de segunda generacin.
Investigacin y Ciencia, Octubre: 72.
Geisler C.H., JX. Larsen, et al. (1991): Prognostic importance of flow cytometric
immunophenotyping of 540 consecutive patients with B cell chronic lymphocytic
leukemia Blood 78:1795
Glassy M.C. (1993): Production methods for generating human monoclonal
antibodies. Human antibodies and hybridomas 4:154.
Goding J.W. (1980): Antibody production by hybridomas. Jour. Imm. Meth.
39:285.
Goldenberg D.M. y J. Schlom (1993): The coming of age cancer
radioimmunoconjugates. Immunol. Today 14:5.
Grossbard M.L. y L.M. Nadler (1994): Immunotoxin therapy of lymphoid
neoplasms. Semin. Hematol. 31:88.
Grunow R., S. Jahn et al. (1988): A highly efficient human B cell immortalizing
heteromyeloma CB-F7. Jour. Imm. Meth. 106:257.
Gustafsson B., E. Whitmore y M. Tiru (1993): Neutralization of tetanus toxin by
human monoclonal antibodies directed against tetanus toxin fragment C.
Hybridoma 12:699.
Hale G., M.J.S. Dyer, M.R. Clark, J.M. Phillips, R. Marcus, L. Riechmann, G.
Winter y H. Waldmann (1988): Remission induction in non-Hodgkin lymphoma
with reshaped human monoclonal antibody CAMPATH-1H. Lancet II: 1394.
Hand P.H., B. Calvo et al. (1992): Comparative biological properties of a
recombinant chimeric anti-carcinoma MAb and a recombinant aglycosylated
variant. Cancer Immunol Immunother 35:165
Henle G., W. Henle y H. Diehl (1968) Relation of Burkitt's tumor-associated
herpes-type virus to infectious mononucleosis. Proc. Nat. Acad. Sci. 59:94.
Harlow E. y D. Lane (1988): Antibodies, a laboratory manual. Cold Spring
Harbor Laboratory.
Hirano T. y col. (1986): Complementary DNA for a novel interleukin (BSF-2) that
induces B lymphocytes to produce immunoglobulin. Nature 324:73.
Hoffman P., M. Jimenez, M. Loleit, W. Troger, K.H. Wiesmuller et al. (1990):
Preparation of human and murine monoclonal antibodies: antigens combined

with or conjugated to lipopeptides constitute potent immunogens for in vitro and

in vivo immunizations. Human Antibodies and Hybridomas 1: 13 7.
Horejsi V. (1991): Surface antigens of human leukocytes. Adv. Immunol. 49:75.
Hudson L. y F.C. Hay (1989): Practical Immunology. Third Edition, Blackwell
Scientific Publications.
Hughes-Jones N.C. y S.F. Parsons (1992): Monoclonal antibodies to red cell
alloantigens with particular reference to Anti-D. Transf. Med. Rev. VI:191.
Jacquemier J., J.P. Moles, F. Penault-Llorca, J. Adelaide, M. Torrente, P. Viens,
D. Birnbaum y C. Theillet (1994): p53 immunohistochemical analysis in breast
cancer with four monoclonal antibodies: comparison of staining and PCR-SSCP
results. Br. Jour. Cancer 69:846.
Jahn S., R Grunow, S.T. Kiessig, U. Settmacher y R. Von Baehr (1990):
Strategies in the development of human monoclonal antibodies. Develop. Biol.
Standard 71:3.
James K. y G.T. Bell (1987): Human monoclonal antibody production, current
status and future prospects. Jour. Imm. Meth. /00:5.
Jand K.M., C.G. Shevlin y R.A. Lerner (1993): Antibody catalysis of a disfavored
chemical transformation. Science 259:490.
Johnstone A. y R. Thorpe (1987): Immunochemistry in practice. Second Edition,
Blackwell Scientific Publications
Jones M.N. y M.J. Hudson (1993): The targeting of inmunoliposomes to tumor
cells (a431) and the effects of encapsulated methotrexate. Bioch. Bioph. Acta
1152:231.
Kaneko T., Y. Fusauchi et al. (1993): Bispecific antibody enhances cytokyneinduced killer-mediated cytolysis of autologous acute myeloid leukemia cells.
Blood 81:1333.
Kohler G. y C. Milstein (1975): Continuous culture of fused cells secreting
antibodies of predefined specificity. Nature 256:495.
Koide N., M. Nose y T. Muramatsu (1977): Recognition of IgG by Fc receptor
and Complement: effect of glicosidase digestion. Bioch. Bioph. Res. Commun.
75:838.
Kozbor D., A.E. Lagarde, J.C. Roder (1982): Human hybridomas constructed
with antigen-specific Epstein-Barr virus transformed cell lines. Proc. Nat. Acad.
Sci. 79:6651.
Kozbor D. y J.C. Roder (1983): The production of monoclonal antibodies from
human lymphocytes. Immunol. Today 4:71.

Lang A.B., S.J. Cryz, U. Schurch, M.T. Ganss y U. Bruderer (1993):

Immunotherapy with human monoclonal antibodies. Fragment A specificity of
polyclonal and monoclonal antibodies is crucial for full protection against
tetanus toxin. Jour. Immunol. 151:466.
Larrick J. y J. Gavilondo (1989): Anticuerpos monoclonales humanos. Interfern
y Biotecnologa 6: 111.
LDAD = Leukocyte Differentiation Antigen Database (1993): Programa de
computacin elaborado en el 5to. Workshop Internacional sobre Antgenos de
Diferenciacin de Leucocitos Humanos. El programa corre en IBM PCs y puede
ser cargado va ftp desde balrog.nci.nih.gov (156.40.182.2).
LeMaistre C.F., S. Rosen, A. Frankel, S. Kornfeld et al., (1991): Phase trial of
H65-RTA immunoconjugate in patients with cutaneous T-cell lymphoma. Blood
78:1173.
Li B.Y. y S Ramkrishnan (1994): Recombinant hybrid toxin with dual enzymatic
activities. Potential use in preparing highly effective immunotoxins. Jour. Biol.
Chem. 269:2652.
Lill H., M. Siannagl et al., (1993): A new immunoassay for soluble fibrin enables
a more sensitive detection of the activation state of blood coagulation in vivo.
Blood Coag. Fibrinol 4:97.
Lubiniecki A.S. (1990): Large-Scale mammalian cell culture technology. Marcel
Dekker Inc.
Lucas C.J., C.F. van Kreijl, A.J. van der Eb (1989): How to deal with potential
contaminations of monoclonal antibody preparations. Develop. Biol. Standard.
71:201.
Lund J., T. Tanaka et al. (1990): A protein structural change in aglycosylated
IgG3 correlates with loss of hu FcRI and hu FcRIII binding and/or activation.
Mot. Immunol. 27: 1145.
Lund J., N. Takahashi, H. Nakagawa, M. Goodall, T. Bentley, S.A. Hindley, R.
Tyler y R. Jefferis (1993): Control of IgG/Fc glycosylation: a comparison of
oligosacharides from chimeric human-mouse and mouse subclass
immunoglobulin Gs. Mol. Immunol. 30:741.
Lundkvist A., J. Horling, L. Athlin, A. Rosen y B. Niklasson (1993): Neutralizing
human monoclonal antibodies against Puumala virus, causative agent of
nephropathia epidemica: a novel method using antigencoated magnetic beads
for specific B cell isolation. Jour. Gen. Virol. 74:1303
Macey M.G. (1993): Flow-cytometric analysis of lymphocytes, leukaemias and
lymphomas. Br. Jour. Biomed. Sci. 50:334.

Max E.E. (1993): Immunoglobulins: molecular genetics, Captulo 10, p.315. En

Fundamental Immunology Third Edition; W.E. Paul. Raven Press.
Melamed M.D., K.M. Thompson, T. Gibson y N.C. Hughes-Jones (1987):
Requirements for the establishment of heterohybridomas secreting monoclonal
human antibody to rhesus (D) blood group antigen. Jour. Imm. Meth. 104:245.
Mirro J. (1992): Pathology and immunology of acute leukemia. Leukemia 6:13.
Morikawa K., F. Oseko, S. Morikawa, K. Imai y M. Sawada (1993): Recombinant
human IL-5 augments immunoglobulin generation by human B lymphocytes in
the presence of IL-2. Cell. Immunol. 149:390.
Morrison S.L. (1992): In vitro antibodies: Strategies for production and
application. Annu. Rev. Immunol. 10:239.
Myers C.D., V.M. Sanders y E.S - Vitetta (1986): Isolation of antigen-binding
virgin and memory B cells. Jour. Imm. Meth. 92:45.
Odgen G.R., J.G. Cowpe, D.M. Chisholm y D. Lane (1994): p53
immunostaining as a marker for oral cancer in diagnostic cytopathology,
preliminary report. Cytopathology 5:47.
Oka T., H. Matsunaga, K. Tokunaga, S. Mitsunaga, T. Juji y A. Yamane (1994): A
simple method for detecting single base substitutions and its application to HLADPB1 typing. Nucleic Acids Res. 11: 1541.
Ossendorp F. A., P.F. Bruning, J.A.M. Van den Brink y M. De Boer (1989):
Efficient selection of High-affinity B cell hybridomas using antigen-coated
magnetic beads. Jour. Imm Meth 120:191
Perkins S.L. y C.R. Kjeldsberg (1993): Immunophenotyping of lymphomas and
leukemias in paraffin -embedded tissues. Am. Jour. Clin. Pathol. 99:362.
Pistillo M.P., Mazzoceni O. et al. (1988): Human anti-HLA monoclonal
antibodies: production, characterization and application. Human Immunol.
21:265
Phillips C. y G.G.B. Klaus (1992): Soluble antimonoclonal antibodies prime
resting B cells to secrete immunoglobulins in response to interleukins-4 and -5.
Eur. Jour. Immunol. 22:1541.
Ploch N.R. y M.K. Brawer (1994): How to use prostate-specific antigen. Urology
43:27.
Pope J.H., M.K. Horne y W. Scott (1968): Transformation of foetal human
leukocytes in vitro by filtrates of a human leukaemic cell line containing herpeslike virus. Int Jour Cancer 3:857

Porter-Jordan K. y M.E. Lippman (1994): Overview of the biologic markers of

breast cancer. Hematol. Oncol. Clin. North-Am. 8:73.
Rapoport B., S. Portolano y S.M. McLachlan (1995): Combinatorial libraries:
new insights into human organ-specific autoantibodies. Immunol. Today 16:43.
Ronneberger H. (1989): Toxicological testing of monoclonal antibodies.
Develop. Biol. Standard 71:185
Rouger P. y D. Anstee (1988): First International Workshop on monoclonal
antibodies against human red blood cells and related antigens, Final report. Vox
Sang. 55:57.
Sell S. (1993): Detection of cancer by tumor markers in the blood: a view to the
future. Crit. Rev. Oncog. 4:419.
Schinger W., C. Urban, H. Lackner y C. Mache (1993): Treatment of aplastic
anemia with a monoclonal antibody directed against the interleukin-2 receptor.
Ann. Hematol. 66:181.
Schnee J.M., M.S. Runge, G.R. Matsueda, H.W. Hudson, J.G. Seidman, E.
Haber y Quertermous. (1987): Construction and expression of a recombinant
antibody-targeted plasminogen activator Proc. Nat Acad. Sci. USA. 84:6904.
Schroff R., K. Foon, S. Beatty, R. Oidham y A. Morgan (1985): Human antimurine immunoglobulin responses in patients receiving monoclonal antibody
therapy. Cancer Res. 45:879
Schwaber J.F., M.R. Posner, S.F. Schlossman y H. Lazarus (1984): Humanhuman hybrids secreting pneumococcal antibodies. Hum. Immunol. 9:137
Skolnick A.A. (1993): First immunotoxin therapy for many common solid tumors
enters phase clinical trial. JAMA 17:2280.
Steinitz M, G. Klein, S. Koskimies y O. Makela (1977): EB virus induced B
lymphocyte cell lines producing specific antibody. Nature 269:420.
Sullman S.F. (1989): Regulatory issues with respect to monoclonal antibodies:
An industry perspective. Develop. Biol. Standard. 71:207.
Sykes M. (1993): Novel approaches to the control of graft versus host disease.
Curr. Opin. Immunol. 5:774.
Tao M. y S.L. Morrison (1989): Studies of aglycosylated chimeric mouse-human
IgG. Jour Immunol. 143:2595
Thall A. y U. Galili (1990): Distribution of Gal alpha 1-3 Gal beta 1-4 GlcNAc
residues on secreted mammalian glycoproteins (thyroglobulin, fibrinogen and
immunoglobulin G) as measured by a sensitive solid-phase radioimmunoassay.
Biochemistry 29:3959.

Thompson K.M. (1988): Human Monoclonal Antibodies. Immunol. Today 9: 113.

Thompson, K.M. y Hughes-Jones, N.C. (1990): Production and characterization
of monoclonal anti-Rh. Bailliere's Clin. Haematol. 3:243.
Thorley-Lawson D.A. (1988): Immunological responses to Epstein-Barr virus
infection and the pathogenesis of EBV-induced diseases. Bioch. Bioph. Acta
948:263.
Tosato G., K.B. Seamon, N.D. Goldman, P.B. Sehgal, L.T. May, G.C.
Washintong, K.D. Jones y S.E. Pike. (1988): Monocyte-derived human B-cell
growth factor identified as interferon-2 (BSF-2, IL-6). Science 239:502.
Traweek S.T. (1993): Immunophenotypic analysis of acute leukemia. Am. Jour.
Clin. Pathol. 99:504.
Uyama I., K. Kumai, T. Yasuda, T. Tagawa, K. Ishibiki, M. Kitajima y T.
Tadakuma (1994): Improvement of therapeutic effect by using Fab' fragment in
the treatment of carcinoembrionic antigen-positive human solid tumors with
adriamycin-entrapped immunoliposomes. Jpn. Jour. Cancer Res. 85:434.
Vitetta, E. (1994): From the basic science of B cells to biological missiles at the
bedside. Jour. Immunol 153:1407
Versluis L.F., E. Rozemuller, S. Tonks, S.G. Marsh, A.G. Bouwens, J.G. Bodmer
y M.G. Tilanus (1994): High-resolution HLA-DBP typing based upon
computarized analysis of data obtained by fluorescent sequencing of the
amplified polymorphic exon 2. Human Immunol. 38:277.
Voak D., E. Lennox, S. Sacks, C. Milstein y J. Darnborugh (1982): Monoclonal
anti-A and Anti-B as cost-effective reagents. Med. Lab. Sci. 39:109
Walker M.R., J. Lund, K.M. Thompson y R. Jefferis (1989): Aglycosylation of
human IgG1 and IgG3 monoclonal antibodies can eliminate recognition by
human cells expressing Fc gamma RI and/or Fc gamma RII receptors. Bloch.
Jour. 259:347.
Wawrzynczak E.J. et al. (1992): Blood clearance of a recombinant mouse
monoclonal antibody lacking the N-linked oligosaccharide side chains of the
CH2 domains. Mol. Immunol. 29:213
Winter G. y C. Milstein (1991): Man-made antibodies. Nature 349:293.
Wright J.F. M.J. Shulman, D.E. Isenman y R.H. Painter (1990): C1 binding by
mouse IgM: The effect of abnormal glycosylation at position 402 resulting from a
serine to asparagine exchange at residue 406 of the mu chain. Jour. Biol.
Chem. 2:10506

Wu G.X., G.R. He, J.C. Wu y C.G. Roan (1992): Thrombus imaging in dogs with
a monoclonal antibody (SZ-51) specific for activated human platelets. Chin.
Med. Jour. Engl. 105:553.
Yokoyama W.M. (1992): Production of monoclonal antibodies, Captulo 2, p.
2.5.1. en Current Protocols in Immunology, Vol 1. Edited by J.E. Coligan, A.M.
Kruisbeek, D.H. Margulies, E.M. Shevach, W. Strober, National Institutes of
Health.
Yoshimura M.; R.A. Nishimura et al. (1994): Assessment of urinary beta-core
fragment of human chorionic gonadotropin as a new tumor marker of lung
cancer. Cancer 73: 2745
Ziegler E.J., C.J. Fisher et al. (1991): Treatment of gram-negative bacteremia
and septic shock with HA-1A human monoclonal antibody against endotoxin. N.
Engl. Jour. Med 324:429.