Practicas Microbiologia.2016ok

UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN AGUSTN
DE AREQUIPA
FACULTAD DE INGENIERA DE PROCESOS
ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERA QUMICA
GUA DE PRCTICA
MICROBIOLOGA INDUSTRIAL
AUTORES:
Dr. Ing. Ral Omar Gallegos Jara
Ing. Marcia Juana Quequezana Bedregal
Ing. Karina Moran Medina
DATOS DEL ALUMNO
DEL..................
ALUMNO
NombreDATOS
del alumno
Nombre del alumno ................................
Grupo.
Grupo.
Turno Calificacin.
Turno Calificacin.
AREQUIPA PER
2016
PROLOGO
El Campo de la Microbiologa en toda su magnitud es indispensable para el
desarrollo de las ciencias de la salud humana y animal, para el desarrollo de la
agricultura y para el ilimitado campo de los bioprocesos.
Los microorganismos han demostrado ser un enorme potencial para la
elaboracin de infinidad de productos tiles al hombre, en la generacin de procesos
productivos con menor contaminacin del medio ambiente y con consumos de energa
muchos menores.
Los microorganismos son objetos de manipulaciones genticas para que
puedan producir sustancias diversas de gran necesidad. Estos microorganismos
pueden generar Enzimas que a su vez son empleados como biocatalizadores para los
nuevos bioprocesos.
El conocimiento de la microbiologa se hace imperioso para su aplicacin a
diversas disciplinas del saber humano. La presente Gua de Prctica se ha desarrollado
con el objeto de poner al interesado en el conocimiento sistematizado sobre las
tcnicas bsicas del manejo de Microorganismos en laboratorio para estudiantes de
Ingeniera Qumica.
Los Autores
NDICE
PROLOGO
NDICE
Pgs.
RECOMENDACIONES GENERALES ................................................................................................................... 5
PRCTICA 1
BIOSEGURIDAD; MICROSCOPIA ........................................................................................ 6
PRCTICA 2
MICROSCOPA ELECTRNICA DE BARRIDO (SEM): VISITA TCNICA

AL CENTRO DE MICROSCOPA ELECTRNICA DE LA U.N.S.A .......................11
PRCTICA 3
MICROSCOPIA; OBSERVACIN DE MICROORGANISMOS
IN VIVO,
COLORACION VITAL ..............................................................................................................14

PRCTICA 4
PREPARACIN DE UN FROTIS BACTERIANO: COLORACIONES:

SIMPLE Y DIFERENCIAL .......................................................................................................18
PRCTICA 5
COLORACIONES
ESPECIALES:
TINCION
MORFOLOGIA
DE
HONGOS .......................................................................................................................................24
PRCTICA 6
EQUIPO Y MATERIAL DE LABORATORIO, ACONDICIONAMIENTO Y

ESTERILIZACIN ....................................................................................................................34
PRCTICA 7
PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO ..................................................................39
PRCTICA 8
SIEMBRA DE MICROORGANISMOS..................................................................................50
PRCTICA 9
CARACTERSTICAS CULTURALES: MORFOLOGA DE COLONIAS...........61
PRCTICA 10
CURVA DE CRECIMIENTO MICROBIANO ....................................................................67
PRCTICA 11
CONTEO DIRECTO DE CLULAS MICROBIANAS .....................................................72
PRCTICA 12
AISLAMIENTO DE BACTERIAS POR EL MTODO DE DILUCIN EN

PLACA ............................................................................................................................................75
PRCTICA 13
AISLAMIENTO Y SELECCIN DE MICROORGANISMOS DE INTERS

INDUSTRIAL ...............................................................................................................................79
PRCTICA 14
AISLAMIENTO Y CULTIVO DEL RHIZOBIUM ............................................................. 83
PRCTICA 15
ANALISIS MICROBIOLOGICO DE AGUAS CONTAMINADAS............................... 86
FRMULA Y PREPARACIN DE REACTIVOS USADOS EN LAS DIFERENTES

PRCTICAS ......................................................................................................................................................................... 88
BIBLIOGRAFA .................................................................................................................................................................. 90
Recomendaciones Generales
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
La hora de entrada tendr 10 minutos de tolerancia, despus de este tiempo, no

se permitir al acceso al laboratorio
Al entrar al laboratorio, el alumno deber ponerse la bata y abotonarla
completamente, slo podr quitrsela al salir de ste.
Las mesas debern estar siempre limpias y desocupadas, las mochilas debern
ser colocadas en los cajones de las mesas de trabajo.
No comer ni fumar en el laboratorio, no introducirse ningn objeto a la boca.
Recogerse el pelo para efectuar el trabajo de laboratorio.
Limpiar y desinfectar el rea de trabajo antes y despus de usarla.
No pasear entre las mesas del laboratorio, el trabajo deber efectuarse sentado
y en su equipo de trabajo.
Hablar slo lo necesario con los compaeros.
Das antes de iniciar la prctica lea cuidadosamente que es lo que se va a
realizar, si no entiende pregunte al profesor.
Si hay necesidad de llevar material biolgico para la realizacin de la prctica,
es necesario conseguirlo de lo contrario la prctica se suspender para todo el
equipo.
El asa utilizada para el cultivo de microorganismos deber esterilizarse en la
flama del mechero, antes y despus de su uso.
Informe al profesor de cualquier accidente que ocurra.
En caso de derramar material que contenga microorganismos, cbralo con
fenol o benzal y deje actuar diez minutos y de aviso al profesor.
Todo el material que se va a incubar o desechar, debe colocarse en el sitio
indicado por el profesor.
Etiquete todo el material que va a incubar con los siguientes datos: equipo,
grupo, fecha, nombre del material e iniciales del nombre del alumno.
Despus de la incubacin es necesario la esterilizacin del material para
eliminar microorganismos que pudieran hacernos dao a nuestra salud.
Lvese las manos con agua y jabn antes de salir del laboratorio.
Es obligacin de cada equipo entregar todo el material limpio.
PRCTICA
BIOSEGURIDAD; MICROSCOPIA
I. OBJETIVOS
Aprender las normas bsicas de bioseguridad en el laboratorio

Identificar peligros y riesgos existentes en el laboratorio.
Valorar la importancia de la bioseguridad en el laboratorio
Identificar cada una de las partes del microscopio ptico, conocer su funcin y el cuidado de
cada uno de ellas.
Dominar el mecanismo de iluminacin, la observacin de una muestra con todos los objetivos.
II. MARCO TEORICO

2.1 BIOSEGURIDAD
La bioseguridad es el conjunto de medidas preventivas de sentido comn que tienen la finalidad de
proteger la salud, la integridad fsica, la seguridad de las personas en un ambiente determinado, frente a
diferentes riesgos biolgicos fsicos, psicolgicos y mecnicos.
2.1.1 PRINCIPIOS BASICOS DE LA BIOSEGURIDAD
Universalidad: se deben seguir las normas de bioseguridad rutinariamente en todas las situaciones que
puedan dar origen a accidentes, estando o no previsto el contacto con sangre o cualquier otro fluido
corporal. Estas precauciones deben ser seguidas en todo momento mientras se est dentro del
laboratorio
Precauciones estndar: comprende las medidas a tomar para evitar la contaminacin de una persona,
evitando la exposicin directa a sangre y otros fluidos orgnicos potencialmente contaminantes, por
ejemplo mediante el uso de barreras, es decir mediante la utilizacin de materiales adecuados que se
interpongan al contacto de los mismos. La utilizacin de barreras por ejemplo guantes no evitan los
accidentes de exposicin a estos fluidos, pero disminuyen las consecuencias de dicho accidente
2.1.2 PRECAUCIONES ESTANDAR
Barreras de proteccin
Lavado de manos
Desinfeccin y esterilizacin.
Manejo de objetos punzo cortantes.
Manejo y eliminacin de desechos
Ventilacin e iluminacin adecuadas
Limpieza y desinfeccin de ambientes
6
2.1.3 VAS DE CONTAMINACIN

1. La boca
Comer, beber y fumar en el laboratorio.
Realizar transferencias con pipetas sin utilizar ningn tipo de proteccin.
2. La piel
Cortaduras o rasguos.
Transferencia indirecta de microorganismos a travs de los dedos o utensilios contaminados
(lpices, bolgrafos, etc.).
3. Los ojos
Salpicaduras de materiales infecciosos.
Transferencia indirecta de microorganismos a travs de los dedos contaminados.
4. Los pulmones
Inhalacin de microorganismos transportados por el aire (aerosoles).
2.1.4 BARRERAS DE PROTECCION
Lavado de manos (antes y despus)
Guantes
Mascarilla o barbijo
Mandil
Gorro
2.1.5 NORMAS DE BIOSEGURIDAD
Entrar al laboratorio en forma ordenada, dejar las carteras, libros y otros objetos personales en
el lugar que se les indique para tal fin.
Llevar puesto el mandil de laboratorio en todo momento, que debe permanecer
completamente cerrado.
Limpiar y descontaminar las superficies de trabajo, antes de comenzar y al finalizar la sesin
prctica.
Lavar las manos con agua y jabn:
antes de realizar las actividades programadas
antes de salir del laboratorio
despus de usar materiales contaminantes.
Recoger el cabello largo.
Evitar desplazamientos innecesarios, movimientos bruscos. Hablar slo lo indispensable.
No comer, beber, fumar.
Conocer el manejo de todos los equipos y reactivos a emplear antes de iniciar las actividades
indicadas en la prctica. Si usted tiene alguna duda, dirjase al profesor.
Usar mascarillas para casos indicados
2.2 MICROSCOPIA
El microscopio permite la observacin de estructuras muy pequeas que no pueden ser vistas a
simple vista. El poder de resolucin de un microscopio est en relacin inversa a la longitud de
onda de la luz usada.
2.2.1.- PARTES DEL MICROSCOPIO COMPUESTO
1.
Parte mecnica:
- Pie
- Columna (pilar, charnela y brazo)
7
2.
Tubo: Revlver
Tornillo macromtrico o sistema de movimiento rpido
Tornillo micromtrico o sistema de movimiento lento
Platina: Pinzas sujetadoras de lminas y mandos coaxiales
Subplatina: Pieza que asciende y desciende condensador, anillo porta filtros, diafragma
iris y soporte para el espejo
Parte ptica del Microscopio:

- Oculares: lentes situados donde va del ojo del observador
- Objetivos: lentes situados en el lado de la muestra
Los objetivos traen impresas las siguientes caractersticas:
o Magnificacin: Ej. x 25
o Apertura numrica (A.N.): Ej. 0,45
o Cualidades de la lente: Ej. Plan cuando se refiere a un objetivo Planacromtico
o Longitud del tubo: Ej. 160 mm
o Correccin de espesor de laminilla Ej. 0,17 mm
o Aparato de iluminacin. comprende: Espejo, Condensador, Diafragma
2.2.2.- USO DEL MICROSCOPIO COMPUESTO

1. El M.O. debe agarrarse siempre del brazo, nunca del tubo o platina porque deteriora el
tornillo micromtrico.
2. Disponer el M.O. en una mesa horizontal y a una altura conveniente para observar sin
fatiga Verificar que los oculares estn limpios y en posicin correcta.
3. Cuando se observe preparaciones fijas, puede inclinar el tubo del M.O. para una mejor
comodidad si se trata de Microscopios que no posean el sistema inclinado. Si se observan
preparaciones frescas oin vivo debe mantenerse la platina horizontal.
4. Verificar que los objetivos en el revlver estn en orden progresivo de aumento.
5. Coloque el objetivo de menor aumento en el eje ptico girando el revlver hasta que haga
clik.
6. Suba el condensador hasta que la lente superior este muy cerca de la platina y abra el
diafragma totalmente.
7. Si el Microscopio tiene luz incorporada, encender el interruptor y si tiene espejo orientarlo
hacia la ventana mejor iluminada o al fluorescente ms cercano.
8. Observe por el ocular la iluminacin del campo y trate de lograr la mxima luminosidad
moviendo el espejo; luego, si es necesario baje ligeramente el condensador.
9. Colocar en la platina el preparado a estudiar, cuidando que la laminilla cubreobjetos quede
hacia arriba, la etiqueta hacia la derecha del observador y que el preparado se encuentre
entre el condensador y el objetivo; es decir, atravesado por los rayos de luz. Este
desplazamiento se logra utilizando los mandos coaxiales.
10. Para iniciar la observacin, emplee siempre el objetivo de menor aumento (panormico
10X) y procure que la distancia objeto-objetivo sea la mnima (5 mm.), esto se logra
bajando el tubo con el tomillo macromtrico y observando por un lado del Microscopio el
descenso del mismo. Luego, observe por el ocular y simultneamente suba al tubo con el
tomillo macromtrico hasta enfocar el elemento en estudio, de inmediato utilice el tomillo
micromtrico para dar nitidez a la imagen. Finalmente recorra la lmina con la ayuda de los
mandos coaxiales para su observacin integral, siempre utilizando el tomillo micromtrico
para no perder la nitidez.
Cuando se trate de Microscopios en donde la platina asciende al utilizar el tomillo
macromtrico, la distancia objeto-objetivo debe ser de 1 a 1,5 cm.
11. Regular el diafragma iris hasta obtener las mejores condiciones de contraste.
12. El elemento que desee observar a mas aumento coloque en el centro del campo y cambie
de objetivo girando el sistema de revlver, teniendo cuidado de girar el objetivo del
8
siguiente aumento (45X) y NO el de inmersin. Ponga ntida la imagen nicamente con el

tomillo micromtrico.
Es importante tener en cuenta que para cambiar de un aumento a otro no debe
manipularse con el tomillo macromtrico porque corre el riesgo de romper la lmina o la
lente frontal del objetivo.
13. Para observar las estructuras con objetivo de inmersin, coloque el elemento seleccionado
en el centro del campo y gire un poco el objetivo, de manera tal, que quede libre ste
sector de lmina para que pueda colocarse una gota de aceite de inmersin. Luego,
contine girando el revlver hasta que el objetivo de inmersin (100X) contacte con la
gota y encaje en el eje ptico; finalmente, observe por el ocular y aclare la imagen
solamente con el tomillo micromtrico.
Una vez terminada la observacin limpie el objetivo de inmersin y la lmina con el campo
ligeramente humedecido con alcohol isoproplico o metanol.
2.2.3.-
AUMENTOS DEL MICROSCOPIO Y CLCULO APROXIMADO DE

DIMENSIONES CELULARES
1. Para calcular el aumento del Microscopio, multiplique el aumento del objetivo por el del
ocular.
Ej.:
Objetivo 40X y Ocular 10X
40 x 10 = 400 aumentos
2. Para el clculo aproximado de dimensiones celulares, se debe conocer el dimetro del
campo microscpico que vara de acuerdo al objetivo que se usa.
Ocular
10X
10X
10X
Ejemplo:
Dimetro del campo microscpico

Dimetro del
Objetivo
campo en micras
10X
1500
45X
400
100X
150
Si observamos una clula epitelial al Microscopio con objetivo 10X y
ocular 10X, y si sta ocupa la tercera parte del campo microscpico,
concluiremos que la clula mide aproximadamente 500 micras; es decir,
la tercera parte de 1500.
2.2.4.- CUIDADOS DEL MICROSCOPIO COMPUESTO

1. El Microscopio debe tomarse por el brazo, nunca por el tubo la platina, porque a la larga
deteriora el tomillo micromtrico.
2. Los objetivos y oculares constituyen la parte ms delicada del Microscopio, por lo que
debe tenerse sumo cuidado en su uso. As, el enfoque debe hacerse suavemente, evitando
que la lente frontal del objetivo roce el cubre objetos. Por ninguna razn debe
desmontarse los objetivos.
El objetivo de inmersin no debe usarse en seco y debe quedar escrupulosamente limpio
despus de su uso, para lo cual use el campo ligeramente humedecido con alcohol
isoproplico o metanol.
3. Al finalizar la observacin microscpica, coloque el objetivo de menor aumento en el eje
ptico dejando un espacio de 2 cm. entre ste y la lentilla del condensador, luego apague la
luz.
III. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

Proceda a enfocar una muestra, con objetivo 4X, 10 X, 40 X y 100X.
Observe las diferencias en el campo ptico y el acercamiento.
IV. CUESTIONARIO
1)
2)
3)
4)
5)
6)
7)
8)
Realice un dibujo del microscopio y seale sus partes?

A qu se denomina campo ptico?
Por qu decimos que nuestro microscopio tiene sistema parafocal.
Qu es el poder de resolucin
qu entiende por bioseguridad
Identifique 3 situaciones de peligro y 3 de riesgo en el laboratorio.
qu barreras de proteccin debe tener en cuenta antes de empezar a trabajar.
Cmo promovera la cultura de bioseguridad?
V. OBSERVACIONES
VI. CONCLUSIONES
10
PRCTICA
MICROSCOPA ELECTRNICA DE BARRIDO (SEM):
VISITA TCNICA AL CENTRO DE MICROSCOPA
ELECTRNICA DE LA U.N.S.A.
I. OBJETIVOS
Familiarizar al estudiante con las diferentes partes del Microscopio Electrnico de Barrido, SEM y sus
diferentes modos de trabajo.
II. MARCO TEORICO
PRINCIPIOS DEL MICROSCOPIO ELECTRNICO DE BARRIDO (SEM)
El microscopio electrnico de barrido utiliza lentes electromagnticas, sistema de vaco, aperturas y
can de electrones. El SEM acelera los electrones y los colima para formar un haz muy fino que incide
sobre la superficie de la muestra produciendo varias posibilidades de obtencin de imagen.
Debido al tamao pequeo de las aperturas y la longitud de onda de los electrones tan corta, se puede
conseguir una gran profundidad de campo (por lo tanto mucho ms informacin de la muestra)
comparado con la imagen que se obtendra con un microscopio ptico si se usa el mismo aumento.
LA ILUMINACIN:
El microscopio electrnico de barrido utiliza electrones en lugar de luz para formar una imagen. El haz
de electrones es producido al calentarse un filamento metlico dispuesto en el can de electrones, en
la parte superior del microscopio. Cuando los electrones son liberados del tomo, se comportan de
forma anloga a la luz. Este comportamiento es el que se aprovecha en la microscopa electrnica.
LAS LENTES ELECTROMAGNTICAS:
El haz de electrones sigue una trayectoria vertical a travs de la columna del microscopio y se dirige y
enfoca sobre la superficie de la muestra a mediante un arreglo de lentes electromagnticas.
Las lentes funcionan creando un campo electromagntico perpendicular a la direccin de la ruta del
electrn hacindolo que los rayos que tienden a dispersarse, se junten y se proyecten sobre un punto
focal.
Al final de la trayectoria la ltima lente condensadora, denominada comnmente en los SEM, lente
objetivo, es la que sintoniza el haz de electrones para formar un punto o mancha muy fina. sta
contiene dos juegos de bobinas deflectoras conectadas a un generador de rastreo para recorrer la
superficie de la muestra doblando el haz sobre ejes x, y de forma ordenada.
De manera sincronizada, esta bobina deposita la seal en el tubo de rayos catdicos (TRC) del
microscopio resultando una correspondencia de uno a uno entre la posicin del haz sobre la muestra y
la posicin de la seal depositada en el TRC.
EL BOMBARDEO DE LA MUESTRA:
Cuando el haz de electrones (primarios) incide sobre la superficie de la muestra, provoca que otros
electrones (retrodispersados y secundarios) sean proyectados de la misma.
11
Los detectores recolectan electrones secundarios o retrodispersados y los convierten en una seal que
es enviada a una pantalla fosforescente, similar a la de una televisin, con esta seal se produce una
imagen.
El haz primario tambin puede desprender electrones de las capas internas de las molculas de la
muestra los cuales al regresar a su estado nativo emiten energa en forma de rayos X. Estas energas
pueden tambin ser recolectadas, identificadas y analizadas por detectores especiales para rayos X. La
muestra tambin puede absorber parte de los electrones primarios.
LOS DETECTORES:
Los electrones secundarios son producidos por choques inelsticos de los electrones primarios con los
tomos de la muestra. Estos electrones poseen baja energa, del rango de 0 a 50 eV; por su baja energa
se asume que estos electrones son generados por las molculas ms superficiales de la muestra y son
utilizados para generar imgenes tridimensionales al ser recolectados mediante un detector para
electrones secundarios.
El detector de electrones secundarios est diseado con una carga ligeramente positiva para atraerlos.
El extremo del detector contiene sistema para hacer que los electrones secundarios atrados golpeen
una placa aluminizada acoplada a un material fosforescente que provoca que se forme una centella o
chispita. Esta es convertida a su vez en un fotoelectrn despus de chocar con un fotoctodo y as
entra a un tubo fotomultiplicador que incrementar el tamao de la seal hasta el orden de cien mil o
un milln de veces.
LAS APERTURAS:
Durante su recorrido por la columna, el haz de electrones atraviesa una serie de aperturas de 1000
micras de dimetro, stas tienen la funcin de eliminar los electrones perifricos y dejar pasar solo la
parte central del haz.
En la lente condensadora final (lente objetivo), est dispuesta una serie de aperturas de diferente
dimetro (30, 50, 100 y 200 micras para el SEM Topcon SM510). Las ms pequeas generan un punto
o mancha ms pequeo, con menos energa y es usada para generar una imagen de electrones
secundarios; las ms grandes generan una mancha mayor con un gran nmero de electrones, stas
pueden daar especmenes muy frgiles, son utilizadas para tener imgenes de electrones
retrodispesados y hacer anlisis de rayos X.
LA MUESTRA:
La muestra est normalmente pegado a una base metlica (por lo genera aluminio) y es aterrizado para
evitar la esttica por las cargas de alto voltaje cuando los electrones golpean la muestra. Es necesario
orientar la muestra de manera precisa respecto a haz de electrones que inciden y el detector.
Para ello se utilizan las funciones de movimiento en x, y, z e inclinacin del microscopio.
EL VACO:
Mientras el SEM funciona, la columna y la muestra deben estar siempre al vaco, lo que significa que la
mayora de las molculas de aire son removidas del interior del microscopio. La ausencia de molculas
en la ruta del haz, permite que ste viaje libremente y logre incidir sobre la muestra. El vaco tambin
protege al filamento de que se funda.
El vaco en un microscopio se logra mediante la combinacin de una bomba rotatoria que hace un
vaco previo y una bomba de difusin de aceite que es mucho ms potente. El sistema de vaco es
controlado de forma totalmente automtica y est protegido contra fallas de operacin.
LA PROFUNDIDAD DE CAMPO:
Adems de controlar el tamao de la mancha y nmero de electrones que inciden finalmente sobre la
muestra, las aperturas son empleadas para controlar la profundidad de campo en la muestra.
La profundidad de campo se refiere al espesor de la muestra aparece estar en foco. Por ejemplo una
apertura de 100 micras, permite observar en foco hasta 4 mm del espesor de la muestra cuando se
observa a un aumento de 10x, mientras que una apertura de 200 micras solo puede enfocar 2 mm.
La profundidad de campo tambin es afectada por la distancia a la cual la muestra es colocada respecto
a las lentes objetivo (distancia de trabajo). A mayor distancia, mayor profundidad de campo.
EL AUMENTO:
12
El haz barre un rea rectangular de la muestra, sta misma rea es la que se visualiza en la pantalla por
lo que el aumento obtenido es la relacin del rea de la imagen en la pantalla y el rea de la superficie
barrida. El aumento que se obtiene puede ser tan grande como 300, 000X.
LA RESOLUCIN:
El dimetro del haz que enfoca la muestra (tamao de la mancha) tiene un dimetro del orden de 4 a
500 nm. En principio este dimetro puede ser manipulado y repercute directamente en la resolucin (a
menor dimetro, mayor resolucin, pero tambin la fuerza de la seal es menor). En la prctica, la
resolucin tambin depende de las propiedades del espcimen o muestra, de las tcnicas de preparacin
y otras condiciones de trabajo del SEM (voltaje de aceleracin, velocidad de barrido, distancia de
trabajo, ngulo de incidencia).
III. CUESTIONARIO
1. Indique los defectos comunes en microscopia electrnica
2. Indique la tcnica de preparacin de la muestra para la observacin en el microscopio de
barrido SEM.
3. Cules son las caractersticas de SEM?
4. cul es el nivel de vaco mnimo para utilizar el microscopio electrnico?
5. Por qu se requiere esta presin?
6. Cmo consigue este nivel de vaco?
7. Qu tipos de medidores de vaco se utilizan en un microscopio electrnico?
8. Qu relacin hay entre la resolucin y el tamao de apertura de la lente ltima en el SEM?
9. Cules son los usos y aplicaciones del SEM?
IV. OBSERVACIONES
Fotografas
V. CONCLUSIONES
13
PRCTICA
MICROSCOPIA: OBSERVACIN DE MICROORGANISMOS
IN VIVO, COLORACION VITAL
I. OBJETIVOS
1) Conocer la morfologa de organismos unicelulares.
2) Conocer los distintos mtodos de observacin de microorganismos in vivo.
II. OBSERVACIN IN VIVO DE ORGANISMOS UNICELULARES

Indicaciones:
1. Ilumine correctamente su Microscopio, cuidando que la platina est en posicin horizontal.
2. Coloque la lmina porta objetos en su Microscopio.
3. Ponga una gota del agua estancada en el centro de la lmina de manera que la luz del Microscopio la
atraviese.
4. Proceda a enfocar con menor aumento y observar que tiene exceso de iluminacin y poca visin
de la muestra corrija ste defecto bajando el condensador y cerrando un poco el diafragma iris.
5. Observar elementos fijos, con pocos movimientos y veloces que tienen caractersticas especiales y
un fondo de partculas de tierra y cristales grises y oscuros. Pueden distinguirse:
- Algas, como la espirogira, de color amarillento verdoso a manera de pequeas escaleras en cuyo
interior se observan los cloroplastos.
- Diatomeas, de diferentes formas y tamaos, se las distingue porque son brillantes, amarillentas,
poco mviles; van desde la forma de un barril pequeo hasta cigarros o prismas.
- Parameccium, de gran movilidad, atraviesan raudamente el campo de observacin. Son
protozoarios que tienen forma ovoide, de zapatilla y se caracterizan por presentar su cuerpo
rodeado de cilios. En su interior observar el ncleo y vacuolas.
- Tambin puede observarse a la stilonichia, ms pequea que el Parameccium y con un pelo o
cerda en un extremo.
- Algunas veces se visualiza a la Euglena Viridis, caracterizada por presentar un flagelo largo
(Protozoario flagelado).
- La ameba, difcil de visualizar por su transparencia, presenta pocos movimientos y se desplaza
lentamente emitiendo pseudpodos en la superficie de su cuerpo.
- Tambin puede encontrar Vorticelas, tienen forma de cliz, con un pedicelo largo y delgado,
generalmente viven en colonias. La superficie del cliz est rodeada de cilios.
14
6. Luego, coloque una gota de colorante vital (rojo neutro o azul de metileno) en su preparado y
observe nuevamente los organismos unicelulares.
7. Haga un dibujo de lo observado y coloque los nombres correspondientes.
Grafique la Observacin y Resultados
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III. EXAMEN EN FRESCO DE MICROORGANISMOS

1. Examen en Fresco
Es la forma ms simple de realizar la preparacin de un espcimen para su examen microscpico.
Las preparaciones en fresco se utilizan para observar microorganismos vivos.
Hay 2 tipos de tcnicas:
a. Preparacin en fresco simple entre porta y cubre.
Consiste en colocar una gota de lquido con los microorganismos sobre un porta objetos y luego
cubrirla con un cubreobjetos.
b. Gota pendiente
Consiste en colocar una gota de lquido con microorganismos en un cubreobjetos y cubrirlo con un
portaobjetos (de forma invertida) con una excavacin central (portaobjetos excavados). Se debe
sellar la preparacin con vaselina alrededor de la excavacin.
La ventaja de esta preparacin es que no se seca y puede ser observada durante un tiempo ms
largo.
2. Coloraciones Vitales
Son los montajes de materia viva teidos. Suelen utilizarse para ello, determinados colorantes (azul
de metileno, rojo neutro) a muy baja concentraciones (1/1000, 1/10000). Su objetivo es facilitar la
observacin, mediante el colorante de la morfologa y la estructura bacteriana, pero sin provocar
alteraciones celulares ni destruir la bacteria.
IV. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

EXAMEN DE MICROORGANISMOS VIVOS
Este examen permite observar microorganismos vivos, se realiza con la finalidad de observar caracteres
de movilidad, morfologa, agrupacin, observacin de huevos y quistes de parsitos.
15
EXAMEN EN FRESCO
Material
- Microscopio
- Lminas cubreobjetos
- Lminas portaobjetos
- Agua destilada
- Asas de Kolle
- Grmenes varios
- Muestras fermentadas
- Cultivo de microorganismos
Metodologa
- Si la muestra proviene de un lquido, con un asa de kolle se coloca una gota de lquido
sobre un portaobjeto, sobre el que se coloca un cubreobjeto.
- Si la muestra proviene de un cultivo slido, se deposita primero una gota de suero
fisiolgico sobre el portaobjetos, para luego con la ayuda del asa de kolle realizar una
suspensin y colocar un cubreobjetos.
- Observar al microscopio con objetivo 40X.
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COLORACIONES VITALES
Estos tipos de exmenes pueden considerarse como preparaciones en fresco o como tcnicas
intermedias entre stas y las preparaciones fijadas y coloreadas. Son montajes de materia viva
teidas.
Material. Microscopio, Lminas portaobjetos, a examinar, Cubreobjetos, Solucin de azul de
metileno (1/1000), Asas de platino, Grmenes diferentes
Procedimiento
- Sobre el portaobjeto colocar una gota de colorante azul de metileno (l/l000).
- Colocar una gota de la muestra a examinar y con ayuda de una asa de kolle mezclar.
Seguir el procedimiento (muestra liquida o slida).
- Observar al microscopio con el objetivo de 40X.
16

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V. CUESTIONARIO
-
Qu ventajas y desventajas ofrece una preparacin en fresco?

Qu ventaja presenta una preparacin gota pendiente?
Realice un dibujo del microscopio y seale sus partes?
VI. OBSERVACIONES
VII. CONCLUSIONES
17
PRCTICA
PREPARACIN DE UN FROTIS BACTERIANO:
COLORACIONES: SIMPLE Y DIFERENCIAL
I.
OBJETIVOS
Observar clulas muertas en frotis seco y teidas con diferentes procedimientos de coloracin.
II.
MARCO TEORICO
Debido a que las bacterias y otros microorganismos son pequeos y su protoplasto posee un
ndice de refraccin cercano al agua, se requiere generalmente tinciones biolgicas para
visualizarlos adecuadamente o demostrar el detalle de sus estructuras internas.
Los colorantes estn constituidos en su mayora por el anillo bencnico, y difieren uno de otro en
cuanto al nmero y disposicin de estos anillos y a la sustitucin de los tomos de hidrgeno por
otras molculas. Algunos de los grupos cromforos ms comunes hallados en los colorantes son:
C=C, C=O, C=S, C=N, N=N, N=O, NO2.
La intensidad de coloracin de colorante es proporcional al nmero de radicales cromforos del
compuesto.
2.1.- COLORACIONES DIFERENCIALES
PARED CELULAR
El espesor oscila generalmente entre 0.150 m y 0.500 m de espesor, pudiendo incluso
alcanzar 0.8 m (Lactobacillus). Las paredes de las clulas jvenes son ms delgadas que las
clulas de cultivo antiguo.
GRAMPOSITIVAS. La pared celular de las Grampositivas est constituida principalmente
por cadenas de peptidoglucano, a menudo unidas por puentes peptdicos.
Sin embargo estas clulas contienen tambin una gran cantidad de cidos teicocos, polmeros
de glicerol y ribitol unidos por grupos fosfato y aminocidos como D-alanina o azcares
como la glucosa estn unidos a los grupos glicerol y ribitol.
GRAMNEGATIVAS. Presentan 3 capas de envoltura distintas, dispuestas de manera laxa,
estas incluyen la membrana externa (ME), con voluta, arrugada con surcos u ondulante, que
contiene el antgeno o somtico conocido como lipopolisacrido LPS, una capa densa
intermedia, y la membrana plasmtica interna. Un espesor de 0.0075 m.
18
2.2.- PREPARACIONES FIJADAS Y COLOREADAS

Este tipo de preparaciones son las ms frecuentes, tanto las obtenidas directamente a partir
de muestras clnicas como las obtenidas a partir de desarrollo de cultivos.
Los pasos a seguir para la realizacin de una preparacin fijada y coloreada son:
a. Confeccin del Frotis. Puede prepararse a partir de productos lquidos o slidos.
Producto lquido. Para preparar un frotis, se coloca sobre un portaobjetos de vidrio limpio
y seco, una gota del material a estudiar y se extiende con ayuda del asa de platino.
Cultivo en medio slido. Puede prepararse una suspensin del material en una gota de
solucin salina colocada previamente en el portaobjetos, extendindola con ayuda del asa de
platino.
b. Secado. Se dejar secar el frotis a temperatura ambiente.
c. Fijacin. La fijacin tiene como objeto la inmovilizacin de las estructuras del material a
estudiar en un estado lo ms prximo posible al estado vivo. Consiste en una muerte rpida
de los microorganismos, debida a la coagulacin de las albminas protoplsmicas. Existe un
gran nmero de fijadores, tanto en forma simple (etanol, cido pcrico). Las formas ms
habituales de fijacin son: por el calor y alcohol en fro.
d. Coloracin. Es el proceso de coloracin de los microorganismos.
e. Lavado. Eliminacin del exceso de colorante.
f.
Secado. Se secar la preparacin al aire.
CLASIFICACIN DE LAS COLORACIONES

La clasificacin de los colorantes es algo confusa, pero est basada en los cromforos presentes.
a. Segn su estructura qumica. Pueden clasificarse como cido o Bsico, trmino que no
ndica sus reacciones de pH en solucin, sino, si una parte de la molcula es aninica o
catinica.
Los colorantes bsicos, tien estructuras de naturaleza cida, como la cromatina nuclear
de las clulas. Ej: Cristal violeta, Violeta de Genciana, Verde de Malaquita. Safranina.
Los colorantes cidos, reaccionan con sustancias bsicas, tales como estructuras
citoplsmaticas, y como colorante de contraste. Ej: cido pcrico.
Los colorantes neutros, cuando se asocia un colorante cido con uno bsico. Ej:
Wright, Giemsa, Hematoxilina - Eosina.
Los colorantes indiferentes, suelen ser insolubles en agua y solubles en alcohol. Ej:
Sudn III.
CLASIFICACIN DE LAS TINCIONES
a. Tinciones Simples. Son las que utilizan un solo colorante y permiten conocer la morfologa
y tipo de agrupacin bacteriana. ejplo. Tincin azul de metileno, Tincin fucsina.
b. Tinciones Diferenciales. Utilizan ms de un colorante y sirven para poner de manifiesto
las caractersticas de afinidad de los microorganismos por ciertos colorantes como; Tincin
Gram, Tincin cido-alcohol resistente.
19
c. Tinciones Estructurales. Utilizan ms de un colorante y sirven para poner de manifiesto

estructuras bacterianas. como; Tincin de flagelos, Tincin de esporas, Tincin de cpsulas,
Tincin de corpsculos metacromticos
III. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
3.1. PREPARACIONES FIJADAS Y COLOREADAS
Preparacin del Frotis
-
Flamee el asa para siembra hasta que se ponga al rojo vivo. Sostenga el asa
inmediatamente arriba de la porcin azul de la flama. Ponga el asa tan cerca de la
posicin vertical como sea posible. Djela enfriar (cuente hasta 20).
Tome una porcin de la muestra que se va examinar, colocando el asa en posicin plana
en la superficie del lquido.
Coloque el asa sobre el portaobjeto y aplnese ligeramente en el centro de ste (el
portaobjeto deber estar numerado).
Sosteniendo todava el asa aplanada sobre el portaobjeto muvala trazando una espiral
del centro a la periferia. Debe dejar cierto espacio entre la muestra y cada uno de los 4
lados del portaobjetos.
Flamee de nuevo el asa hasta que est al rojo vivo para destruir cualesquiera bacterias que
se encuentren en ella.
Fijacin
Confirme que el frotis se ha secado completamente al aire libre.
Pase el portaobjeto tres veces a travs de la llama del mechero de Bunsen, con la muestra
hacia arriba.
- Djelo enfriar antes de aplicar la tincin.
-
3.2. TINCIONES SIMPLES

Material. Microscopio, Lminas portaobjetos, Azul de metileno (solucin acuosa al 1%),
Safranina (solucin acuosa 1%), Asas de platino, Grmenes diferentes, Aceite de inmersin.
TINCIN DE AZUL DE METILENO
Las bacterias aparecen de color azul, aunque el grado de absorcin del colorante por los
diferentes microorganismos es variable, y algunas estructuras como las esporas absorben el
colorante con dificultad son as fcilmente diferenciables.
Procedimiento
- Tome una lmina portaobjeto limpia, coloque una gota de agua destilada para hacer un
frotis.
- Con l esa tome una pequea porcin del cultivo en medio slido y disuelva en la gota de
agua (cuando el cultivo es medio liquido no necesita de agua). Los frtices que se
obtengan no deben ser ni muy gruesos m muy finos.
- Deje secar a temperatura ambiente o pasando por la llama suavemente para obtener la
fijacin del frotis.
- Cubrir la preparacin con el colorante (2 o 3 gotas) y se deja actuar de unos 5 minutos.
- Lavar bien con agua corriente, evitando que el chorro de agua caiga directamente sobre el
frotis, hasta quitar el exceso de colorante.
- Secar al aire, a temperatura ambiente.
- Observar al microscopio con lente de inmersin. (100X) y con aceite de inmersin.
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TINCIN DE SAFRANINA
Las bacterias aparecen de color rojo.
Procedimiento
- Tome una lmina portaobjeto limpia, coloque una gota de agua destilada para hacer un
frotis.
- Con el asa tome una pequea porcin del cultivo en medio slido y disuelva en la gota
de agua (cuando el cultivo es medio liquido no necesita de agua). Los frtices que se
obtengan no deben ser ni muy gruesos ni muy finos.
fijacin del frotis.
- Cubrir la preparacin con el colorante de safranina (2 3 gotas) y se deja actuar de unos
5 minutos.
- Lavar bien con agua corriente, evitando que el chorro de agua caiga directamente sobre
el frotis, hasta quitar el exceso de colorante.
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3.3. COLORACIONES DIFERENCIALES

Material. Microscopio, Lminas portaobjetos, Set para la coloracin de Gram, Asas de
platino, Grmenes diferentes, Aceite de inmersin.
TINCIN GRAM
El cristal violeta acta como un colorante primario, que se une a la pared celular bacteriana
luego de un tratamiento con una solucin dbil de iodo (Mordiente). Algunas bacterias
debido a su naturaleza qumica de sus paredes celulares, poseen la capacidad de retener el
cristal violeta, an luego del tratamiento con un decolorante orgnico, tal como una mezcla
de alcohol y acetona. Tales bacterias se denominan Grampositivas.
Las bacterias Gramnegativas debido a su mayor contenido lipdico en su pared celular,
pierden la coloracin primaria del cristal violeta cuando son tratadas con el decolorante. El
colorante secundario o de contraste utilizado es la safranina. Las bacterias Gramnegativas que
han perdido el cristal violeta, aparecen rojas o rosadas vistas al microscopio, habiendo fijado
la safranina como contracolor a sus paredes celulares.
Las bacterias aparecen de color azul, aunque el grado de absorcin del colorante por los
diferentes microorganismos es variable, y algunas estructuras como las esporas absorben el
colorante con dificultad son as fcilmente diferenciables.
Reactivos
- Solucin de Cristal Violeta(Cristal violeta= 1.0 g, Alcohol 95 = 20 ml, Agua destilada
csp=100 ml)
- Solucin de Lugol (Yodo en cristales, 1.0 g, Yoduro de potasio= 2.0 g, Agua destilada=
100 ml)
- Decolorante (Acetona= 50 ml, Etanol= 50 ml) Etanol comercial
- Safranina ( Safranina= 0.25 g, Alcohol 95= 10 ml, Agua destilada csp=100 ml)
Procedimiento
- Coloque una asada de caldo nutritivo que contiene una mezcla de bacterias
Grampositivas y Gramnegativas sobre una lmina portaobjeto limpia.
fijacin del frotis, con la finalidad de que el material no sea arrastrado durante el proceso
de tincin.
- Colocar el preparado sobre un soporte de tincin y cubrir la superficie con solucin de
cristal violeta por 1 minuto. Lavar bien con agua de cao.
- Cubrir el preparado con Iodo de Gram durante 1 minuto. Lavar con agua.
- Sostener el portaobjeto entre el pulgar y el ndice y baar la superficie con unas gotas del
decolorante acetona-alcohol hasta no arrastrar ms colorante violeta. Se requiere unos 10
segundos ms o menos. Tambin puede utilizar etanol comercial como decolorante , en
este caso dar ms tiempo aproximadamente 1 minuto.
- Cubrir la superficie con la safranina durante 1 minuto. Lavar con agua de cao.
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IV.
CUESTIONARIO
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
Qu es un colorante y cules son sus propiedades?

Por qu se le llama a un colorante cido o bsico?
A qu se debe la afinidad que tiene un colorante por la bacteria?
De qu manera influye el pH en la coloracin?
Por qu es necesario utiliza mtodos de tincin para visualizar a las bacterias?
Escriba la estructura del azul de metileno y safranina
Mencione 4 microorganismos que tengan la forma de bacilos
Mencione 4 microorganismos que tengan la forma de espirales
Dibuje los componentes de la pared celular de los microorganismos grampositivos y explique
la funcin que cumple cada uno de ellos.
Dibuje los componentes de la pared celular de los microorganismos gramnegativos y explique
la funcin que cumple cada uno de ellos.
Explique el fundamento de la coloracin de Gram y esquematice.
A qu se denomina mordiente y mencione tres ejemplos?
Mencione tres razones por las que un microorganismo grampositivo se observa gramnegativo.
Dibuje la estructura del colorante cristal violeta
Mencione tres microorganismos (gnero) que sean cocos grampositivos, bacilos,
grampositivos, cocos gramnegativo y bacilos gramnegativos.
V. OBSERVACIONES
VI. CONCLUSIONES
23
PRCTICA
COLORACION ESPECIAL: TINCION Y MORFOLOGIA DE
HONGOS
I.
OBJETIVOS
-
Distinguir las caractersticas macroscpicas y las estructuras microscpicas de los Aspergillus,

Penicilium y Rhizopus
Conocer mediante las caractersticas macroscpicas y microscpicas las especies de Aspergillus,
Penicilium y Rhizopus
Conocer la aplicacin de los gneros Aspergillus, Penicilium y Rhizopus en la industria.
II. MARCO TERICO

1. ASPERGILLUS
A. CARACTERISTICAS MICROBIOLOGICAS
Caractersticas morfolgicas del hongo: tamao y forma de las cabezas conidiales, Morfologa de
los conidiforos, filides y metulas, y en la presencia de clulas de Hulle y de esclerocios. En la
siguiente figura se muestra las principales estructuras morfolgicas del gnero Aspergillus:
24
B. APLICACIONES INDUSTRIALES
En la produccin de enzimas que se emplean en la industria molinera y panadera:
ALFA y BETA-AMILASA.
El nombre de diastasas corresponde a un sinnimo de las amilasas, aunque se usa Principalmente
para designar la alfa-amilasa, que se extrae de cereales.
Origen de alfa-amilasa'. Fngico (Aspergillus oryzae), de cereales y del pncreas.
En la produccin de enzimas que se aplican en la industria de alimentos azucarados.
INVERTASA O SACARASA.
Origen y accin'. La hidrlisis de la sacarosa en glucosa y fructosa (azcar invertido) puede ser
realizada por dos enzimas: la betafructosidasa, que acta sobre el extremo fructosa de la molcula
de sacarosa, y la alfa-glucosidasa, que la ataca por el extremo de la glucosa. Actualmente, se entiende
generalmente por "invertasa" la beta-fructosidasa, que es producida por levaduras (Sacaromyces
cerevisiae, Candida), mientras que la alfa-glucosidasa constituye preferentemente las invertasas
intestinales y de hongos (Aspergillus oryzae).Rango de pH: 4-6.
La aplicacin de enzimas en los detergentes
Las enzimas optimizan la eficiencia de los detergentes, a la vez que permiten el trabajo de limpieza
a bajas temperaturas y perodos ms cortos de lavado.
Las enzimas usadas en los detergentes de lavado de ropa actan sobre los materiales que
constituyen las manchas, facilitando la remocin de estos materiales y de forma ms efectiva que
los detergentes convencionales.
Lipasas: Las lipasas deben mezclarse con los lpidos para romperlos por hidrlisis, pero las
lipasas son solubles en agua y los lpidos son insolubles en agua. Por lo tanto, la hidrlisis slo
ocurre en la interfase entre la gota lipdica y la fase acuosa, lo que causa que la reaccin sea
relativamente lenta e inefectiva. Se busca desarrollar lipasas que permitan la remocin de
manchas de grasas a bajas temperaturas de lavado. Una combinacin de bsqueda y
manipulacin gentica ha conducido a la introduccin reciente de lipasas en los jabones en
polvo. Un ejemplo es la lipasa Hamicola , que se logr producir en Aspergillus otyzae y que se
conoce como "Lipolasa".
Preparativos de celulasas comerciales y aplicaciones en procesos extractivos Extraccin de

aceite. El uso de algunos preparados celulolticos en el proceso de extraccin ha tenido un efecto
positivo sobre el rendimiento de la extractabilidad del aceite. El efecto de un preparado enzimtico
producido por Aspergillus fumigatus fue evaluado sobre la extraccin del aceite de soya. En
condiciones ptimas, el contenido de aceite de soya extrable (24.9 % en base seca) y el porcentaje
de recuperacin del aceite de soya (99 %).
El efecto de una enzima cruda obtenida de Aspergillus fumigatus, con actividad mixta principalmente
celulasa, hemicelulasa, quitinasa, xilanasa, pectinasa y proteasa; sobre el rendimiento en la extraccin
de aceite a partir de las semillas de ajonjol, de cacahuate y de girasol. Los niveles de porcentaje de
aceite extrado fueron de 51.4 a 56.7 % para el aceite de ajonjol, de 51.0 a 53.2 % en el caso del
aceite de cacahuate y de 55.3 a 57.1 %
Extraccin de colorantes. La extraccin de colorantes es otra aplicacin atribuida a algunos
preparados enzimticos.
Extraccin de antioxidantes con preparados enzimticos con actividades mixtasmixtas
El preparado enzimtico comercial Grindamyl pectinasa, con actividad mixta principalmente
pectinasa, pero ambin celulasa y hemicelulasa, producido por Aspergillus niger, no slo fue efectivo
25
al aumentar la extraccin de los fenoles debido a la degradacin de los polisacridos

(celulosa,.hemicelulosa y pectina) que constituyen la pared celular de la cascara de uva, sino que
mejor tambin la actividad antioxidante de los extractos fenlicos
2. PENICILLIUM
Las especies de Penicillium son reconocidas por su denso cepillar como las estructuras de la esporacojinete.
Los conidiforos son simples o ramificados y son terminados por los racimos de fales en forma de
botella.
Las esporas (conidios) se producen en cadenas secas de las extremidades de los fialides, con la espora
ms joven en la base de la cadena, y son casi siempre verdes.
La ramificacin es una caracterstica importante para identificar especie del penicillium. Algunos son no
ramificados y llevan simplemente un racimo.de fialides en la tapa del estpite. Otros pueden tener un
racimo de ramas, cada cojinete un racimo de fialides. Un tercer tipo tiene ramas el llevar de una segunda
pedido de ramas, llevando alternadamente un racimo de fialides. Estos tres tipos de sistemas del
cojinete de la espora (penicilli) se llaman monoverticillate, biverticillate y terverticillate respectivamente.
Colonias de crecimiento rpido, vellosas, aterciopeladas, verdosas con una corona radial ancha y blanca,
a 25 C (no crecen o crecen pobremente a 37 C) (Figura 66). Puede haber gotas de exudado sobre la
superficie de la colonia. Reverso habitualmente amarillento o cremoso. Esporulacin abundante. Olor
aromtico, especiado o afrutado (a manzanao a pina).
ECOLOGIA
El Penicillium es gnero grande y difcil encontrado casi por todas partes, y generalmente el gnero ms
abundante de hongos en suelos. La ocurrencia comn de la especie del Penicillium en alimento es un
problema particular. Unas ciertas especies producen las toxinas y pueden hacer el alimento no
comestible o an peligroso. Es una buena prctica desechar los alimentos que demuestran el desarrollo
de cualquier moho.
Se le encuentra en el polvo domstico, en los edificios hmedos y mohosos donde deteriora diferentes
materiales de construccin, entre los que resaltan el papel de decoracin (crece bien en la cola empleada
para su adhesin a las paredes). No muestra una notable variacin estacional. Las mximas
concentraciones de conidios en el aire se alcanzan en invierno y primavera (mayores en las reas
urbanas que en las rurales).
APLICACIONES DEL PENICILLLIUM
Por otra parte unas ciertas especies de Penicillium son beneficiosas a los seres humanos. Los quesos
tales como Roquefort, Brie, camembert, Stilton, etc. se maduran con la especie de Penicillium y son
absolutamente seguros de comer.
La cepa de Penicillium notatum aislada por A. Fleming produca 2 mg de penicilina por cada litro de
cultivo, posteriormente se encontr que otros Penicillium eran mejores productores de penicilina y se
eligi a Penicillium chrysogenum como cepa sper productora de este antibitico. Finalmente, la
seleccin de sucesivos mutantes sper productores y la mejora en las tcnicas de fermentacin
realizadas por la industria biotecnolgica han hecho que actualmente se obtengan 20 g/L de penicilina
Se le emplea en la produccin de algunos alcaloides como la roquefortina C, meleagrina y chrisogina.
Incluye las siguientes especies:
Penicillium bilaiae
> Penicillium camemberti, que es usado para producir los quesos camembert y brie.
> Penicillium candida, dem.
> Penicillium glaucum, que es usado para producir queso gorgonzola.
> Penicillium marneffei, que desarrolla una micosis sistmica emergente que afecta a roedores y
humanos, especialmente a personas inmunodeprimidas, conocida como penicilioisis
26
> Penicillium notatum, que es usado para producir la penicilina.

> Penicillium purpurogenum
> Penicillium roqueforti, que es usado para producir los quesos roquefort, danish blue y
recientemente tambin gorgonzola
III. PROCEDIMENTO
A.
MATERIAL
Asa de kolle
KOH al 30%
Mechero
Azul de lactofenol
Lminas portaobjetos
Lminas cubreobjetos
Microscopio
B. MATERIAL BIOLOGICO
Muestras de alimentos con hongos
Cultivo de Aspergillus niger
Cultivo de Penicillium
C. REACTIVOS
C.1. Azul de lactofenol.
Fenol
cido lctico
Glicerol
Agua destilada
20 g
20 g
40 ml
20 ml
Disolver los componentes antes mencionados y despus se agrega el colorante.

Se puede emplear cualquiera de los siguientes:
Azul de algodn
0.05g
Azul de metileno
0.05 g
Azul de cotton de Perrier 0.05 g
27
2. CULTIVOS
Se realiza en los medios habituales sin cicloheximida, Agar Sabauraud. Las colonias crecen con rapidez,
son de color blanco y por la produccin de esporas se tornan de diferentes colores. La superficie es
aterciopelada o pulvurulenta. Estos hongos se diferencian por el aspecto y pigmentacin de la colonia.
2.1. AGAR SABOURAUD
A. FUNDAMENTO
Es un medio recomendado para el aislamiento de hongos, particularmente a aquellos asociados a
infecciones dermatolgicas. Su bajo pH inhibe el desarrollo de muchas bacterias contaminantes que
pueden estar presentes en la muestra.
B. COMPOSICION
C. PREPARACION
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IV. RESULTADOS
A. ASPEGILLUS NIGER
Caracteres Macroscpicos
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Caracteres Microscpicos
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B. ASPERGILLUS FUMIGATUS
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C. ASPEGILLUS FLAVUS
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D. PENICILLIUM
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3. RHYZOPUS
Las especies del Rhizopus son hongos filamentosos cosmopolitas encontrados en suelo, fruta que se
decae y las heces del vehculo, animales, y el viejo pan. En ciertas especies del Rhizopus son causas
ocasionales del zygomycosis (phycomycosis). Pueden causar infecciones serias (y a menudo fatales) en
seres humanos y animales debido a su tarifa de crecimiento rpida. En ciertas especies son patgeno de
la planta, y uno, oligosporus del Rhizopus, se utiliza en la produccin del tempeh, un alimento
fermentado derivado de las sojas.
Las especies del Rhizopus producen las esporas de dos diversas maneras. Los sporangiospores son el
interior producido a pinhead-como la estructura, el esporangio, y son gentico idnticos a su padre, los
zygospores se producen despus de que dos mycelia se fundan durante la reproduccin sexual, y dan
lugar a las colonias que pueden ser gentico diferentes de sus padres.
EL GNERO MUCOR
Se caracteriza por no formar estolones ni rizoides. Por estos motivos, sus especies invaden lentamente
los medios de cultivo.
EL GNERO RHYZOPUS
Posee estolones y rizoides, razn por la cual invaden rpidamente los medios de cultivo. En este
Gnero los esporangiforos nacen en los nudos de los estolones, o sea sobre los rizoides.
EL GENERO ABSIDIA
Los esporangiforos derivan internodalmente de segmentos de hifas entre rizoides.
APLICACIONES INDUSTRIALES
Importancia econmica, sntesis de productos industriales: produccin de cidos lctico, ctrico,
succnico, oxlico, etc. Y alimentos populares orientales: su-fu y tem-pe
Mucor racemosus: Se presenta en dos formas segn el medio en que se desarrolle. Una forma tpica o
filamentosa, en medios slidos y otra forma atpica o levaduriforme que por lo general aparece en los
medios lquidos y que es aprovechada en la industria para obtener etanol por fermentacin de mostos
azucarados, en cambio, la forma tpica se usa para obtener enzimas (amilasas).
Mucor rouxil: Hidroliza el almidn posteriormente y posteriormente fermenta los azcares formados
en la hidrlisis anterior produciendo etanol en forma lenta, por lo cual es conveniente sembrar una
levadura a las 24 horas de desarrollo de Mucor para facilitar la fermentacin alcohlica. Esto es en
sntesis lo que se conoce con el nombre de proceso amilo. La forma tpica se emplea para la fabricacin
de amilasas.
31
Rhyzopus nigricans: Es un hongo de bajo poder amiloltico, puede hidrolizar el almidn y producir
etanol, pero en menor proporcin que otras especies, por lo cual no se lo aplica en la industria de
fermentacin alcohlica, en cambio, en los ltimos aos se
A. CULTIVOS
Se realiza el cultivo en Agar Sabauraud. Se deja a temperatura ambiente.
Las colonias sospechosas son aquellas que producen colonias de muy rpido crecimiento, son vellosas
o algodonosas y empujan la tapa de la placa petri. Inicialmente son blancas pero cambian a gris,
marrn o negro con la madurez a medida que se forman esporas.
B. OBSERVAR
a. RHYZOPUS
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b. MUCOR
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c. ABSIDIA
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V. CUESTIONARIO
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
Dibuje e indique las partes del Aspergyllus?

Mencione las enfermedades producidas por el gnero Aspergillus?
Mencione 4 diferencias entre cada especie de Aspergillus (Macroscpicas y microscpicas)?
Dibuje.
Cmo diferencia el gnero Aspergillus del Penicilium?
Indique Ud. 4 aplicaciones del Aspergillus?
Indique Ud. 4 aplicaciones del Penicillium?
Qu es una enzima?
Dibuje e indique las partes del Penicillium?
Mencione Ud. Cules son las caractersticas macroscpicas del Penicillium?
Cul es la estructura bsica de la Penicilina?
Cules son los hongos que pertenecen a los Zygomycetes?
Cmo sospecha Ud. Que el hongo que ha desarrollado en su placa de cultivo se trata de un
Zygomycete?
Dibuje e indique las partes de los Zygomycetes?
Indique Ud. Cules son las diferencias que permiten identificar un Mucor, Rhyzpopus y una
Absidia?
Qu enfermedades producen estos hongos?
Mencione Ud. 5 aplicaciones Industriales de estos hongos?
VI. OBSERVACIONES
VII. CONCLUSIONES
33
PRCTICA
EQUIPO Y MATERIAL DE LABORATORIO;
ACONDICIONAMIENTO Y ESTERILIZACIN
I.
OBJETIVOS
1) Dar a conocer al estudiante las tcnicas para el acondicionamiento y esterilizacin de materiales y

equipos ms empleados en un laboratorio de microbiologa industrial.
2) Ejecutar con habilidad y destreza el acondicionamiento de materiales para el anlisis
microbiolgico.
3) Justificar la importancia de los mtodos de esterilizacin para el control microbiolgico de los
alimentos.
II. MARCO TERICO

El acondicionamiento de los materiales as como la esterilizacin de los mismos es el primer paso en el
control microbiolgico de los alimentos, pues de l depender el xito del anlisis.
2.1.- METODOS DE ESTERILIZACION POR CALOR
El calor acta desnaturalizando y coagulando las protenas.
2.1.1.- ESTERILIZACIN POR CALOR SECO
Se requiere temperaturas elevadas y un periodo ms prolongado de calentamiento que la
esterilizacin con vapor. Su uso est limitado primariamente a la esterilizacin de material de
vidrio y aquellas sustancias que sean impermeables al vapor.
El mecanismo por el cual los organismos son destruidos se basa en los efectos letales del calor
seco debido a la desecacin en general, lesin por oxidacin y efectos txicos de los niveles de
electrlitos.
En ausencia de agua, disminuye el nmero de grupos polares de la cadena peptdica y se requiere
ms energa para abrir las molculas, de all la aparente mayor estabilidad del organismo.
Se emplea el horno o estufa de esterilizacin, en la que se aplica una temperatura de 160-170C
durante 1 hora.
34
a) Flameo o Llama Directa. Consiste en exponer los materiales a esterilizar (asas y agujas de
kolhe, esptulas, pinzas, tijeras, etc.) al contacto de la llama de un mechero para eliminar
rpidamente los microorganismos del entorno; Ejemplo: mechero de Bunsen.
b) Aire Caliente. Para ello se utiliza un horno bacteriolgico u horno Pasteur, donde se esteriliza
el material a temperaturas de 170-180C por 2 horas. Es generalmente empleado para
esterilizar material de vidrio.
2.1.2 ESTERILIZACIN POR CALOR HMEDO
Se usa el vapor, tanto porque las bacterias se mueren ms rpidamente cuando se encuentran
hmedas como porque el vapor proporciona un medio de distribuir el calor uniformemente en
todas partes del recipiente de esterilizacin, el vapor debe conservarse a una presin de 1000g/cm3
sobre la presin atmosfrica para obtener una temperatura de 121C. Se produce tambin rupturas
de cadena nica en el ADN, y la prdida de la viabilidad de las clulas expuestas a calor leve puede
correlacionarse con la introduccin de estas rupturas. La lesin de ADN parece ser enzimtica,
como resultado de activacin o liberacin de una nucleasa.
El calor produce tambin una prdida de la integridad funcional de la membrana y filtracin de
pequeas molculas y material absorbente de 260 nm. Este material es de origen ribosmico y
aparentemente es resultado de la degradacin de los ribosomas por ribonucleasas activadas por el
tratamiento con calor. Existe tambin degradacin del ARN ribosmico y la prdida de viabilidad
de las clulas expuestas a temperaturas elevadas.
a) Por Ebullicin. Se coloca el material a esterilizar en agua hirviendo (100C) por 15-35
minutos.
b) Vapor de agua sin Presin. Se coloca el material a esterilizar a la accin del vapor de agua y
a temperatura no mayor de 100C; para ello puede hacer uso del autoclave con la espita
abierta. Se utiliza para materiales termolbiles como es el caso de algunos medios de cultivo.
c) Vapor de agua con Presin. Se realiza en un autoclave a 15 libras de presin y 121C por
15-20 minutos. Se emplea para esterilizar medios de cultivo y todos aquellos materiales que no
pueden esterilizarse por calor seco. Se puede usar; autoclave, pasteurizacin o tindalizacin.
c.1) Autoclave: es un equipo construido en acero inoxidable, de forma cilndrica, paredes
resistentes, puede ser horizontal o vertical; consta de:
2.2
Caldera de material resistente, fondo cncavo cubierta de una camisa metlica cilndrica.
Dispositivos para la instalacin de la fuente calorfica (gas, electricidad o vapor de agua).
Orificios superiores para purga de gases de combustin.
Tapa con vlvula de seguridad, espita, manmetro.
Canastilla para colocar el material a esterilizar.
ESTERILIZACIN POR FILTRACIN
Consiste en hacer pasar las sustancias lquidas o gaseosas a esterilizar a travs de membranas
porosas que retienen a los microorganismos; sirve para la esterilizacin de sustancias termolbiles.
El material filtrante puede ser de porcelana, tierras de infusorios, acetato de celulosa, etc.
35
2.3
ESTERILIZACIN POR RADIACIN ULTRAVIOLETA
Poseen efectos letales y mutagnicos en las bacterias presentando su mayor efectividad como
agente bactericida en la regin espectral de alrededor de los 260 nm. de longitud de onda, ste
mtodo presenta muchas dificultades tcnicas.
III. MATERIALES Y EQUIPO

-
Material de vidrio: pipetas, palcas Petri

Erlenmeyer, tubos de ensayo
Papel craff, algodn, gasa, tijeras
Mechero de Bunsen
Horno Pasteur de aire caliente
Autoclave

4.1 PREPARACIN DE MATERIAL A ESTERILIZAR
a) Preparacin de tubos matraces
-
Los tubos, matraces y frascos antes de su esterilizacin deben llevar sus tapones de
algodn respectivamente, los cuales deben cerrar suavemente no muy flojos ni apretados,
ni largos ni cortos, preparados segn el mtodo siguiente:
De acuerdo al tapn a confeccionar se toma el pedazo convenientemente de algodn de
fibra, extendida, rectangular
Practicar un dobles de 1/3 a lo largo de la fibra.
Enrollar de un extremo, presionando sobre si mismo hasta completar toda la longitud.
Rotar con los dedos el trozo confeccionado aplastando para drsele la forma de cono
truncado, con el dimetro a la medida del recipiente a taponar, el tapn debe entrar en el
recipiente hasta la mitad, y el otro medio quedar fuera. Se pueden preparar los tapones
envueltos en gasa para evitar el hilachamiento.
Tubos de Ensayo
- Formar un paquete de tubos de ensayo taponados, empaquetarlos con papel kraft y
amarrarlos, en su defecto se le envuelve con papel slo la zona de las bocas.
Frascos y Matraces
- Los frascos y matraces se taponan con algodn, se cubre con papel kraft y se amarra con
hilo pabilo.
- Colocar el nombre del medio de cultivo
- Rotular la fecha de preparacin.
b) Preparacin para proteger las pipetas
- En el extremo de succin de cada pipeta introducir una porcin de algodn con auxilio
de una aguja o puntero delgado, evitando que quede muy ajustado.
- Cortar tiras largas de papel kraft de unos 3 cm. de ancho, y colocar uno de sus extremos,
en una de las puntas del papel envolver la punta de la pipeta en forma oblicua y envolver
toda la longitud de la pipeta girndose en espiral en forma ajustada y en la parte terminal
de la boquilla se remata con una torsin para protegerla y se rompe el resto de papel
sobrante.
- Anotar con un lpiz la medida de la pipeta y la fecha de su esterilizacin.
36
c) Preparacin de las placas Petri

- Cortar papel kraft tamao adecuado para cubrir ntegramente las placas petri completas.
- Con la parte brillante del papel hacia fuera se envuelve la placa ponindose esta en el
centro, se envuelve la placa tomndose dos extremos opuestos del papel, dndose una
vuelta alrededor de ella, los otros dos extremos del papel se doblan en tringulos,
rematndose con un fuerte dobles hacia el dorso de la placa, dndosele una apariencia de
paquete de regalo.
4.2 ESTERILIZACIN CON CALOR SECO
El procedimiento de esterilizacin por aire caliente slo se puede emplear con utensilios de vidrio
o metal.
a) Procedimiento para la esterilizacin en horno
- Ponga el termostato a l75C y encienda el horno.
- Si hay un ventilador verifique que est funcionando.
- Vigile el termmetro. Cuando la temperatura llegue a l75C. sgase calentando durante 60
minutos ms.
- Apague el horno. Espere a que la temperatura descienda hasta 60C. Abra la puerta del
horno.
- El papel empleado para envolver deber de haber tomado un color marrn oscuro, si el
color del papel es amarillo plido indicar que el horno no se ha calentado bastante. Si el
papel se ha ennegrecido indicar que el horno se ha calentado demasiado.
4.3 ESTERILIZACIN CON CALOR HMEDO
a) Procedimiento para la esterilizacin con autoclave
- Llene con agua el fondo de la autoclave (hasta el soporte de la canasta). Cercirese que el
agua no toque la canasta. Elimine el exceso de agua abriendo la espita del drenaje.
- Introduzca en la autoclave la canasta con los materiales que se van a esterilizar, se pueden
aadir indicadores de la esterilizacin, como ciertas piezas de papel especial que
ennegrecen al lograrse la temperatura adecuada.
- Cierre la tapa de la autoclave, cerciorndose de que la arandela de goma se encuentra en
su surco. Atornille a niveles iguales los sujetadores de la tapa, con firmeza pero sin
apretarlo demasiado.
- Abrir la vlvula de salida del aire.
- Inicie el calentamiento de la autoclave.
- Vigile la salida de aire hasta que aparezca un chorro de vapor. Aguarde 3- 4 minutos hasta
que el chorro de vapor sea uniforme y continuo, esto indicar que todo el aire ha sido
expulsado de la autoclave.
- Cierre a continuacin la vlvula de salida del aire. Apritense los sujetadores de la tapa del
autoclave y reduzca la temperatura ligeramente.
- Cuando se obtenga la temperatura adecuada 120C se deber regular el calor para
conservarla. Y esperar por 15 minutos.
- Reduzca completamente el calor tan pronto como se cumpla el tiempo requerido.
- Cuando la temperatura descienda a menos de 80C abra la vlvula de salida de aire para
igualar las presione dentro y fuera del autoclave.
- Deje enfriar la autoclave y a continuacin retire cuidadosamente la canasta con los
utensilios estriles.
37
V.
CUESTIONARIO
1. Qu mtodo de esterilizacin utiliz en la prctica, cite algunos ejemplos?
2. Cree usted que es importante acondicionar y esterilizar los materiales antes del control
microbiolgico, por qu?
3. Cite en forma ordenada cada uno de los pasos a seguir para poner en funcionamiento el
autoclave.
4. Compare la resistencia al calor de las clulas vegetativas con esporas bacterianas. Y explique a
que se debe tal diferencia.
5. Cite usted tipos de filtros empleados en el proceso de esterilizacin.
VI. OBSERVACIONES
VII. CONCLUSIONES
38
PRCTICA
MEDIOS DE CULTIVO
I.
OBJETIVOS
a. Identificar las diferentes condiciones de un medio de cultivo para que pueda llevarse a cabo un
crecimiento microbiano.
b. Describir los medios de cultivo ms empleados en bacteriologa.
c. Conocer las aplicaciones y utilidades de los medios de cultivo ms corrientes.
d. Saber manejar el material que se emplea en la elaboracin de cualquier medio de cultivo.
II. MARCO TEORICO

2.1
REQUERIMIENTOS NUTRICIONALES DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

El medio proporciona los elementos necesarios para el crecimiento microbiano. De acuerdo con
esto, siempre se requerir una fuente de energa y una fuente no energtica como son las sales,
factores de crecimiento, etc., que sin proporcionar energa son necesarias para su desarrollo.
2.1.1.- REQUERIMIENTOS ENERGTICOS DE LOS MICROORGANISMOS
A. FUENTES DE CARBONO
En la mayor parte de los casos, la fuente de carbono corresponde a azcares en forma de mono o
disacridos, como glucosa, lactosa, maltosas etc., e incluso hay microorganismos que pueden
utilizar azcares ms complejas para obtener energa., como es el caso del almidn.
Existen tambin bacterias capaces de utilizar el gas carbnico CO2 hecho que es caracterstico de
las bacterias fotosintetizantes y quimiolittrofas.
Otros microorganismos pueden crecer a expensas del metano, benceno e, incluso hidrocarburos
como fuente de energa: Ejemplo: Cladosporium.
Por ltimo, existen especies como Pseudomonas que pueden utilizar como fuente de energa un
gran nmero de componentes hidrocarbonados diferentes.
B. FUENTE DE NITROGENO
Pueden presentarse como protenas completas, que sera el caso de la gelatina o incluso protenas
an ms complejas, como es el caso de los extractos de carne, sales de amonio, o como peptonas
etc.
39
Es frecuente encontrar peptonas como fuente de nitrgeno que corresponden a pptidos o

polipptidos dependiendo de su complejidad pero en cualquier caso son tambin protenas que
estn parcialmente hidrolizadas, aunque no se las deba considerar como tal.
El bio-Thione, es una denominacin comercial correspondiente a una peptona ppsica de carne.
La casena en forma de peptona tripsica de casena se usa para estudiar la formacin de indol por
parte de la bacteria debido al alto contenido de triptfano que posee este tipo de peptona.
Tambin es utilizada para estudiar la reduccin de los nitratos e incluso para el cultivo de algunos
protozoos.
La peptona papanica de soja, es una fuente de nitrgeno especialmente para hongos y ciertos
grmenes como Neisserias.
Otra fuente de nitrgeno serian: nitratos, nitrgeno orgnico, amoniaco, sales de amonio,
aminocidos, etc.
2.1.2. REQUERIMIENTOS NO ENERGTICOS DE LOS MICROROGANISMOS
A. FUENTE DE AZUFRE
Todos los microorganismos que utilizan en su metabolismo azufre lo hacen mayoritariamente en
forma de sulfatos, a veces en forma de tiosulfatos y en otras ocasiones lo pueden obtener a partir
de algn aminocido, ejemplo: metionina, cisterna, tiamina, etc.
Ejemplo de medios de cultivo: TSI, LIA, SIM, SS.
B. FUENTE DE FSFORO
En general, las bacterias que utilizan el fsforo lo suelen hacer en forma de fosfato.
C. IONES METLICOS
Son utilizados por las bacterias bajo la forma de iones a concentraciones muy bajas. Por ej: el
Sodio, el Potasio, Magnesio, Hierro, etc.
Tambin se encuentra otro tipo de iones metlicos Cobalto, Molibdeno.
Estos iones son esenciales para el crecimiento microbiano y dependiendo de su concentracin
pueden inhibir el crecimiento de otros, como el caso del sodio que a concentraciones altas inhibe
el crecimiento de un tipo de microorganismo y facilita el crecimiento de otros.
- Agar Manitol Salado, contiene 7.5% ClNa permite el crecimiento de Staphylococous.
- Agar Streptococus KF contiene 6.5% ClNa permite el crecimiento del Enterococus.
D. FACTORES DE CRECIMIENTO
Existen bacterias que an con los medios antes descritos no crecen o, si lo hacen, es muy
lentamente. A este tipo de bacterias les hace falta adems una serie de componentes definidos
que no son capaces de fabricar por s solas.
A este tipo de componentes se denomina factores de crecimiento y van a corresponder a algn
tipo de aminocido de bacterias muy exigentes o incluso vitaminas, bases pricas o pirimidinicas,
etc.
Ejemplo de medios de cultivo y microorganismos:
- Agar sangre enriquecido con metionina, cido glutmico y cido nicotinico para el
crecimiento de Xanthomonas.
- El Agar Chocolate permite el desarrollo de colonias hmedas, lisas y grises del Haemophylus
influenzae. Este medio contiene hematina (factor X) y est enriquecido con otros cofactores,
como el NAD (factor V), que permite el desarrollo de este microorganismo.
- Agar Sangre enriquecido con Glicerol - papa (Bordet Gengou) para crecimiento de Bordetella
pertusis. Se observa colonias en gotas de mercurio brillantes es fcil de apreciar.
- Agar sangre enriquecido con nitrgeno suplementario y vitaminas del complejo B para el
crecimiento del Flavobacterium.
40
E. FACTORES INHIBIDORES
Son componentes que van a impedir el crecimiento de algn tipo de microorganismo por
bloqueo de sus procesos metablicos.
Los antibiticos son agentes inhibidores o destructores de la propia bacteria.
La azida sdica inhibe el crecimiento de los Gramnegativos.
Algunos colorantes: Eosina Azul de metileno impide el crecimiento bacteriano de los
Grampositivos.
Cristal Violeta impide el crecimiento de los Grampositivos.
Las sustancias inhibidoras son muy tiles para la identificacin y tipificacin de pruebas
bioqumicas de las bacterias.
Ejemplo de medios de cultivo y microorganismos:
Agar Mac Conkey: Las sales biliares y el cristal violeta inhiben el desarrollo de las bacterias
Gramnegativas.
El medio EMB contiene Eosina y azul de metileno que son colorantes de anilina y van a inhibir
el crecimiento de los microorganismos Grarnpositivos, permitiendo el crecimiento de todas las
Enterobacterias.
Agar Salmonella Shigella contiene una alta concentracin de sales biliares y citrato de sodio,
inhibe a todas las bacterias Grampositivas y a muchas Gramnegativas incluyendo las coliformes.
2.3.- CONDICIONES QUE HA DE CUMPLIR UN MEDIO DE CULTIVO
Para que un microorganismo crezca en un medio de cultivo es necesario:
- Una composicin de nutrientes adecuada a las necesidades de ese microorganismo.
- Unas condiciones fsico-qumicas apropiadas. De acuerdo con ello, habra que considerar:
A. TEMPERATURA PTIMA
Los microorganismos, pueden clasificarse en una de las cinco categoras siguientes en funcin de los
rangos de temperatura de crecimiento.
- Los psicrfilos crecen bien a 0C y tienen una temperatura ptima o inferior, la mxima es de
20C. Se aslan del rtico y Antrtico. Pueden crecer a 0C, aunque su temperatura ptima sea 20
a 30C y la mxima de casi 35C. Las bacterias y los hongos responsables de la putrefaccin de
alimentos refrigerados.
- Los Mesfilos, crecen a una temperatura ptima de 20 a 45C, siendo la mnima de 15 a 20C y la
mxima de casi 45C. La mayora de los microorganismos pertenecen a esta categora. Las
bacterias patgenas para el hombre suelen crecer a una temperatura ptima de 37C.
- Los termfilos, pueden crecer a una temperatura de 55C o superiores. La temperatura mnima
es normalmente de 45C y la ptima es de 55 a 65C. Microorganismos que crecen en fardos de
heno, tuberas de agua caliente, aguas termales.
- Los Hipertermfilos, temperatura ptima de entre 80C y casi 113C, no crecen por debajo de
55C. Microorganismos aislados en zonas calientes del suelo marino.
41
RANGOS DE TEMPERATURA PARA EL CRECIMIENTO MICROBIANO
Microorganismo
Bacillus psichrophilus
Microcococcus cryophilus
Pseudomona fluorescens
Staphylococcus aureus
Enterococcus faecalis
Escherichia coli
Neisseria gonorrhoeae
Thermoplasma acidophilum
Bacillus stearthermophilus
Sulfolobus acidocaldarius
Pyrococcus abyssi
Pyrodictium occultum
Pvrolobus fumarii
Candida scotti
Saccharomyces cerevisiae
Mucor pusillus
Temperaturas cardinales (C)

Mnima
ptima
Mxima
-10
23-24
28-30
-4
10
24
4
25-30
40
6.5
30-37
46
0
37
44
10
37
45
30
35-36
38
45
59
62
30
60-65
75
60
80
85
67
96
102
82
105
110
90
106
113
0
4-15
15
1-3
28
40
21-23
45-50
50-58
B. GRADO DE HUMEDAD
Va a corresponder a la cantidad de agua que va a necesitar la bacteria para su crecimiento.
En general, cualquier medio slido o lquido requiere cierta proporcin de agua.
En medios sin agua es muy difcil el crecimiento bacteriano: de ah que la liofilizacin y cualquier
mtodo de deshidratacin, sea un buen medio de conservacin.
C. pH
Cada especie tiene un rango definido de pH para su crecimiento y un pH ptimo de crecimiento.
- Los acidfilos tienen un valor de pH ptimo de crecimiento entre 0 y 5.5.
- Los neutrfilos, entre 5.5 y 8.0
- Los alcalfilos prefieren un rango de pH entre 8.5 y 11.5
La mayora de las bacterias y protozoos son neutrfilos.
La mayora de hongos prefieren medios ligeramente cidos, con valores de pH de 4 a 6.
Variaciones intensas en el pH pueden daar a los microorganismos alterando la membrana
plasmtica o inhibiendo la actividad de las enzimas y las protenas transportadoras.
El pH ptimo en la mayora de los casos es cercano a la neutralidad.
Los tiobacilos pueden crecer mejor a pH muy cido, a pH prximo a 0.
Los bacilos ureasa positivo tal como Proteus crece a pH cercano a 8.
El Vibrio Cholerae crece bien a pH 9.
En un medio de cultivo pueden aparecer variaciones de pH como consecuencia de los metabolitos
que se producen por la degradacin de los nutrientes por parte de las bacterias. Es tpico que en la
fermentacin glucdica se produzca acidificacin del medio o en la degradacin proteica utilizando
la bacteria sales amnicas como fuente de energa se alcalinice el medio.
Siempre es necesario tamponar el medio de cultivo, al menos al comienzo para mantener el pH
dentro de los lmites fisiolgicos.
42
EFECTOS DEL PH EN EL CRECIMIENTO MICROBIANO

Microorganismo
Picrophilus oshimae
Thiobacillus thiooxidans
Sulfolobus acidocaldarius
Lactobacillus acidophilus
Staphylococcus aureus
Proteus vulgaris
Escherichia coli
Clostridium sporogenes
Pseudomonas aeuriginosa
Nitrosomonas
Bacillus pasteurii
Bacillus alcalophilus
Lmite
inferior
0
0.5
1.0
4.0-4.6
4.2
4.4
4.4
5.5-5.8
5.6
7.0-7.6
8.5
8.5
pH ptimo
0.7
2.0-3.5
2.5
5.8-6.6
7.0-7.5
6.0-7.0
6.0-7.0
6.0-7.6
6.6-7.0
8.0-8.8
SD
10.6
Lmite
superior
SD
6.0
4.0
6.8
9.3
8.4
9.0
8.5-9.0
8.0
9.4
SD
11.5
D. PRESIN OSMTICA
Se suele trabajar en condiciones de isotonia (300 miliosmoles) aunque existen muchas bacterias que
pueden crecer a concentraciones algo superiores.
Las bacterias pueden mantenerse vivas y crecer en medios muy acuosos e hipotnicos; este hecho es
debido a su pared rgida que permite que el agua no penetre en la bacteria y sta se rompa.
En las bacterias halfilas, su crecimiento so produce especialmente a concentraciones muy altas de
cloruro sdico; Ej: Staphylococus.
Como la concentracin osmtica de un hbitat tiene efectos tan marcados sobre los
microorganismos, es de gran utilidad expresar cuantitativamente el grado de disponibilidad del agua.
Se emplea la actividad de agua (aw).
Actividad del Agua
1.00 (agua pura)
0.95
0.90
0.85
0.80
0.75
0.70
0.60
Ambiente
Sangre
Pan
Jamn
Salami
Conservas
Lagos salados
Pescado salado
Cereales, dulces
Chocolate
Leche
deshidratada
Microorganismo
Mayora de Gramnegativos
no halfilos
Bacilos Grampositivos, Basidiomycetes
Cocos, Bacillus, Fusarium, Mucor, Rhizopus
Staphylococus, Saccharomyces
Penicillum
Halobacterium, Aspergillus
Actinospora
Aspergillus
Saccharomyces
Xeromyces
E. CONCENTRACION DE OXGENO
Un organismo que puede crecer en presencia de oxgeno atmosfrico es AEROBIO, mientras que
otro puede crecer en su ausencia, es ANAEROBIO.
Los ANAEROBIOS FACULTATIVOS no precisan de Oxigeno para crecer, pero lo hacen mejor
en su presencia.
Los ANAEROBIOS AEROTOLERANTES como Enterococcus faecalis pueden crecer bien
tanto en su presencia como en su ausencia.
Por el contrario los ANAEROBIOS ESTRICTOS U OBLIGADOS, ejemplo: Bacteroides.
Fusobacterium, Clostridium, no toleran en absoluto el oxigeno y mueren en su presencia.
43
Los anaerobios tolerantes y los estrictos no pueden producir energa mediante la respiracin aerobia
y deben utilizar vas de fermentacin o respiracin anaerobia para este objetivo.
Finalmente existen unos pocos microorganismos como el Campylobacter, que son
MICROAEROFILOS que son daados por el nivel de oxigeno atmosfrico 20% precisando para
su crecimiento niveles del 2 al 10% de Oxgeno.
2.3.- PRINCIPALES TIPOS DE MEDIOS DE CULTIVO
Existen muchos tipos distintos de medios de cultivo, as como diferentes clasificaciones. De
acuerdo con esto y segn criterios se podran dividir en:
2.3.1.-MEDIOS DE CULTIVO SEGN SU PROPORCIN EN AGUA
A. MEDIOS SLIDOS
Corresponden a aquellos medios donde la proporcin en agar est siempre por encima del 15%.
La importancia, de los medios slidos es muy grande, pues permite el aislamiento, purificacin y
visualizacin del crecimiento en colonias, as como su posible identificacin a travs de medios
especficos y diferenciales de caracteres, slidos elaboracin de antibiogramas, etc.
Ejemplo de medios de cultivo:
- Agar Mac Conkey, permite el crecimiento de microorganismos Gramnegativos.
- Agar EMB, permite el crecimiento de coliformes.
- Agar Chapman, permite el crecimiento de Staphylococcus.
- Agar Sabouraud, permite el crecimiento de hongos.
- Agar Nutritivo, permite el estudio de la morfologa de las colonias.
B. MEDIOS LQUIDOS
Tambin denominados caldos, no contienen agar. Son de gran utilidad para la realizacin de
recuentos bacteriolgicos por turbidimetra, especialmente til en levaduras, para la realizacin de
inculos, para obtener metabolitos primarios o secundarios, de los microorganismos como:
antibiticos, cidos lcticos, etc.
Ejemplo de medios de cultivo:
- Caldo MRVP, para investigar la ruta utilizada en la degradacin de glucosa.
- Caldo Peptona, para investigar la produccin de Indol.
- Caldo Lactosado, para investigar la formacin de cido y gas
- Caldo BHI, permite el crecimiento de microorganismos considerados difciles de cultivar.
C. MEDIOS SEMISLIDOS
Son medios intermedios entre los lquidos y los slidos; su proporcin en agar suele ser inferior al
5% pero siempre presentan una cierta cantidad que le proporcione consistencia semislida. Son
tiles para algunas pruebas bioqumicas:
- Agar SIM, estudiar movilidad, produccin de H2S, Indol.
- Agar MIO, estudiar movilidad, produccin de Indol y Ornitina.
2.3.2.- MEDIOS DE CULTIVO SEGN SU USO O UTILIZACIN
A. MEDIOS PARA AISLAMIENTO
Son medios con la particularidad de poder obtener a partir de ellos colonias aisladas. Estos, segn
sea su composicin, se pueden a su vez dividir en:
A.1. MEDIOS ENRIQUECIDOS
Son medios a los cuales, como su nombre indica, se les aade adems de los componentes bsicos,
uno o varios elementos, como por ejemplo casena soja, triptfano, etc., que facilitan el crecimiento
de algn tipo de microorganismo generalmente exigentes, lo que nos permite aislar el
microorganismo que buscamos.
44
A.2. MEDIOS SELECTIVOS

Son medios en cuya composicin presentan componentes que impiden el crecimiento de algn tipo
bacteriano.
- Medio Salmonella Shigella, contiene en su composicin sales biliares, citrato de sodio y el verde
brillante que inhibe a la flora Grampositiva y los hacen con el grupo coliforme.
A.3. MEDIOS DIFERENCIALES
Corresponden a aquellos medios que presentan las mismas propiedades que los medios selectivos,
es decir, tienen componentes que inhiben el crecimiento de algunas bacterias y, lo que es ms
caracterstico de este medio, presentan sustancias que al ser utilizadas, o no, por las bacterias que
van a crecer en dicho medio, dan una informacin suplementaria y especfica, es decir, diferencial;
por ejemplo:
- El medio Levine (EMB) este medio presenta en su composicin eosina y azul de metileno que
inhiben el crecimiento de los Grampositivos y algunas Gramnegativas, facilitando el crecimiento
de la enterobacterias, que segn utilicen o no la lactosa darn lugar a una coloracin caracterstica
para cada tipo de microorganismo.
Los medios diferenciales suelen ser tambin selectivos y se usan con fines de aislamiento e
identificacin.
- Agar TSI, que permite investigar si un microorganismo es capaz de utilizar la Glucosa, Lactosa y
Sacarosa, adems si puede producir H2S.
- Agar LIA, permite investigar si un microorganismo descarboxila o desamina el aminocido
Lisina.
- Agar Citrato de Simmons, investiga si el microorganismo es capaz de utilizar el citrato como
nica fuente de carbono.
B. MEDIOS PARA CRECIMIENTO EN GENERAL
Son medios ya sea en forma lquida o slida que sirven para el cultivo de la mayor parte de las
bacterias. Su composicin va a corresponder a una fuente de carbono, una fuente de nitrgeno,
sales y agua. Dentro de los medios generales ms empleados tendramos el caldo comn, que est
compuesto por extracto de carne, peptona, glucosa, cloruro de sdico y agua.
C. MEDIOS DE MANTENIMIENTO DE CEPAS
Son medios que suelen tener los nutrientes necesarios para mantener a las cepas vivas durante
perodos de tiempo relativamente largos mantenindose tales medios generalmente a temperaturas
lo suficientemente bajas en cada caso como para impedir su crecimiento. Ejemplo, leche
descremada que congelada se utiliza a menudo para mantener cepas durante meses.
2.3.3.- MEDIOS DE CULTIVO SEGN SU COMPOSICIN
A. MEDIOS NATURALES
B. MEDIOS SEMISINTTICOS
C. MEDIOS SINTTICOS
D. MEDIOS COMPLEJOS
2.3.4.- MEDIOS DE CULTIVO SEGUN SU PRESENTACIN
A. MEDIOS DESHIDRATADOS O LIOFILIZADOS
B. MEDIOS YA PREPARADOS
C. MEDIOS SLIDOS EN PLACA PETRI
D. MEDIOS SLIDOS EN TUBO
D.1. Con Agar Inclinado
D.2. Con Agar Semi-Inclinado o Pico de Flauta
E. MEDIOS LQUIDOS EN TUBO
45
III. MATERIALES Y REACTIVOS

d. MATERIAL REQUERIDO
- Matraces 250 ml, 100 ml. 50 ml Probetas de 50ml, 100 ml. Baguetas. Balanza. Esptula.
Agua destilada. Placas Petri .Tubos de ensayo.
e. MEDIOS DE CULTIVO
- Agar nutritivo. Agar TSI. Agar Citrato de Simmons. Agar Mac Conkey
Agar Sabouraud. Agar LIA . Agar Manitol salado.

4.1. PREPARACIN
- Para la preparacin de medios de cultivo se usa agua destilada.
- El medio de cultivo a preparar debe ser pesado, segn la cantidad que est indicada en la
etiqueta del medio de cultivo.
- Agregar el medio de cultivo en el matraz, y aadir la mitad del volumen de agua que se
requiere, agitar suficientemente para conseguir una suspensin homognea, despus
incorporar el agua restante, aprovechando esta adicin para desprender e incorporar al
conjunto las partculas del medio de cultivo que hubieran quedado adheridas a la pared
interna del recipiente.
- Los medios nutritivos que contienen agar deben ser calentados para conseguir su
disolucin.
- Para reconocer que se ha alcanzado una disolucin completa, al agitar no debe adherirse el
medio a la pared interna del recipiente; la solucin es viscosa y resbala libremente.
- Tapar el matraz con el tapn de algodn, envolver con papel Kraft y pabilos.
4.2. ESTERILIZACION
- Se esterilizar el medio de cultivo, ya disuelto en el autoclave en caso de ser necesario.
- El tiempo es de 15 minutos a 121C.
4.3. REPARTICION DE LOS MEDIOS DE CULTIVO
- Debe verterse el medio de cultivo a una temperatura de 45-55C.
- Previamente hay que remover el medio de cultivo hacindolo oscilar en sentido circular su
recipiente para garantizar la homogeneidad del medio.
- Los tubos llenos con medios de cultivo esterilizado, todava lquido, se colocan en la
posicin deseada:
o Pico y Fondo o Pico de flauta o semi inclinado
o Pico o inclinado
o Fondo
o El medio de cultivo se deja solidificar en la posicin lograda.
- Repartir:
o En Placas (aproximadamente 16 a 20 ml) los siguientes medios de cultivo:
Agar nutritivo
Agar Mac Conkey
Agar EMB
Agar Sabouraud
46
o En Tubos: la posicin de pico y fondo (aproximadamente 4 ml)

Agar TSI
Agar LIA
o En Tubos: la posicin de pico (aproximadamente 2 a 3 ml)
Agar Citrato de Simmons
o En tubos: la posicin de Fondo (aproximadamente 3 ml)
Agar SIM
4.4. ALMACENAMIENTO
- Los medios de cultivo deshidratados debern conservarse en lugar seco, protegidos contra
la luz, a una temperatura de 15C a 30C, y en envases bien cerrados.
- Los medios de cultivo preparados, listos para su uso, tienen un slo tiempo limitado de
conservacin. Cuando no se indique otra cosa y bajo condiciones adecuadas de
conservacin es de varios meses. Se recomienda temperatura de 4 8C.
- Las placas Petri, preparadas con el medio de cultivo, debern pre encintarse con cinta
adhesiva su borde lateral, para impedir fugas entre el cuerpo de la placa y la tapa.
4.5. COMPOSICION Y PREPARACIN DE CADA UNO DE LOS MEDIOS
UTILIZADOS
AGAR NUTRITIVO
Composicin
Peptona, 17.0 g. Extracto de carne, 3.0 g. Cloruro de sodio, 5.0 g
Agar Agar, 12.5 g. Agua destilada, 1000 m
Preparacin
_________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
Descripcin del Medio
Requerimiento Energtico
Fuente de carbono: ________________________
Fuente de nitrgeno: _______________________
Requerimiento no Energtico
Fuente de azufre: _________________________
Fuente de fsforo: ________________________
Iones metlicos: __________________________
Factores de crecimiento: ____________________
Factores de arranque: ______________________
Factores inhibidores: ______________________
Segn su proporcin en agua
_________________________________________________________
Segn su uso o utilizacin
_________________________________________________________
Segn la composicin
_________________________________________________________
Segn su presentacin
_________________________________________________________
47
AGAR MAC CONKEY

Composicin
Peptona de casena 17.0 g. Rojo neutro 0.03 g. Peptona de carne 3.0 g.
Cristal violeta 0.001 g. Lactosa 10.0 g. Sales biliares 1.5 g. Cloruro de sodio 5.0 g
Agar Agar 12.5 g. Agua destilada 1000 ml.
Preparacin
_________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
Fuente de azufre: _________________________
Fuente de fsforo: ________________________
Iones metlicos: __________________________
Factores inhibidores: _______________________
_________________________________________________________
_________________________________________________________
Segn la composicin
_________________________________________________________
Segn su presentacin
_________________________________________________________
AGAR TSI
Composicin
Extracto de carne, citrato de amonio, 0.2 g. Extracto de levadura, 3.0 g. , peptona de sacarosa,
Tiosulfato de sodio, 0.3 g. Peptona, 20.0 g. Rojo de fenol, 24 mg., sacarosa,
Cloruro de sodio, 5.0 g. Lactosa, 10.0 g. Agar Agar, 12 g. Glucosa,
1.0 g
Agua destilada, 1000 ml
Preparacin
_________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
Fuente de azufre: ________________________
Fuente de fsforo: _______________________
Iones metlicos: _________________________
Factores de crecimiento: ___________________
Factores de arranque: _____________________
48
Factores inhibidores: _____________________

_________________________________________________________
_________________________________________________________
Segn la composicin
_________________________________________________________
Segn su presentacin
_________________________________________________________
MEDIO EMB.
Composicin
Fosfato dipotsico, 1.0 g. , 5.0 g. Sulfato de magnesio, 0.2 g, peptona, azul de metileno, lactosa,
sacarosa, caseina, Agar Agar, 12.5 g. Agua destilada, 1000 ml
Preparacin
_________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
Fuente de azufre: _________________________
Fuente de fsforo: ________________________
Iones metlicos: __________________________
Factores inhibidores: ______________________
Segn su proporcin en agua ___________________________________________
Segn su uso o utilizacin ___________________________________________
Segn la composicin _____________________________________________
Segn su presentacin. _____________________________________________
CALDO LURIA BERTANI (LB)
Composicin
Extracto de levadura,.. g. ,
Cloruro de sodio.. g.
Triptonag
Agua destilada. ml
Preparacin
_________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
Fuente de azufre: ________________________
49
Fuente de fsforo: _______________________

Iones metlicos: _________________________
Factores de crecimiento: ___________________
Factores de arranque: _____________________
Factores inhibidores: _____________________
_________________________________________________________
_________________________________________________________
Segn la composicin
_________________________________________________________
Segn su presentacin
_________________________________________________________
V.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
CUESTIONARIO
Defina Ud. los siguientes trminos y mencione 1 ejemplo de microorganismo: Aerobios obligados,
Anaerobio facultativo, Anaerobio aerotolerante, Anaerobio estricto, Microaerofilo.
Cules son las condiciones que debe reunir un medio de cultivo?
Cual es al funcin del agar-agar en los medios de cultivo?
Por qu es difcil para los microorganismos crecer en medios con valores bajos de aw?
A qu se denomina medio sinttico o definido? De 3 ejemplos.
Qu es un medio complejo?. De 3 ejemplos.
Qu es un medio selectivo?. De 3 ejemplos.
Qu es un medio diferencial?. De 3 ejemplos.
Realice una grfica donde se coloquen los rangos de temperatura para el crecimiento microbiano,
y clasifique en categoras diferentes segn los rangos de temperatura de su crecimiento (psicrfilos.
Psicrtrofos, mesfilos, termfilos, Hipertermfilos?
Con qu sustancias puede enriquecerse un medio de cultivo? Mencione por lo menos 4.
Qu es un medio de transporte y para qu sirve? De 2 ejemplos.
Qu medios diferenciales conoce? Qu utilidades tienen?
Qu es un medio selectivo y qu funcin tiene? Mencione por lo menos 3 y qu sustancias se le
agregan para que cumpla esa funcin?
Cmo pueden incubarse los microorganismos anaerobios estrictos?
Cmo pueden incubarse los microorganismos microaerfilos?
Para qu sirve utilizar un medio de cultivo semislido? Cmo se obtiene la consistencia del agar
blando?
VI. OBSERVACIONES
VII. CONCLUSIONES
50
PRCTICA
SIEMBRA DE MICROORGANISMOS
I.
OBJETIVOS
-
Explicar los diferentes tipos de siembra que puedan realizarse.

Saber llevar a cabo los diferentes mtodos de siembra e inoculaciones.
Proporcionar los medios adecuados para que el alumno trabaje en condiciones de asepsia y
esterilidad.
II. MARCO TEORICO

Para poder estudiar los microorganismos, se necesita como requisito previo poder cultivarlos en
condiciones de laboratorio y, por tanto inicialmente deben ser aislados.
Para ello, se dispone de muestras, que muchas veces suelen presentar los siguientes problemas:
- Que no existe la cantidad suficiente de microorganismos que se busca.
- Que las muestras contengan varios tipos de microorganismos, pacte de los cuales son
contaminantes, hacindose necesario su aislamiento inicial para obtener cultivos puros.
2.1. SIEMBRA
Procedimiento que consiste en inocular a los microorganismos en medios de cultivo
adecuados para que se desarrollen y multipliquen, de acuerdo a sus exigencias vitales, para
que en condiciones ptimas de temperatura y tiempo de inoculacin, puedan desarrollarse y
multiplicarse IN VITRO. Se siembra con dos finalidades:
a. Para hacer un aislamiento.
b. Para hacer un transplante.
AISLAMIENTO
Permite la separacin de los microorganismos al estado de pureza a partir de una muestra
problema. Se requiere un medio slido con gran superficie para que los microorganismos al
ser diseminados sobre el medio, generen su progenie (cepa) por formacin de colonias
separadas. Si se aslan especies distintas, cada colonia tendr caractersticas especiales, la
morfologa bacteriana ser tambin distintiva.
TRANSPLANTE
Significa la separacin previa de la cepa a un medio de cultivo apropiado en tubo, que puede
ser lquido o slido.
51
Se conserva la cepa pura, y por subsiguientes transplantes en medios especiales, se logra

conocer las propiedades culturales y bioqumicas y como resultado la identificacin
especfica. Los trasplantes se pueden realizar:
1. De lquido a slido.
2. De lquido a lquido.
3. De slido a slido.
4. De slido a lquido.
2.2. MATERIAL DE SIEMBRA O INOCULACION
Existen los siguientes materiales:
ASAS DE SIEMBRA
El asa de siembra consiste de un alambre de Nichrome o platino, con una punta en asa o
recta y en el otro extremo insertado con un mango cilndrico para un uso sencillo.
Se utiliza para inoculacin o siembra por estra en medios slidos, presentan un arco bastante
cerrado en su extremo cuyo dimetro es ms o menos especfico es decir muchas asas son
calibradas y corresponden a un volumen determinado de siembra las ms utilizadas son las de
0,01 mililitro que se esterilizan por flameado.
HILOS DE PLATINO (ASA EN PUNTA)

Son similares a las asas con la diferencia de no presentar arco en su extremo, nicamente es
un hilo. Se utiliza para la siembra por picadura en medios semislidos y slidos.
ASAS DE DIGRASKY
Son asas de vidrio en forma de tringulo ms o menos abierto. Se utiliza para extender el
inculo lquido previamente adicionado en la placa, a travs de una pipeta pasteur. Se
esteriliza en autoclave, aunque generalmente se puede hacer empapando en alcohol y
prendiendo la llama hasta agotar el alcohol del asa.
52
HISOPOS
Se utiliza para la toma de muestras, para transportar muestras sin que esta sufra desecacin,
deterioro o contaminacin. Sirve para extender la muestra a travs del hisopo en el medio de
cultivo. Se suele comercializar ya estril listo para utilizar y desechables.
PIPETAS
Se pueden disponer de forma individual o en paquetes. Pueden ser de vidrio, reutilizables por
esterilizacin o de plstico, generalmente desechables. Pueden ser graduadas (contienen
volmenes especficos), en cuyo caso su aspiracin se realizar con aspiradores para pipeta
tipo pera o pipeta. La pipeta pasteur no contiene volmenes graduados son muy utilizados en
bacteriologa y cuya aspiracin se realiza con chupetes de goma. Tambin nos encontramos
con micropipetas utilizadas para la siembra de microlitros y mililitros en un determinado
medio de cultivo.
2.3. PREPAPACION DE INOCULOS
Un inculo corresponde a una cantidad suficiente y representativa de microorganismos
problema. As pues, se debe partir, por un lado, de un, cultivo puro y, por otro lado, de una
concentracin adecuada de microorganismos problema.
Si la muestra no es pura se aplicar distintos mtodos para el aislamiento mediante tcnicas
especficas, como es el caso de la siembra por estras en placa o por agotamiento, o la tcnica
de la placa invertida, que en general va a permitir el crecimiento ms o menos separado de los
microorganismos. Es muy til usar medios de cultivo enriquecidos especficos y diferenciales
que permitan el crecimiento del tipo de microorganismos concreto que buscamos. De esta
forma, una muestra natural que en principio no es pura puede ser aislada y desarrollada como
puro.
METODOS DE PREPARACION DE INOCULOS
Si la muestra es slida o semislida se tomar siempre con asa de siembra estril. Si la
muestra es lquida se tomar con pipeta graduada o pipeta pasteur estril en cantidad
suficiente y, en ambos casos se homogenizar
2.4. PREPARACIN DE INCULOS
Si la muestra es slida o semislida se tomara siempre con asa de siembra estril. Si la
muestra es lquida se tomar con pipeta graduada o pipera pasteur estril en cantidad
suficiente, y en ambos casos se homogenizar posteriormente en el medio especfico de
cultivo.
Si la muestra tomada con asa de siembra estril se adiciona a un medio lquido se
homogenizar y se dejar crecer a la temperatura adecuada, que generalmente para
organismos patgenos coincidir con la temperatura corporal, dejndolos crecer
aproximadamente 24 horas. En ocasiones excepcionales se hace necesaria la utilizacin de un
rotavapor para que el crecimiento se establezca por igual en todo el medio lquido, aunque
esto va a depender de su aplicacin posterior y de la cantidad de inculo que se requiera.
Si la muestra se toma con asa de siembra estril y se adiciona en un medio de cultivo slido,
se utilizara diferentes tcnicas de siembra y posteriormente se verificar el cultivo, ej. siembra
por agotamiento.
Si la muestra se toma con pipeta graduada o pipeta pasteur y se adiciona a un medio liquido,
se homogenizar la mezcla inicial por agitacin y se dejar crecer a una temperatura de 37C
por 24 horas. Es importante que los inculos sean siempre jvenes.
53
Si la muestra se toma con pipeta graduada o pipeta pasteur y sta se aade a un medio slido,
se extender con el asa de Digrasky, previamente estril a travs de toda la placa incubndose
a a temperatura adecuada durante 24 horas. Se requieren tambin cultivos jvenes.
Los medios lquidos pueden ser agua destilada estril, solucin salina estril o caldo de
cultivo base.
A veces es necesario partir de un inculo con un nmero aproximados de microorganismos
problema. En estos casos, los inculos se establecen en medios lquidos y el nmero de
microorganismos se recuenta de forma aproximada, por comparacin de medios lquidos con
diferentes gradientes de turbidez. Este es el caso de la escala de Mc-Farland formada por una
batera de tubos cada uno de las cuales tiene distinta turbidez segn la concentracin de
sulfato brico. Cada tubo corresponder a una determinada concentracin de
microorganismos.
2.5. METODOS DE INOCULACION O SIEMBRA (MTODOS DE AISLAMIENTO)
El paso de una muestra microbiana aun medio de cultivo, ya sea lquido o slido se
denomina siembra o inoculacin.
El paso de una muestra microbiana de un medio de cultivo a otro se denomina resiembra.
La siembra del inculo puede realizarse en medio slido o en medio lquido.
2.5.1. SIEMBRA DEL INCULO EN EL MEDIO SLIDO
Estas siembras pueden darse en placa o en tubo.
2.5.2. SIEMBRA DEL INCULO EN PLACA
Todo aislamiento implica el agotamiento de una muestra sobre la superficie del medio slido.
Se va descargando gradualmente el inculo, para que en los ltimos planos del medio queden
escasas clulas aisladas que en el ambiente nutritivo se irn multiplicando, logartmicamente
hasta formar colonias puras.
Los mtodos de aislamiento varan segn el dispositivo de siembra y la forma de distribuir el
inculo.
Cualquiera que sea el mtodo ensayado, aprovechando el mximo de superficie del medio se
logra el aislamiento de mayor nmero de cepas microbianas.
CLASES DE SIEMBRA
- Siembra por agotamiento o por estras.
- Siembra por difusin.
- Siembra por diseminacin.
a. SIEMBRA POR AGOTAMIENTO: ESTRIA SIMPLE
Con el asa de siembra (previamente esterilizado por flameado) se construye una cantidad
adecuada de muestra problema depositando el inculo en uno de los extremos superiores de
la placa, a partir de aqu se realizar movimientos en zig - zag de un extremo a otro de la
placa no tomndose en ningn momento nuevos inculos y no levantndose el asa hasta
concluir la siembra en toda la placa.
54
- ESTRIA MLTIPLE
Se tomar la muestra problema con el asa de siembra previamente estril y dicho inculo se
depositar en el extremo superior de la placa, extendindose de un extremo a otro de sta
solo en la parte superior. Flameado el esa de platino y girando ligeramente dicha placa
repetiremos el proceso anterior que nos permitir arrastrar la muestra desde uno de los
bordes donde qued la muestra hasta el otro extremo superior de la placa. Se vuelve de
nuevo a flamear el asas de platino sin coger muestra como en el caso anterior y siguiendo la
misma direccin se repite la operacin hasta un total de cuatro o cinco veces, que son los que
tienen cabida aproximadamente en una placa, teniendo en cuenta que el ltimo tramo se
efectuar hacia el interior de la misma.
El resultado son colonias cada vez ms separadas como consecuencia de que cada vez que se
va arrastrando y separando ms la muestra. Es importante que para separar estas colonias se
realice en cada estra un flameado previo del asa de siembra.
- TECNICA DE LOS CUATRO CUADRANTES

Con un rotulador para vidrio, en la base de la placa (reverso), se dibujan dos lneas
perpendiculares que debern cruzarse en el centro de la placa de tal forma que esta queda
dividida en cuatro cuadrantes iguales. Se tomar con el asa de siembra estril una cantidad de
inculo y se adicionar en el extremo superior de uno de los cuadrantes extendindose por
todo ese cuadrante en forma de zig - zag. Realizamos la misma operacin sin flamear el asa
en todos los dems cuadrantes siguiendo un orden de tal forma que iremos arrastrando el
microorganismo problema observndose en el ltimo cuadrante las colonias ms aisladas o
separadas.
- TECNICA DE LOS TRES GIROS
Se rotula la placa en forma anloga al caso anterior. Se toma inculo con el asa de platino y se
siembra por estra la mitad superior de la placa. Sin flamear el asa de platino giraremos la
placa unos 90 y volveremos a sembrar una segunda vez. As sucesivamente hasta completar
toda la siembre (girando de nuevo la placa 900) sta tcnica no es muy utilizada.
55
b. SIEMBRA POR DIFUSION (TCNICA DE BARRY)

En este mtodo, el medio de cultivo se mezcla con el inculo, al solidificar las colonias
crecen en diferentes niveles, los cuales servirn para contaje de colonias.
Para ello en el medio de cultivo previamente fundido (de 20 a 25 ml de medio a una
temperatura de 45 a 50C) en el tubo, en el tubo se adicionar la cantidad de inculo que
oscila entre 0,1 a 0,4 y se homogenizar la muestra en el tubo mediante el vibrador.
Una vez, constituida la muestra, se vierte sta en la placa Petri estril y se dejar solidificar, la
mezcla tambin se podra realizar en la misma placa Petri, aunque la homogenizacin en este
caso es ms difcil. Esta tcnica es utilizada, por ejemplo, para la determinacin de CMI
(concentracin mnima inhibitoria) de un antibitico frente a determinados microorganismos.
c. SIEMBRA POR DISEMINACIN (CON ASA DE DIGRASKY).
Consiste en adicionar al medio slido, un inculo que puede oscilar entre 0,2 y 1 ml segn los
casos con una pipeta graduada estril, y posteriormente se extiende con el asa de Digrasky
tambin estril. Esta tcnica se puede utilizar para el recuento de clulas viables,
antibogramas, etc.
2.6. SIEMBRA DEL INCULO EN TUBO

a. SIEMBRA POR ESTRIA EN MEDIO SLIDO INCLINADO
Se toma con asa de siembra previamente esterilizada por flameado una cantidad de muestra
adecuada. Se aade al tubo desde el fondo de la superficie de sta realizando movimientos
ascendentes en zig - zag hasta completar toda la superficie del medio. Este mtodo es
utilizado para conservar cepas durante largos perodos, as como para la realizacin de ciertas
pruebas bioqumicas como la prueba de ureasa.
56
b. SIEMBRA POR PICADURA

Se suelen tomar con hilo de siembra aunque en algunas ocasiones tambin puede hacerse con
asa de siembra. Consiste en introducir el asa en el medio de cultivo que se encuentra en el
tubo hasta el fondo de esta y en posicin central. Esta tcnica se utiliza para la siembra de
medios de cultivo semislidos ej. medio de oxidacin - fermentacin de Hugh-Leiffson.
c. SIEMBRA POR PICADURA Y ESTRIA

Consiste en la utilizacin de las dos tcnicas anteriormente descritas. Este mtodo se lleva a
cabo cuando el medio es slido y est inclinado. Primero se realiza la siembra por picadura y
posteriormente la siembra por estra ej. prueba de medio KIA y la prueba en medio citrato
entre otras.
2.7. CULTIVOS PUROS: AISLAMIENTO EN PLACA Y TRANSFERENCIA

CELULARES
El empleo de microorganismos en Biotecnologa se fundamente en la obtencin de cultivos
puros, que estn constituidos por una nica especie microbiana. La mayora de las
aplicaciones en biotecnologa conlleve el uso de cultivos puros.
La mayora de los mtodos de obtencin de cultivos puros se basa en algn mtodo de
dilucin. El mtodo ms til y prctico es el aislamiento en placa, en el que un cultivo
mezclado se inocule y se extiende sobre la superficie de un medio de cultivo de modo que las
clulas individuales queden separadas una de otras. Cada clula aislada crece ahora para
formar una colonia y, por lo tanto, un cultivo (o clon) puro puesto que las clulas que
componen la colonia son la progenie de una nica clula original.
Existen varios mtodos para confirmar la pureza de un cultivo:
1.
Repitiendo la operacin de aislamiento; una colonia aislada procedente de un

aislamiento en placa inicial debera dar lugar al repetir la operacin a colonias todas del
mismo tipo, y cuya morfologa concuerda con la del aislamiento inicial.
57
2.
El examen microscpico de los organismos procedentes de una colonia deberan

mostrar un nico tipo celular. Los mtodos diferenciales de tincin Gram, son tiles
pare establecer que la colonia una mezcla de tipos microbianos diferentes.
Es necesario emplear una tcnica asptica para transferir los cultivos puros y para mantener
la esterilidad a los medios y soluciones. Trabajando aspticamente, el biotecnlogo tome
prudentemente las precauciones necesarias para prevenir la contaminacin o de las
soluciones con microorganismos no deseados.
III. MATERIALES Y EQUIPOS

Material de Vidrio
- Tubos de ensayo (16 x 125) (13 x 100)
- Placas petra
- Pipetas 1ml, 5ml, 10 ml
- Erlenmeyer
Equipos
- Estufa 37C
- Autoclave
Otros materiales
- Gradillas
- Mechero Bunsen
- Asas de siembra
- Algodn
- Pinzas
Reactivo y Medios de cultivo
- Medios de cultivo
Agar Mc Conkey
Agar nutritivo
Agar Saboraud
Agar TSI, LIA (tubos pico de flauta)
Agar SIM (tubos fondo)
Caldo SIM
IV. PROCEDIMIENTO DE MUESTRAS

4.1. SIEMBRA DE UNA MUESTRA LQUIDA CON EL ASA DE DIGRASKY
Muestra: Inculo de un cultivo puro
Medio de cultivo: Agar nutritivo
____________________________________________________________
____________________________________________________________
58
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
4.2. SIEMBRA POR AGOTAMIENTO O AISLAMIENTO EN ESTRIA
Muestra: Microorganismos
Medio de cultivo: Agar Mac Conkey
Medio de cultivo: Agar EMB
Medio de cultivo: Agar Sabouraud
Propsito: Obtener colonias aisladas para observar sus caractersticas
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
4.3. TCNICA DE LOS CUATRO CUADRANTES
Muestra: Muestra fermentada y de microorganismos
Medio de cultivo: Agar Sabouraud
Medio de cultivo: Agar Mac Conkey
Medio de cultivo: Agar EMB
Propsito: Obtener colonias aisladas para observar sus caractersticas
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
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____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
59
V.
CUESTIONARIO
1.
2.
3.
4.
Por qu razn no debes compartir el mechero de Bunsen?

Cul es la razn para flamear los tubos antes y despus de cada transferencia?
Por qu debes evitar el usar el pulgar para sostener las tapas durante una transferencia?
Explica por qu debes evitar que el asa llena de inculo toque la boca del tubo fuente o del tubo a
ser inoculado.
5. Cuando tomas un inculo de un tubo con agar inclinado. por qu es necesario tocar una parte
estril del agar con el asa antes de tocar el crecimiento bacteriano?
6. Por qu el asa debe ser flameada antes y despus de todos los procedimientos de siembra?
7. Por qu las placas de agar deben mantenerse invertidas durante la incubacin?
VI. OBSERVACIONES
VII. CONCLUSIONES
60
PRCTICA
CARACTERSTICAS CULTURALES: MORFOLOGA DE
COLONIAS
I.
OBJETIVOS
-
Aprender las diferentes caractersticas de la morfologa colonial utilizadas en la identificacin de

bacterias.
Estudiar caractersticas culturales de crecimiento de los microorganismos en medio slido
Investigar las manifestaciones de crecimiento de los microorganismos en medio lquido
II. MARCO TERICO

GENERALIDADES:
Para estudiar las caractersticas de los microorganismos (forma, estructura, tamao, consistencia,
cromogenesis y otros), es necesario sembrarlos y cultivarlos en medios de cultivos apropiados segn el
tipo de microorganismo, de tal forma que proporcione los nutrientes necesarios para su crecimiento y
desarrollo. La siembra de microorganismos se realiza en medios slidos y lquidos.
Una colonia es una agrupacin de bacterias formada a partir de la reproduccin de una Unidad
Formadora de Colonia (UFC) sobre un medio slido; aunque vara de tamao generalmente es visible a
simple vista.
Una UFC puede ser un solo microorganismo o bien un grupo de microorganismos de una misma
especie como en el caso de bacterias que tienen tendencia a permanecer unidas como los estafilococos
o los estreptococos.
Las colonias bacterianas tienen una medida, forma, textura y en algunos casos color caractersticos, que
aunque puede variar de acuerdo al medio en que se encuentren, es constante bajo condiciones
controladas y depende de la especie bacteriana que la forme.
Debido a que las caractersticas de las colonias ocurren en varios grados y combinaciones dependiendo
de las bacterias y son a menudo muy uniformes, sirven para identificar bacterias en cultivos mezclados.
Sin embargo, adems de stas caractersticas se requiere tambin estudiar la fisiologa y propiedades
inmunolgicas de las bacterias para poder realizar una identificacin completa.
La morfologa colonial es comparable a una estadstica ya que se deriva de una clula individual pero es
la caracterstica de la masa celular. As pues, por ejemplo, la pigmentacin es aparente en la colonia,
pero no en la clula individual, en el caso de la consistencia mucosa de algunas colonias esta se deriva
de la sustancia capsular en aquellas bacterias con cpsula muy grande.
Medida de las colonias. sta caracterstica es bastante constante dentro de las especies y puede ir desde
colonias muy diminutas hasta un dimetro de varios milmetros.
61
Forma. Est determinada por su borde y su espesor. En las siguientes figuras se pueden observar varias
formas, elevaciones y bordes de colonias bacterianas.
Consistencia y textura. La consistencia de las colonias puede variar desde una colonia seca que puede
moverse sobre el agar con el asa, hasta una colonia viscosa que se pega al asa y forma filamentos o hilos
mucosos cuando se trata de separarla del agar..
La superficie puede ser uniformemente brillante y suave o puede ser estriada con muescas
concntricas o quebradas. Al examinar la colonia con luz transmitida puede aparecer con textura
granular o amorfa.
Pigmentacin. Esta caracterstica es muy comn en las bacterias saprfitas en las que las colonias
aparecen rojas, anaranjadas, amarillas, etc. De los microorganismos patgenos uno de los pigmentados
ms importantes es Staphylococcus aureus que tiene un color amarillo dorado. El pigmento no se
aprecia en las clulas individuales a que se debe a grnulos intracelulares muy pequeos para verse con
luz transmitida.
III. MATERIALES Y EQUIPO

Se utilizarn las placas y tubos sembrados en la prctica anterior.
1 mechero Bunsen
2 asa bacteriolgica
62

TRMINOS DESCRIPTIVOS PARA LA MORFOLOGA DE COLONIAS EN LA
SUPERFICIE DE UN MEDIO SLIDO
63
SUPERFICIE
Lisa
Rugosa
Plegada
CONSISTENCIA (probarla con el asa)
Cremosa
Membranosa
COLOR
Se usan trminos comunes para definirlo y se especifica si el pigmento producido
Difusible o no.
CARACTERSTICAS PTICAS
LUZ TRANSMITIDA (observar a travs de la colonia)
Opaca: no permite el paso de luz
Traslcida: Deja pasar la luz sin permitir la completa visibilidad de los objetos
Observados a travs de la colonia.
Transparente: Deja pasar la luz permitiendo ver claramente los objetos observados a travs de la
colonia.
LUZ REFLEJADA (observar la superficie de la colonia)
Opaca
Brillante
CULTIVO EN CALDO
Al igual que en los medios slidos, en los medios lquidos las caractersticas de la
bacteria sembrada se reflejan en las caractersticas que presenta el caldo
Inoculado como son:
Turbidez: Opacidad ms o menos densa, signo de crecimiento.
Pelcula: Crecimiento casi contino sobre el lquido
Sedimento: Depsito de clulas en el fondo del tubo que se resuspende al agitar
Crecimiento en caldo Nutritivo
64
Crecimiento en medio semislido
PRESENTACIN DE RESULTADOS
Anote las caractersticas coloniales de cada cepa en la tabla, basndose en el Texto, las figuras:
AGAR EN SUPERFICIE
Bacteria
Forma
Borde
Elevacin
Superficie
Consistencia
Color
Luz
transmitida
Luz reflejada
CALDO
Bacteria
Pelcula
Turbidez
Sedimento
65
MEDIO SEMISLIDO
Bacteria
Movilidad
IV.
CUESTIONARIO
1. Qu mtodo utilizara para reconocer un cultivo para reconocer un cultivo puro, joven, injuriado y
envejecido.
2. Por qu algunos microorganismos de importancia industrial desarrollan en caldo una caracterstica
de forma de pelcula.
3. Cmo se visualiza el polisacrido extracelular y a qu bacteria puede corresponder?
4. Qu es la prueba de catalasa, cmo se realiza y qu utilidad tiene?
5. Cmo se interpretan los resultados de una prueba de fermentacin de hidratos de carbono?
V.
OBSERVACIONES
VI. CONCLUSIONES
66
PRCTICA
CURVA DE CRECIMIENTO
I.
INTRODUCCIN
Los cultivos bacterianos actan como suspensiones coloidales, absorbiendo y reflejando la luz
que incide sobre ellos. La turbidimetra mide la entidad de luz transmitida por la suspensin,
mientras que la medida de la luz difractada recibe el nombre de nefelometra. Por estos
procedimientos se puede estimar el nmero de bacterias en el cultivo, ya que, dentro de un rango,
la luz absorbida o difractada por una suspensin bacteriana es directamente proporcional a la
concentracin de clulas en el cultivo. El espectrofotmetro es el aparato que se utiliza para la
medida de la luz transmitida. Este aparato proporciona luz monocromtica por medio de un filtro
que permite slo el paso de la longitud de onda elegida. La cantidad de luz transmitida por una
suspensin bacteriana es medida por una clula fotoelctrica e inversamente proporcional a la
cantidad de bacterias. Normalmente la multiplicacin bacteriana no se expresa como disminucin
de la luz transmitida (transmitancia), sino como aumento de la luz absorbida (absorbancia), ya
que esta ltima es directamente proporcional al nmero de bacterias presentes en la suspensin.
La relacin entre la transmitancia y la absorbancia se expresa matemticamente de la siguiente
manera:
Absorbancia = 2 - log % de transmitancia
Para la medida de la luz difractada se emplea e! nefelmetro.
Para el manejo prctico de los cultivos bacterianos en estudios de turbimetria es muy til el uso
de matraces con brazo lateral, ya que permite la realizacin de medidas sin necesidad de tomar
muestras del cultivo, evitando as el riesgo de contaminacin por la manipulacin.
II. OBJETIVOS
1) Determinar los principios generales en un crecimiento microbiano.
2) Realizar una curva de multiplicacin bacteriana.
III. FUNDAMENTO TERICO

Durante el crecimiento celular, todos los constituyentes de la clula aumentan en cantidad, en la
mayora de organismos el crecimiento continuo hasta que la clula se divide en dos nuevas
clulas, proceso denominado fisin binaria. Cada una de las clulas hijas recibe, un cromosoma
completo, copias de todas las macromolculas, monmeros e iones inorgnicos.
67
El intervalo para la formacin de dos clulas a partir de una se llama generacin y el tiempo
requerido para que esto ocurra se llama tiempo de generacin o tiempo de duplicacin,na entre
los microorganismos, algunos crecen rpidamente y se dividen en solo 20 a 30 minutos, otros
requieren de una a tres horas, otros de varias horas o incluso das.
3.1. CURVA DE CRECIMIENTO
Si se inocula un medio liquido con clulas microbianas, procedentes de un cultivo que ha
crecido a saturacin, en el que se ha determinado el nmero de clulas variables por
minuto peridicamente y trazamos una grfica de ello, se obtiene una curva de
crecimiento. Esta curva se divide en cuatro fases fundamentalmente y son las siguientes:
1. Fase de Rezago.- Llamado fase de adaptacin, los microorganismos se encuentran
desprovistos de metabolitos, enzimas y otros constituyentes que deben ser sintetizados
hasta alcanzar concentraciones que permitan que el crecimiento se reinicie.
2. Fase Exponencial.- Llamada fase logartmica, es consecuencia de la divisin celular y
las nuevas clulas crecen en progresin geomtrica, se sintetiza nuevo material celular a
velocidad constante aumentando la masa en forma exponencial.
3. Fase Estacionaria.- Los nutrimentos se agotan y se acumulan productos metablicos
txicos. Aqu cesa el crecimiento de una poblacin.
4. Fase de Declinacin.- Llamada fase de muerte celular en el cultivo, varia con el
microorganismo y condiciones de cultivo, la velocidad de mortalidad aumenta hasta
alcanzar un nivel sostenido.
Fases de Crecimiento
Latencia
Exponencial
Estacionaria
Rezago
Adaptacin
Logaritmo
Divisn celular
Crecimiento
Nutrientes se agotan
Acumulan metabolitos txicos
Sesa crecimiento
Muerte
Declinacin
8,0
Turbidez
(densidad ptica)
Viables
0,5
7,0
0,25
6,0
5,0
0,1
Tiempo
IV. PARTE EXPERIMENTAL

4.1
0,75
MATERIALES Y REACTIVOS
- Cubres
- Cultivo E. Coli sobre un slant de agar nutritivo
- Cubetas
- Caldo Luria Bertani estril
- Jeringa descartable de 10 cc.
- Contmetro
Equipo
- Mechero Bunsen
- Estufa de incubacin a 37C
- Microscopio
- Espectrofotmetro
68
Densidad ptica
Log 10 organismos
viables/ml
9,0
V.
METODOLOGIA
5.1. CRECIMIENTO EN MEDIO LQUIDO
Curva de Crecimiento.- Las clulas que estn creciendo en un cultivo discontinuo (en un
matraz en agitacin) normalmente experimentan cuatro diferentes estadios de crecimiento:
una fase de latencia (lag), una fase de crecimiento estacionado, y una fase de muerte. Las
clulas en fase de latencia, que proceden de una alcuota de un cultivo anterior que ha sido
transferida a un medio nuevo, no crecen en seguida.
Primero tienen que adaptarse al nuevo medio antes de comenzar a crecer a un ritmo
rpido. La duracin de esta fase de latencia depende de numerosos factores: la edad y
genotipo del inculo, de la temperatura, de la concentracin en nutrientes del cultivo viejo
y nuevo, de la aireacin, y de la concentracin de toxinas que pueden haberse formado en
el cultivo viejo.
Una vez que las clulas empiezan a crecer rpidamente, se dice que han entrado en la fase
de crecimiento logartmica (log) o exponencial. En este estadio las clulas crecen
rpidamente, y a diferencia de las clulas de las fases de latencia y estacionaria, la mayora
de las clulas se hallan en el mismo estado fisiolgico. La velocidad de crecimiento durante
la fase log depende del nivel de nutrientes y de la aireacin de cultivo. La constante de
velocidad de crecimiento (u) sirve para definir la velocidad de crecimiento de un cultivo
durante un crecimiento equilibrado: u = In2/g (g es el tiempo medio de duplicacin o
tiempo de generacin).
Conforme se consumen los nutrientes en un crecimiento discontinuo y se van acumulando
productos inhibitorios, la velocidad de crecimiento va disminuyendo, hasta llegar a
detenerse al llegar el cultivo a la fase estacionaria. En la fase estacionaria las clulas no estn
todas en el mismo estado fisiolgico; algunas todava se estn dividiendo mientras que otras
ya han comenzado a morirse. Pero la poblacin total se mantiene constante. Conforme se
agota la mayor parte de los nutrientes, el nmero de clulas que mueren sobrepasa al
nmero de clulas que se producen, y el cultivo entra en la fase de muerte.
Realizacin (Fig. 1)
(Todas las maniobras que se describen a continuacin se deben realizar en condiciones de
esterilidad en las proximidades del mechero.)
1. Aadir solucin salina estril al slant de E. coli hasta cubrirlo completamente (entre 2 y
3 mi) y resuspender las bacterias en la solucin salina por agitacin.
2. Tomar 0.5 ml de la suspensin bacteriana con una pipeta estril y aadirlos a un matraz
con 50 ml de Caldo Luria Bertani estril.
3. Incubar el matraz en un bao termostatado a 37 C, con agitacin (200 rpm).
4. Medir la absorbancia del cultivo a distintos tiempos (longitud de onda aconsejada: (540
nm). Ajustar el espectrofotmetro a 100 % de transmitancia con un tubo conteniendo
Caldo Luria Bertani estril antes de cada medida.
5. Recoger alcuotas de 9 ml del cultivo cada 15 minutos de incubacin y colocadas en
refrigeracin hasta su lectura
6. Dibujar una curva de multiplicacin con los datos obtenidos, colocando en el eje de
abscisas los valores de tiempo y en el de ordenadas los de absorbancia.
69
VII. CUESTIONARIO:
1. Por qu se calibra el espectrofotmetro a 100% de transmitancia con medio de cultivo
estril?
2. Por qu motivo puede ser de alguna forma til conocer la curva de multiplicacin de una
bacteria?
3. Identificar en la grafica las fases del desarrollo microbiano.
70
VIII. OBSERVACIONES
IX. CONCLUSIONES
71
PRCTICA
CONTEO DE CLULAS MICROBIANAS
I.
OBJETIVO
Determinar el recuento directo de clulas microbianas con la cmara de contaje celular.
II. FUNDAMENTO TERICO

Una suspensin celular se caracteriza por presentar un nmero de partculas microscpicas
dispersas en un fluido. Habitualmente ser necesario determinar tanto la densidad de las clulas
en la suspensin como el porcentaje de stas que son viables.
Para determinar la densidad de las clulas se emplean diferentes tcnicas, desde la relativamente
simple cmara de contaje celular de la que existen numerosas variantes, entre ellas la que
empleamos (cmara de Neubauer), hasta equipos automticos de contaje celular como el Cell
Coulter.
Sin embargo, es posible determinar la densidad celular empleando mtodos ms sencillos. Nos
basta con una cmara de contaje celular, por ej. La cmara de Neubauer, y un microscopio. Una
cmara de contaje celular es un dispositivo en el que se coloca una muestra de la suspensin a
medir. El dispositivo presente unas seales que determina un volumen conocido (x microlitros).
Al contar bajo el microscopio el nmero de partculas presentes en ese volumen se pueden
determinar la densidad de partculas en la suspensin de origen.
La cmara de Neubauer es una cmara de contaje adaptada al microscopio de campo claro o al de
contraste de fases. Se trata de un portaobjetos con una depresin en el centro, en el fondo de la
cual se ha marcado con la ayuda de un diamante una cuadrcula como la que se ve en la imagen.
Es un cuadrado de 3 x 3 mm, con una separacin entre dos lneas consecutivas de 0.25 mm. As
pues el rea sombreada y marcada L corresponde a 1 milmetro cuadrado. La depresin central
del cubreobjetos est hundida 0.1 mm respecto a la superficie, de forma que cuando se cubre con
un cubreobjetos ste dista de la superficie marcada 0.1 milmetro, y el volumen comprendido
entre la superficie L y el cubreobjetos es de 0.1 milmetro cbico, es decir 0.1 microlitro.
72
Si contamos las cuatro reas sombreada (L) observando un total de x clulas entre las cuatro
reas, la concentracin en la suspensin celular ser:
Concentracin en la suspensin (clulas / mL) == 10000 (x/4)
En la imagen puedes observar el aspecto de una de las regiones marcadas como L y que en el
microscopio se ven como una cuadrcula de 16 pequeos cuadrados de 0.25 milmetros de lado.
Esta imagen ha sido tomada empleando un microscopio invertido de contraste de fases.
Existen numerosos modelos de cmaras de contaje celular adaptadas a su uso en microscopa. En

la imagen puedes observar una cmara de Neubauer doble, como las que usas en el laboratorio de
prcticas.
El recuento directo al microscopio es tedioso, pero es una forma rpida de estimar la cantidad de
clulas microbianas, sin embargo, tiene algunas limitaciones:
1) No se distinguen las clulas muertas de las clulas vivas.
2) Las clulas pequeas son difciles de ver bajo el microscopio y posiblemente se omitan algunas
clulas.
3) La precisin es difcil de lograr
4) Se requiere un microscopio de contraste de fases cuando no se ha teido la muestra.
73
5) El mtodo no es adecuado para suspensiones de clulas de baja densidad. En el asa de

bacterias, en una suspensin de clulas con menos de 106 clulas por mililitro, se podran ver
pocas o ninguna bacteria.

- Cultivo de E. coli
- Matraz
- Cmara del Neubauer
- Estufa
- Cultivo de levadura
- Pipetas
-Pipeta Pasteur
- Microscopio
IV. METODOLOGA
CARGANDO LA CMARA
Agita la suspensin celular con el vrtex. Aspira una pequea cantidad de suspensin con
una pipeta Pasteur. Deposita una gota pequea en la superficie pulida de la cmara de
recuento cerca del extremo del cubre. La suspensin entrar en la cmara por capilaridad.
Una cmara adecuadamente llenada contiene clulas solo en el espacio contenido entre el
cubre y la cmara de recuento. No debera sobrar fluido que cayera en los surcos.
V.
CUESTIONARIO
1.- Investigue las caractersticas de:

Cmara de cuenta de Petroff Hausser, equipos automticos de Contaje celular, Otros mtodos de
recuento celular
2.- Indique como diferencia las clulas viables de clulas totales.
3.- Describa los mtodos directos e indirectos de contaje celular.
VI. OBSERVACIONES
VII. CONCLUSIONES
74
PRCTICA
AISLAMIENTO DE BACTERIAS POR EL MTODO DE
DILUCIN EN PLACA
I.
OBJETIVOS
Aprender la tcnica de dilucin para el aislamiento y cuenta en placa de diferentes fuentes de inculo.
II. INTRODUCCIN
Dentro del grupo de recuentos microbianos a base de cultivos con formacin de colonias, la tcnica
por vaciado en placa es la ms utilizada. La muestra en cantidades conocidas se deposita en cajas petri
estriles, se adiciona el medio de cultivo fundido a una temperatura de 45C y se mezcla con la muestra.
Despus de la incubacin se cuentan las colonias desarrolladas las que multiplicadas por el inverso de la
dilucin que corresponda permite estimar el nmero de microorganismos viable por gramo o mL de
muestra, obviamente con las condiciones de prueba (medio de cultivo, condiciones fisicoqumicas y
tipo de colonias contadas), el recuento obtenido se referir a determinado grupo de microorganismos.
Esta tcnica permite la mayora de las veces cuantificar la contaminacin en alimentos, medicamentos.
SIEMBRA POR DISEMINACIN (CON ASA DE DIGRASKY).
Consiste en adicionar el medio slido, un inculo que puede oscilar entre 0,2 y 1 ml segn los casos con
una pipeta graduada estril, y posteriormente se extiende con el asa de Digrasky tambin estril. Esta
tcnica se puede utilizar para el recuento de clulas viables, antibogramas, etc.
TECNICA DE SIEMBRA POR DILUCION

Se dispondr de un batera de tubos con medio de cultivo especfico o agua estril segn los casos. Se
adicionar una cantidad de muestra liquida o slida en los tubos sabiendo la cantidad de muestra o
inculo que se aade en el tubo inicial. Se agitar hasta homogenizar. Con la pipeta estril se tomar
una cantidad exacta y se adiciona al segundo tubo, que se homogeniza. Repetimos la operacin anterior
con el tercer tubo y as sucesivamente hasta obtener la dilucin deseada. Con la dilucin obtenida por
75
ej. l0-4 y 10-5 inocular en placas de cultivo una cantidad exacta y extender con el asa de Digrasky
previamente estril. Incubar a temperatura ptima de 24 horas y posteriormente recontar. Existen
muchas variaciones de este mtodo. Una de ellas es hacerlo en medio de cultivo agar, donde se mezcla
en los tubos la muestra y se diluye hasta obtener la dilucin deseada; posteriormente son vertidos en
placas y se le deja solidificar.
III. MATERIAL REACTIVOS

Tubos de rosca, Cloruro de sodio, Gradilla Agar nutritivo, Mechero, Juegos de tincin de Gram, Cajas
Petri, Pipetas de 1 y 10 ml, 1 probeta de 100 ml,
Material que deben traer los alumnos: masking-tape, algodn, gasa, alcohol.
IV. METODOLOGA
SIEMBRA POR DILUCION
Preparacin de reactivos y medio de cultivo:
Solucin isotnica: Pesar 0.09 g de NaCl y disolviendo en 100 ml de agua destilada
Agar nutritivo: Preparar 200 ml de medio siguiendo las indicaciones del reactivo.
Envolver cajas de Petri y pipetas..
Bajo condiciones estriles hacer las diluciones en la solucin isotnica estril, de acuerdo a la figura 1.
Tomar 0.1 ml de la dilucin 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6, 10-7 y colocar en cajas de petri bajo
condiciones estriles. Inocular de la misma manera con las diluciones siguientes
Se realizar el conteo en placa por superficie.
Incubar las cajas en forma invertida a 30C, de 24 a 48 horas.
Considerar las siguientes reglas para la realizacin del reporte de la prctica:
Reglas para conteo en placa. Seleccionar aquellas placas donde aparezcan de 30 a 300 colonias, pues hay
menor error en el conteo.
Contar todas las colonias de la placa. Si el nmero se estima mayor de 300 y no hay diluciones
subsecuentes: 301-500 colonias se divide en dos partes y el nmero de colonias contadas se multiplica
por 2.
501-800 colonias se divide en cuatro partes y el nmero de colonias contadas se multiplica por 4.
>800 colonias se cuentan de 10 a 20 cuadros se promedia y se multiplica por el nmero de cuadros que
ocupa la caja.
El nmero de colonias contadas deber ser multiplicado por el inverso de la dilucin y considerar si la
tcnica fue por vertido o por superficie (debido al volumen de la muestra).
Redondear la cifra obtenida en el recuento de tal forma que haya dos dgitos al inicio de la cifra por
ejemplo: 129 se reporta 130, 2,417 se reporta 2400, 49 se reporta 49
76
Fig. 1
SIEMBRA EN PROFUNDIDAD
Preparar las muestras segn procedimientos recomendados para la preparacin y dilucin de muestras.
Pipetear a placas Petri estriles, alcuotas de 1 ml. A partir de las diluciones, dilucin 10-1, 10-2, 10-3, 10-4,
10-5, 10-6, 10-7.
Agregar inmediatamente a las placas Petri 15 ml de agar nutritivo licuado y temperado a 45C, mezclar
rpidamente con movimientos vaivn y rotacin de la placa; dejar solidificar.
Incubar las placas en posicin invertida a 37 C por 48 horas.
Efectuar el recuento de microorganismos segn:
a) Seleccionar dos placas correspondientes a una dilucin que contenga entre 30 y 300 colonias.
b) Tomar la media aritmtica de dos recuentos y multiplicar por el factor de dilucin utilizada.
Reportar el resultado como numero de m.o. aerobios mesofilos viables por gramo o mililitro, segn
el caso
c) Si las placas de dos diluciones consecutivas presentan recuentos menores que 30 y mayores que
300, tomar el promedio de los dos recuentos y computar el recuento para cada una de las diluciones
y establecer la relacin de los dos recuentos
V.
RESULTADOS
Reportar el nmero de unidades formadoras de colonia/ml de muestra de TODOS LOS
EQUIPOS en una tabla con los resultados de todos los equipos y discutir.
Presentar descripcin de morfologa de colonias y microscpica.
77
VI. CUESTIONARIO
1. Indique la importancia de utilizar el mtodo de dilucin para el aislamiento de
microorganismos.
2. Comparar el mtodo de dilucin con el de estra para el aislamiento de microorganismos.
3. Por qu el nmero de microorganismos es el resultado de multiplicar el nmero de colonias
por el inverso de la dilucin?
4. De los datos obtenidos en la prctica cules cree que sean congruentes y cules no y porque?
5. Por qu la incubacin se realiza con las placas en posicin invertida?
6. Qu finalidad tienen las diluciones y donde se requerirn ms diluciones, en muestra fresca o
procesada, por qu?
VII. OBSERVACIONES
VIII. CONCLUSIONES
78
PRCTICA
AISLAMIENTO
Y
SELECCIN
DE
MICROORGANISMOS DE INTERS INDUSTRIAL
I.
OBJETIVOS
Seleccionar microorganismos de diferentes fuentes, que puedan servir para la obtencin de

metabolitos de inters industrial.
Aplicar tcnicas de purificacin de microorganismos aprendidas previamente en microbiologa
general.
II.
MARCO TEORICO
Las reas de aplicacin de la microbiologa industrial son muy variadas, y de ellas surge la importancia y
el impacto que tiene esta disciplina en la actualidad.
En primer lugar, se debe destacar la importancia de la microbiologa industrial en el mantenimiento de
la salud y tratamiento de enfermedades, fundamentalmente por su aplicacin en la produccin de
compuestos de actividad farmacolgica y de vacunas.
En la industria de alimentos es tambin significativa la aplicacin de la microbiologa industrial, en la
produccin de bebidas, enzimas, saborizantes, productos lcteos y muchas otras aplicaciones.
La produccin agropecuaria se ve tambin favorecida en sus aspectos de produccin vegetal y animal,
por un conjunto variado de procesos microbiolgicos.
El rea de aplicacin en minera est relacionada con la biolixiviacin, o sea, con la aplicacin de
microorganismos en la extraccin de metales de minerales de baja ley.
Finalmente, el rea de servicios se refiere fundamentalmente a la aplicacin de microorganismos en la
purificacin de efluentes, aspecto fundamental para el mantenimiento de la calidad de vida.
Debido a que el xito o fracaso de un proceso fermentativo comienza con el microorganismo utilizado,
para la eleccin del mismo se deben tener en cuenta los criterios generales que se indican a
continuacin:
1. La cepa a utilizar debe ser genticamente estable.
2. Su velocidad de crecimiento debera ser alta.
3. La cepa debe estar libre de contaminantes, incluidos fagos.
4. Sus requerimientos nutricionales deberan ser satisfechos a partir de medios de cultivo de costo
reducido.
5. Debe ser de fcil conservacin por largos periodos de tiempo, sin prdida de sus caractersticas
particulares.
79
6. Debera llevar a cabo el proceso fermentativo completo en un tiempo corto.

7. Si el objetivo del proceso es un producto, ste debera ser de alto rendimiento y de fcil extraccin
del medio de cultivo.
Los microorganismos que se utilizan en un proceso, pueden ser obtenidos por aislamiento a partir de
fuentes naturales o de una coleccin de cultivos. En el mbito industrial, en general, cada firma posee
su propia coleccin de organismos, muchos de los cuales han sido mejorados por medio de tcnicas
clsicas de mutacin o de ingeniera gentica. Sin embargo, estas cepas slo son empleadas por la
industria que las posee, debido al gran valor comercial que representan. En algunos casos se dispone de
organismos modificados genticamente para llevar a cabo reacciones especficas de biosntesis,
degradacin o biocatlisis, los cuales estn protegidos por patentes. Esto significa que un gran
porcentaje de organismos aislados o modificados no est disponible para uso general en laboratorios.
Si el organismo a utilizar es aislado de fuentes naturales, como agua, suelo, plantas y desechos, la
eleccin del material de partida puede hacerse teniendo en cuenta que el organismo exprese en ese
ambiente las propiedades que son de inters.
Por ejemplo, en suelos tratados con pesticidas, se podran encontrar organismos adaptados a la
degradacin de estos productos qumicos; o en larvas de insectos muertos, agentes causales de la
muerte.
Elegida la fuente de aislamiento, las posibilidades de xito dependen de la tcnica elegida para el mismo;
en este caso las alternativas son: a) aislamiento directo, b) enriquecimiento del cultivo con o sin pre
tratamiento de la muestra.
III.
PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
Materiales y Reactivos
Asa.
Hisopos estriles.
Bolsas plsticas 1 l.
Cuchillo.
Caja Petri con agar nutritivo.
Caja Petri con agar papa dextrosa.
Caja Petri con agar YPD con 10 % de
Aceite de oliva.
Incubadora.
Mechero.
Balanza.
Las muestras que se analizarn son tierra, queso y pia.

Procedimiento para tierra
1. Pesar 10 g de tierra y mezclar con 90 ml de solucin salina estril dentro de una bolsa de
plstico; homogeneizar durante 1 minuto.
2. Inocular con el asa calibrada cada una de las cajas de cultivo, por la tcnica de estras, para
tener colonias aisladas.
3. Incubar las cajas de APD a 30 C y de AN a 37 C.
Procedimiento para queso
80
1. Pesar 10 g de queso y mezclar con 90 ml de solucin salina estril dentro de una bolsa de
plstico; homogeneizar durante 1 minuto.
2. Inocular con el asa calibrada cada una de las cajas de cultivo, por la tcnica de estras, para
tener colonias aisladas.
Procedimiento para la pia
1. Mojar un hisopo con solucin salina estril y frotar la superficie de la pia con l.
2. Descargar el hisopo sobre un tercio de la superficie de la caja de cultivo y estriar la descarga
con un asa calibrada para tener colonias aisladas.
Procedimiento para identificar los microorganismos de inters industrial
Dependiendo del uso que se est buscando para los microorganismos y la industria donde se
emplearn, ser el procedimiento a seguir.
1. En el queso se buscarn levaduras con actividad lipasa o esterasa, para eso se inocularn
diferentes colonias por picadura en la superficie de una caja de agar YPD
Con 10 % de aceite de oliva. De ser positivo, se observar un halo transparente, resultado
de la actividad lipasa positiva.
2. Tambin en el queso se buscarn bacterias del genero Lactobacillus cido-lcticas, con potencial
para ser utilizadas para la preparacin de yogur. Se efectuarn las pruebas bioqumicas
pertinentes para su identificacin.
3. En la pia se buscarn hongos del gnero Aspergillus, productoras de cido actico, as como
bacterias cido-acticas para la produccin de vinagre. La identificacin del hongo se har
con base en sus caractersticas macroscpicas y microscpicas, y para las bacterias se harn
pruebas bioqumicas.
4. Con la tierra se seguir el procedimiento dependiendo lo que crezca en la caja de cultivo, ya sea
hongos, levaduras o bacterias. Para el caso de los hongos, se identificarn con base en sus
caractersticas macroscpicas y microscpicas; para las bacterias, se harn pruebas
bioqumicas. En el caso de las levaduras, se observarn las caractersticas morfolgicas de
las colonias y un frotis en fresco al microscopio.
IV.
CUESTIONARIO
1. Mencione cinco industrias en donde se utilizan microorganismos durante los procesos de

fabricacin.
2. Mencione cinco bacterias que son utilizadas en la industria alimentaria, as como el producto o
proceso en el que participan.
3. Mencione cinco levaduras que son utilizadas en escala industrial, as como el producto o
proceso en el que participan.
4. Mencione los lugares donde se pueden encontrar las bacterias del gnero Lactobacillus.
5. Mencione los lugares donde se pueden encontrar hongos del genero Aspergillus.
V.
RESULTADOS
Resultados de las pruebas que se efectuaron a cada una de las colonias.
81
Bacterias
Levaduras
Tierra
Queso
Pia
VI.
OBSERVACIONES
Fotografas de las cajas de cultivo
VII.
CONCLUSIONES
82
Hongos
PRCTICA
AISLAMIENTO Y CULTIVO DEL RHIZOBIUM
I.
OBJETIVO
-
II.
Obtener ndulos de Rhizobium de races de alfalfa.

Observacin microscpica de bacterias de Rhizobium
FUNDAMENTO TERICO
La produccin agrcola basada en leguminosas es fundamental para la alimentacin humana,
especialmente si es en equilibrio con el ambiente. Por ello la interaccin natural de estas plantas
con una bacteria del suelo a nivel de la raz, es ecolgicamente importante, como medida para
evitar el uso excesivo de fertilizantes nitrogenados que deterioran el suelo y contaminan el
ambiente.
La fijacin biolgica del N2, solo se observa cuando la bacteria reconoce a su hospedero, lo
infecta a travs de los pelos radicales para que en la matriz de las clulas corticales induzca una
meiosis y mitosis acelerada que da lugar a un tejido hipetrofiado: El ndulo en el sistema radical
de la leguminosa para entonces Rhizobium ha perdido su pared celular y se ha transformado en
un bacteroide, mientras que por la enzima llamada nitrogenasa fija el N2 y lo convierte en
amonio, que luego transfiere al ribosoma vegetal para la sntesis de protenas vegetales;
simultneamente por la fotosntesis la leguminosa reduce el C02 en carbohidratos que servirn
como fuente de carbono y energa para Rhizobium, y con ella al aumentar la reserva de la
glucosa mantenerlo activo en el ndulo hasta cubrir las necesidades de N de la planta.
Por tanto el uso de inoculantes a base de Rhizobium que reducen la aplicacin de fertilizantes
qumicos al suelo; incrementan el contenido de N en el cultivo vegetal, su peso seco y
mantienen el rendimiento en las leguminosas, lo que en consecuencia al bajar su costo de
produccin y la contaminacin de mantos acuferos y suelos, es vital para una agricultura
sustentable.
83
GRUPOS DE INOCULACIN CRUZADA Y ASOCIACIONES

Grupo de
Inoculacin cruzada
Grupo de alfalfa
Grupo del trbol
DE Rhizobium LEGUMINOSA
Especies de
Gnero
Rhizobium
R. meliloti
R. leguminosarum
biovar trifolii
hospedero
Medicago
Melilotus
Leguminosa
incluida
Alfalfa
Trebol dulce
Trigonella
Trifolium
Alholva
Trbol

Material Biolgico
- Races de alfalfa con ndulos
Matraces
- Placa Petri
- Pinzas bistur
- Mecheros
- Vasos PP 100 ml
Reactivos
- Agua destilada estril
- Hipoclorito de sodio 2.5%
- Bicloruro de Mercurio 0.2%
- Medio PSA (papa sacarsa agar)
IV. METODOLOGA
1. Preparacin del Medio PSA
Sancochar 125 gr de papa pelada con 250 ml de agua destilada, hasta que las papas estn
cocidas.
Filtrar la solucin de coccin y a 100 ml de volumen adicionar 3 gr de sacarosa y 1.2 g agar
agar autoclave 120C 15? Y proceder a plaquear
2. Observacin Microscopia de Bacterias de Rhizobium
-
Obtener los ndulos de Rhizobium de las races de alfalfa.
Caracterizar los ndulos segn posicin en las races, color, forma, tamao.
Lavar con agua destilada los ndulos y realizar diseccin del ndulo sobre un porta
objeto y dejar caer el lquido interno para realizar un frotis.
Fijar el frotis de Rhizobium.
Realizar coloracin Gram
Observacin en el microscopio a 100X
84
3. Cultivo de Rhizobium en Medio PSA

Esterilizacin de ndulos
-
Disponer los ndulos en un matraz de 100 ml
Lavar con etanol 70%, 1 minuto, decantar.
Lavar en hipoclorito de sodio al 2.5% de 5 8 minutos, decantar
Lavar con agua destilada estril 3 veces
Realizar la diseccin del ndulo con la ayuda de pinzas y bistur sobre papel estril.
Dejar caer el lquido interno del ndulo seccionado apretando con la pinza o pasar sobre
la superficie del medio.
Tapar la placa y llevarla a incubar a 26 27C en estufa, 5 das.
V. CUESTIONARIO
-
Qu otros medios se utilizaran para el cultivo de Rhizobium.
Cul es la ruta metablica que utiliza el Rhizobium.
Cul sera la importancia industrial del aislamiento y cultivo de Rhizobium.
VI. OBSERVACIONES
VII. CONCLUSIONES
85
PRCTICA
ANALISIS MICROBIOLOGICO DE AGUAS CONTAMINADAS
I.
FUNDAMENTO TEORICO
La deteccin de microorganismos contaminantes en alimentos y bebidas constituye

una prctica habitual en cualquier laboratorio de Bromatologa. Para ello se utilizan medios
selectivos, indicadores y generales que nos permiten identificar desde el total de bacterias
contaminantes (realmente slo se detecta una cierta parte de la poblacin total) hasta grupos de
bacterias concretas, de especial inters como agentes contaminantes por su posible peligrosidad, o
por tratarse de indicadores de procesos sufridos por el producto durante su manufacturado o
almacenamiento.
II. PROCEDIMIENTO
Por razones prcticas, en este experimento slo vamos a tratar de distinguir la presencia y
cantidad de cuatro posibles tipos de bacterias contaminantes:
Escherichia coli Samonella
typhimurium Proteus morganii
Enterobacter aerogenes.
El mtodo a seguir consistir en efectuar una serie de diluciones decimales del agua contaminada
en solucin fisiolgica, siguiendo el esquema que se representa a continuacin:
0.1 ml
0.1 ml
0.1 ml
0.1 ml
0.1 ml
0.9 ml ClNa 0.9%
MUESTRA
10-1
10-2
10-3
10-4
10-5
A partir de estas diluciones hay que inocular los siguientes medios:

1)
Para recuento de bacterias totales por ml, hay que extender 0.1 ml de las diluciones 105, 10-4 y 10-3 sobre tres placas de agar comn, e incubarlas a 37C durante la noche en posicin
86
invertida. Tras incubar 24 horas se cuenta el nmero de colonias y se multiplica por los factores de
dilucin correspondientes.
2)
Determinacin de bacterias coliformes. Se extiende 0.1 ml de las diluciones
10-5 y 10-4 sobre dos placas de agar MacConkey, incubndolas de la forma descrita. Una vez
crecidas, se cuentan las colonias rojas y las rosceas y se multiplican ambos nmeros por los factores
de dilucin. Una vez efectuado el recuento, se toman varias colonias rojas y/o rosas al azar y se
extiende un inculo denso sobre la superficie de una placa de agar EMB, incubando a
continuacin a 37C durante toda la noche. En este medio, confirmativo para E. coli, esta especie
debe dar lugar a colonias negras con reflejos verdes metalizados, mientras que Enterobacter da
colonias ms rosceas y nunca reflejos. Utilizando este criterio, determinar el porcentaje de E.coli,
sobre el total de coliformes.
3)
Determinacin de Salmonella y Proteus. Se extienden 0.1 ml de las diluciones 10-5
y 10-4 en placas de agar al verde brillante, y se incuban a 37C durante 24-48 horas. Sobre este
medio Salmonella y Proteus generan metabolitos alcalinos que hacen que los alrededores de las
colonias se vuelvan rosa, mientras que los eminentemente fermentadores no crecen o viran hacia el
amarillo (una buena forma de detectar coliformes).
Con estos datos, hay que deducir el nmero de bacterias (por ml) de agua contaminada que
dan colonias rosas. Para confirmar si se trata de Salmonella o Proteus, hay que reinocularlas en
caldo de urea y en TSI. Sobre caldo de urea la estirpe de Proteus debe generar color azul.
Salmonella da negativo para ambas actividades. En TSI nicamente la estirpe de Salmonella
debe aparecer con precipitados negros (por produccin de SH2 que genera sulfuro de hierro),
apareciendo el resto de los caracteres siguientes:
Fondo*
Pendiente
S. typhimurium
A+G
Alcalino
P. morganii
A+G
Alcalino
(*) A indica produccin de cido y G de gas.
III.
RESULTADOS
IV.
OBSERVACIONES
V.
CONCLUSIONES
87
Ennegrecimiento
S
No
FRMULA Y PREPARACIN DE REACTIVOS USADOS EN LAS

DIFERENTES PRCTICAS
1.- SOLUCIN DE AGUA OXIGENADA AL 10%
PREPARACIN
Preparar antes de usarse. Colocar 1 ml de agua oxigenada en 9 ml de agua destilada
2.- COLORANTE DE AZUL DE METILENO AL 5%
PREPARACIN
Azul de metileno
5.0 gr
Agua destilada
100 ml
3.- REACTIVOS DE LA TCNICA DE GRAM
A) COLORANTE CRISTAL VIOLETA
FRMULA:
Cristal violeta
2.0 gr
Etanol al 95%
20 ml
Oxalato de amonio 0.8 gr
Agua destilada
80 ml
PREPARACIN:
1.- Disolver el cristal violeta en el etanol
2.- Disolver el oxalato en el agua
3.- Mezclar las dos soluciones
B) SOLUCION DE LUGOL
FORMULA
Yoduro de potasio
10.0 gr
Agua destilada
20.0 ml
Yodo metlico
5.0 gr
Etanol, aforar a
100.0ml
PREPARACIN:
1.- Disolver el yoduro de potasio en el agua
2.- Agregar el yodo metlico y disolver
3. Aforar a 100 ml con etanol
C) SOLUCIN DE ALCOHOL ACETONA
FORMULA
Acetona
1 volumen
Etanol al 95%
2 volmenes
D) COLORANTE SAFRANINA
FORMULA
Safranina
0.5 gr
Agua destilada
100.0 ml
PREPARACIN
Disolver la safranina en aproximadamente 20 ml de agua, despus aforara a 100 ml con ms
agua.
4.- REACTIVOS DE LA TCNICA DE ZIEHL- NEELSEN
A) COLORANTE FUCSINA FENICADA
FORMULA:
Fucsina bsica 5.0 gr
Fenol 25.0 grs
Etanol al 95% 50 ml
Agua destilada aforar a 500 ml
88
PREPARACIN
1.- Colocar el fenol en 100 ml de agua destilada y calentar en bao a ebullicin
2.- Aadir la fucsina bsica y disolver
3.- Aadir el etanol y mezclar
4.- Aforar la solucin a 500 ml con agua destilada
B) SOLUCIN DE ALCOHOL CIDO
FORMULA
cido clorhdrico 3.0 ml
Etanol al 95 100.0 ml
PREPARACIN
Adicionar el cido clorhdrico al etanol, lentamente y agitando
C) COLORANTE AZUL DE METILENO
FORMULA
Azul de metileno 5.0 gr
Agua destilada 100.0 ml
5.- MEZCLA CRMICA
Dicromatode potasio
cido sulfrico concentrado
Aguadestilada
20.0 gr
20.0 ml.
250.0 ml.
89
BIBLIOGRAFA
BARRETO, Miriam. 1994. Manual Prctico de Microbiologa General. Canoabo
CARPENTER, Philip. 1969. Microbiologa. 2da Edicin. Editorial Interamericana, S.H. Mxico.
PELCZAR. 1990. Microbiologa. 2da Edicin. Editorial. Mc Graw-Hill. Mxico.
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FARRAS, Ramn Pars J. Bioqumica de los Microorganismos. Ed. Revert, S.A., Espaa, 1997.
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PRESCOTT, Lansing M. Microbiologa. McGraw Hill. Interamericana, Espaa 1999.
TORTORA Gerard J. Introduccin a la Microbiologa. Ed. Acribia, S.A. Espaa, 2002.
WAITES, Michael J. Industrial Microbiology: An Introduction, Blackwell Science Ltd, Oxford,
2001.
WARD, Owen P. Biotecnologa de la Fermentacin, Ed. Acribia, S.A. Espaa, 1991.
90

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Nombre del alumno ................................

BIOSEGURIDAD; MICROSCOPIA ........................................................................................ 6

MICROSCOPA ELECTRNICA DE BARRIDO (SEM): VISITA TCNICA

MICROSCOPIA; OBSERVACIN DE MICROORGANISMOS

COLORACION VITAL ..............................................................................................................14

PREPARACIN DE UN FROTIS BACTERIANO: COLORACIONES:

EQUIPO Y MATERIAL DE LABORATORIO, ACONDICIONAMIENTO Y

PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO ..................................................................39

CARACTERSTICAS CULTURALES: MORFOLOGA DE COLONIAS...........61

CURVA DE CRECIMIENTO MICROBIANO ....................................................................67

CONTEO DIRECTO DE CLULAS MICROBIANAS .....................................................72

AISLAMIENTO DE BACTERIAS POR EL MTODO DE DILUCIN EN

AISLAMIENTO Y SELECCIN DE MICROORGANISMOS DE INTERS

AISLAMIENTO Y CULTIVO DEL RHIZOBIUM ............................................................. 83

ANALISIS MICROBIOLOGICO DE AGUAS CONTAMINADAS............................... 86

FRMULA Y PREPARACIN DE REACTIVOS USADOS EN LAS DIFERENTES

La hora de entrada tendr 10 minutos de tolerancia, despus de este tiempo, no

Aprender las normas bsicas de bioseguridad en el laboratorio

II. MARCO TEORICO

2.1.3 VAS DE CONTAMINACIN

Parte ptica del Microscopio:

2.2.2.- USO DEL MICROSCOPIO COMPUESTO

siguiente aumento (45X) y NO el de inmersin. Ponga ntida la imagen nicamente con el

AUMENTOS DEL MICROSCOPIO Y CLCULO APROXIMADO DE

Dimetro del campo microscpico

2.2.4.- CUIDADOS DEL MICROSCOPIO COMPUESTO

III. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

Realice un dibujo del microscopio y seale sus partes?

II. OBSERVACIN IN VIVO DE ORGANISMOS UNICELULARES

III. EXAMEN EN FRESCO DE MICROORGANISMOS

IV. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

Grafique la Observacin y Resultados

Qu ventajas y desventajas ofrece una preparacin en fresco?

2.2.- PREPARACIONES FIJADAS Y COLOREADAS

Secado. Se secar la preparacin al aire.

CLASIFICACIN DE LAS COLORACIONES

c. Tinciones Estructurales. Utilizan ms de un colorante y sirven para poner de manifiesto

3.2. TINCIONES SIMPLES

Grafique la Observacin y Resultados

3.3. COLORACIONES DIFERENCIALES

Qu es un colorante y cules son sus propiedades?

Distinguir las caractersticas macroscpicas y las estructuras microscpicas de los Aspergillus,

II. MARCO TERICO

Preparativos de celulasas comerciales y aplicaciones en procesos extractivos Extraccin de

al aumentar la extraccin de los fenoles debido a la degradacin de los polisacridos

> Penicillium notatum, que es usado para producir la penicilina.

Disolver los componentes antes mencionados y despus se agrega el colorante.

Dibuje e indique las partes del Aspergyllus?

1) Dar a conocer al estudiante las tcnicas para el acondicionamiento y esterilizacin de materiales y

II. MARCO TERICO

ESTERILIZACIN POR RADIACIN ULTRAVIOLETA

III. MATERIALES Y EQUIPO

Material de vidrio: pipetas, palcas Petri

IV. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

c) Preparacin de las placas Petri

II. MARCO TEORICO

REQUERIMIENTOS NUTRICIONALES DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

Es frecuente encontrar peptonas como fuente de nitrgeno que corresponden a pptidos o

RANGOS DE TEMPERATURA PARA EL CRECIMIENTO MICROBIANO

Temperaturas cardinales (C)

EFECTOS DEL PH EN EL CRECIMIENTO MICROBIANO

A.2. MEDIOS SELECTIVOS