Degustao de trechos de livros sugeridos

Tcnicas eletroforticas
Fonte: Wilson & Walker. Principles and Techniques of Biochemistry and Molecular
Biology, 7ed. Page 399Princpios gerais
O termo eletroforese descreve a migrao de uma partcula carregada sob influncia de
um campo eltrico. Vrias biomolculas, como aminocidos, peptdeos, protenas,
nucleotdeos, e cidos nucleicos, possuem grupos funcionais ionizveis e, portanto,
adquirem carga positiva ou negativa em um determinado valor de pH. Assim, quando
submetidos a um campo eltrico, essas partculas carregadas iro migrar para o ctodo
ou nodo, dependendo de sua carga lquida.
O equipamento necessrio para a eletroforese consiste basicamente de dois itens: uma
fonte de tenso e uma unidade de eletroforese. As unidades de eletroforese esto
disponveis em duas formas, as quais permitem realizar migrao na vertical ou na
horizontal. Gis para eletroforese vertical so disponveis comercialmente e so
utilizados rotineiramente para separar protenas em gel de poliacrilamida. O gel
formado entre duas placas de vidro que so mantidas juntas por uma pina, porm
separados por um espaador. O aparato mais comumente utilizado mostrado na Figura
10.1 (ver no livro). As dimenses do gel so tipicamente de 8.5 cm de largura x 5 cm de
altura, com uma espessura de 0.5-1 mm. Um pente de plstico inserido na soluo do
gel e removido aps a polimerizao para formar cavidades (em torno de 10) onde as
amostras so inseridas.
Aps a montagem do aparato, tanto o topo como a base do gel so imersos em soluo
tampo apropriado, o qual importante para manter constante o estado de ionizao das
molculas que esto sendo separadas. Qualquer variao no pH pode afetar a carga
lquida e portanto a mobilidade da partcula.
Para entender como as partculas so separadas necessrio olhar para algumas
equaes simples relacionadas eletroforese. Quando uma diferena de potencial
aplicada (Voltagem, V) atravs dos eletrodos, gera-se um gradiente de potencial (E),
que numericamente igual voltagem aplicada V, dividida pela distncia, d, entre os
eletrodos. Quando o gradiente de potencial, E, aplicado, a fora que age sob a
molcula com uma determinada carga q em coulombs Eq newtons. a fora que
direciona a molcula carregada em direo ao eletrodo de carga oposta. No entanto, h
tambm uma fora oposta (resistncia friccional) que retarda o movimento da molcula
carregada Esta fora/resistncia friccional uma medida do tamanho hidrodinmico da
molcula, da forma da molcula, do tamanho do poro em que a eletroforese est sendo
conduzida e da viscosidade do tampo. A velocidade, v, da molcula carregada no
campo eltrico dada pela equao:
v = Eq
f
onde f igual ao coeficiente de frico/friccional.
Mais comumente, o termo mobilidade eletrofortica () de um on utilizado, o qual
a razo da velocidade de on (v) em relao fora do campo eltrico (v/E).

= v
E
Quando uma diferena de potencial aplicada, molculas com diferenas na carga
lquida iro se separar devido s diferentes mobilidades eletroforticas. Mesmo
molculas com carga similar vo sofrer separao devido s diferenas no tamanho, e
portanto, diferenas na fora friccional experimentada. Como ser visto abaixo, algumas
formas de eletroforese baseiam-se totalmente nas diferenas de cargas para a separao
das molculas, enquanto outros mtodos exploram as diferenas no tamanho da
molcula e baseiam-se nos efeitos de fora friccional para a separao.
Assim, uma vez removido o campo eltrico, quando a primeira molcula atinge o
eletrodo, os componentes da mistura estaro separados no gel de acordo com a sua
mobilidade eletrofortica. As molculas separadas so ento localizadas no gel por meio
de colorao com corantes adequados ou por autoradiografia no caso de amostras
marcadas radioativamente.
A corrente entre os eletrodos majoritariamente conduzida pelos ons contidos no
tampo e uma pequena parcela pelos ons presentes na prpria amostra. A lei de Ohm
expressa a relao corrente (I), voltagem (V) e resistncia (R) da seguinte forma:
V=R
I
Portanto possvel acelerar a separao eletrofortica aumentando a voltagem aplicada,
o que resulta no aumento respectivo da corrente. A distncia percorrida pelo on ser
proporcional corrente e ao tempo. No entanto, o aumento de corrente gera um grande
problema na eletroforese que a gerao de calor.
Durante a eletroforese o potencial (W, watts) gerado dado por:
W = I2R
Grande parte deste potencial dissipada como calor. O aquecimento durante a
eletroforese tem as seguintes consequncias:

Aumento na difuso dos ons contidos na amostra e no tampo levando ao

alargamento das bandas;
Formao de correntes convexas, que resulta na mistura das amostras separadas;
Instabilidade de amostras sensveis ao calor (desnaturao de protenas e,
portanto, perda de atividade enzimtica);
Diminuio na viscosidade do tampo e, portanto, diminuio na resistncia do
meio.

Se uma voltagem constante aplicada, a corrente aumenta durante a eletroforese devido

diminuio da resistncia, e o aumento na corrente aumenta ainda mais o calor
liberado. Por esta razo, utilizam-se fontes de tenso estabilizadas, para que forneam
sempre uma voltagem constante, eliminando flutuaes na migrao devido ao
aquecimento.

Gerao constante de calor um problema. Assim, a soluo seria realizar a eletroforese

em baixa voltagem (baixa corrente) para evitar o aquecimento, mas isso em geral resulta
em separaes pobres devido ao aumento na difuso decorrente de um tempo muito
longo para a separao. Deste modo, em geral, realiza-se a eletroforese em uma
condio de voltagem intermediria/razovel que resulte em uma separao aceitvel
mantendo o aparato em uma condio de baixa temperatura.
Um ltimo fator que afeta a separao eletrofortica o fenmeno de eletroendosmosis
(fluxo eletroosmtico), decorrente da presena de gupos carregados na superfcie do
suporte. Por exemplo, o papel possui grupos carboxlicos, a agarose (dependendo da
pureza) grupos sulfato e a superfcie do vidro utilizado na eletroforese capilar contem
grupos silanis (Si-OH). A Figura 10.3 demonstra como a eletroendosmosis ocorre em
um tupo capilar, embora o princpio seja igual para qualquer outro suporte. Em tubo
capilar, os grupos silanois ionizam em pH >3 criando cargas negativas na superfcie. O
grupo silanol ionizado cria uma dupla camada de cargas.
Gel de Agarose
Agarose uma polissacardeo linear (massa molecular mdia de aproximadamente
12000) constitudo de repeties de unidades de agarobiose, o qual constitudo de
unidades alternadas de galactose e 3,6-anidrogalactose. A agarose um componente do
gar que uma mistura de polissacardeos isolados de algas. Agarose utilizada
normalmente em concentraes de 1 a 3 %. O gel de agarose preparado suspendendose a agarose em gua e aquecendo-se at obteno de um lquido claro. Esta mistura
colocada em uma forma e resfriada at formar um gel. A propriedade gelificante
atribuda formao de pontes de hidrognio inter e intra-moleculares entre as cadeias
de agarose. O tamanho do poro do gel controlado pela concentrao da agarose; sendo
que poros grandes so formados em baixas concentraes e poros menores so
formados em altas concentraes.
Geis de agarose so utilizadas para separaes de protenas e cidos nucleicos. Para
protenas, os poros formados com gel a 1 % so grandes em relao ao tamanho das
protenas. Esses poros grandes so mais adequados para molculas maiores como o
DNA e o RNA. A vantagem e se utilizar o gel de agarose a existncia de agarose de
baixo ponte de fuso (62-65 C). Isso possibilita liquefazer o gel aquecendo-se a 65 C
e recuperando-se, por exemplo, o DNA.

Gel de Poliacrilamida
Eletroforese em gel de acrilamida frequentemente denominada de PAGE, sendo uma
abreviao de polyacrylamide gel electrophoresis.
O gel de poliacrilamida formado pela polimerizao de monmeros de acrilamida na
presena de quantidades pequenas de N,N-methylene-bisacrylamide (normalmente
conhecido como bis-acrilamida) (Fig. 10.5). Note que a bis-acrilamida consiste de duas
molculas de acrilamida ligadas por um grupo metileno e utilizada como agente
formador de ligaes cruzadas.
A polimerizao da acrilamida um exemplo de polimerizao catalizada por radicais
livres, iniciada pela adio de TEMED (N,N,N,N-tetramethylenediamine). TEMED

catalisa a decomposio de ons persulfato em nion sulfato e radical sulfato (uma

molcula contendo eltron desemparelhado).
S2O82- +

e-

SO42- + SO4-

Representando o radical livre como R (onde o representa o eltron desemparelhado), e

M o monmero de acrilamida, pode-se representar a polimerizao da seguinte forma:
R +
RM +
RMM +

M
M
M

RM
RMM
RMMM, etc.

Radicais livres so espcies reativas devido presena do eltron desemparelhado que

necessita obter um eltron para se tornar estvel. R reage com M, formando uma
ligao simples covalente. Ocorre ento um rearranjo dos eltrons na molcula
produzindo um novo radical R-M, o qual igualmente reativo e capaz de atacar um
outro monmero M. Desta maneira, a reao radicalar se propaga produzindo longas
cadeias de acrilamida ligadas entre si ocasionalmente por molculas de bis-acrilamida.
importante mencionar que o oxignio presente em soluo pode sequestrar
(neutralizar) os radicais formados. Portanto recomenda-se desgaseificar a soluo do gel
antes da polimerizao. A desgaseificao tem tambm um segundo intuito que
remover bolhas de ar formadas durante a polimerizao da acrilamida.
A fotopolimerizao uma alternativa para a polimerizao do gel. Neste caso o
persulfato e o TEMED so substitudos por riboflavina e o gel irradiado por 2-3h. A
fotodecomposio da riboblavina gera os radicais necessrios para o incio da
polimerizao.
O gel de poliacrilamida definido em termos de porcentagem total da acrilamida
presente e o tamanho do poro gerado pode ser alterado variando-se a porcentagem de
acrilamida. Os gis de acrilamida podem ser preparados na porcentagem entre 3-30 %
de acrilamida. Baixas porcentagens resultam em gis com tamanho de poro maior.
Eletroforese de protenas
SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulphate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis)
SDS-PAGE o mtodo mais utilizado para anlises qualitativas de protenas. um
mtodo particularmente til para acompanhar a purificao de protenas. Sendo um
mtodo em que protenas so separadas segundo o tamanho, a anlise de protenas por
SDS-PAGE tambm til para a determinao da massa molecular relativa da protena.
O SDS um detergente aninico. Amostras aplicadas no SDS-PAGE so previamente
fervidas por 5 min em tampo de amostra contendo SDS e -mercaptoetanol. O mercaptoetanol reduz as pontes de disulfeto que mantm a estrutura terciria de
protenas e o SDS liga-se fortemente protena desnaturando-a. As protenas presentes
nas amostras so totalmente desnaturadas atravs deste tratamento adquirindo uma
forma alongada em forma de tubo cercada de vrias molculas de SDS ao longo da
cadeia. Em mdia, uma molcula de SDS liga-se a dois resduos de aminocidos. A
4

estrutura nativa original da molcula , portanto, completamente rodeada por molculas

de SDS carregadas negativamente. As estruturas alongadas em forma de tubo so
mantidas graas s repulses entre as cargas negativas que recobrem a cadeia
polipeptdica, o que impede qualquer dobramento da protena de volta sua estrutura
tridimensional. O tampo de amostra tambm contem um corante, o azul de
bromofenol, que permite a visualizao da corrida eletrofortica, e o glicerol, que
aumenta a densidade final da amostra, fazendo com que ela permanea no fundo do
pocinho de aplicao.
Uma vez aplicadas todas as amostras, liga-se a fonte de tenso. importante observar
que a amostra no aplicada diretamente no gel de separao (normalmente em torno
de 5 cm) e sim sob uma camada de gel mais poroso (em geral em torno de 0.8-1 cm)
conhecido como gel de empilhamento. neste gel de empilhamento que se produz as
cavidades onde so injetadas as amostras. O objetivo do gel de empilhamento
concentrar a amostra da protena para formar bandas finas antes de entrar no gel de
separao. Este objetivo alcanado utilizando diferenas na fora inica e no pH entre
o tampo de eletroforese e o tampo do gel de empilhamento e envolve um fenmeno
conhecido como isotacoforese.
O gel de empilhamento possui um poro bem grande (4 % de acrilamida), o qual permite
que as protenas migrem livremente e se concentre sob o efeito do campo eltrico. O
efeito de afinamento da banda baseia-se no fato de que ons glicinato ([glicina]-)
presentes no tampo de eletroforese possuem uma mobilidade eletrofortica menor do
que o complexo protena-SDS ([protena-SDS]-) o qual por sua vez, possui mobilidade
menor que ons cloreto (Cl-) presentes no tampo (loading buffer) e no tampo do gel de
empilhamento. Quando a corrente ligada, todas as espcies inicas precisam migrar
com a mesma velocidade, do contrrio elas funcionariam como breque no circuito
eltrico. O on glicinato pode se mover na mesma velocidade que o cloreto somente se
eles estiverem em uma regio de fora de campo mais forte. A fora de campo
inversamente proporcional condutividade, que proporcional concentrao. O
resultado que as trs espcies de interesse ajustam as suas concentraes [Cl ]>[protena-SDS]>[glicinato]. H somente uma pequena quantidade do complexo
protena-SDS, portanto eles se concentram em uma banda bastante estreita na divisa
entre os ons glicinato e cloreto. Uma vez que o glicinato atinge o gel de separao ele
torna-se totalmente desprotonado devido ao pH mais elevado e ento a sua mobilidade
aumenta (o pH do gel de empilhamento de 6.8, enquanto do gel de separao de
8.8). Portanto, o glicinato deixa para trs o complexo protena-SDS o qual passa a
migrar no gel de separao de acordo com o tamanho de cada protena. O complexo
protena-SDS carregado negativamente migra para o nodo, e como todas as protenas
possuem a mesma carga lquida por unidade de comprimento, elas migram no gel de
separao com a mesma mobilidade. No entanto, medida que eles passam no gel de
separao as protenas de tamanhos diferentes se separam devido s propriedades
peneirantes do gel. De forma simples, quanto menor a protena mais facilmente ela
passa atravs dos poros do gel, enquanto protenas maiores tem sua migrao retardada
pela fora friccional (resistncia) resultante do efeito peneira do gel. Sendo uma
molcula pequena, o azul de bromofenol o que migra com mais facilidade indicando a
localizao da frente da eletroforese.
Quando o corante atinge a extremidade do gel, desliga-se a corrente (fonte de tenso) e
o gel ento removido e colocado em uma soluo de colorao (normalmente utilizase o Coomassie Blue) e depois descolorido utilizando-se uma soluo de descolorao.
A soluo de descolorao remove o corante que no se ligou ao gel, deixando visveis
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as bandas de protenas coradas em azul em um gel transparente. Um minigel leva em

torno de 1 h para o preparo, 40 min para a corrida em 200 V e 1 h para colorao em
azul de coomassie. Fazendo-se uma descolorao rpida possvel visualizar as bandas
em 20 min, porm as bandas so melhor visualizadas aps descolorao por uma noite.
A massa molecular relativa (Mr ou PM, peso molecular) de uma protena pode ser
determinada comparando-se a mobilidade da protena com o de padres de Mr
conhecido. Plotando-se um grfico de log Mr x migrao relativa, constri-se uma curva
de calibrao (curva padro) que permite a determinao da Mr da protena de interesse.
A anlise por SDS-PAGE utilizada para acompanhar a purificao de protena em
cada etapa de purificao. Uma protena pura aparece como uma banda nica no gel, a
no ser que a protena seja constituda por duas subunidades de tamanhos distintos.
Neste ltimo caso, aparecero duas bandas no gel, cada uma correspondendo a uma
subunidade da protena.
Gel nativo
Apesar do SDS-PAGE ser o mtodo mais frequentemente utilizado, ele no serve para
experimentos em que o objetivo seja detectar uma protena (em geral uma enzima) com
base na sua atividade biolgica, pois a protena totalmente desnaturada na anlise por
SDS-PAGE. Neste caso, necessita-se de uma anlise em condies no-desnaturantes
em gel nativo. Para esta finalidade utiliza-se o gel de poliacrilamida (em geral na
porcentagem de 7.5 %), mas tudo feito na ausncia do SDS para no desnaturar a
protena. Nestas condies as protenas possuem carga lquida distinta no pH do gel (em
geral 8.7) e as protenas so separadas de acordo com suas respectivas mobilidades
eletroforticas no gel. Nas anlises em gel nativo difcil predizer o comportamento de
cada protena, mas devido s diferentes cargas e formas, em geral consegue-se uma boa
separao das protenas em uma mistura. A enzima de interesse pode ser identificada
incubando-se o gel em soluo contendo um substrato adequado. Em geral utiliza-se um
substrato que resulte na formao de um produto colorido.
Deteco de protenas no gel
O corante mais comumente utilizado para detectar protenas em um gel o Coomassie
Brilliant Blue R-250 (CBB). A colorao normalmente feita com uma soluo a 0.1
% de CBB em metanol:gua:cido actico glacial (45:45:10). A mistura cido-metanol
serve como um agente desnaturante que precipita e fixa as protenas no gel, evitando
que as protenas sejam perdidas no processo de lavagem do gel. A colorao por CBB
requer em torno de 0.1 ug (100 ng) de protena.
Quando se requer uma colorao mais sensvel que detecte concentraes mais baixas
de protena, utiliza-se a colorao por prata. No processo de colorao o on de prata
(Ag+) reduzido prata metlica na protena, onde a prata se deposita formando uma
banda de cor marrom. A colorao por prata pode ser utilizada imediatamente aps a
eletroforese ou depois da colorao com CBB. A colorao por prata pelo menos 100
vezes mais sensvel que o CBB detectando protenas em torno de 0.001 ug (1 ng).
Outros corantes utilizados so o Sypro Orange (30 ng) e Sypro Ruby (10 ng).

Anlises quantitativas da protena podem ser feitas realizando-se um escaneamento por

densitometria. Existem vrios equipamentos comerciais (Densitmetros, Scanners) que
detectam as bandas atravs do uso de um laser e medindo-se a transmitncia.
Embora a anlise por eletroforese em gel seja um mtodo analtico, em algumas
situaes ela pode ser utilizada para separar ou purificar protenas. Neste caso corta-se a
banda contendo a protena de interesse. Em geral esse procedimento feito para anlises
que requerem quantidade muito pequena de amostra como, por exemplo, para anlises
por espectrometria de massas.