Beruflich Dokumente
Kultur Dokumente
Bioqumica General
Reporte de Prctica N4 Determinacin de Aminocidos terminales con grupo alfa amino
libre Mtodo se Sanger Fonseca Camero Karina, Garca Torres Alba Patricia Grupo:
4QM1 Sec: 2 Fecha de realizacin: 25/09/2015
Objetivos
Identificar el aminocido alfa-amino terminal de las
cadenas de la molcula de hemoglobina mediante el
mtodo de Sanger
Introduccin
El mtodo de 1-fluoro-2,4,dinitrobenceno (DNFB) para la
determinacin en pptidos y protenas de los
aminocidos con el grupo alfa amino libre fue
introducido por F. Sanger La determinacin cosnsite en
la dinitrofnilacin del aminocido N-terminal de la
protena, la eliminacin del DNFB que no reaccion,
hidrlisis de la DNP-protena y de la identificacin del
residuo N-terminal por cromatografa en papel.
Qu hicimos?
Hemolobina+Bicarbonat
o de Sodio+DNFB
Agreamos HCl al 3 N
Agregamos ter
saturado con solucin
acusosa de FeSO4
Colocar en la protena
dinitrofenilada en bao
maria y agitar
Centrifugamos a
3000rpm a 15 minutos
Aadimos HCl al 6N
Despus se calent en
autoclave a 3 horas y 15
libras
Agregamos ter
saturado, en 3 porciones
En papel Whatman, se
realiz una
cormatografa en papel
Utilizando cido ctrico,
citrato de sodio
Se coloc dicho
cromatograma, en una
cmara previamente
saturada con el solvente
Se realz el mismo
procedimiento de
cromatografa para DNPphe, DNP-Asp. Dnp-Val
Despus de 5 horas,
sacamos los
cromatogramas de la
cmara, y se marc el
frente del solvente
Por dicha cromatografa
se identific el residuo Nterminal de la protena
hemoglobina
Para qu?
Para que reactivo de DNFB
reaccione con la protena, se
tiene que llevar a cabo en
condiciones alcalinas
Para detener la reaccin
Para obtener la fase acuosa
de la solucin
Resultados:
4.-DNF
5.-Poblema
Conclusiones
Frmula
Rf (Relacin de frentes)=
Compuesto
Fs
Rf
DNP- Phe
24 cm
24
32=0.75
DNP- Val
28.3 cm
28.3
32=0.88
DNP-Ala
24.5 cm
24.5
32=0.76
DNF
19 cm
19
32=0.59
Problema
26.9 cm
26.9
32=0.84
Anlisis de resultados:
Mediante el mtodo de Sanger se determin
experimentalmente el grupo amino libre de la molcula
hemoglobina mediante una cromatografa en papel para
su identificacin con aminocidos dinitrofenilados como
referencia junto con nuestro producto hidrolizado, de
acuerdo con la bibliografa la hemoglobina est
conformada por cuatro polipptidos: dos cadenas alfa y
dos cadenas beta. Cada cadena alfa est constituida por
141 aminocidos y la valina es el aminocido con el
grupo alfa amino libre, es decir el amino terminal y la
cadena beta contiene 146 aminocidos tambin con la
valina con el el grupo alfa amino libre..(3)
Lo que se obtuvo en los valores de Rf que en
comparacin con nuestro problema el valor ms alto fue
el de la valina lo que indica que mediante este mtodo
se pudo llegar a la determinacin el amino libre de la
hemoglobina, no se necesit de un indicador debido a
que el reactivo de Sanger es de color amarillo por lo que
se distinguen bien.
Bibliografa
1. http://themedicalbiochemistrypage.org/es/pr
otein-structure-sp.php, Estructura de las
protenas , consultado 29 septiembre 2015
2. https://www.clubensayos.com/Ciencia/Pr
%C3%A1ctica-No-1-Determinaci%C3%B3nDe-Amino%C3%A1cidosTerminales/1101801.html Determinacin de
aminocidos
terminales.
septiembre 2015
Consultado
29