Abstracto

la liberacin de GnRH en la eminencia mediana (ME) es la salida central para el control de

la reproduccin. procesos de GnRH en el rea preptica (POA) tambin liberan GnRH.
Examinamos la regulacin especfica de la regin de la secrecin de GnRH usando explorar
discos voltametra cclica para detectar la liberacin de GnRH en secciones de cerebro de
ratones machos adultos. El bloqueo de la recaptacin de calcio del retculo endoplsmico
para elevar el calcio intracelular provoca una liberacin de GnRH, tanto en el ME y el
POA. Esta liberacin es dependiente del potencial de accin en el ME, pero no el POA. Se
aplica localmente kisspectina inducida por la secrecin de GnRH, tanto en el ME y el POA.
Bloqueo local de la liberacin de calcio mediada por inositol trifosfato-inhibe la liberacin
de GnRH kisspectina inducida en el ME, pero se requiere un amplio bloqueo en el POA.
Por el contrario, la secrecin kisspectina evocada en el POA fue bloqueado por la hormona
gonadotropina inhibitoria local, pero se requiere una amplia aplicacin de la hormona
gonadotropina inhibitorio en el ME. Aunque se requieren potenciales de accin para la
liberacin de GnRH inducida por el aumento de calcio intracelular farmacolgicamente en
el ME y la liberacin evocada kisspectina requiere la liberacin de calcio mediada por
inositol trifosfato, el bloqueo de los potenciales de accin no inhibi la liberacin de GnRH
kisspectina inducida en el ME. La liberacin de GnRH inducida por Kisspeptina fue
suprimida despus de bloquear ambos potenciales de accin y de la membrana plasmtica
de Ca 2 + canales.Esto sugiere que la accin kisspectina en el ME requiere tanto el aumento
de calcio intracelular y la afluencia desde el exterior de la clula, pero no los potenciales de
accin. interacciones locales entre los procesos Kisspeptina y GnRH en el ME podran
estimular as la liberacin de GnRH sin la participacin de las regiones perisomtica de las
neuronas GnRH. El acoplamiento entre la accin potencial de generacin y liberacin de la
hormona en las neuronas de GnRH tanto, es probable fisiolgicamente lbil y puede variar
con la regin.
neuronas GnRH forman la va comn final para el control central de la reproduccin. Esto
se logra a travs de la secrecin episdica de GnRH cerca de vasos portales en la eminencia
media (ME) para regular la pituitaria anterior ( 1 , 2 ).Adems de esta salida
neuroendocrino bien establecida, la evidencia reciente indica que la GnRH se libera
tambin en otras regiones del cerebro, especficamente en el rea preptica (POA) ( 3 ).Esta
ltima observacin es consistente con un informe reciente de la liberacin perisomtica en
cultivos de neuronas GnRH de primates ( 4 ) y con los informes de que la GnRH tiene
funciones neuromoduladores centrales, adems de la funcin neuroendocrina ( 5 , 9 ).Central de GnRH se ha postulado para participar en sincronizacin directa de la red de
neuronas GnRH, en la regeneracin de potencia local en las neuronas de GnRH, y en la
alteracin de la conducta sexual ( 10 , - 12 ).
la liberacin del pptido tambin se ha observado a partir de las dendritas / soma de las
neuronas neuroendocrinas magnocelular situados en el ncleo supraptico. La funcin
neuroendocrina de estas neuronas es la liberacin de vasopresina y la oxitocina de
terminales en la pituitaria posterior ( 13 ).Curiosamente, la liberacin dendrticas parece
estar regulada de manera independiente de la secrecin a la sangre y el uso de diferentes
mecanismos. En concreto, grandes vesculas de ncleo denso que contienen pptidos

pueden ser liberados de una manera independiente de potencial de accin que requiere un
aumento de los niveles intracelulares de Ca2 + y puede ser iniciado por la sealizacin que
surge de las interacciones de ligandos con los receptores metabotrpicos ( 14 , 17 ).Neuronas neuroendocrinas parvocelulares, incluyendo las neuronas GnRH, no se han
estudiado en este sentido, pero muchos neuromoduladores se han reportado para regular la
liberacin de GnRH ( 18 ).De estos, kisspectina es uno de los activadores ms potentes, y la
hormona gonadotropina inhibitoria (GnIH) es uno de los inhibidores ms
potentes. Neuronas GnRH expresan el receptor kisspectina (kiss1r) y estn fuertemente
despolariza por kisspectina ( 19 , 20 ).Administracin Kisspeptina aumenta la liberacin de
GnRH y de este modo aumenta la secrecin de la LH pituitaria de gonadotropina (
21 ).GnIH puede actuar a travs de G-receptor acoplado a protena 147, que se expresa en
el centro, as como en la pituitaria. En rodajas de cerebro, GnIH inhibe la accin de las
neuronas GnRH potencial de tiro, incluso en presencia de kisspectina ( 22 , 23 ).Si las
interacciones de pptidos tambin son distintos para diferentes regiones del cerebro
requiere un mtodo suficientemente sensible que puede ser dirigido visualmente a sitios
especficos. Se adapt un mtodo electroqumico, voltametra cclica de barrido rpido
(FSCV), para la deteccin de la GnRH directamente en rodajas de cerebro de ratn (
3 ).Usando FSCV, tanto POA y ME liberacin puede ser detectado, lo que permite estudios
de los mecanismos de liberacin subyacente en estas regiones. Aqu, nosotros usamos
FSCV para investigar la accin potencial de dependencia, la dependencia de calcio, y
neuropeptidrgico (kisspectina y GnIH) regulacin de la secrecin de GnRH en el ME y el
POA.
Ir:
Materiales y mtodos
Animales y preparacin de cortes de cerebro
Adultos de 40 a 90 das de edad protena GnRH-gnada masculina mejorada intacta verde
fluorescente (GFP) ratones ( 24 ) y los ratones knockout (kisspectina generoso regalo del
Dr. Yee-Ming Chan y el Dr. Stephanie Seminara, Massachusetts General Hospital) ( 25 )
fueron alojados bajo una luz de 14 horas, 10 horas oscuridad fotoperodo (luces encendidas
a las 3 am) con Harlan 2916 chow y agua disponible ad libitum.Todos los procedimientos
fueron aprobados por la Universidad de Michigan, el Comit de la Universidad de Uso y
Cuidado de los Animales.
preparacin de cortes de cerebro
Todos los productos qumicos fueron adquiridos de Sigma Chemical Co menos que se
indique. Los ratones fueron decapitados, y cortes de cerebro se prepararon como se
describe ( 26 , 27 ).Todos los tampones se burbuje con 95% O2 / 5% de CO 2 15 minutos
antes de su uso.Sagital rodajas de cerebro de 300 micras se cortaron utilizando un
vibratomo Leica VT 1200S (Leica Biosystems) en helado de solucin salina que contiene
sacarosa: 250 mM de sacarosa, 3,5 mM de KCl, 26 mM NaHCO3, 10 mM de D-glucosa,
1,25 mM NaH 2 PO 4, 1.2 mM MgSO4, MgCl2 y 3,8 mm.Las rebanadas se incubaron 30
minutos a temperatura ambiente en una mezcla 1: 1 de solucin salina sacarosa y el lquido

cefalorraqudeo artificial (ACSF) que contiene: 125 mM NaCl, 3,5 mM KCl, 26 mM de

NaHCO3, 1,25 mM NaH 2 PO 4, 2,5 mM CaCl 2, 1,2 mM MgSO 4, y 10 mM de Dglucosa (pH 7,4), despus se transfirieron a 100% ACSF y se incubaron 30-300 minutos a
temperatura ambiente antes de estudio.En nuestra experiencia, las secciones de cerebro son
viables durante al menos 8 horas.
De barrido rpido voltametra cclica
rebanadas individuales se transfirieron a una cmara de grabacin montado en la etapa de
un microscopio vertical (Olympus BX50WI; Opelco). La cmara se perfundi
continuamente con ACSF a una velocidad de 5-6 ml / min a 31 C-32 C. Las rebanadas
se estabilizaron en la cmara durante al menos 10 minutos antes de la grabacin. Deteccin
de GnRH se control usando microelectrodos de fibra de carbono (CFM) fabricados como
se ha descrito previamente ( 28 ).FSCV grabaciones fueron hechas en el modo de fijacin
de voltaje de un amplificador USB EPC-10 corriendo Patchmaster (HEKA Elektronik) en
un ordenador Macintosh Mac Pro (Apple Computers). Potencial de electrodo se escane
continuamente 0,5-1,45 V a 400 V / s cada 100 ms ( Figura 1 C).las neuronas de GnRHGFP fueron identificadas mediante una breve iluminacin a 470 nm. CFM fueron colocados
entre los terminales de las neuronas GnRH en el ME o cerca de GnRH aposiciones de fibrafibra en el POA ( Figura 1 ).
Figura 1.
Ilustracin de la configuracin experimental con las posiciones relativas de electrodo para
sitios FSCV e inyeccin en el ME (A) y el POA (B).
Diseo experimental
El diseo general de los experimentos fue el siguiente. El protocolo de voltaje para la
deteccin de GnRH se realiz durante 10-15 minutos despus de CFMs se colocaron en el
tejido antes de la recogida de datos para permitir grabaciones se estabilice. Release se
registr de forma continua durante la duracin de cada experimento, durante el cual una
variedad de tratamientos se aplicaron por breve (10-20 s) de inyeccin local (3-5 l de una
jeringa de 25 l Hamilton) a travs de una pipeta colocada 20-30 micras de la CFM usando
3stos se especifican para cada estudio a continuacin. Al final de cada grabacin, la
viabilidad de la rebanada y la capacidad de detectar GnRH se confirm la aplicacin de 20
mM KCl 20 minutos despus del tratamiento experimental final. Slo rebanadas que
liberan GnRH en respuesta a KCl se incluyen en el anlisis (~ 90%).
En primer lugar, se investig el Ca2 + y la accin potencial de dependencia de la secrecin
de GnRH en ME vs POA. La inyeccin local de thapsigargin (5M; Tocris Biosciences) o
cido ciclopiaznico (CPA 10M) se utiliz para elevar los niveles de calcio citoplsmico (
29 , 30 ).Ambos medicamentos bloquean Ca 2+ la recaptacin en el retculo endoplsmico
mediante la inhibicin de la ATPasa de transporte de calcio del retculo sarcoendoplasmic
(SERCA) bombas y aplicaciones breves como se usa aqu, tienden a aumentar el calcio
intracelular.Para probar si varios comunicados podran ser inducidos, thapsigargina o CPA

se inyect a intervalos de 20 minutos. Para probar el requisito para la accin potencial de

generacin, thapsigargina se inyect en condiciones de control, a continuacin, la rodaja se
ba con 0.5M tetrodotoxina (TTX) (Calbiochem) durante 5-10 minutos para bloquear los
potenciales de accin de los canales de sodio dependientes y liberacin en respuesta a
thapsigargina inyeccin a prueba de nuevo. Para probar el requisito para la liberacin
kisspectina, la capacidad de CPA para inducir la liberacin de GnRH en el ME se prob en
ratones knock-out kisspectina (KO). POA estudios no se realizaron en ratones KO
Kisspeptina porque se requiere GFP para apuntar a los CFM en el POA y GFP no se
expresa en las neuronas GnRH en esta lnea de ratn.
A continuacin, para probar los efectos de neuromoduladores sobre la liberacin de GnRH
del POA y ME, kisspectina 10 nM (Phoenix Pharmaceuticals) solo o en combinacin con
1M GnIH (Phoenix) se inyect de forma local en la divisin. Kisspeptina solo se inyect
de manera similar durante la aplicacin del bao de 1M GnIH. El intervalo entre los
tratamientos fue de 10-15 minutos.
A continuacin, se investig el papel de Ca 2 + movilizacin intracelular en la liberacin de
GnRH kisspectina evocada en el POA y ME. Hemos bloqueado inositol trifosfato (IP3)
mediada por la liberacin de Ca 2+ desde el retculo endoplsmico con xestospongin C
(XC) (20M Tocris).Kisspeptina se inyect de forma local 3 veces en 10 a intervalos de 15
minutos: en condiciones de control (slo kisspectina), con la inyeccin local de XC, y
despus de lavado de XC. En algunos estudios en el POA, kisspectina se inyecta localmente
en condiciones de control y durante la aplicacin del bao de XC (5M). Para probar los
posibles efectos fuera de la meta de XC sobre la secrecin de kisspectina evocados, se
utiliz Cd2 + para poner a prueba si el bloqueo de los canales de Ca2 + impedira
kisspectina de estimular la liberacin de GnRH.Kisspeptina se administr localmente tanto
en el POA y el ME en condiciones de control y en presencia de bao aplicado 200M Cd
2+.Esto fue seguido por 20 minutos de perodo de lavado, a continuacin, 20 mM KCl se
utiliz para probar la viabilidad rebanada.
Para determinar si la liberacin de GnRH kisspectina evocada en el ME era dependiente del
potencial de accin, 3 inyecciones Kisspeptina locales se realizaron a intervalos de 10 a 15
minutos: en condiciones de control y, a continuacin, en presencia de bao-aplicado TTX
(0.5M, 3- 4 min antes de la segunda inyeccin kisspectina), y luego en la presencia tanto
de TTX y el bloqueador de los canales de calcio Cd 2+ (200M 3-4 min antes de la
inyeccin tercera kisspectina).
Anlisis
FSCV datos fueron convertidos a formato de texto general utilizando Igor Pro
(Wavemetrics) y luego analizados utilizando el software Demon (generosamente
proporcionada por Jordan Yorgason, Rodrigo Espana, y Sara Jones, Wake Forest University
Ciencias de la Salud) como se ha descrito previamente ( 3 , 28 ).voltametracclica (CV) se
resta el fondo por un promedio de 10 barridos del fondo. Un ejemplo de la curva de CV
obtenido en la corriente de pico de la liberacin de GnRH kisspectina evocados se muestra
en la Figura 1 D. Para verificar la identidad de un pico como la liberacin espontnea de
GnRH, 5 CV de control recogidos despus de la GnRH se inyectaron en una rebanada se

promediaron.Cada putativo GnRH CV se correlacion con este promedio y se consider

que era GnRH si R 2 0,8.Este umbral se establece para permitir la variabilidad del
electrodo. Un total de 92% de CV pas esta prueba. Se estimaron los cambios en la
concentracin de GnRH basndose en la calibracin del MFC en 5M GnRH.
Los datos se transfieren a Prism5 para el anlisis estadstico (GraphPad Software). Los
parmetros medidos incluyeron la duracin de liberacin evento, cambio de concentracin
de GnRH, el retraso de la liberacin de GnRH despus de cada tratamiento farmacolgico,
y el porcentaje de tratamientos que resultan en la secrecin de GnRH evocados. Los datos
se analizaron mediante pruebas paramtricas o no paramtricas ANOVA segn lo dictado
por la distribucin de datos, seguido de post-hoc de dos colas anlisis. Los datos se
presentan como media SEM, y P <0,05 fue considerado significativo.
Ir:
resultados
Ca2 + intracelular liberacin de GnRH -evoked es dependiente del potencial de accin slo
en el ME
Mecanismos que conducen a la neurosecrecin pueden diferir entre dendrticas / somtico y
regiones terminales ( 31 ).Se utiliz una breve exposicin a 5M thapsigargina inyectados
localmente en el ME o POA como se ilustra en La Figura 1 , A y B, para provocar la
liberacin.Tapsigargina bloques de Ca2 + de la recaptacin en el retculo endoplsmico por
las bombas de SERCA inhibir, y breves aplicaciones como se utiliza aqu tienden a
aumentar el calcio intracelular ( 14 , 32 , 33 ).Thapsigargina se inyect por primera vez
bajo condiciones de control y luego despus de bloquear los potenciales de accin
dependientes de sodio con TTX (0.5M, lnea de tiempo; Figura 2 A).Thapsigargin
inducida de forma fiable la liberacin de GnRH, tanto en el POA (n = 7 de 7 ensayos) (
Figura 2 , B y F) y ME (n = 5 de 5 ensayos) ( Figura 2 , C y F) en condiciones de
control.inducida por la liberacin thapsigargina persisti en el POA con magnitud y
duracin similar despus de tratar en el sector con TTX para bloquear los potenciales de
accin. ( Figura 2 , B y F).En marcado contraste, los potenciales de accin de bloqueo
inhibidas thapsigargin inducida por la liberacin de GnRH en el ME ( Figura 2 , C y F).
Figura 2.
El aumento de Ca2 + intracelular mediante el bloqueo de las bombas de SERCA induce la
liberacin de GnRH en el POA y ME, pero requiere los potenciales de accin nica en el
ME.
Para probar si la falta de respuesta a una segunda aplicacin de thapsigargina en el ME se
debi a la incapacidad de thapsigargina para obtener las liberaciones repetidas,
thapsigargina ( Figura 2 , D y E) o CPA, un frmaco con el mismo mecanismo de accin (
Figura 2 E), se inyect repetidamente en condiciones de control (es decir, no TTX).Tanto
thapsigargina (n = 3) y CPA (n = 4) provocado la liberacin de GnRH repetida similar en el
100% de los ensayos en el ME sin disminucin, ya sea en la amplitud o la duracin. Ni el

cambio de concentracin de GnRH ni duracin de la liberacin en respuesta a thapsigargina

diferan entre las regiones ( Figura 2 F).El requisito de que los potenciales de accin para el
aumento del calcio intracelular inducida por el bloqueo de la recaptacin de retculo
endoplsmico para inducir la liberacin de GnRH sugiri la posibilidad de que Ca2 + fue
elevado en una celda de aguas arriba de la propia neurona GnRH y que celular aguas arriba
necesaria para generar potenciales de accin para liberar un mediador posterior para inducir
la liberacin de GnRH.Para probar la hiptesis de que este mediador intermedia era
kisspectina, la capacidad de CPA para inducir la liberacin de GnRH en el ME se prob en
ratones KO kisspectina (en ausencia de TTX). CPA liberacin de GnRH inducida por
repetidas veces en ratones knockout kisspectina en el ME ( Figura 2 G), aunque el cambio
de concentracin de GnRH en respuesta a CPA fue menor que en respuesta a kisspectina (
Figura 2 G).En conjunto, estos datos sugieren que la secrecin de GnRH en respuesta a un
aumento de Ca intracelular 2+ puede ser del potencial de accin independiente en el POA.
bloques GnIH locales kisspectina inducida por la liberacin de GnRH en el POA, pero se
requiere la aplicacin de bao GnIH en el ME
A continuacin examin los efectos de 2 moduladores de accin establecidas neuronas
GnRH potencial de fuego, y kisspectina GnIH, sobre la liberacin de GnRH ( 19 , 22 ).La
liberacin de GnRH en respuesta a kisspectina 10 nM se control tanto en el ME y el POA
cuando se administran solos, a continuacin, despus de la inyeccin local de 1M GnIH,
y, finalmente, despus de la aplicacin del bao de GnIH ( Figura 3 A).Para minimizar los
efectos de la kisspectina en la red neuronal aguas arriba de las neuronas GnRH, kisspectina
siempre se aplica localmente a travs de la inyeccin breve directamente a la
divisin. Tanto en el POA (n = 7 de 7) y ME (n = 6 de 7), y en repetidas ocasiones
kisspectina potentemente inducida por la secrecin de GnRH ( Figura 3 ).No hubo
diferencias en ninguno de duracin del evento o cambio de concentracin entre las regiones
o con la aplicacin repetida ( Figura 3 , D-F).En el POA, coapplication local del GnIH
bloquea la liberacin de GnRH en 5 de 7 intentos. Por el contrario, GnIH local no puede
bloquear la liberacin de GnRH kisspectina inducida en los 6 ensayos en el ME. Esto
sugiere que los receptores GnIH no estn cerca del sitio de la aplicacin del frmaco en el
ME o que GnIH es ineficaz en el bloqueo de la liberacin de GnRH en esta regin. Para
probar si la aplicacin generalizada de GnIH podra bloquear la liberacin de GnRH
inducida por la inyeccin local de kisspectina, GnIH se aplic bao. Bao-aplicado GnIH
bloque completamente la secrecin de GnRH kisspectina evocada en ambas regiones del
cerebro, lo que indica que este tratamiento es eficaz y el apoyo a la hiptesis de que los
receptores no se encuentran dentro de la zona de aplicacin local de frmacos eficaces en el
ME (n = 6 cada uno) ( Figura 3 , D-F).Tambin es posible que las diferencias entre los
tratamientos localmente y bao-aplicado pueden reflejar diferencias estructurales entre las 2
regiones cerebrales que alteran las tasas de difusin / rango espacial de agentes
farmacolgicos aplicados localmente, pero es difcil de abordar este problema de forma
experimental.
Figura 3.
El neuropptido modulacin de la secrecin de GnRH en el ME y el POA.

Kisspeptina-evoc la secrecin de GnRH requiere tanto la movilizacin de Ca2 +

intracelular y extracelular tiendas influjo de Ca2 +
En la siguiente serie de experimentos, se investig la interseccin entre neuromoduladores
y la movilizacin de calcio intracelular. Actos kisspectina a travs de un receptor acoplado
a Gq, el agotamiento de fosfatidilinositol 4,5-bifosfato (PIP2) y diacilglicerol la activacin
y la produccin de IP 3 ( 34 ); cualquiera de estos mecanismos podra alterar la liberacin
de GnRH.Para probar la hiptesis de que la secrecin de GnRH inducida por kisspectina
requiere la liberacin de Ca2 + intracelular de las tiendas, se utiliz para bloquear XC IP3
liberacin dependiente de Ca2 + ( Figura 4 A).La administracin local de 20M XC
impedido en gran medida kisspectina de provocar la secrecin de GnRH en el ME
(liberacin observada en 1 de 6 casos), pero no POA (liberacin observada en 5 de 5 casos)
( Figura 4 ).Para probar la posibilidad de que los objetivos en el XC POA son distal al sitio
de aplicacin kisspectina, XC (5M) fue aplicado bao. Bath-aplicado XC totalmente
bloqueado kisspectina inducida por la secrecin de GnRH en los 7 rebanadas ensayadas (
Figura 4 , F-H).Estos resultados sugieren que se necesitan medidas de movilizacin de Ca2
+ intracelular en la secrecin de GnRH kisspectina evocada tanto en el ME y el POA. Por
otra parte, la distribucin espacial de los objetivos XC (lo ms probable retculo
endoplsmico), receptores Kisspeptina y / o sus mediadores abajo, y los sitios de liberacin
de GnRH diferencia entre el POA y ME. Una de las advertencias de XC es que las mismas
concentraciones que bloquean la liberacin de IP3 desde el RE pueden tener efectos fuera
de la meta, incluyendo la inhibicin de Ca 2 + dependientes de voltaje y los canales de K +
( 35 ).La inhibicin del turismo probablemente despolarizar potencial de membrana y
aumentar la probabilidad de liberacin, por tanto, una inhibicin fuera del objetivo de K +
dependientes de voltaje canales por XC tenderan a tener el efecto contrario al observado
aqu.De inters, kisspectina inhibe los canales de potasio dependientes de voltaje en las
neuronas de GnRH ( 36 ), que pueden estar relacionados con la estimulacin de la
liberacin de GnRH en el presente estudio.Para probar si el bloqueo de la membrana celular
Ca 2 + canales sin un efecto directo sobre intracelular de Ca 2 + tiendas impedira
kisspectina de la induccin de la secrecin de GnRH, que kisspectina aplica localmente
tanto en el POA y el ME de rebanadas baado en ACSF que contiene 200M Cd 2 + un
bloqueador de Ca 2+ canales.En estas condiciones, kisspectina siendo estimulado la
liberacin de GnRH en el ME, pero la autorizacin fue de menor amplitud ( Figura 4 , I y
J).Esto sugiere que trabaja en el XC ME ms probable es que a travs del bloqueo de IP 3
Ca 2 + -dependiente lanzamiento.En el POA, sin embargo, Cd2 + impidi la liberacin de
GnRH kisspectina inducida ( Figura 4 I).Esto sugiere adems las diferencias regionales
entre el POA y el ME, pero deja abierta la posibilidad de que en el POA bloques XC
liberacin kisspectina inducida a travs de dos mecanismos intracelulares y de la membrana
celular. El compuesto 2-aminoethoxydiphenylborane, que entre sus acciones pueden
bloquear IP3 mediada por la liberacin de Ca2 + en las tiendas, no puede ser probado en
nuestro entorno experimental debido a su profunda ensuciamiento del CFM que impeda la
deteccin de GnRH (datos no mostrados).

Figura 4.

El bloqueo farmacolgico de la liberacin de trifosfato de inositol dependiente de Ca2 +

intracelular reduce la secrecin de GnRH inducida por kisspectina.
Por ltimo, se investig si la liberacin inducida por kisspectina requiere la generacin de
potenciales de accin. Esto fue probado slo en el ME, porque la liberacin inducida por el
aumento de Ca2 + intracelular Fue slo potencial de accin dependiente en esta
regin.Kisspeptina (10 nM) se inyect de forma local en el ME antes y durante el
tratamiento con TTX ( Figura 5 A).En 10 de 10 rebanadas, kisspectina todava evocaba la
secrecin de GnRH cuando los potenciales de accin fueron bloqueadas ( Figura 5 , BD).Para probar si el bloqueo de la membrana celular dependientes de voltaje canales de Ca2
+, adems de los potenciales de accin inhibe la liberacin de GnRH kisspectina inducida,
se repiti el experimento en presencia de 200M Cd 2+.Este tratamiento bloqueado
kisspectina induccin de la secrecin de GnRH en el ME (n = 5 de 5) ( Figura 5 , B-D), lo
que sugiere que el Ca 2 + de ambos depsitos intracelulares y exterior de la clula subyace
en la secrecin de GnRH inducida por kisspectina.
Figura 5.
El bloqueo de los dos potenciales de accin y los canales de calcio dependientes de voltaje
de membrana soma impide la liberacin de GnRH kisspectina inducida en el ME.
Ir:
Discusin
Secrecin pulstil de GnRH desde el ME en la vasculatura portal hipofisaria es un motor
esencial de la funcin reproductora y liberacin local de GnRH en el POA puede servir a
una variedad de papeles neuromoduladores.Poco se sabe, sin embargo, acerca de los
mecanismos que subyacen a la liberacin en el ME vs POA. Aqu, se utiliz una FSCV, un
detector localizado de la liberacin de GnRH ( 3 , 37 ), en combinacin con la
administracin localizada de neuromoduladores y / o agentes para alterar la sealizacin
intracelular directamente.Demostramos tanto similitudes como diferencias en la regulacin
especfica de la regin de la liberacin de GnRH que pueden ser atribuibles a la posicin
relativa de los receptores de la superficie celular y sitios de liberacin de GnRH, as como a
la sealizacin hacia y dentro de las neuronas GnRH.
Estudios de microscopa electrnica indican que la GnRH se localiza en grandes vesculas
de ncleo denso en el soma, dendritas, axones y terminales de las neuronas GnRH ( 38 , 41 ).La hiptesis de que, en consonancia con otros sistemas neurosecretoras, el aumento de
Ca2 + intracelular es necesario para la liberacin de esas vesculas y probado este breve por
inyeccin local de thapsigargina o CPA para bloquear Ca 2+ recaptacin en el retculo
endoplsmico.Tapsigargina ha informado para aumentar rpidamente los niveles de calcio
intracelular en las neuronas de GnRH inmortalizadas ( 42 , 43 ).El bloqueo de SERCA
bombas, ya sea con thapsigargina o CPA para elevar la liberacin de GnRH evocados
rpida y repetidamente Ca2 + intracelular, tanto en el POA y ME. Debido a que los
tratamientos fueron entregados cerca del sitio de la medicin de GnRH, su zona eficaz es
espacialmente limitado.Sin embargo, no es posible, para determinar si los tratamientos

actan directamente sobre las neuronas de GnRH, en sus aferentes, en glia local o una
combinacin de stos. Seales entre neuronas probablemente requeriran potenciales de
accin en la clula presinptica para liberar una seal intermedia, bloqueando de este modo
potencial de accin disparando puede revelar pistas sobre el sitio de accin. Adems, se
inform thapsigargin para aumentar el potencial de accin de disparo en las neuronas de
GnRH inmortalizadas ( 43 ).De este modo, se determin si la liberacin de GnRH inducida
bloqueador de SERCA requiere potenciales de accin.En el POA, la liberacin de GnRH
fue del potencial de accin independiente. Esto sugiere que la liberacin de GnRH es ms
probable evocado por la inhibicin SERCA directamente en las neuronas de GnRH en la
regin somato-dendrtica de estas clulas. Accin potencial modificacin independiente de
la liberacin neuromodulador de las neuronas presinpticas no puede, sin embargo, ser
excluida por completo ( 44 ).
En contraste con el POA, se requiri que los potenciales de accin de la liberacin de
GnRH thapsigargin-inducida en el ME. Esto indica que se necesita propagacin de una
seal, ya sea entre una neurona aferente y la neurona GnRH, o para conectar elementos ms
distantes dentro de la propia neurona GnRH (en el caso de los bloqueadores de SERCA,
retculo endoplsmico, y los sitios de liberacin de GnRH). Con respecto a la sealizacin
de una neurona aferente, la liberacin de GnRH evocados-CPA persisti en el ME de
ratones KO Kisspeptina. Esto indica que no se requiere kisspectina para esta respuesta,
aunque el aumento de la amplitud de la liberacin de GnRH en respuesta a kisspectina vs
CPA en kisspectina animales KO puede implicar un papel para kisspectina en la mejora de
esta respuesta. En general, la presente observacin de que el bloqueo de potenciales de
accin bloquea la capacidad de elevar el calcio intracelular con bloqueadores de SERCA
para inducir la liberacin de GnRH en el ME no es atribuible a un fallo de la liberacin
kisspectina de las neuronas aferentes. Esto no elimina la posibilidad de que los
bloqueadores de SERCA estn aumentando el potencial de accin de disparo y posterior
neurosecrecin de una neurona aferente.En este sentido, la activacin de neuroquinina 3
receptores tambin induce la liberacin de GnRH en el ME de kisspectina KO ratones (
37 ).Neuroquinina 3 receptores son el sitio de unin de alta afinidad por la neuroquinina B (
45 ), un pptido que se coexpresan en algunas neuronas kisspectina ( 46 ) y se muestra que
son importantes para la fertilidad ( 47 ).Adems, tanycytes rodean terminales de GnRH
contienen retculo endoplsmico ( 40 , 41 ).Por lo tanto las acciones indirectas a travs de
cualquiera de las neuronas o clulas gliales son posibles explicaciones para el potencial de
accin dependencia de la liberacin de GnRH inducida bloqueador de SERCA en el ME.
Estos datos apoyan y extienden los informes anteriores de las diferencias entre el centro /
dendrtica y la liberacin perifrica / terminal en el sistema neuroendocrino magnocelular
liberacin de oxitocina y la vasopresina. Liberacin dendrticas de estos pptidos se puede
provocar independiente del potencial de accin de disparo, mientras que la secrecin de
terminales de los axones es tpicamente dependiente de la actividad ( 44 ).Liberacin
dendrticas implica la movilizacin de Ca2 + en las tiendas thapsigargin sensible tanto para
la oxitocina y la vasopresina ( 16 ) y an ms la entrada de calcio debido a la activacin de
los canales de Ca2 + sensibles al voltaje de la vasopresina ( 16 , 17 ).Para el sistema de
GnRH, la coordinacin posiblemente proporcionada por accin de liberacin potencial de
guiado en el ME puede ser crtico para la generacin del patrn pulstil requerido por la
pituitaria.

Se propone el activador fisiolgico de aumento del calcio intracelular es necesario para la

liberacin dendrticas en las neuronas magnocelulares que las interacciones de los
receptores de ligando ( 31 ).En las neuronas de GnRH, kisspectina es un potente
estimulador de la accin de tiro de potencial ( 19 ) y la liberacin de hormonas en la
vasculatura portal pituitaria a travs de la ME ( 48 ).El receptor kisspectina (kiss1r) est
acoplado a Gq y las seales de la deplecin de PIP2 e IP 3 ( 49 , 50 ).Aqu demostramos
que la secrecin de GnRH puede ser evocada por kisspectina de una manera dependiente de
IP3 no slo en el ME ( 51 ), sino tambin en el POA. En el POA, sin embargo, fue
necesario bloquear la liberacin de calcio mediada por IP 3 sobre un rea ms amplia para
inhibir la liberacin de GnRH kisspectina inducida.Esto sugiere que el receptor de
kisspectina y Ca2 + intracelular tiendas estn ms separadas en los procesos de las
neuronas de GnRH en la regin perisomtica de lo que son en los terminales de las
neuronas GnRH en el ME, aunque tambin es posible que las diferencias regionales en la
difusin del frmaco contribuyen a estas observaciones.Adems, la naturaleza localizada de
aplicacin tanto kisspectina y la medicin de la GnRH utilizado en el presente estudio
indica que, tanto en el POA y ME, receptores y sitios de liberacin de GnRH Kisspeptina es
probable que se superponan ( Figura 6 ).Curiosamente, la inyeccin local de kisspectina
induce repetidamente la liberacin de GnRH de corta duracin sin decremento en las
condiciones utilizadas en los presentes estudios. Esto est en contraste con los informes de
la desensibilizacin de la accin de las neuronas GnRH potencial de disparo con la
aplicacin repetida de bao kisspectina, incluso cuando la aplicacin de bao era una sola
gota a la cmara de grabacin de la rebanada con una alta tasa de flujo ( 52 , 53 ).Adems,
los potenciales de accin de disparo aumentos de estos estudios duraron varios minutos
(normalmente> 20 min), en comparacin con la relativamente breves pulsos de liberacin
en el presente estudio que dura menos de 2 minutos. Esto puede ser debido a una
concentracin ms baja y menor volumen y masa, por tanto, ms pequea de kisspectina ser
entregado de una manera ms localizada en el presente estudio.Aunque claramente eficaz
en la obtencin de la liberacin de GnRH, la cantidad de kisspectina utilizado en el presente
estudio no puede inducir la desensibilizacin y tambin puede ser lavada ms
fcilmente. Con respecto a esto ltimo, los estudios de sealizacin kisspectina en clulas
cultivadas indican que las elevaciones intracelulares en Ca 2 + se prolongan a menos
kisspectina se retira del medio ( 54 ).Tambin es posible que los mtodos de aplicacin de
bao utilizadas en los estudios anteriores en trminos ms generales dedican partes
adicionales de la red de aguas arriba, lo que resulta en la estimulacin prolongada de la
actividad de las neuronas GnRH. Debido a que las neuronas GnRH expresan kiss1R, es la
accin kisspectina probable, al menos en parte, directamente sobre las neuronas
GnRH. Kisspeptina puede, sin embargo, tambin excitar neuronas GnRH indirectamente
mediante el aumento de GABArgicas excitatorios, as como la transmisin glutamatrgica
a estas clulas ( 52 , 55 , - 57 ).
La Figura 6.
modelos posibles para la regulacin diferencial de la liberacin de GnRH en el POA y ME.
Tambin es posible que el aumento robusto y prolongada en GnRH tasa de disparo de las
neuronas en respuesta a kisspectina no puede generar neurosecrecin prolongado. De
inters adicional en este sentido, el bloqueo potencial de accin disparando no impidi

kisspectina de provocar la secrecin de GnRH en el ME y sin bloqueo concomitante del

influjo de Ca2 + a travs de canales -sensibles Cd 2+.La aparente discrepancia entre la
accin potencial de dependencia de la liberacin de GnRH evocados por thapsigargina y la
accin potencial liberacin independiente evocada por kisspectina en el ME se puede
explicar en un par de maneras. En primer lugar, la liberacin mediada por IP3 de calcio con
posterioridad a kiss1r activacin no sera bloqueada mediante la prevencin de potencial de
accin disparando si kisspectina actuaban en kiss1r expresado por las neuronas GnRH,
proporcionando una prueba ms para la accin directa de kisspectina en las neuronas GnRH
para evocar la liberacin de GnRH.En segundo lugar, kisspectina activa mecanismos
adems de la movilizacin de calcio intracelular en las neuronas de GnRH, incluyendo la
reduccin de tipo A corrientes de potasio ( 36 ) y el aumento de las corrientes de los
receptores de potencial transitorio de canal 4 (TRPC4) ( 58 , 50 ) y las corrientes de
cationes no especficos ( 59 ).En tercer lugar, el agotamiento de PIP2 de la membrana
plasmtica puede modular una variedad de actividades del canal de iones ( 60 , - 65 ) que
en ltima instancia podra cambiar la salida de secrecin.
Otro neuropptido postulado estar implicado en el control de actividad de las neuronas
GnRH es GnIH. Inhibe tanto la actividad elctrica de las neuronas de GnRH ( 22 , 66 ) y la
secrecin de las hormonas gonadotrpicas de la glndula pituitaria ( 67 ).GnIH tambin fue
recientemente implicado en la supresin prepuberal de los niveles de FSH y LH respuesta a
la GnRH ( 68 , 69 ).Estos hallazgos sugieren que un mecanismo de inhibicin GnIH
subyacente de la secrecin de LH puede ser a travs de la supresin de la liberacin de
GnRH. Demostramos que GnIH contrarresta el efecto estimulador de kisspectina sobre la
liberacin de GnRH, tanto en el POA y ME, en contraste con la superposicin apretado de
los receptores kisspectina y la liberacin de GnRH.Sin embargo, hubo diferencias
especficas de la regin en la distribucin espacial de los objetivos GnIH. En el ME,
coapplication local del GnIH con kisspectina no impidi que la secrecin de GnRH
inducida por kisspectina, sugiere que no hay suficiente o la activacin de los receptores
GnIH cerca de receptores Kisspeptina en esta regin ( Figura 6 ).En consonancia con esta
observacin, la inmunohistoqumica ha demostrado poca o ninguna fibras GnIH
immunopositive en el ME ( 70 , - 72 ).Esto sugiere que los receptores GnIH pueden no
estar presentes en el ME. En el POA, sin embargo, GnIH locales impide eficazmente la
liberacin de GnRH kisspectina evocada en la mayora de los casos, lo que sugiere la
ubicacin ms proximal de Kisspeptina receptores y receptores GnIH en esta regin (
Figura 6 ).En consonancia con esta observacin, se ha informado de algunas neuronas de
GnRH para expresar el receptor putativo GnIH G-receptor acoplado a protena 147 (
73 ).Esta observacin contrasta un poco con estudios electrofisiolgicos previos que
demuestran que GnIH inhibe disparar slo en un subconjunto de neuronas de GnRH ( 66 ,
22 ).GnIH podra bloquear la liberacin de GnRH a travs de mecanismos que no implican
la inhibicin de la coccin, otra posible indicacin de desacoplamiento entre la accin de
las neuronas GnRH potencial de generacin y liberacin de GnRH. Por otra parte, la
aplicacin del bao de GnIH suprime la liberacin kisspectina-evocado en tanto POA y
ME. Esto sugiere que GnIH puede evitar la liberacin inducida por kisspectina de GnRH a
travs de redes de aguas arriba.
Localizacin dependiente de regulacin de la liberacin de GnRH en el POA vs ME sugiere
diferencias regionales en los procesos de las neuronas de GnRH, en particular en la

disposicin de los receptores de neuromoduladores, sistemas de sealizacin intracelular, y

los sitios de liberacin de GnRH en estas 2 regiones ( Figura 6 ).Los estudios
electrofisiolgicos limitadas efectuadas en los procesos de GnRH distales se aproximan a la
ME sugieren que estos procesos reciben la transmisin sinptica rpida ( 74 ).Una
disposicin similar es probable que para las entradas de neuromoduladores y es, en efecto
sugerido por la regulacin diferencial de la liberacin de GnRH observada en el presente
estudio. Tales mecanismos reguladores distintos permiten la liberacin de GnRH en cada
regin para ser independiente de la otra. Esto facilita el ajuste fino de la salida de GnRH
para servir a una variedad de diferentes funciones fisiolgicas, tanto en el cerebro y que
salen del cerebro como salida neuroendocrina a la pituitaria.

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