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INRODUCCIN
Las bacterias son organismos unicelulares microscpicos cuyo tamao oscila
generalmente entre 0,5 y 5 m de longitud, debido a estas caractersticas para
poder mirarlas al microscopio adecuadamente y puesto que presentan poco
contraste al ser observadas debido a que son casi incoloras (transparentes), se
requiere a menudo prepararlas y una manera de hacerlo consiste en
someterlas a tinciones (coloraciones) para poderlas visualizar de una mejor
manera y poder identificar detalles de su estructura externa, interna y algunas
funciones fisiolgicas.
Para las tinciones bacterianas se utilizan colorantes, la tincin se da cuando el
colorante entra en contacto con un componente celular, en general, los
colorantes son sales en las que uno de sus iones tiene color y se denomina
cromforo. Los colorantes se clasifican en bsicos, cidos y neutros, segn sea
la carga del grupo cromforo. La nigrosina y la fucsina cida son colorantes
cidos; en tanto el azul de metileno, la fucsina bsica (carbolfucsina), el cristasl
violeta, la safranina, el verde malaquita y el rojo neutro son colorantes bsicos;
algunos colorantes con neutros, como el Giemsa, el Wright y el Leishman
(Rodrguez, et al, 2005).
La composicin qumica de una clula microbiana (as como el pH del material
que la rodea) determina el colorante tomado por la clula. Los colorantes
cidos se combinan con los componentes bsicos, mientras que los
componentes cidos se combinan con los colorantes bsicos, las bacterias
usualmente se tien con colorantes bsicos.
Las tinciones se pueden dividir en: simples, diferenciales y negativas, de
estructuras microbianas y de materias de reserva. La tincin simple consta en
la utilizacin de un solo colorante, en las tinciones diferenciales se emplean por
lo menos dos colorantes, que tien o reaccionan en forma diferente con las
bacterias, segn su estructura fsica o qumica. La tincin negativa en realidad
no tie a las bacterias, sino que tie su entorno, aumentando el contraste para
una mejor visualizacin. Las tinciones para estructuras bacterianas o para
DESARROLLO
Las tinciones requieren previamente la preparacin de un extendido de
bacterias mejor conocido como frotis, el extendido del material se lo realiza
sobre un porta objetos; este se deja secar y luego se fija. En bacteriologa
generalmente la fijacin se la realiza calentando en la llama, lo cual coagula
protenas y adhiere el material a la lmina. En la fijacin qumica se pueden
emplear sustancias que coagulen protenas, como el metanol, aunque lo mejor
son los materiales que se combinan con el material, como la formalina, que
realiza enlaces peptdicos con los grupos aminos (Rodrguez, el al, 2005).
Una vez realizo el frotis se puede proceder a realizar la tincin que se requiera,
de acuerdo, a lo que necesitemos observar en las bacterias.
Tinciones simples
Esta es una tincin directa que utiliza solo un colorante, el cual debe ser rpido
para que la clula bacteriana se tia. Esta tincin permite destacar a la clula
bacteriana por completo para visualizar la morfologa general bsica de una
clula; al utilizar solo un colorante las clulas se tien todas de un solo color.
Los colorantes ms empelados son cristal violeta, azul de metileno y fucsina
fenicada, estos se diferencias en la velocidad y grado en que tien. El azul de
metileno tarde entre 30 y 60 segundos en teir, el cristal violeta es ms reactivo
y usualmente tarde solo unos 10 segundos, la fucsina fenicada es an ms
rpida, generalmente requiere unos 5 segundos (Ortega, UTN, 2009).
Procedimiento
El colorante se aplica al frotis durante un tiempo determinado y luego se lava; a
continuacin el portaobjetos se seca y se examina. En ocasiones se agrega
una sustancia qumica a la solucin para intensificar su coloracin; el aditivo se
denomina mordiente cuya funcin es aumentar la afinidad de una manera
biolgica por un colorante; otra es cubrir una estructura celular (como un
flagelo) para darle mayor espesor y facilitar la observacin despus de teido
(Tortora, et al, 2007).
Tinciones diferenciales
A diferencia de las tinciones simples, las tinciones diferenciales reaccionan de
distinta manera dependiendo la clase de bacterias, por lo tanto pueden ser
empleadas para establecer una distincin entre ellas. Estas tcnicas utilizan
ms de un colorante o bien ciertos reactivos complementarios para la tincin.
Tincin Gram
Fue desarrollada por el cientfico dans Hans Christian Gram en 1884. Es uno
de los procedimientos de tincin ms tiles porque permite clasificar las
bacterias en dos grandes grupos: grampositias y gramnegativas.
Los principios de la tincin de Gram estn basados en las caractersticas de la
pared celular de las bacterias, la cual le confiere propiedades determinantes a
cada microorganismo. La pared celular de las bacterias gramnegativas est
constituida por una capa fina de peptidoglicano y una membrana celular
externa, mientras que las bacterias grampositivas poseen una pared celular
gruesa constituida por peptidoglicano, pero no cuentan con membrana celular
externa as pues, la composicin qumica y el contenido de peptidoglicano en la
pared celular de las bacterias gramnegativas y grampositivas explica y
determina las caractersticas tintoriales (Lpez, et al, 2014).
Procedimiento
El frotis se cubre con colorante violeta bsico, por lo general cristal violeta, se
lo denomina colorante primario, el cual tiene afinidad con el peptidoglicano de
la pared celular bacteriana. Despus de un breve lapso se escurre el colorante
violeta, se lava el extendido, se lo cubre con lugol (yodo), un mordiente e
impide la salida del cristal violeta para la formacin del complejo cristal violetayodo que satura los espacios de la pared. Cuando se lava el yodo, tanto las
bacterias gramnegativas como las grampositivas se tornaran de violeta oscuro
o prpura. Se lleva a cabo despus la decoloracin, usando una mezcla de
alcohol-acetona, la cual deshidrata la pared celular y cierra los poros de la
misma tambin destruye la membrana externa de las bacterias gramnegativas.
Las bacterias grampositivas al tener un gran contenido de peptidoglicano
retienen con mayor fuerza este complejo. Por ltimo se adiciona safranina la
funciona como colorante secundario sirve para teir las bacterias que no
pudieron contener cristal violeta-yodo. Luego se vuelve a lavar el extendido, se
lo seca y se lo examina con el microscopio (Lpez, et al, 2014).
Las bacterias Gram positivas se observan de color azul obscuro a morado,
mientras que las Gram negativas se observan de color rosa a rojo y as
bacterias Gram positivas se observan de color azul obscuro a morado, mientras
que las Gram negativas se observan de color rosa a rojo
Tinciones especiales
Las tinciones especiales se utilizan para colorear y aislar partes especficas de
bacterias, como endosporas, flagelos y detectar la presencia de cpsulas, en
ocasiones se utiliza como mtodo de diagnstico.
Ilustracin 4 Los flagelos aparecen como extensiones ondulantes de los extremos de la clula
bacteriana Spirillum volutans. En relacin con el cuerpo de la clula los flagelos con mucho ms
gruesos de lo normal por la acumulacin de capas de colorante por el tratamiento de la muestra
con el mordiente
Tincin negativa
Este mtodo es ideal para para observar inclusiones refrctiles que no se tien
fcilmente, tales como granulos de azufre, cido poli--hidroxibutrico o
cpsulas bacterianas. La tincin de cpsulas es ms difcil que otras tinciones
Conclusiones
Las tinciones son procedimientos tiles para una correcta observacin de
bacterias al microscopio, permiten observar estructuras internas, externas
incluso funciones, lo cual brinda la oportunidad de poder describir, caracterizar,
distinguir entre bacterias para poder identificarlas en base a un parmetro.
Segn las estructuras de inters que deseemos observar o la morfologa bsica
en general de la bacteria se emplean diferentes tipos de tinciones, que se
desarrollan especficamente a los requerimientos deseados.
Existen tinciones como: las simples en las cuales se observa la morfologa
bsica, diferenciales que permiten establecer distinciones y especiales con las
cuales se pueden observar estructuras especficas.
En general las tinciones son herramientas de ayuda para poder trabajar con
bacterias conociendo su estructura y por lo tanto caractersticas.
BIBLIOGRAFA