Sie sind auf Seite 1von 29

Name:

Datum:

Kleines Mikrobiologisches Praktikum

Skriptum

Skriptversion: 28.06.2005

Groes Mikrobiologisches Praktikum fr Leistungskurse Biologie


Warum soll man Obst vor dem Essen waschen? Ist Zhneputzen wirklich ntig? Warum
reicht Hnde waschen allein nicht, sondern ist auch das Abtrocknen enorm wichtig?
berall in unserer Umwelt befinden sich Bakterien, die unser Leben stndig beeinflussen.
Ziel der Versuche in diesem groen, mikrobiologischen Praktikum ist es, den Schlerinnen
und Schlern die Mglichkeit zu geben, den experimentellen Umgang mit Bakterien im
Labor zu erproben. Zustzlich lernen die Leistungskursler das Verfahren der
Genbertragung durch Plasmide als modernes Instrument in der biochemischen
Forschung kennen.
Experimente
1. Prinzipien des sterilen Arbeitens / Herstellung von Agarplatten
2. Nachweis und Auswertung von Luftkeimen
3. Nachweis und Auswertung von Keimen in verschiedenen Wassersorten
4. Mikroskopieren von Bakterien
5. Frbung von Bakterien
6. Bakterien am Krper und Hygieneregeln
7. Wachstum von Bakterien

Inhalte: Markus Frg, Dirk Stiebler, Udo Kummer, Melanie Odenigbo


Copyrights 2004: GSF-Forschungszentrum fr Umwelt und Gesundheit GmbH, Neuherberg

Mikrobiologie

Versuch 1A Steriles Arbeiten

Grundstze fr mikrobiologisches (steriles) Arbeiten


Mikroorganismen sind allgegenwrtig. Um Kulturen, sterile Lsungen und sterile Gerte vor
Verunreinigungen (Kontaminationen) zu schtzen, mssen einige Regeln beachtet werden. Nur so knnen
korrekte mikrobiologische Ergebnisse gewhrleistet werden.
Unter Sterilitt (v. lat. steril: keimfrei, unfruchtbar) versteht man den Zustand absoluter Keimfreiheit (=
Nichtvorhandensein vermehrungsfhiger Mikroorganismen). Dazu bedient man sich physikalischer und
chemischer Verfahren. In den nachfolgenden Arbeitsschritten fhrst Du die verschiedenen
Sterilisationsverfahren durch.
Als physikalisches Sterilisationsverfahren verwendet man das Autoklavieren (v. lat. clavis: Schlssel,
Riegel). Diese Methode wird zur Sterilisation von hitzestabilen Kulturmedien, Lsungen und Gegenstnden,
die eine Temperatur ber 130 C nicht vertragen (z. B. Plastik), verwendet. Die zu sterilisierenden
Gegenstnde werden fr mindestens 20 Minuten einer Wasserdampfatmosphre von 121 C ausgesetzt;
vergleichbar ist dies mit einem Dampfdrucktopf.
Bei der Desinfektion hingegen wird nicht immer ein vollstndiges Abtten pathogener
(krankheitserregender) Keime erzielt, sondern erreicht oftmals nur eine Reduzierung (Verminderung) der
Keimzahl.

Material:

Petrischal en, Impfse, Drygalsk ispate l, Reag enzg lser mit Steril isierk app en, Bunse nbre nner, Pasteur pip etten

Chemik ali en:

Desinfekti onsmittel, Seife

Versuchsablauf

Bemerkungen

1. chemisches Verfahren:
Hndedesinfektion (nur wenn ohne Handschuhe gearbeitet wird)
Vor und nach jedem mikrobiologischen
Arbeiten mssen die Hnde mit speziell dafr vorgesehenem
Desinfektionsmittel desinfiziert werden.

Hnde erst mit Seife waschen, dann


desinfizieren.
Beispiele fr andere c hemische
Sterilisations mittel sind:
Antibiotika, C hemotherapeutika etc

2. physikalisches Verfahren:
Arbeitsmaterialdesinfektion.
Beim mikrobiologischen Arbeiten mssen die verwendeten
Arbeitsgerte und -materialien jeweils vor und nach Gebrauch
sterilisiert werden, so dass man keine Keime auf das zu
untersuchende Objekt verschleppt.
2 a) AUSGLHEN
Sterilisation der Impfse durch Ausglhen in einer Flamme:
Entznde den Bunsenbrenner. Halte dann die Impfse schrg
nach unten in den nicht leuchtenden Teil der Flamme bis sie
glht. Ziehe danach den Impfsenhals einige Male durch die
Flamme. Anschlieend lass die Impfse abkhlen, bevor du
Material aufnimmst.

Wege der physikalischen Sterilisation:


A. Temper atur: ausglhen, abflamm en
B. mechanisch: filtrieren
C. Strahl ung: radi oaktiv, UV

Impfse: Werkzeug z ur Entnahme v on


kleinen Mengen Kultur material, sowie z um
Bei mpfen von Kultur medien.

Mikrobiologie

Versuch 1A Steriles Arbeiten

2 b) ABFLAMMEN
Tauche den Drygalskispatel kurz in das abgedeckte Becherglas
mit Alkohol. Verschliee das Becherglas wieder mit der
Petrischale.
Entznde
den
Drygalskispatel
nur
kurz
an
der
Bunsenbrennerflamme und halte dabei den brennenden
Drygalskispatel neben dem Bunsenbrenner leicht schrg nach
unten bis die Flamme erlischt.
Anschlieend nimm die Schraubverschlussflasche mit dem
sterilen
Wasser.
ffne
die
Flasche
neben
der
Bunsenbrennerflamme und zieh die Flaschenmndung kurz
zweimal durch die Flamme. Gie jetzt etwas Wasser aus, zieh
die Flaschenmndung und die Innenseite des Verschlusse s
wieder kurz durch die Flamme und verschliee die Flasche.
MERKE DIR!!!
Je schneller du arbeitest, desto
verwendeten Materialien steril.

lnger

bleiben die

Drygalskisp atel:
Werkzeug
zum
Ausstreichen
von
Kultur material
auf
Nhrbden in Petrischalen.
Glasgerte knnen nicht ausglhen, sie
knnen nur oberflchlich s terilisiert werden.

Mikrobiologie

Versuch 1B Steriles Arbeiten

Herstellung von Agarplatten


Du brauc hst:

Kulturmed ium (N hrag ar), Bunsen bren ner, Petrischa len, Arbe itshan dschu he

Versuchsablauf

Bemerkungen

Das Kulturmedium (Nhragar) wurde von uns schon durch


Autoklavieren
sterilisiert
und in
Schraubverschlussflaschen
vorbereitet. Besorge dir den frisch aufgekochten Nhragar aus der
Mikrowelle.

Kultur medi um = ein N hrboden, der die fr


das Bakterienwac hstum nti gen Stoffe
beinhaltet.
Hier: Nhragar = enthlt ei nen
Fleischextrakt als Bakteriennahrung und
Agar z um F estwerden des Nhrbodens

1. Verschluss der Schraubverschlussflasche vorsichtig entfernen


und Rand kurz abflammen.

Arbeitshandschuhe tragen!!!

2. Insgesamt acht Petrischalen


Bunsenbrenner bereitstellen.

dem

Die Wrme der Flamme lsst Luft


aufsteigen und bewirkt, dass
bei m
Eingie en des Kultur mediums k eine Kei me
aus der Luft hineinfall en k nnen.

3. Deckel der Petrischalen anheben und soviel eingieen, dass der


gesamte Boden vollstndig bedeckt ist (ca. 30 ml). Whrend des
Gieens den Deckel der Petrischale schrg ber das Unterteil
halten.

Das Halten des D eckels whrend des


Gieens soll verhi ndern, dass sic h Kei me
aus der Luft i n den N hrboden mischen.

(jede

Gruppe)

neben

4. Eventuell entstandene Luftblschen durch kurzes Befcheln (von


oben) mit der entleuchteten Bunsenbrennerflamme entfernen.
5. Deckel schrg auflegen und in waagrechter Position erstarren
lassen. (ca. 5 min)

Dies soll verhindern, dass Kondensw asser


vom Deckel i n die Platten tropft und
Bakterien wegschwemmt
Die Petrischalen nicht mehr bew egen, da
sonst der Nhragar nicht erstarrt.

6. Nach Erkalten und Erstarren des Nhrmediums (erkennbar an


einer leichten Trbung des Nhragars) werden die Petrischalen
umgekehrt, mit Deckel nach unten und Boden nach oben,
aufgestellt und fr Versuch 2 verwendet.

Mikrobiologie

Versuch 2 Luftkeime

Nachwei s von Keimen in der Luft


A) Beimpfen der Platten
(Versuche A und B mssen nacheinander durchgefhrt werden)
Definitionen:
Beimpfen: Behandeln einer Ls ung durch Ei nbringen von Kei men
Inkubation: [v. lat. inc ubar e: in ( oder auf) etwas liegen] die Bebr tung, entwic klungsfrdernde Er wrmung v.a. von Z ellen und
Organismen
Material: Kulturme dium i n Petrischa len, Foli enstifte, Stoppuhr

Versuchsablauf

Bemerkungen

Vorarbeiten:
Die Beschriftung der Agarplatten erfolgt ausschlielich auf der
Unterseite der Petrischale.
Zu notieren sind:
- der Versuch (Nw von Luftkeimen)
- das Datum, an dem die Platte beimpft worden ist
- Standort (z.B. Tisch innen, Boden, Fensterbank,)
- Expositionszeit
1. Stelle alle drei Agarplatten an einem Platz auf, z.B.
- im Abzug oder
- auen auf der Fensterbank oder
- innen an einem Arbeitstisch oder
- etc. (eigene Ideen!)
2. ffne die Agarplatten gleichzeitig und starte den Countdown auf Bereite die Stoppuhr vor!
der Stoppuhr. Verschliee nach 30, 60 und 90 min die jeweilige
Agarplatte.
3. Zum Abschluss drehe die Agarplatten um, mit Deckel nach unten
und Boden nach oben.
4. Gib die fertig beschrifteten Agarplatten in den Brutschrank. Die Positioniere die Agarplatten
Platten werden dann bei 30 C fr 2-3 Tage inkubiert (bebrtet).
folgendermaen:
Der Boden der Agarplatte muss leicht
schrg auf dem Deckel zu liegen
kommen.
Bitte Betreuer fragen!!!
Fragen:
1. Warum werden die Petrischalen v or der Auswertung mit Tesafilm v erschlossen?
2. Wie entsteht eine Kolonie von Keimen auf der Agarplatte? Begrnde!

Mikrobiologie

Versuch 2 Luftkeime

Mikrobiologie

Versuch 2 Luftkeime

Nachwei s von Keimen in der Luft


B) Auswertung der inkubierten Platten
Definition Kolonien-Morphologie:
(Morphologi e: Lehr e von der Struk tur und For m der Or ganis men; v. griech. Lehre von der Gestalt)

Das Wach stum von Keimen auf Agarplatten resultiert in der Bildung von Kolonien, die ein ganz
verschiedenartiges Aussehen haben knnen. Diese Kolonien-Morphologie ist oft sehr charakteristisch fr
entsprechende Bakterien und kann zur groben ersten Identifizierung einen ersten Anhaltspunkt bieten.

ACHTUNG!!! Bitte achte darauf, dass du die inkubierten Agarplatten v or der Auswertung
sorgfltig am Rand mit Tesafilm zuklebst. Es knnten sich eventuell pathogene Keime in
grerer Menge gebildet haben und dich infizieren!
Material ien:

bewac hsen e Platten der Vor grup pen, Farbatl as der Mikro bio log ie

Arbeitsgang

Bemerkungen

1. Besorge dir drei bebrtete Anstze (30, 60, 90 min) eines


bestimmten Standortes und notiere Datum und Versuch.
Verschliee die Platten bev or du sie auswertest, indem du den
gesamten Rand mit Tesafilm umklebst.
2. Beurteile und beschreibe anhand nebenstehender Tabelle die
Morphologie der entstandenen Kolonien.

Lege daz u di e bewac hsenen Platten auf den


Leuc httisch.

3. Skizziere die verschiedenen Kolonien einer wenig bewachsenen Agarplatte und versuche mit Hilfe des
Farbatlas die Bakterienkolonien zu benennen.
Hilfestellung:
Luftkeime knnen s ein:
Bakterien:
Micrococcus luteus (goldgelb), M. ros eus
(rot)
Bacillus myocides, Bacillacea
Corynebacterium
Mycobacterium
Streptomyc es
Nocardia, R hodococc us (rot)
Pilze:
Rhodotorul a (roter Hefepilz)
Aspergillus niger (Giekannenschlimmel)
Mucor mucedo (Kpfc henschimmel)
Alternaria
Penicillium s p. (Pi nselschi mmel)
- Cladosporium

Skizze:

Mikrobiologie

Versuch 2 Luftkeime

Beispiele fr gebruchliche Umschreibungen:


Gre: nadelkopfgro, pfenniggro, klein, .
Rand: glatt, zackig, samtig,
Farbe: elfenbeinfarben, wei, durchsichtig, gelb,
Form: rund, unregelmig, kugelig, flach ,
Expositionsz eit und
Standort

Anzahl
Kolonien

Gre

Farbe

Verlauf des
Randes

Formen

Aufgaben:
1. Vergleiche die Ergebnisse deiner Proben, indem du sie graphisch darstellst!
2. Versuche die zu erwartenden Ergebnissen, aber auch die eventuellen Abw eichungen, allgemein
zu interpretieren!

Mikrobiologie

Versuch 2 Luftkeime

Graphische Darstellung:

Antworten:

10

Mikrobiologie

Versuch 3 Keime im Wasser

Nachwei s von Keimen in Wasser


A) Erstellen einer Verdnnungsreihe
Um die unzhligen Keimanzahl in einer Probe bestimmen zu knnen, ist es oft erforderlich die Probe
schrittweise zu verdnnen. Sind zum Beispiel zu viele Keime in einer Probe vorhanden, bewachsen sie die
gesamte Oberflche der Agarplatten und sind somit nicht mehr zhlbar.
Mittels einer Verdnnungsreihe, dem schrittweisen Verdnnen einer Probe, ist es nun mglich die
Keimanzahl der verschiedenen Verdnnungen zu zhlen und letztendlich durch Umrechnen die
Gesamtkeimzahl in einem Liter Wasser zu bestimmen.
Material:

4 Reag enzg lser mit Steril isierk app en, 4 Nhr bd en in Petrisc hal en, verschi ede ne Wasserpr obe n, Mikropi petten (20 0 l u nd 10 00 l), sterilis ierte
Pasteurpi petten

Chemik ali en:

steriles Wasser

Versuchsablauf

Bemerkungen

1. Im Folgenden soll die Keimzahl in verschiedenen Wassersorten


untersucht werden. Dazu entscheide dich fr eine der
bereitgestellten Mglichkeiten an Wasserproben und beschrifte
die Agarplatten auf der Unterseite mit Datum, Versuch (z.B. Nw v.
Keimen in wasser) und der entsprechenden Verdnnung (z.B.
1:10, 1:100, 1:1000 oder 10 -1, 10 -2, 10 -3)

Wassersorten:
Destilliertes Wasser, Leitungsw asser,
Teichwasser, Mineralwasser.
Oder:
Orangens aft, Apfelsaft, .

2. Lass dir vom Kurleiter den Gebrauch der. Mikropipetten erklren!

Da die Wasserproben eine fr di e


Auswertung zu hohe Anzahl an Kei men
enthalten, muss vor dem Ausplattieren
verdnnt w erden.
Mikropipette senkrec ht halten, blas enfrei die
Lsung aufnehmen und l angs am tropfen.

3. Gib 100 l der unverdnnten Wasserprobe auf eine Agarplatte.


4. Verdnne anschlieend die Wasserproben mit sterilem Wasser
getrennt nach folgendem Schema von 10 -1 bis 10 -3.
Dazu bertrage 100 l der Probe in das erste Eppendorfgef
und mische mit dem Vortexer.
5. Verdnne entsprechend des Schemas weiter. Nach jedem Schritt
vortexen!
6. Entnimm 100 l aus der jeder Verdnnungslsung und gib dies
auf je eine Agarplatte.
100 l Probe
100 l

100 l

100 l

100 l

100 l

100 l

Agarplatte
unverdnnt

Agarplatte
10-1

Agarplatte
10-2

Agarplatte
10-3

11

Mikrobiologie

Versuch 3 Keime im Wasser

7. Mglichst zgig den Drygalski spatel abflammen und auf dem


Nhrboden, neben dem aufgebrachten Wassertropfen abkhlen
lassen.

Den Drygalskispatel unbedi ngt abk hlen


lassen, dami t die Bakterien nic ht abgettet
werden.

8. Drehe die Petrischale und verteile mit dem Drygalskispatel die


Wasserprobe gleichmig auf der Agaroberflche.
9. Anschlieend die Petrischale wieder verschlieen und auf den Kopf drehen.
10. Bringe die fertig beschrifteten Agarplatten zum Brutschrank. Die Agarplatten werden dann von uns 24
Stunden bei 37C bebrtet.

12

Mikrobiologie

Versuch 3 Keime im Wasser

Nachwei s von Keimen in Wasser


B) Bestimmung des Titers/ Kolonienmorphologie
Definition Titer: (frz. titre, eigtl. Angabe eines (Mischungs)verhltnisse s)
Gehalt einer verwendeten Lsung an einer Substanz oder an Zellen.
Material:

Agarpl atten der Vorgr upp en, feiner Fol ienstift, Mac Conkey-A garp latte

Chemik ali en:

---

Versuchsablauf

Bemerkungen

1. Besorge Dir jeweils drei bebrtete Anstze einer Wasserprobe


und drei bebrtete Anstze einer anderen Wasserprobe (gleiche
Wassersorten wie bei Versuchsteil A verwenden!). Notiere
Datum, Versuch und Verdnnungsansatz.
2. Verschliee jede Agarplatte, indem du den gesamten Rand mit
Tesafilm umklebst.
3. Zhle die Anzahl der Kolonien und notiere die Ergebnisse aller
Versuchsanstze!

Zum Abz hlen lege die Agarplatte auf einen


Leuc httisch und mar kiere mit ei nem
Folienstift auf der Unterseite der Petrischal e
die abgezhlten Kolonien.

4. Entnimm 100 l von jener Verdnnung (s. Versuchsteil A),


dessen bebrteter Ansatz maximal 100 Kolonien enthlt, und
plattiere diese Verdnnung auf eine Mac Conkey-Agarplatte aus.

Mac Conkey-Agarplatten
sind
Nachweis von colifor men Kei men.

zum

5. Beschrifte und verschliee diesen Ansatz und lege ihn in den


Brutschrank.
6. Besorge dir gleich einen schon bebrteten Ansatz dieser
Agarplatte und zhle die Anzahl der Kolonien. Notiere das
Ergebnis dieses Versuchsansatzes!
7. Beurteile und beschreibe anhand der bei Versuch 2 angefhrten
Tabelle die Morphologie der entstandenen Kolonien dreier
Versuchsanstze (Wasserprobe 1, Wasserprobe 2, Mac Conkey),
die eine maximale Kolonienzahl von 100 Kolonien aufweisen.
8. Skizziere die verschiedenen Kulturen der drei Agarplatten.
9. Berechne den durchschnittlichen Titer an Keimen der
verschiedenen Wasserproben. Dazu beachte die Verdnnung
des entsprechenden Versuchsansatzes und das Volumen der
pipettierten Probe!
10. Berechne die durchschnittliche Keimzahl fr einen Liter Wasser
([n K ] = 1 / L) !

13

Petrischal en i mmer verschloss en lassen!


Infek tions gefahr!!!

Mikrobiologie

Versuch 3 Keime im Wasser

Auswertung:
Skizz e:

Datum,
Verdnnung,
Agarsorte
Wassers orte:

Anzahl an
Koloni en:

Morphologie
der Kolonien:

Titer:

Ergebnisse:

Fragen:
Welche allgemeinen und auch kologischen Aussagen lassen sich anhand deiner Ergebnisse
treffen? Vergleiche dazu die Ergebnisse aller Wassersorten!

14

Mikrobiologie

Versuch 4 Mikroskopie von Bakterien

Mikroskopie von Bakterien


(Vergleichsmaterial wird von der Kursassistenz bereitgelegt, z.B. E. coli K12)
Material:

Mikroskop, Farbatl as der Mikro bio log ie, Objekttrger, Deck glsc hen, Pinz ette, Immersionsl, Tropfpi pette

Versuchsablauf

Bemerkungen

1. Lies genau die Mikroskopieranleitung durch.


2. Impfse ausglhen und einen kleinen Tropfen Leitungswasser
auf die Mitte des Objekttrgers bringen.
3. Impfse ausglhen und auf Agaroberflche, nicht auf einer
Bakterienkolonie, abkhlen lassen.
4. Wenig Material einer Bakterienkolonie aus der Petrischale
entnehmen und im Wassertropfen bis zur leichten Trbung
verrhren.
5. Deckglas mit einer Pinzette (nicht mit den Fingern!) auflegen und
vorsichtig leicht andrcken, bis Luftblschen verschwinden
6.
7. Immersionsl (nur 1 kleiner Tropfen) auf die Mitte des
Deckglases auftragen. Vorsichtig von der Seite beim Drehen des
Grobtriebs beobachten, wie das 100-fache Objektiv langsam in
den ltropfen eintaucht.
Darauf achten dass der Objekttischabstand gro genug ist.
8. Mit Feintrieb Schrfeebene suchen.
Objekt auf x/yAchse mit Objekttisch-Einstellschrauben
durchmustern und geeignete Stelle aufsuchen, an der die
Bakteriensuspension nicht zu dicht ist.

ACHTUNG! Immersions l bitte nicht auf


dem Tisch vertropfen. Im F alle von
verschtten, bitte s ofort w egwischen.

Die Zellen mssen fr eine gute Beurteilung


frei schwi mmen, ansonsten lsst sich di e
Beweglichk eit nicht beobachten.

Auswertung:
Skizziere und beschreibe drei verschiedene Bakterienarten und beschrifte sie gegebenenfalls mit ihrem
Namen (s. Farbatlas!).

15

Mikrobiologie

Versuch 5 Frbung von Bakterien

Unterscheidung von Bakterien durch Frbung


Neben vielen anderen Untersuchungsmethoden von Bakterien gibt es ein gngiges Frbeverfahren, mit dem
es mglich ist, Bakterien unter dem Mikroskop zu unterscheiden.
Die Gram-Frbung ist nach dem dnischen Arzt und Bakteriologen HANS CHRISTIAN GRAM benannt, der sie
ca. Ende des 19. Jahrhunderts entwickelte. Verschiedene Bakterien reagieren auf diese Frbung
unterschiedlich. So kann man eine Einteilung in sogenannte Gram-positive Bakterien, die violett/blau
erscheinen, und Gram-negative Bakterien, die rot gefrbt werden, ableiten.
Dies ist ein wichtiges Kriterium fr die Unterscheidung verschiedener Bakterien z.B. bei der Diagnostik von
Infektionskrankheiten. "Gram-positive" und "Gram-negative" Bakterien reagieren unterschiedlich auf
Antibiotika. Mit dieser schnellen diagnostischen Methode kann man in kurzer Zeit (ca. 5 Minuten) anhand
eines Abstriches das "Gramverhalten" der Bakterien bestimmen. Damit hat man die Mglichkeit, sofort mit
einer antibiotischen Therapie zu beginnen bevor das Ergebnis der oft mehrere Tage dauernden definitiven
Keimbestimmung vorliegt.( s. www.lexikon-definition.de)

A) Vorbereitung des Prparats Hitzefixierung


Material:

Objekttrger, Deckg lser, Pinz ette, Tropfpipette, Impfse, Bunsenbr enn er, bewac hsen e Agarp latte mit apatho ge nen Bakter ienstmm en (z.B. E. coli
K12 , B-Staphylokokk en, etc.)

Chemik ali en:

dest. Wasser

Versuchsablauf

Bemerkungen

1. Reinige die Objekttrger mit Alkohol (Entfetten).


2. Ziehe den entfetteten Objekttrger 2-3-mal kurz durch die
Flamme des Bunsenbrenners.

Achtung! Entfettete Schichtseite beachten

3. Lege den Objekttrger ber die Frbeschale und gib einen


Tropfen Wasser darauf.
4. Entnimm mit der ausgeglhten Impfse etwas Material einer
Bakterienkultur und vermische das Material mit dem
Wassertropfen auf dem Objekttrger.
5. Verteile den Wassertropfen auf eine grere Flche
(ca. 10 x 20 mm) und erwrme den Objekttrger v orsichtig an
der Rckseite, damit das Wasser schneller verdampft.

Nicht zu stark erhitz en!!!


Wedeln besc hleunigt das Eintr ocknen!

6. Ziehe den Objekttrger mit der Schichtseite nach oben einige


Male SCHNELL durch die Bunsenbrennerflamme.

Das Glas darf nur handwarm werden,


ansonsten ist das Prparat besc hdigt und
nicht mehr brauchbar!)

7. Wiederhole den
Bakterienkultur!

Arbeitsgang

1-5

mit

einer

16

anderen

Mikrobiologie

Versuch 5 Frbung von Bakterien

Unterscheidung von Bakterien durch Frbung


B) Frbung nach GR AM
Material:

Objekttrger, Petrischa le

Chemik ali en:

Kristallvi olett-Ls ung, Lu golsc he Ls ung, Alko hol, Safran in-L sun g, dest. Wasser

ACHTUNG!!!!

Beim Frben Handschuhe tragen, um Kontakt mit den Farbsubstanzen zu vermeiden. Farbspritzer
auf den Tischen bitte sofort mit einem feuchten Papiertuch abw ischen!!!
Versuchsablauf

Bemerkungen

1. Lege die hitzefixierten Prparate ber eine


Frbeschale / Petrischale.

Behandelte Seite nac h oben!

2. Gib nur einen Tropfen Kristallviolett-Lsung


auf die Oberflche und bettige die Stoppuhr.

Bereite die Stoppuhr v or!

3. Sple die Kristallviolett-Lsung nach einer


Minute mit Lugolscher-Lsung ab und warte
zwei Minuten.
4. Tropfe anschlieend Alkohol langsam auf
den gefrbten Ausstrich, lass den Alkohol
einwirken und kipp den Alkohol ab. Dies wird
solange wiederholt, bis keine Farbwolken
mehr vom Prparat abgehen.
5. Gib jetzt 3-4 Tropfen Safranin-Lsung hinzu
und sple nach einer Minute mit dest.
Wasser.
6. Trockne die Rckseite des Objekttrgers und
lege ein Deckglas auf die Schichtseite.

berschssiges Wass er auf der


Schichts eite wird v orher durch
Absaugen mi t Papier entfernt!

7. Untersuche die gefrbten Bakterien unter


dem Mikroskop auf ihr Farbverhalten und
vergleiche den Abbildungen von Bakterien im
Farbatlas der Mikrobiologie (s. Seite 78!).
Auswertung:
Beschreibe die Form und die Gram-Frbung deiner Prparate!

17

Mikrobiologie

Versuch 5 Frbung von Bakterien

18

Mikrobiologie

Vers uch 6 Krperkeime und Hygieneregeln

Nachwei s von Keimen am Krper


A) Verschiedene Krperregionen
Material:

sterile Wattestbche n, drei Agarplatten

Chemik ali en:

steriles Wasser

Im folgenden Versuch geht es darum zu untersuchen, an welchen Krperstellen sich verschiedene Keime
befinden.
Zum Beispiel befinden sich auf der Haut je nach Region unterschiedlich viele Keime: So wachsen am Rcken
etwa 1.000 Keime pro Quadratzentimeter, unter den Achseln dagegen, wo es viel feuchter ist, etwa 100.000. Auf
jeden Fall wachsen die Keime unserer Hautflora so dicht, dass sie uns vor schdlichen Keimen wie zum Beispiel
dem Eitererreger Streptococcus aureus schtzen. Diese Keime sind zwar in geringer Anzahl auf der Haut
vorhanden, haben aber keine Chance, sich zu vermehren.

Versuchsablauf

Bemerkungen

1. Besorge dir eine Agarplatte und teile sie auf der Unterseite in drei
gleich groe Felder ein. Beschrifte sie mit Datum und Versuch.
2. Entscheide dich fr drei Krperregionen deren Keimzahl du
untersuchen willst.
3. Feuchte ein steriles Wattestbchen mit sterilem Wasser an (nicht
triefend nass machen!) und streiche ber die entsprechenden
Krperregionen.
4. Berhre das entsprechende Drittel der Agarplatte mit dem
beimpften Wattestbchen und streiche in Zick-Zick-Linien ber
die Agaroberflche ohne den Agar zu beschdigen (s. Skizze)

1. Ausstrich

2. Ausstrich

5. Wiederhole die Prozedur (3 und 4) fr die beiden anderen


Proben.
6. Anschlieend verschliee die Petrischale und drehe sie auf den
Kopf.
3. Ausstrich

7. Falls noch Zeit bleibt, dann berhre eine weitere Agarplatte mit
drei verschiedenen Alltagsgegenstnden, z.B. Geldschein, -stck,
Stift, Handtuch, . Verschliee und beschrifte diese Agarplatte.
8. Bringe die fertig beschrifteten Agarplatten zum Brutschrank. Die
Agarplatten werden dann von uns 24 Stunden bei 37C bebrtet.

19

Mikrobiologie

Versuch 6 Krperkeime und Hygieneregeln

Auswertung:
Besorge dir die schon bereitgestellten, bebrteten Versuchsanstze der Vorgruppen und verschliee sie, indem
du den gesamten Rand mit T esafilm umklebst.
Werte nach folgenden Gesichtspunkten aus!
Keimzahlunterschiede: Berechne die Verhltnisse zwischen unterschiedlichen Krperbereichen!
Kolonien-Morphologie, Zell-Morphologie
Hilfestellung:
Die vorkommenden Bakterienkolonien si nd v.a. Milchsurebakt erien, wie z.B.
Kokken: Streptoc occus (Zellteilung in einer Ebene, daher Paare und K etten), Lact ococc us, Leuconost oc, Pediococcus (Zellteilung
in zwei Ebenen, daher Paare und Tetraden)
oder
Stbc hen: Lact obacillus, S porol actobacillus, Bifidobacterium

Fragen:
1. Nenne die Hauptfunktion, die Bakterien der menschlichen Haut verleihen!
2. Wovon ernhren sich die Bakterien auf der Hautoberflche?
3. Die Hauptgruppe der auf der menschlichen Haut vorkommenden Bakterien sind Milchsurebakterien.
3 a) Erlutere die Aufgabe und Wirkung der Milchsurebakterien auf der Krperoberflche!
3 b) Wie nennt sich der dnne, saure Film, der die Haut berzieht?

20

Mikrobiologie

Vers uch 6 Krperkeime und Hygieneregeln

B) Hygieneregeln
Material:

sterile Wattestbche n, Agarpl atte

Chemik ali en:

steriles Wasser

Versuchsablauf
1. Besorge dir eine Agarplatte und beschrifte sie am Rand mit Datum und Versuch. Zeichne auf der
Rckseite mit dem Folienstift ein Kreuz, um die Platte in vier Bereiche einzuteilen.
2. Beschrifte die vier Bereiche mit den Versuchsteilen, die durchgefhrt werden.
3. Fhre vier Fingerabdrcke (vorsichtiges Berhren) in folgenden Zustnden durch:
- ungewaschen
- gewaschen, nicht getrocknet
- abgetrocknet
- anschlieend desinfiziert
4. Bringe die fertig beschrifteten Agarplatten zum Brutschrank. Die Agarplatten werden dann von uns 24
Stunden bei 37 C bebrtet.
5. Wasche dir nach dem Versuch die Hnde!
Auswertung:
Besorge dir die schon bereitgestellten, bebrteten Agarplatten der Vorgruppen dieses Versuches und
verschliee sie, indem du den gesamten Rand mit T esafilm umklebst.
Leite aus deinen Ergebnissen fr den Alltag ntzliche und sinnv olle Hygieneregeln ab!

21

Mikrobiologie

Versuch 6 Krperkeime und Hygieneregeln

Fragen:
uere dich kritisch zu folgendem Presseartikel, indem du deine Versuchsergebnisse mit einbeziehst!

Presseinformation
Wenn Karies-Erreger tdlich werden
Forschungsprojekt soll Mundhhlen-Streptoko kken genau untersuchen
Bakterien vom Ty p der so genannten Oralstreptokokken, die in der menschlichen Mundhhle leben, lsen nicht nur Karies aus, sondern manchm al auch
weit schlim mere Erkrankungen bis hin zur Herzklappenentzndung. Ein neues Forschungsproj ekt, gefrdert durch die Helm holtz-Gem einschaft Deutscher
Forschungszentren, wird diese Erreger jetzt genau unter die Lupe nehmen und Anstze fr m gliche Gegenmanahmen entwickeln. An dem Vorhaben
beteiligen sich drei wissenschaftliche Einrichtungen, koordiniert wird es von der Gesellschaft fr Biotechnologische Forschung (GBF) in Braunschweig.
Im Mund des Menschen leben mehrere hundert Arten von Bakterien. Gut zwei Dutzend von ihnen gehren zur Gattung Streptococcus, beispielsweise die
Arten Streptococcus m utans und Streptococcus salivarius. Manche dieser Oralstreptoko kken sind an der Bildung von Plaque und Karies an den Zhnen
beteiligt unangenehm , aber nicht wirklich gefhrlich. Wenn sie jedoch in den Kreislauf eindringen, etwa durch Verletzungen, knnen diese
Mikroorganismen zu einer Blutvergiftung (Sepsis) fhren. Gelangen sie ber die Blutbahn an andere Stellen des Krpers, verursachen die Keime
m anchmal Abszesse in Hals, Lunge und Leber, sogar lebensbedrohliche Herzklappenentzndungen.

Zhne putzen schtzt die He rzklappe


Anlass zur Panik besteht dennoch nicht: Keineswegs j ede Bakterien-Verunreinigung im Blut m uss dramatische Folgen haben nur in groer Anzahl und
bei geschwchtem Im m unsy stem knnen sich Oralstreptokokken zur Bedrohung entwickeln. Doch Fachleute befrchten, dass ihre klinische Bedeutung in
naher Zukunft zunehm en wird. Professor Singh Chhatwal, Strepto ko kken-Experte und Abteilungsleiter an der GBF, nennt dafr m ehrere Ursachen: Das
liegt zum einen an unserer Lebensweise zuckerreiche Ernhrung begnstigt das Wachstum von Karies-Bakterien, erklrt Chhatwal. Zum anderen ist es
paradoxerweise gerade die gute zahnmedizinische Versorgung, die neue Risiken hervorbringt: E ine groe Zahl von zahnm edizinischen Eingriffen erhht
die Wahrscheinlichkeit, dass kleine Wunden in der Mundhhle entstehen, durch die Oralstreptokokken ins Blut gelangen knnen. Die gestiegene
Lebenserwartung und damit verbundene Im m unschwche bei lteren Leuten erleichtert zudem die Um wandlung von harm losen Kariesbakterien in
gefhrliche Krankheitserreger. Bei Kindern m it Leukm ie werden Blutvergiftungen durch Kariesbakterien zunehm end hufiger beobachtet.
Die bedenklichste Entwicklung j edoch: Streptoko kken haben eine ausgeprgte Fhigkeit, Resisten zen zu entwickeln. Das heit, sie werden unem pfindlich
gegen Antibiotika, unsere besten Waffen im Kam pf gegen Bakterien, warnt Chhatwal. Und wir beobachten, dass Streptokokken ihre Gene fr solche
Resistenzen an andere Bakterien weitergeben auch an noch gefhrlichere Krankheitserreger. Deshalb halten Chhatwal und seine Forscherkollegen es fr
unverzichtbar, m ehr ber Oralstreptoko kken zu erfahren. Bis m an die Mechanismen besser versteht, die aus harm losen Mundhh-len-Bewohnern
m anchmal gefhrliche Erreger machen, bleiben im Alltag nur bewhrte Hausmittel fr die Prophy laxe: Zhne putzen und gesund leben, em pfiehlt
Chhatwal, denn gefhrdet sind vor allem Personen m it schlechter Mundhy giene und schwachem Imm unsy stem .

Fakten zum Forschungsprojekt


Das Projekt Oral streptococci: An emerging threat for hum an health hat zum Ziel, die Mechanismen der Pathogenitt oraler Streptoko kken zu
untersuchen. Projektpartner sind die GBF, die Universitt Kaiserslautern und das Klinikum der Universitt Leipzig. Bildmaterial unter
www.gbf.de/presseinformationen.

22

Mikrobiologie

Vers uch 6 Krperkeime und Hygieneregeln

23

Mikrobiologie

Versuch 7 Bakterienwachs tum

Wachstum von Bakterien


Die Vermehrung von Bakterien erfolgt ber Zweiteilung und damit grundlegend anders als bei mehrzelligen
Organismen. Da eine einzelne Zellteilung vergleichsweise schnell abluft, resultieren enorme
Vermehrungsraten.
In diesem Versuch wird ber eine Zeitdauer von mindestens vier Stunden das Bakterienwachstum verfolgt,
indem man einerseits die gewachsenen Kolonien aus einer Verdnnungreihe auszhlt, andererseits die T rbung
der Nhrlsung mittels eines Photometers misst. Zum Schluss lsst sich eine verlssliche Aussage ber die
Vermehrungsrate von Bakterien treffen.
Material: bernachtku ltur von E. coli, Schika neko lbe n, Schttler, Flssigme dium, Mikro literp ipetten, Epp end orfgefe, Kulturme di um in Petrisch ale n, Folienstifte, Dryga lski-Sp atel

Versuchsdauer: mindest. 4 Stunden!

Versuchsablauf

Bemerkungen

Ein Schikanekolben mit 50ml Flssigmedium wird mit 1,0ml einer


bernachtkultur von E. coli beimpft und bei Raumtemperatur auf dem
Schttler inkubiert.
Alle 60 Minuten vorzubereiten:
-2
-4
-5
-6
4 Eppendorfgefe mit: Beschriftung Probe 10 10 10 10
Flssigmedium (LB) s.u.
4 Agarplatten mit Beschriftung auf Unterseite:
Versuch, Gruppe, Zeit (Minuten), Verdnnung, Datum
Zu Beginn des Versuches (0 Minuten) und dann alle 60 Minuten wird eine Die Probe muss sofort weiter
Probe der Flssigkultur genommen.
verarbeitet w erden!
1. bertragen Sie 10 l der Probe in das erste Eppendorfgef und
mischen Sie grndlich mit dem Vortexer oder per Hand.
2. Verdnnen Sie entsprechend des Schemas weiter. Nach jedem
Schritt vermischen!
3. Von jedem Eppendorfgef 100 l auf die entsprechende Petrischale
ausplattieren und die Agarplatten zum Brutschrank bringen.
4. Parallel die Absorption der unverdnnten Probe messen. Dazu den Die Absorption ist direkt
nicht bentigten Rest der Probe in eine neue Kvette geben und in proportional zur Bakterienzahl.
die Probenposition 3 des Photometers geben.
Bitte Betreuer zu Hilfe holen!
5. Die Platten werden bei 37 C fr 2-3 T age inkubiert.
10 l Probe
10 l

ausplattieren:

100 l

100 l

100 l

100 l

24

100 l

Mikrobiologie

Vers uch 7 Bakterienwachs tum

Auswertung:
Holen Sie Sich vom Materialtisch einen Stapel mit allen Agarplatten dieses Versuches einer Gruppe. Whlen Sie
fr jeden Zeitpunkt eine Petrischale mit einer sinnvollen Koloniedichte und zhlen Sie sie aus.
1. Berechnen Sie die Bakteriendichten in der Flssigkultur und stellen Sie die Ergebnisse in einem
halblogarithmischen t/N-Diagramm dar. Benennen Sie einzelne Abschnitte!
2. Tragen Sie im selben Diagramm mit einer zweiten y-Achse die Absorption ein!
3. Bestimmen Sie die Generationszeit!

Fragen:
1. Wieso werden die Werte in einem halblogarithmischen Diagramm dargestellt?
2. Bakterien vermehren sich stets schrittweise durch Zweiteilung. Warum sind selbst bei genauester
Messung nie Sprnge in der Koloniezahl zu beobachten?

25

Mikrobiologie

Versuch 7 Bakterienwachs tum

26

Mikrobiologie

Vers uch 7 Bakterienwachs tum

27

Mikrobiologie

Notizen

28

Mikrobiologie

Notizen

> ber das Glserne Labor


Das Glserne Labor w urde speziell fr Schlerinnen und Schler eingerichtet. Hier sollen sie zu
bestimmten naturw issenschaftlichen Themen mglichst eigenstndig, aber natrlich nach
Anleitung, experimentieren und dabei entdecken, w ie faszinierend naturw issenschaftliche
Phnomene sind und Spa haben an der Experimentier- und Forscherttigkeit.
Zustzlich sollen die Schlerinnen und Schler die GSF als Forschungseinrichtung kennen lernen
und verstehen, w ie Grundlagenforschung funktioniert und w arum sie w ichtig bzw . ntig ist. Je nach
Thema w erden aktuelle Forschungsprojekte der GSF vorgestellt.
Das GSF-Forschungszentrum fr Umw elt und Gesundheit bernimmt als Mitglied der HelmholtzGemeinschaft Verantw ortung fr die Qualitt der naturw issenschaftlich-technischen Bildung
unserer Kinder.
Das Glserne Labor dient als Institution, um dieser Anforderung durch unterrichtsergnzende
Angebote gerecht zu w erden.
Es w urde am GSF Forschungszentrum fr Umw elt und Gesundheit mit grozgiger finanzieller
Untersttzung der Helmholtz-Gemeinschaft eingerichtet.

> Weitere Informationen


Besuchen Sie uns im Internet. Dort finden sie aktuelle Informationen und das
Anmeldeformular:
www.gsf.de/gsf-lab
Bei Fragen stehen wir telefonisch unter 089. 3178 2725 zur Verfgung.

Auf ein baldiges Wiedersehen freut sich ihr Team vom Glsernen Labor!

Glsernes Labor
Abteilung ffentlichkeitsarbeit
GSF Forschungszentrum
fr Umwelt und Gesundheit
Ingolstdter Landstrasse 1
85764 Neuherberg

29