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Curso de Histologa

Tcnicas de Procesamiento

Dr. Miguel Lecuona Rodrguez


Departamento de Biologa Celular y Tisular
Facultad de Medicina, UNAM
Universidad Autnoma del Estado de Mxico.
2015

Qu es la Tcnica Histolgica?

Son una serie de pasos fsicos y qumicos


para obtener una muestra susceptible de
ser analizada al microscopio

Clulas NO procesadas
Se observan en microscopio de contraste de
fases o de campo oscuro:
Clulas de la sangre
Clulas de descamacin

Clulas Procesadas

Tcnica histolgica ordinaria


Tcnica de corte por congelacin
Tcnicas de tincin selectiva
Tcnicas de histoqumica enzimtica
Tcnicas de inmunomarcaje

Otras Tcnicas (Investigacin)


Tcnicas para microscopia electrnica
Tcnica de impregnacin metlica o
argntica
Ultracentrifugacin diferencial
Cultivo de clulas o tejidos

Tcnica Histolgica Ordinaria


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Obtencin de la muestra
Fijacin
Deshidratacin
Aclaracin o diafanizacin
Infiltracin
Inclusin
Corte
Desparafinizacin
Rehidratacin
Tincin
Deshidratacin
Aclaracin
Montaje

Obtencin de la muestra
Ser vivo: biopsia
Circunstancias o condiciones:
De rutina
Transoperatoria

Cantidad de tejido que se toma de la lesin:


Insicional: un fragmento de la lesin
Excisional: toda la lesin, pudiendo tener fin teraputico

Procedimientos:
Corte
Raspado: de sistemas epiteliales citologia exfoliativa (cervico-vaginal citobrush o
abatelenguas)
Legrado
Puncin

Aspiracin con aguja fina (BAAF)


Aspiracin con aguja gruesa (Tru-cut)

Endoscopia

Cadver: necropsia

FIJACIN
Conservacin de la estructura, evitar
cambios postmortem, como la autolisis, la
putrefaccin o la proliferacin
Qumica:
desnaturaliza
protenas
proteolticas, estabiliza membranas, inactiva
enzimas (autolisis), antispticos (evita
proliferacin de microorganismos)
Fsica: congelacin

FIJACIN
Los fijadores mas usados son:
Formol (formaldehdo) al 10%: endurece el tejido y tiene
capacidad de penetracin al espacio intracelular, buen poder
fijador; se usa de 12 a 24 horas (ideal); se utiliza un volumen
de 1 a 20 veces el tamao de la muestra.
Glutaraldehido, tetraxido de osmio (para ME)
Alcohol Etlico al 50% o 70%

Mezclas fijadoras; spray: formol-fosfato


Otros: Bouin, Zenker, Sanboni

Deshidratacin
Es gradual para evitar la refraccin
Se utiliza etanol o alcohol etlico al 30%,
50%, 70% y 100%

Aclaramiento o diafanizacin
Se utiliza como ayudante para observar
con mayor calidad los compartimientos
celulares
Se utilizan solventes como: Xilol, Toluol o
Cloroformo (Agentes Aclarantes)
Se dan 2 baos al menos

Infiltracin

Se da en parafina lquida o celoidina

INCLUSIN
Solubles en agua: gelatina, carbowax,
metacrilato de glicol
Solventes orgnicos: parafina, celoidina

CORTE
Se utiliza el micrtomo
Van de 4 a 8 micras por lo general

Se va generando un listn de cortes


Se colocan en una bandeja en bao Mara
con gelatina o albmina
Se separan y se colocan en portaobjetos

Desparafinizacin

Se realiza con Xilol (Agente aclarante)

Rehidratacin

De forma gradual, con agua

TINCIN
Se utiliza para dar contaste a la muestra
Monocrmica (1 colorante) Azul de toluidina

Bicrmica (2 colorantes) H-E ncleo azulmorado, el resto rosa-naranja


Tricrmica (3 colorantes) Masson: ncleoazul oscuro, citoplasma-rojo, colgena-azul,
msculo- rojo;

TINCIN
Hematoxilina: azul-morado, base
(basofilia). Ncleos (cido y basofilo)
Eosina: rosa-naranja, cido (acidofilia)
citoplasma (bsico y acidofilo)

TINCIN
Ortocromasia: se respeta el color del
colorante
Metacromasia: cambio del color original del
colorante (tonalidades) Vg. Azul de Toluidina
Pancromasia: mezcla de varias colorantes
neutros, da como resultado varios colores y
tonalidades Vg. Wright y Giemsa

Deshidratacin

Se saca el agua propia de los colorantes


con alcohol

Aclaracin

Se da un bao en Agente Aclarante para


aumentar la transparencia de la muestra

MONTAJE
Se coloca un cubreobjetos a la muestra
junto con Resina Sinttica o Blsamo de
Canad, como pegamento formando una
capa transparente y adhesiva.

TCNICA DE CORTE POR


CONGELACIN
Usos: en procesamiento de biopsias
transoperatorias
Obtencin: biopsia transoperatoria
Fijacin: por congelacin
Corte: criostato (micrtomo en gabinete refrigerado
a una temp. de -20 C en el interior)
Tincin: HE
Tiempo estimado: 10 minutos
La preparacin solo se puede observar al momento
Otros usos: pruebas de histoqumica enzimtica,
evitando el uso de AA polares como xilol.

TCNICAS DE TINCIN SELECTIVA


Se tien determinados componentes celulares con colorantes especficos:

Para lpidos:

Para glucgeno y glucoprotenas:

Sudan III y IV: rojos o naranjas


Sudan negro: negro
Rojo oleoso: rojo
cido osmico (tetraoxido de osmio): negro

cido perydico de Schiff (PAS); Rojo-magenta para glucgeno, Rojo para glucoprotenas
Carmn de Best: glucogeno

Para DNA sin RNA

Tcnica de Feulgen: rojo ( el RNA no reacciona)

Bensley y Cains: para mitocondrias

Dafano (sales de plata): para aparato de Golgi

Wilder (argentica): para fibras reticulares: caf a negro

Reyes (rojo), Orceina (amarillo), Verhoeff (caf): para fibras elsticas

HISTOQUMICA ENZIMTICA
Detecta un grupo de enzimas especficas
(la misma enzima)
Se va a observar en forma de precipitado
denominado MARCA
Enzima + sustrato = producto(s) +
revelador = MARCA

INMUNOMARCAJE
Se utilizan anticuerpos, se identifican molculas altamente
especficas
Inmunoflorescencia
se utiliza un compuesto fluorescente
muestra fluorescentes los anticuerpos a los cuales se les
pega el antigeno
Puede ser directa: 1 antgeno por 1 anticuerpo
Puede ser indirecta: 1 antgeno por varios anticuerpos

Inmunohistoqumica
se utiliza para marcar enzimas

Joaqun Carrillo Farga

Joaqun Carrillo Farga

Joaqun Carrillo Farga

Joaqun Carrillo Farga

Joaqun Carrillo Farga

Pnfigo vulgar

IHQ indirecta

IHQ negativa

IHQ positiva

CASO CLNICO
Mujer de 58 aos
Lesin difusa en mama derecha que infiltra piel y
complejo arola pezn

Receptores de estrgeno y progesterona

Her2-neu

DIAGNSTICO

Carcinoma ductal infiltrante:


RE y RP (+)
Her-2 Neu (+)

TCNICA PARA MET


Mismos pasos que la tcnica ordinaria:
Diferencias:
Fijacin; en vez de formaldehdo se utiliza glutaraldehido

Infiltracin; en vez de parafina se utilizan resinas plsticas


(epxicas) Vg. EPON y Araldita
Corte: va de 60 a 100 nanometros, se utiliza un ultramicrtomo
cuyas cuchillas son de vidrio o diamante
Se utilizan rejillas de cobre en lugar de portaobjetos
No se quita la resina
Para el contrastado se utilizan sales de metales pesados como el
acetato de plomo y el acetato de Uranilo

IMPREGNACIONES METLICAS O
ARGNTICAS
En lugar de usar tincin de color, se
utilizan sales de Oro y Plata (tonos de
caf a negro)
Se utilizan para procesar muestras de:
tejido nervioso (se tien bien las diferentes
clulas gliales)

La metenamina de plata permite marcar o


teir laminas basales al igual que PAS

ULTRACENTRIFUGACIN DIFERENCIAL
Se utiliza para separar organelos
Despus de la centrifugacin se obtiene un sedimento y un
sobrenadante
Ejemplo:
1. A la primera centrifugacin quedan: en sedimento clulas
completas y en el sobrenadante mitocondrias y otros
organelos
2. Al repetir el proceso en el sedimento quedan los ncleos y
en el sobrenadante los dems organelos
3. Al repetir el proceso en el sedimento quedan mitocondrias
y en el sobrenadante ribosomas

CULTIVO DE CLULAS Y/O TEJIDOS


El procedimiento general es el siguiente:
Obtencin de clulas
Separacin de clulas (si es que no estn separadas)
Se colocan en cajas con medio de cultivo (lquidos a semi-lquidos,
tienen nutrientes y son distintos a los de las bacterias)
Se introducen en incubadores de cultivo, manteniendo temperaturas
de 37C aprox.
Se da un intercambio gaseoso 02-CO2
En buenos cultivos las clulas se pueden reproducir (se resiembran)
Esta tcnica se usa en investigacin mas que en clnica
En cultivo de tejidos las clulas deben organizarse para formar el tejido
(Ingeniera de cultivo de tejidos); las cepas de HELA, es la que se ha
adaptado mejor a las condiciones de cultivo, estas vienen del tumor de
una mujer desde finales de 1950.

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