DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE

LA VIDA
CARRERA DE INGENIERIA EN
BIOTECNOLOGIA

GENETICA

Calvopia Flores Jonathan Alexander

Resumen artculo cientfico: Herencia
Extracromosmica
Enero 08 del 2015

SEMESTRE: octubre 2015

febrero 2016

Transferencia bacteriana de amplio DNA genmico funcional en

clulas humanas
La transferencia eficiente de vectores basados en el cromosoma en clulas
de mamfero es difcil, debido principalmente a su gran tamao. Usando un
vector invasivo de Escherichia coli genticamente diseado, el ADN satlite
alfa clonado en el cromosoma artificial basado en P1 fue entregado de
manera estable en la lnea celular HT1080 y gener eficientemente
cromosomas artificiales humanos de novo.
Del mismo modo, un gran regulador de conductividad de transmembrana de
la fibrosis qustica genmico (CFTR), construccin de 160 kb, que contiene
una porcin del gen CFTR se propagan de forma estable en el vector
bacteriano y se transfieren a clulas HT1080 donde se transcribi y
empalm correctamente, lo que indica la transferencia de un locus intacto y
funcional de al menos 80 kb.
Estos resultados demuestran que las bacterias permiten la clonacin, la
propagacin y la transferencia de grandes fragmentos intactos y funcionales
de DNA genmico y su posterior entrega directa en las clulas para el
anlisis funcional. Este enfoque abre nuevas perspectivas para la terapia
gnica.
El primer requisito para que se produzca la transferencia de genes de las
bacterias a las clulas de mamferos es la internalizacin celular eficiente de
las bacterias, que vara dependiendo de la lnea celular. El porcentaje de
clulas HT1080 infectadas inicialmente se determin mediante anlisis de
citometra de flujo de clulas fluorescentes despus de la invasin con
bacterias que expresan GFP bajo el control de un promotor procariota.
La E. coli que alberga un plsmido que dirige la sntesis de GFP en las
bacterias, se us en multiplicidades de infeccin en la proporcion (MOI)
(bacterias / clulas de mamferos) de 5 o 25 para infectar HT1080. Despus
de unas 2 horas de coincubacin, las clulas se lavaron y se incubaron en el
mdium completo que contena 20 mg / ml de gentamicina para destruir las
bacterias extracelulares.

Despus de 45 min de incubacin, las clulas se trataron con tripsina y se

analizaron por citometra de flujo. En una MOI de 5, el 74.5% de las clulas
eran fluorescente, y a una MOI de 25, el 97.6% de las clulas eran
fuertemente fluorescentes. Bacterias intracelulares viables se enumeran
despus de la lisis celular suave; el nmero de bacterias viables por clula
se calcul a partir del nmero de bacterias recuperadas por pocillo.
El nmero de bacterias intracelulares viables recuperadas fue 0.25 por
clula en una MOI de 5 y 1.2, y en una MOI de 25. La discrepancia entre el
nmero de bacterias viables recuperadas de las clulas y el porcentaje de
clulas positivas para GFP se puede explicar por el hecho de que las
bacterias muertas o moribundas pueden seguir siendo GFP positivo. En
conjunto, los resultados indican que, a una MOI de 25, casi todas las clulas
haban internalizado al menos una bacteria productora de GFP. La viabilidad
celular en 48 horas despus de la infeccin, vari desde 90 hasta 50% para
una MOI de 5 y 25, respectivamente.
Varios laboratorios han demostrado recientemente que las bacterias pueden
transferir genes funcionales a una gama muy amplia de clulas de
mamfero. Las cepas atenuadas de Shigella, E. coli invasivos, Salmonella y
Listeria son capaces de transferir DNA de plsmido a clulas de mamfero.
Las bacterias utilizadas para la transferencia a las clulas fagocticas y no
fagocticas son patgenos intracelulares facultativos que han sido diseados
para lisar despus de la invasin celular.
Hasta ahora, esta propiedad se ha explotado principalmente para
desarrollar vacunas de DNA basado en la capacidad de Shigella y
Salmonella para dirigir clulas dendrticas. Ms recientemente, las bacterias
invasivas tambin han sido utilizadas como vectores de DNA para la terapia
gnica. La administracin a ratones genticamente inmuno-deficientes de
Salmonella avirulenta que llevan el gen de IFN-g por plsmido murino dio
lugar a la expresin del transgn dentro de los macrfagos y las clulas
dendrticas y la correccin del defecto gentico.
En conclusin se ha mencionado que tomando ventaja de la proximidad de
la mucosa intestinal a las bacterias luminales, se ha entregado con xito un
gen teraputico a la mucosa del colon de los ratones. La E. coli
(BM2710/pGB2Oinv-hly) fue capaz de entregar el gen TGF-b1-plsmido
realizado en la lnea celular epitelial del colon CMT-93, y de la
administracin oral a ratones de las bacterias redujo significativamente la
gravedad de la colitis experimental inducida por TNBS.
Adems los vectores basados en el cromosoma se consideran que son
potencialmente tiles para introducir genes exgenos en clulas de
mamferos, ya que al replicarse de forma autnoma y al tener capacidad de
clonacin ilimitada, permite la insercin de genes enteros con su endgeno
adecuado y elementos reguladores especficos de tejido. Por lo tanto, las
tcnicas simples y eficientes para transferir estas molculas muy grandes
en clulas de mamfero necesitan ser desarrolladas.
Ya que concretamente hay una gran variedad de enfermedades genticas
de las cuales este tipo de vectores funcionales viables con plsmidos que
permiten la insercin de nuevos genes al genoma humano y replicarse con

existo, podran intervenir en esos errores del DNA para solucionar problemas
de ndole expresivo, es decir corrigiendo correctamente un gen mal formado
o por una delecin, se obtendra las protenas apropiadas para el correcto
funcionamiento de los mamferos, en su metabolismo o morfologa.