4 MATERIAL E MTODOS

4.1 LOCAL DE ESTUDO E ANIMAIS

O trabalho foi aceito atravs do Parecer na Comisso de tica no Uso de
Animais (CEUA) atravs do Protocolo 023/2014 (CEUA) - 23084.006334/2013-32
(UFRA) e ttulo do Projeto de Pesquisa/Plano de ensino: Avaliao da Ocorrncia e
de Frequncia de Salmonelose, Micoplasmose e Doena de Newcastle em Pombos
Domsticos (Columba livia) de Vida Livre no Estado do Par.
Para o presente estudo foram capturados 80 pombos domsticos (Columba
livia) de vida livre, oriundos do Parque Mangal das Garas, capturados por
armadilha do tipo rede tarrafa e canos de pvc (Figura 2 (A) e (B)).

Figura 1 (A) e (B) Captura de pombos com armadilha rede tarrafa tipo PVC
Fonte: Fotos cedidas pela Mdica veterinria Bruna Ramos.

O Parque Naturalstico Mangal das Garas foi criado pelo Governo do Estado do
Par em 2005 sendo localizado s margens do rio Guam, em pleno centro histrico
de Belm do Par, no entorno do Arsenal da Marinha, em uma rea de 40.000 m, o
qual se tornou um dos pontos tursticos mais elogiados da cidade pela sua bela
paisagem com lagos, aves e vegetao tpica como a aninga que cria condies
favorveis de sombra

possibilitando o aparecimento de outras espcies de

vegetao propiciando um ambiente ideal para recebimento, adaptao de aves e

visita de aves de vida livre, principalmente as aves aquticas como as garas pela
presena do lago artificial presente no local e tambm de pombos domsticos que

so

atrados

pela

disponibilidade

de

alimento

presente

no

viveiro

do

parque(WIKIPEDIA, 2015; PARQUE MANGAL DAS GARAS).

A presena do pombo domstico (Columba livia) no parque um fator de
grande importncia para sade pblica (NUNES,2003) por apresentarem risco de
transmisso de vrias doenas aos animais e humanos presentes no local, sendo
uma delas a salmonelose (BENCKE,2007) que uma das zoonoses que mais
acomete o homem por todo o mundo, da a importncia da investigao da
participao dessas aves na cadeia de transmisso dessa doena.

Figura 2 - Mapa do Parque Naturalstico Mangal das Garas

Fonte: www.mangaldasgaras.com.br

4.2 COLETA E PROCESSAMENTO DE AMOSTRAS

A coleta de amostras e a tcnica de diagnstico utilizadas nesta pesquisa
foram processadas no laboratrio de Microbiologia e Doenas Infecciosas dos
Animais, do Instituto de Sade e Produo Animal, da Universidade Federal Rural da
Amaznia (UFRA).
Inicialmente para realizar a coleta de amostras fez-se jejum e dieta hdrica de
12 horas para procedimento de sedao e eutansia dos mesmos, visando o bem
estar animal, diminuindo o sofrimento durante a realizao do mesmo.

Na sedao o Columba livia foi primariamente contido, seguido de sedao por

associao de quetamina e xilazina (Figura 4) nas doses de 0,3ml e 0,15 ml,
respectivamente, somando no total de 0,45 ml de soluo administrada por via intramuscular (IM); com espera de 3 minutos para insensibilizao da ave, seguida da
coleta de sangue total por via intracardaca com auxlio de agulha de calibre nmero
20 e seringa de 20 ml (Figura 5) que foi transferido para tubo de Vacatube (Figura 6).
Para posterior centrifugao com obteno do soro para realizao da sorologia.
Aps,

eutansia

esses

animais

foram

refrigerados

e,

descongelados para realizao da necropsia.

Figura 3 - Momento da Insensibilizao com quetamina e xilazina

Fonte: Fotos cedidas pela Mdica veterinria Bruna Ramos.

posteriormente

Figura 5 Coleta de sangue total por via intracardaca

Fonte: Fotos cedidas pela Mdica Veterinria Bruna Ramos

Figura 6 - Amostra sangunea de Pombos Domsticos

Fonte: Arquivo Pessoal.
.

4.3 MTODO DE DIAGNSTICO

4.3.1 Soroaglutinao Rpida para Deteco de anticorpos anti Salmonella sp
Foi utilizado o antgeno Pulor Teste da BIOVET indicado para o diagnstico de
infeco por Salmonella pullorum ou Salmonella gallinarum, em galinhas e perus,
por reao de soroaglutinao ou hemaglutinao pelo mtodo rpido em placa,

segundo as recomendaes do fabricante e as indicaes do Programa Nacional de

Sanidade Avcola - PNSA (BRASIL, 1994).

Figura 4 - Antgeno Pulor Teste da BIOVET.

Fonte: Arquivo Pessoal.

4.3.2 Realizao da Prova

4.3.2.a Avaliao do Soro Bruto
Foi utilizado soro de 80 pombos domsticos, de forma individual e enumerados.
Colocou-se 25 l de soro de cada frasco, segundo sua numerao, em placa
de vidro totalizando 80 testes. Em seguida, acrescentou-se 25 l do antgeno sobre
a placa de vidro, j, contendo o soro (Figura 8).
Imediatamente realizou-se a mistura do antgeno ao soro com ajuda de
misturador de plstico, seguido de homogeneizao por movimento de rotao da
placa durante 5 segundos, deixando-a em descanso por 1 minuto, seguida
novamente de rotao da placa por mais 5 segundos para consecutiva leitura no 2
minuto, aps a mistura inicial.
A formao de grumos de cor azul caracteriza o resultado como positivo e a
permanncia da mistura uniforme e transparente, ou com, microgranulao pouco
visvel caracteriza a reao como negativa.

Figura 5 Teste SAR apresentado na parte inferior, em amarelo o soro e em azul o antgeno. J na parte
superior, a primeira amostra a esquerda apresentou reao sororeagente e as demais caracterizaram-se como
reaes no reagentes.
Fonte: Arquivo Pessoal.

4.3.2.b Prova de Diluio ou Titulao

Essa etapa caracterizada com duas fases de diluio, sendo a primeira de
1:05 e a segunda de 1:10; utilizando-se apenas os soros que apresentaram
positividade na avaliao do soro bruto (Figura 9).
Empregou-se dois tubos para cada amostra positiva, um correspondente
a1titulao e outro a 2 titulao, totalizando um nmero de 40 tubos de ensaio,
adicionados de 80l de soluo fisiolgica 0,9 %. Na sequncia, aos tubos
referentes a 1 titulao, foi acrescentado 20 l de soro em cada tubo, seguida da
homogeneizao da soluo.
A partir dessa mistura diluda foi removido 20 l, e adicionada ao tubo
correspondente a 2 titulao(1:10), seguida da homogeneizao da mesma.
Na ordem, foi realizado o teste de soroaglutinao rpida em placa (SAR) de
cada soro diludo, utilizando duas placas de vidro, uma referente ao teste da 1
titulao e outra ao teste da 2 titulao. Em cada teste de soroaglutinao rpida
em placa foi utilizado 25 l de cada de soro diludo na placa de vidro, juntamente
com 25 l do antgeno Pulor Teste (Figura 10). Seguida, da mistura do antgeno ao
soro com auxlio de misturador de plstico, com imediata homogeneizao da
mistura por rotao da placa, por 5 segundos, deixando-a em repouso por 1 minuto,
seguida novamente de rotao da placa por mais 5 segundos para consecutiva

leitura no 2 minuto para efetuar a leitura para observao ou no da formao de

grumos de cor azul.

Figura 6 diluio das amostras reagentes do soro bruto.

Fonte: Arquivo Pessoal.

Figura 7 Soro diludo para a realizao do Teste SAR com o antgeno PULOR TESTE.
Fonte: Arquivo Pessoal.

4.3.3 Leitura e Interpretao dos Resultados

A formao de grumos de cor azul caracteriza o resultado como positivo e a
permanncia da mistura uniforme e transparente, ou com, microgranulao pouco
visvel caracteriza a reao como negativa.
O procedimento seguiu as Instrues da Normativa 78 do Programa Nacional
de Sanidade Avcola(PNSA).

5 RESULTADO E DISCUSSO
Com a realizao do diagnstico de soroaglutinao rpida em placa (SAR)
para Salmonella sp, do total de 80 amostras sanguneas coletadas de Pombos
domsticos do Parque Naturalstico Mangal das Garas, 20 amostras apresentaram
anticorpos anti-Salmonella sp, correspondendo a 25 % das amostras na avaliao
do soro bruto, representados na Tabela 1 e Figura 9.

Tabela 1 - Frequncia absoluta e relativa da SAR em soro bruto de amostras sorolgicas de pombos
domsticos do Parque Naturalstico Mangal das Garas, 2016.

Frequncia absoluta
Frequncia relativa

Amostras reagente
20
25%

Amostras no reagentes
60
75%

Amostras positivadas; 25%

amostras negativadas; 75%

Figura 11 - Frequncia Relativa da SAR em soro bruto de amostras sorolgicas de pombos

domsticos do Parque Naturalstico Mangal das Garas, 2016.

O resultado obtido nessa anlise assemelha-se aos de Nunes (2008), que

encontrou 28,23 % do anticorpo, no soro bruto, do total de 124 galinhas no Municpio
de So Jos do Egito, Estado de Pernambuco; Buchala et al., (2006) encontrou
16,5% de aves sororeagentes ao antgeno de Salmonella Pullorum de amostras sem
diluio, em aves domsticas de fundo de quintal encontradas em reas geogrficas
prximas granjas reprodutoras no Estado de So Paulo. Pessoa et al., (2006),
apresentaram 11,4% (12/105) de positividade para Salmonella sp, do total de 105
aves analisadas do Municpio de Suzano, So Paulo.
Resultados encontrados por Carrasco et al., (2011) diferem dos resultados
encontrados nesta pesquisa pois, do total de 133 amostras sanguneas de pombos
de um Parque da regio central de Ribeiro Preto, So Paulo, apenas uma delas foi
soropositivo para Salmonella no teste realizado com soro bruto. Assim como os de
Luz (2012), de um total de 121 amostras coletadas em aves silvestres cativas em
centros de reabilitao e criadouro no estado do Rio Grande do Sul, apenas uma foi
sororeagente. Da mesma forma Ferreira (2012) tambm encontrou baixo ndice de
anticorpos anti-Salmonella. Em testes com soro bruto, de 240 pombos domsticos
analisados em reas de armazenamento de gros e sementes do Estado de So
Paulo, apenas um apresentou soropositividade atravs do mtodo SAR.
Quanto a titulao do soro, na primeira titulao foi constatado que dessas 20
amostras reagentes no soro bruto, somente 3 delas se mantiveram positivas,
constituindo 15% do soro bruto (Tabela 2 e Figura 10) e 3,75% do total (Tabela 3 e
Figura 11). Na segunda titulao todas as amostras apresentaram negatividade
A titulao do soro foi realizada apenas para a comparao com alguns
trabalhos que realizam este processo pois, segundo PULOR TESTE, resultados
satisfatrios dependem da realizao do teste seguindo as recomendaes contidas
na bula, onde o processo de titulao no mencionado nem recomendado, tendo
em vista que o PULOR TESTE preparado com cultura de Salmonella pullorumgallinarum e suas partidas de antgeno so cuidadosamente produzidas e sofrem no
laboratrio todas as provas de controle.
Para dirimir quaisquer questionamentos quanto a titulao na identificao da
aglutinao da salmonelose, atravs do PULOR TESTE em comparao com a
microplasmose, atravs do antgeno MYCO-GALI TESTE, o segundo afirma atravs
de sua bula que os soros reagentes positivos no teste de aglutinao rpida em

placa devem ser submetidos a outras provas, mais especficas, como a inibio de
hemaglutinao ou ELISA, coisa que a bula do PULOR TESTE no recomenda.

Tabela 2 - Frequncia absoluta e relativa da SAR em diluio (1:05) de amostras sorolgicas de

pombos domsticos do Parque Naturalstico Mangal das Garas, 2016

Frequncia absoluta
Frequncia relativa

Amostras reagente
3
15%

Amostras no reagentes
17
85%

Amostras positivadas; 15%

Falso-positivo; 85%

Figura 12 - Resultado da frequncia relativa do SAR em amostras sanguneas, em relao ao soro

diludo de 1:05, de pombos domsticos do Parque Naturalstico Mangal das Garas, 2016.

Resultado encontrados por Carrasco et al., (2011) apresentaram negatividade

da amostra ao realizar a diluio (1:05) da amostra positiva no soro bruto,
semelhante aos resultados encontrados neste trabalho que ao fazer a diluio
diminuiu consideravelmente a quantidade de amostras regentes. Ferreira (2012)
tambm encontrou resultados semelhantes utilizando a tcnica de soroaglutinao
lenta (SALT) em tubos, pois a amostra (1/240) que havia positivado na tcnica de
soroaglutinao rpida em placa no foi reagente atravs dessa tcnica(SALT).
Com base nisso, constata-se que

a diluio das amostras diminui

significativamente a positividade de anticorpos anti- Salmonella sp, assim como na

diluio de 1:05, deste trabalho, que reduziu do total de 20 amostras reagentes no

soro bruto para 3 amostras positivas e que negativaram na diluio de 1:10,

apresentando maior nmero de resultados falso positivos.
De acordo com Rodrigues (2002) a Soroaglutinao rpida em placa no deve
ser uma tcnica utilizada para a confirmao de aves positivas para Salmonella sp,
mas somente como um teste de triagem e que o isolamento para o swabs de cloaca
e de arrasto permitiu detectar a presena de Salmonella sp. nas amostras coletadas,
o qual obteve em seus resultados, 34 aves soropositivos em 360 anlises para
Salmonella pulorum, atravs do mtodo SAR, representando 9,44% do total, porm
isolou 0,83 % da bactria
Tabela 3 Frequncia absoluta e relativa do total de amostras analisadas pelo critrio de diluio em
amostras sanguneas, de pombos domsticos do Parque Naturalstico Mangal das Garas, 2016.

Frequncia absoluta
Frequncia relativa

Amostras reagente
3
3,75%

Amostras no reagentes
77
96,25%

Amostras positivadas; 4%

Amostras negativadas; 96%

Figura 13 - Frequncia relativa do total de amostras sanguneas analisadas pelo critrio de diluio
em de pombos domsticos do Parque Naturalstico Mangal das Garas, 2016.

Sousa (2012) em sua pesquisa encontrou 36 amostras positivas no SAR, do

total de 36 aves selvagens, porm apenas uma apresentou a bactria na cultura,
fator este importante, visto que os resultados se contradizem, confirmando o que foi

enfatizado por Rodrigues(2002).Assim, tambm Sousa (2007) avaliando a

participao de aves silvestres na cadeia de transmisso da Salmonella sp para
aves de criao atravs do mtodo SAR, do total de 80 soros, apenas uma ave foi
positiva, porm apresentou-se negativa na cultura microbiolgica.
J Correa (2010) no detectou a bactria em nenhuma das 50 amostras de
Columba livia provenientes da Escola estadual Joaquim Izidoro Marins no municpio
de Sorocaba/SP, as quais foram submetidas aos testes bacteriolgicos. Assim,
tambm Ramos(2014) pesquisando Salmonella sp em 10 amostras de suabes
cloacais de Columba livia provenientes do Mercado de Ver-o-Peso da cidade de
Belm do Par, no encontrou positividade em nenhumas das amostras.
Na regio metropolitana de Belm do Par pouco ainda se pesquisa sobre a
relao do Columba livia na cadeia de transmisso de Salmonella sp para outros
animais e pessoas, da a importncia de maiores investigaes da incidncia da
contaminao e disseminao desse patgeno, j que a salmonelose que uma das
zoonoses que mais acomete o homem por todo o mundo.

CONSIDERAES FINAIS
A alta prevalncia de anticorpos anti Salmonella sp evidncia o alto nvel de
infeco encontrada nesses pombos domsticos demostrando a importncia na
dessas aves como vetor e disseminao desse patgeno para os visitantes e para
as aves que vivem no Parque. Deve se levar em considerao o controle, o
impedimento de acesso dessas aves e a vacinao das aves pertencentes ao local,
afim de evitar a proliferao da Salmonella sp no local e nas reas ao redor do
Parque.
Com base no exposto segure-se a importncia de pesquisas mais amplas
com diagnsticos mais precisos para verificar o risco significativo que essas aves
sinantrpicas representam na cadeia de transmisso da Salmonelose.