DIAGNSTICO DE HERPES VIRUS MEDIANTE

TCNICAS DE PCR
ARAUJO FERNNDEZ HERNANI, JOHAN; CARAZAS BARRIOS, NARDELLY; PUMA CUSI, LUZ;
VALDIVIA CARBAJAL, IRMA

INTRODUCCION

del SNC. Las modificaciones de la tcnica

bsica de PCR se han utilizado para
aumentar la sensibilidad de deteccin de los
virus, por ejemplo, mediante el uso de
ensayos de PCR anidadas. Aunque es muy
sensible, esta tcnica tiene la desventaja de
ser
altamente
susceptibles
a
la
contaminacin, llevando potencialmente a
resultados falsos positivos.

Virus del herpes simple tipos 1 y 2 (HSV-1 y

HSV-2) causan una variedad de sntomas
clnicos en el sistema nervioso central (SNC).
En pacientes inmunocomprometidos, el virus
conduce a resultados clnicos severos,
incluyendo la enfermedad mucocutnea y
neumona. En la entrega, HSV puede
transmitirse al recin nacido y, despus de
esta exposicin, puede causar infecciones
diseminadas graves y la muerte.

Ensayos de PCR en tiempo real se basan en

la qumica TaqMan o el sistema HydProbe.
Ambos sistemas combinan una PCR estndar
con un fluormetro de lectura en un sistema
cerrado.

El virus de la varicela-zster (VZV), el agente

causante de la varicela y la culebrilla-tambin
pueden causar infecciones sistmicas graves
del SNC y el tracto respiratorio en individuos
inmunocompetentes, as como en pacientes
inmunocomprometidos. Este ltimo tambin
puede sufrir de enfermedades diseminadas de
mltiples rganos y sistemas.

El PCR en tiempo real tambin permite la

deteccin de ADN de doble cadena por la
tecnologa verde SYBR. Sin embargo, el uso
de sondas TaqMan individuales es superior a
la tecnologa de SYBR Verde porque los
ensayos con sondas TaqMan son ms
especficos y carecen de resultados falsos
positivos debido a productos de amplificacin
no especficos, que son detectados por la
tecnologa verde SYBR.

El diagnstico rpido de laboratorio se

necesita con urgencia para distinguir
infecciones de HSV, cuando el CNS est
involucrado, especialmente en los casos con
manifestaciones
drmicas
clnicamente
confusas.

Desde PCR en tiempo real permite una rpida

deteccin de genomas virales en muestras
clnicas y es fcil de usar en un laboratorio
clnico, diferentes ensayos de PCR en tiempo
real para la deteccin de HSV y VZV se han
desarrollado recientemente.

Adems, el diagnstico rpido de infecciones

por HSV y VZV es crucial en los recin
nacidos para prevenir un resultado letal de la
enfermedad. Hoy en da, la terapia eficaz de
las infecciones por HSV y VZV es posible con
medicamentos antivirales como el aciclovir.
Sin embargo, la terapia debe iniciarse muy
temprano despus de la aparicin de la
enfermedad para disminuir la letalidad y para
reducir al mnimo el nmero de pacientes que
sostienen el dao neurolgico persistente. Por
lo tanto, la capacidad de diagnosticar
rpidamente las infecciones por HSV y VZV
es una caracterstica clave en el laboratorio
de virologa. Ensayos de diagnstico
molecular utilizando PCR son el estndar para
la deteccin de infecciones por herpesvirus

El objetivo de este estudio fue desarrollar tres

ensayos de PCR en tiempo real para el
instrumento LightCycler basada en la qumica
TaqMan para la deteccin de HSV-1, HSV-2,
VZV y en muestras clnicas y para comparar
estos ensayos para PCR anidado en-casa
sistemas.

MATERIALES Y MTODOS
DISEO Y SINTESIS DE PRIMERS
1

Los primers fueron diseados utilizando el

Software Primer Exprese 1,0 de la empresa
Applied Biosystems , Weiterstadt , Alemania.
La secuencia del DNA que se desea
amplificar mediante qPCR es el gen de la
glicoprotena D (gD) del HSV- 1. En la
siguiente tabla veremos los primers (F y R)
que se usaran en el presente trabajo y las
caractersticas que tiene cada uno:

A continuacin, se procedi a la realizar la

lisis de leucocitos; para esto, al pellet obtenido
se agreg 500l de buffer de leucocitos y se
pipeteo 5-6 veces para que se mezcle bien
con el pellet, se procedi a resuspender y se
transfiri el contenido a un eppendorf, donde
se agreg 5l de proteinasa K y se mezcl
bien por pipeteo, se dej incubando la

TABLA 1.- Caractersticas Principales de

cada uno de los Primers

minutos, y se agito cada 2 minutos.

Seguidamente, se procedi a precipitar las
protenas, para lo cual, luego de la incubacin
con proteinasa K se agreg a la muestra
500l de la mezcla cloroformo: alcohol
isoamilico (24:1), se agito la muestra
vigorosamente durante 10 segundos y se
pas a centrifugar a 10000 RPM durante 5
minutos. Salido de la centrifuga, se identific
las fases y se transfiri a un nuevo eppendorf
la fase acuosa.
Se realiz la precipitacin y el lavado del
ADN, para lo cual, el sobrenadante obtenido
se agreg 1 ml de isopropanol frio, se dej
precipitando el DNA durante 2 horas y se
centrifugo a 10000 RPM durante un minuto,
se elimina el sobrenadante y se enjuaga el
pellet del DNA salido de la centrifuga con
500l de etanol frio al 70%, se invirti el tubo
para resuspender el pellet y nuevamente se
centrifugo 10000 RPM durante 1 minuto, se
elimin el sobrenadante y se dej abierto para
que el etanol se evapore; finalmente se
resuspendi el pellet de DNA con 30l de
Agua
grado
Biologa
Molecular,
se

muestra a 56

*La Tm se calcul con el software de Primer

Express basado en el algoritmo Rychlik
*El nmero de acceso en el Gen Bank son
E00401 y J02217
La sntesis de los primers fue realizada por la
empresa MACROGEN; llegando cada una en
forma liofilizada y con sus diversas
caractersticas.
TOMA DE MUESTRA
Para el presente trabajo se busc un paciente
postivo para HSV 1, un paciente que no
presento nunca la enfermedad ni que se
encuentre en su lnea materna, un paciente, y
finalmente un paciente que se sospecha que
pueda tener la enfermedad.
Se tom 5ml de sangre intravenosa de cada
uno de los pacientes, 30 minutos antes de la
extraccin de ADN y se coloc en un tubo con
heparina totalmente cerrado, y se mezcl muy
bien, para que la sangre no se coagule.

por un espacio de 30

resuspendi y se almaceno a -20 .

PCR CONVENCIONAL
Lo primero que se hizo fue resustituir los
primers con agua grado biologa Molecular
hasta llegar a una concentracin de 100 pmol;
que es lo que indica la empresa MACROGEN.
Para el trabajo se necesita 300nm de
fordward y 300nm de reverse as que se
realizaron los clculos para que al final al
tomar 1ml de fordward o reverse este tenga la
concentracin de 300nm.
Una vez listo los primers, en eppendorf
especiales para PCR se procedi coloco 30l
de Master Mix, 8l de ADN extrado, 0,5l de
Fordward y 0,5l de Reverse, 1l de Agua
grado Biologa molecular.
Se coloc en la PCR y se pusieron las
condiciones mostradas en la siguiente tabla:

EXTRACCIN DE ADN
Primero se diluyo la sangre 1/3 con Suero
Fisiolgico (2ml de sangre con 6 ml de Suero
fisiolgico), luego se procedi a lisar los
eritrocitos, para esto se midi 6 ml de buffer
de lisis de eritrocitos en un tubo falcn y luego
se agreg 2 ml de la sangre diluida; se mezcl
por inversin unas 5-6 veces y se incubo la
muestra con hielo durante 5 minutos,
terminado el tiempo de incubacin; se
centrifugo a 7000 RPM durante un minuto, se
descaro el sobrenadante y se procedi a lavar
el pellet con 1 ml de suero fisiolgico y se
volvi a centrifugar a 7000 RPM durante un
minuto.
2

al utilizar slo 5ul de material gentico. Se

confirm la deteccin del virus del Herpes
humano en la muestra de control positivo
extrado de un paciente del cual se sabe que
una semana antes de la toma de muestra
mostr un rebrote del virus debido a estrs,
sin embargo, debido al tiempo prolongado de
corrida electrofortica, los fragmentos de
aproximadamente 200 bp parecen haber
desaparecido del gel, pese a ello, la ausencia
de DNA genmico en los pozos demuestra la
actividad de los primers verificando su
especificidad. En el caso de la muestra, se
present una banda gruesa en el pozo, lo que
demuestra que los primers empleados no
amplificaron el gen de la glicoprotena D (gD)
por la ausencia del virus en el paciente
empleado como muestra para diagnstico.

TABLA 2.- Programacin de la PCR

Etapa PCR
Activacin de la
Enzima
Desnaturalizacin
Alineamiento
Extensin

Temperatura

Tiempo

5 min

95

15 seg

30 seg

72

30 seg

95

60

Nmero de Ciclos: 45

Luego del tener los productos de la PCR, se

prepar un gel de agarosa al 0.8%, para lo
cual se pes 0.12 gr de Agarosa y se diluyo
con 15 ml de buffer TAE 1X, se disolvi con
calor y se esper que enfri para agregar
SyBRsafe 2l. A continuacin, se puso en la
bandeja para formar el gel y los pocillos
correspondientes. Una vez listo, se coloc el
marcador de peso molecular y cada muestra,
las cuales se prepararon con 10l de ADN y
2l de loading buffer. La corrida se program
para 30 minutos a 100V. Salido el gel se
revelo bajo luz ultravioleta.
PCR EN TIEMPO REAL
Al igual que el anterior, en un tubo especial
para PCR se coloc 12l de Master Mix, se
repiti el control positivo a 2 concentraciones
5l de ADN extrado y 3l de ADN extrado,
en todos los casos se agreg 1l de Fordward
y 1l de Reverse, y se complet con Agua
grado Biologa molecular hasta 20 l. Una vez
listo se coloc en la qPCR y se realiz la
programacin mostrada en la TABLA 2.
Luego del tener los productos de la qPCR, se
prepar un gel de agarosa al 0.8%, para lo
cual se pes 0.12 gr de Agarosa y se diluyo
con 15 ml de buffer TAE 1X, se disolvi con
calor y se esper que enfri para agregar
SyBRsafe 2l. A continuacin, se puso en la
bandeja para formar el gel y los pocillos
correspondientes. Una vez listo, se coloc el
marcador de peso molecular y cada muestra,
las cuales se prepararon con 10l de ADN y
2l de loading buffer. La corrida se program
para 30 minutos a 100V. Salido el gel se
revelo bajo luz ultravioleta.

Figura 1. Resultados de PCR convencional

para la deteccin del virus del Herpes
Humano. L: ladder, C+ muestra de un
paciente con presencia de sintomatologa del
virus una semana antes de la prueba. C (NR)
muestra de un paciente negativo a la
infeccin. M muestra de un paciente
presuntivo de poseer el virus de HVH tipo 1.
DISCUSIN
En el ensayo de PCR en tiempo real realizado
por Weidmann et al. (2003), la especificidad
de los primers empleados, iguales a los
nuestros, llega a un mximo del 100%,
mientras que el empleo de NESTED PCR o
PCR anidada rindi resultados vegos y

RESULTADOS
Cuando se emplearon 8ul de DNA com 2 ul de
primers, la PCR rindi un mejor resultado que
3

negativos para amplificacin al igual que los

resultados descritos por Weidmann et al, con
la diferencia que ellos encontraron reacciones
cruzadas de los cebadores.
Adems se
necesit de par de primers que amplifiquen el
exn y de tal manera los primer especficos
podran trabajar de manera satisfactoria para
el diagnstico.

BIBLIOGRAFIA
(1) Weidmann, Manfred. Rapid Detection of
Herpes Simplex Virus and Varicella-Zoster
Virus Infections by Real-Time PCR.
JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY.
Vol. 41, No. 4. pgina 15651568. 2003.
(2) GENBANK. HSV1 glycoprotein D gene.
Disponible en:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/J0221
7
(3) GENBANK. Herpes simplex virus-1 (HSV1) glycoprotein D (gD) gene Disponible en:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/E0040
1

CONCLUSION
El herpes virus se presenta de dos formas
siendo de inters en este trabajo el herpes
virus tipo I, el cual se puede diagnosticar de
manera rpida mediante la tcnica de PCR
convencional y una evaluacin electrofortica.