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II. JUSTIFICACIN
El test de Ames es comnmente usado como una prueba eficiente y barata para la
determinacin de sustancias mutagnicas. Las bacterias que son deficientes en la
biosntesis de histidina (His-) se extienden en un slido de agar que contiene
azcares y sales inorgnicas (medio mnimo). El medio mnimo no contiene el
aminocido histidina o cualquier otro suplemento de aminocidos. Entonces la
bacteria no crece a menos que sea objeto de una reversin de mutacin. En el test
de Ames, las bacterias se mezclan con la sustancia (posible mutagnico) en el medio
mnimo. Si la sustancia es mutagnica, algunas de las bacterias se someten a una
reversin de mutacin y sern capaces de crecer en ausencia de histidina. Si el
producto qumico no es mutagnico entonces las bacterias no crecern. Lander, E.
et al. (2004).
Esta tradicional prueba de Ames de incorporacin sobre placa, es uno de los ms
comnmente realizados ensayos de genotoxicidad en el mundo, cuyos ensayos han
sido reglamentados. Sin embargo, con el proceso de desarrollo aparecen ms
qumicos y con ello la creciente demanda de los primeros indicios de la mutacin y
potencial de carcinognesis. Entonces el tradicional formato de este test no puede
servir a este mercado actualmente, ya que requiere demasiados anlisis qumicos, el
trabajo y el tiempo son muy largos. El ensayo de Ames MPF Mutagenicidad, se basa
en el mismo principio del test de Ames, sino que establece un nuevo estndar para
este tipo de pruebas, ofrecen varias ventajas sobre el mtodo tradicional test de
Ames. Los anlisis de este ensayo se citan en las directrices de la FDA.
III. FUNDAMENTO
III.1
Mutaciones, mutgenos.
por lo tanto el
Salmonella Thypimurium:
El conjunto TA1535 (TA1535, TA1536, TA1537, TA1538) no tienen urvB y rfa por
ende tienen diferentes secuencias de DNA en el sitio de mutacin de histidina y
cada tipo es revertiente para cada compuesto toxico por ejemplo para
compuestos como los hidrocarburos policclicos aromticos es recomendable el
TA1538 y TA1537. Para la aflatoxina es recomendable usar el TA1538 (Ames,
1971).
Medios
Medio GM
Medio de crecimiento (liquido)
Medio de exposicin (liquido) 6 concentraciones
Control positivo
Control negativo
Medio indicador de pH
*Los medios deben estar entre 20 25C, protegidos de la
luz
Cultivos
S. typhimurium (TA100)
B. Reactivos
Agua destilada.
2-Aminoanthracene (2-AA)
Qumico a analizar
4.1.
4.2.
Materiales
-
Pipetas de plstico
Fiolas de 50mL
24 microplacas
Caja de luz
Equipos
-
Agitador
Balanza Analtica
Centrfuga
Microcontador de colonias
4.3.
Estufa
Cuarto:
Despus de los 90min aadir 2,8ml del
indicador de medio en cada placa, este
reacciona y se torna de color prpura.
Tenga cuidado de no contaminar el medio
indicador.
* El indicador reacciona con el medio libre de
histidina, ya que las bacterias consumieron
todo el aminocido en los 90min de incubacin
para promover una preincubacin.
Quinto:
De cada placa se toman 50ul en 48 alcuotas y son llevados al contador caja
de luz donde hay 348 pozos.
Siendo 48 espacios para cada una de las dosis a evaluar incluido controles
positivos y negativos.
Se deja incubando por 48 horas a 37C
V. RESULTADO Y DISCUSIONES
Graficar el numero de celdas positivas (eje y) Vs cada dosis evaluada del
compuesto en estudio.
Donde:
RM = Respuesta de mutagenicidad
RI = Revertantes inducidos (diferentes dosis)
RE = Revertantes espontneos (cero dosis, control negativo)
La respuesta de mutagenecidad ser positiva si (RM) es mayor o igual a 3. A
fin de asegurar una significanca de la prueba.
VI. CONCLUSIONES
VII.CUESTIONARIO
Cules son las ventajas y desventajas del Test de Ames y del Test MPF, para
la deteccin de carcingenos como mutagnicos?
Por qu se prefiere trabajar con cepas de Salmonella typhymurium y no con
cepas de E. coli?
Qu otras tcnicas de deteccin de compuestos carcingenos in Vitro
conoce?
VIII.
REFERENCIAS
Lander, E. et al. 2004. Introductory Biology - Fall. Biology Department
200443:123-143.
Legator, M. S. y Malling, H. V. (1971) in Chemical Mutagens, ed. Hollaender,
A. (Plenum Press, New York), Vol. II, chap. 22.