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Anlisis de aminocidos en muestras biolgicas impregnadas en papel de filtro por tcnicas fluorimtricas.

Aplicacin a la deteccin precoz de errores congnitos


del metabolismo
POR

R. Peaiiel, F. Monserrat,
F. Solano y J. A. Lozano

PRESENTACIN (Profesor Dr. D. Jos A. Lozano Teruel)


En el Departamento de Qumica Orgnica de la Facultad de Ciencias,
dirigido por el catedrtico de Qumica Orgnica y Bioqumica profesor
Dr. D. Antonio Soler Martnez, siempre existi una preocupacin por conectar con la sociedad ofrecindose en cada momento las colaboraciones
que fueran precisas para buscar soluciones adecuadas a los problemas
planteados desde fuera de la Universidad. De este modo, todas las personas que en una u otra poca hemos desarrollado nuestra actividad en el
citado Departamento quedamos sensibilizadas en tales aspectos de servicios a la sociedad.
En el ao 1975, a instancia de la entonces Excma. Diputacin Provincial de Murcia fui requerido para prestar colaboracin en el proyecto de
poner en marcha un Centro dedicado a la prevencin e la subnormalidad
de origen metablico-gentico en recin nacidos. Teniendo en cuenta los
antecedentes citados la respuesta tena que ser afirmativa y entusiasta.
El hoy Instituto de Bioqumica Clnica es sobradamente conocido a
nivel nacional e internacional por la labor que viene desarrollando en las
provincias de Albacete, Alicante y Murcia, superando anualmente la cifra
de 25.000 recin nacidos, sobre los cuales se analizan muestras de orina y
sangre que impregnan un papel de filtro especial, realizndose sobre las
mismas numerosas determinaciones encaminadas a la bsqueda de posibles deficiencias, pero sobre todo enfocadas a la deteccin de fenilcetonurias, galactosemias e hipotiroidismo congnitos. Son bastantes los nios

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que precozmente descubiertos han sido sometidos en los ltimos aos a
los correpondientes tratamientos, liberndose de la certeza de la subnormalidad correspondiente. Asimismo, en el Instituto de Bioqumica Clnica
se efecta un intenso trabajo en el campo de las cromosomopatas y, por
consiguiente, en las correspondientes orientaciones y consejos genticos.
Para facilitar en lo posible la toma y el procesado de las muestras en
los recin nacidos, sin necesidad de traslados ni procedimientos complejos y teniendo en cuenta la dificultad de la extraccin de muestras de sangre suficiente en muchos neonatos, se plante intentar realizar el anlisis
de aminocidos en las muestras de sangre impregnante de papel de filtro
y que se obtiene rutinariamente en tales neonatos mediante una simple
puncin en el taln, permitiendo el envo de las muestras por correo. En
el trabajo adjunto se describe el resultado, positivo, de las investigaciones
realizadas al respecto.

Anlisis de aminocidos en muestras biolgicois

INTRODUCCIN
Durante los ltimos quince aos los autoanalizadores de aminocidos
han jugado un gran papel en el campo de la deteccin de las enfermedades
denominadas errores congnitos del metabolismo de aminocidos, tales
como fenilcetonuria, enfermedad del jarabe de arce, etc. Ello implica la
estimacin rutinaria de los niveles de aminocidos en muestras biolgicas
tales como sangre y orina.
La deteccin de aminocidos, despus del paso de las muestras lquidas por una columna cromatogrfica de intercambio inico (1,2), que se
ha venido realizando hasta hace poco con ninhidrina, ha sido sustituida
en muchos casos por mtodos de deteccin ms sensibles basados en tcnicas de fluorescencia que emplean como reactivo fluorescamina (3) y
o-ftalaldehido (4,5), con lo que se ha conseguido aumentar la sensibilidad
de deteccin al rango de nanomoles.
A pesar de estos avances, la utilizacin de muestras lquidas no siempre es posible en determinadas aplicaciones, tales como el screening de
muestras de recin nacidos para la deteccin precoz de aminoacidopatas,
ya que, por una parte, es frecuentemente difcil obtener sangre suficiente
de los neonatos, y, por otra parte, an ms importante, este screening

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precisa un mtodo fcil, seguro y rpido para que las muestras lleguen lo
ms pronto posible al laboratorio, por lo que el mtodo ms efectivo es
sin duda la recogida de las muestras en papel de filtro y el envo, por correo, de dichas muestras al laboratorio una vez impregnadas y secas.
Por tanto, y haciendo uso de la gran sensibilidad de deteccin del mtodo fluorimtrico, que alcanza un rango de deteccin del orden de nanomoles, se ha estudiado la posibilidad de la cuantificacin rpida de los
aminocidos contenidos en una muestra biolgica impregnada en papel de
filtro, tanto para el screening neonatal como para el seguimiento y control
del tratamiento de los desrdenes metablicos relacionados con ciertos
aminocidos.

MATERIALES Y MTODOS
1)

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL.

Se utiliz un autoanalizador Chromaspek Rank Hilger con un programa optimizado para la separacin de aminocidos de muestras biolgicas. La duracin del programa fue de 4 horas, emplendose un gradiente
de pH obtenido por la combinacin programada de un tampn cido de
ctrico^citrato de litio 0,1 M pH = 1,9 y otro bsico de borato 0,1 M pH =
11,9. En determinados perodos a lo largo del programa se incluy la adicin de un tampn con metanol para la mejor separacin de aminocidos
hidroxilados no aromticos, y la variacin de temperatura de la columna
de 40 C a 60 C para una mejor resolucin de los aminocidos ramificados y aromticos. La deteccin de los aminocidos eluidos de la columna
de intercambio inico (resina MK2, Rank Hilger) se llev a cabo por reaccin del aminocido con o-ftalaldehido (0,8 g/1) en presencia de 2-mercaptoetanol (2 g/1) y en un tampn borato 0,1 M pH = 9, y ilectura en el FIuormetro Chromaspek.
El programa incluye la adicin a tiempos preestablecidos de una disolucin al 0,008 % de hipoclorito sdico, con el fin de aumentar la sensibilidad de deteccin de los aminocidos cistina, prolina e hidroxiprolina,
que dan una baja respuesta con el o-ftalaldehido.
El registro de la seal fluorimtrica e integracin de dicha seal se
llev a cabo mediante un integrador Hewlett-Packard, modelo 3390 A.
Como patrn de concentracin se emple una mezcla de los siguientes
aminocidos, a concentracin 1,6 mg/1, obtenidos de Sigma Chemical Co.
Londres: taurina, asprtico, hidroxiprolina, treonina, serina, glutmico.

Anlisis de aminocidos en muestras biolgicas

prolina, glicina, alanina, valina, cistina, metionina, isoleucina, leucina, tirosina, fenilalanina, homocistina, P-aminorsobutrico, histidina, ornitina. Usina y arginina. Nor-Leucina se us como patrn interno. El o-ftalaldehido
fue obtenido de Aldrich y otros reactivos fueron de grado analtico y
suministrados por diferentes firmas.
2)

REACCIN DE DETECCIN.

El o-ftalaldehido reacciona con los grupos amino de los aminocidos


en presencia de 2-mercaptoetanol y en medio bsico para dar un producto fluorescente (I) con un mximo de excitacin a 340 nm y una regin de
emisin entre 400-500 nm:

S-CH2-CH2OH

^V\
(I)

El producto fluorescente (I), l-alquil-2-tioalquil-isoindol, sufre en medio acuoso un reajuste azufre-oxgeno dando un producto no fluorescente (II), 2,3-dihidro-l-ona isoindol.

CU)
Esta ltima reaccin depende del radical R, es decir, del aminocido.
Glicina e histidina forman los complejos fluorescentes ms inestables (6),
siendo la descomposicin del 40 % y 10 % respectivamente en la primera
media hora despus de la formacin del complejo. Los restantes aminocidos producen isoindoles de mayor estabilidad, siendo el decaimiento

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R. Peafiel,

F. Monserrat,

F. Solano

y J. A.

Lozano

inferior al 5-7 % durante los primeros 30 minutos. En todos los casos la


prdida de fluorescencia sigue una cintica de primer orden para dar la
amida cclica. En cualquier caso, los tiempos entre la formacin del compuesto I y su deteccin en el programa utilizado, son lo suficientemente
cortos para que la prdida de fluorescencia sea despreciable.
Prolina e hidroxiprolina no reaccionan con el reactivo, mientras cistina produce un bajo rendimiento de fluorescencia, por lo que se introducen algunas modificaciones para convertir estos aminocidos en compuestos que reaccionen con el o-ftalaldehido y el 2-mercaptoetanol. En
concreto, estos aminocidos son oxidados despus de la elucin de la
columna con hipoclorito sdico, rompindose en los dos primeros casos
el anillo pir-rlico y dando en el tercer caso cido cisteico, siendo todos
los productos capaces de dar fluorescencia con el OPA por lo que pueden
ser analizados.
Los fluidos fisiolgicos pueden contener tambin aminocidos no proteicos que no son a-aminocidos, como la (3-alanina, el y-aminobutrico o
el 3-aminoisobutrico. Dichos aminocidos reaccionan tambin con este
reactivo mientras no lo hacen, o lo hacen muy dbilmente, con ninhidrina,
por lo cual son tambin susceptibles de valoracin con este mtodo.
3)

PREPARACIN DE MUESTRAS.

a) Patrn lquido.
Para la determinacin de aminocidos en muestras lquidas, se prepar una disolucin mezcla de todos los aminocidos a una concentracin
de 1,6 mg/1 incluido la Nor-leucina, que se usa como patrn interno,
en CIH 0,025 M. Una muestra de 160 al se inyecta al autoanalizador, y se
somete al programa de 4 horas.
Un cromatograma tpico de esta disolucin patrn se muestra en la
figura 1. Cada aminocido es identificado por un tiempo de elucin, representado en minutos en cada uno de los picos en la figura. El orden de
elucin es aproximadamente desde los aminocidos ms cidos, es decir,
de pl ms bajo, los ms bsicos, aunque existen ciertas modificaciones
como el cas de la Treonina y Serina por la aplicacin al principio del
gradiente de pH de un tampn con metanol al 10 % para la separacin
de stos.
Por integracin de los picos, el factor de respuesta (f) de cada aminocido respecto a Nor-leucina, se puede calcular por medio de la expresin:
f =

rea aminocido problema


rea Nor-leucina

Anlisis

de aminocidos

b) Patrn en papel

en muestras

biolgicas

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impregnado.

Para la determinacin de muestra impregnadas en papel de filtro, se


prepar una disolucin mezcla de todos los aminocidos, excepto el patrn interno Nor-leucina, a una concentracin de 80 mg/1, en ClH 0,025 M.
Los papeles de filtro apropiados se impregnaron en esa disolucin por
inmersin y se dejaron secar. Una vez secos, se cort un disco de 6,4 mm
de dimetro (1/4 de pulgada) con un sacabocados, y se coloc en un tubo
Eppendorf de 1 mi de capacidad. Se adicionaron al tubo 200 jil de una
disolucin de cido tricloroactico al 5 % y 200 \x\ de otra disolucin de
Nor-leucina a 3,2 mg/1 en ClH 0,025 M. El tubo se tapa y se agita durante
un minuto en un agitatubos Vortex-Mixer para realizar la elucin de la
muestra del papel de filtro. A continuacin los tubos se centrifugaron
a 8.000 rpm durante 1 minuto en una centrfuga Eppendorf modelo 5412
y 160 [xl del sobrenadante se aplicaron al autoanalizador. El factor de respuesta de cada aminocido depende del papel de filtro que se use y del
porcentaje de extraccin de cada uno. La figura 2 muestra un cromatograma tpico de un disco de papel SS-903, que es el usado para la recogida
de muestras de sangre en el screening. El cromatograma obtenido con un
disco de papel Whatman 1, que es el que se usa para la recogida de muestras de orina, es totalmente anlogo al anterior, aunque con un factor de
respuesta menor. Las diferencias se deben a la distinta capacidad de absorcin que presentan los dos tipos de papel. Por tanto, cada muestra
debe compararse con el correspondiente patrn impregnado en el mismo
papel en que lo est la muestra.
c) Preparacin de muestras

lquidas.

Para muestras biolgicas lquidas (sangre, plasma u orina), se realiza


el siguiente protocolo. A un volumen (normalmente 100 \xl) se le adicionan 4 volmenes de cido tricloroactico al 5 %. Se agita la mezcla y se
centrifuga para sedimentar las protenas y otros materiales insolubles
que se hayan podido formar. A continuacin se toma 1 volumen de sobrenadante y se le adiciona 1 volumen de ClH 0,025 M y 2 volmenes de Norleucina de 3,2 mg/1. Se mezcla y se aplica al autoanalizador una muestra
de 160 p.1.
Los aminocidos se identifican por su tiempo de retencin y se cuantifican con la siguiente frmula:

(aa) = X 20 X 1,6 mg/1

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R. Peafiel, F. Monserrat, F. Solano y J. A. Lozano

siendo f el factor de respuesta en la mezcla problema y f el factor de


respuesta en el patrn lquido. 20 y 1,6 son dos factores relacionados con
la dilucin de la muestra biolgica problema y con la concentracin del
patrn, respectivamente.
d)

Preparacin de muestras impregnadas en papel.

Se corta un disco de 6,4 mm de dimetro (1/4 de pulgada) y se adicionan 200 |jil de tricloroactico al 5 % y 200 [xl de Nor-leucina de 3,2 mg/1
y se procede como en 1 apartado b. Por ltimo, se aplican al autoanalizador 160 [ de muestra.
La determinacin de cada aminocido se realiza por comparacin con
el patrn disco, mediante la frmula:
f
(aa) = - X 80 mg/1
Siendo f y f los factores de respuesta de cada aminocido respecto a Norleucina en el disco problema y en el disco patrn, respectivamente.
RESULTADOS Y DISCUSIN
El tanto por ciento de extraccin de los aminocidos del papel de filtro
fue establecido por comparacin entre los factores de respuesta de patrones lquidos y de patrones impregnados en papel SS-903, considerando
una impregnacin media de 4,7 Jil por disco (7). Se aplicaron al autoanalizador muestras patrones lquidas y muestras patrones en papel SS-903.
Aunque los factores de respuesta pueden variar apreciablemente y dependen de una gran diversidad de factores, la tabla 1 muestra el valor de estos factores para cada aminocido (primera columna) en el patrn lquido. No obstante, y para controlar esta variabilidad, dichos patrones han
de ser introducidos peridicamente en el autoanalizador durante el anlisis rutinario cada 20 muestras aproximadamente y aplicar correcciones
cuando sea necesario o realizar la determinacin de aminocidos en las
muestras problemas referencindolas al patrn ms cercano en tiempo
que se haya aplicado a la columna del autoanalizador.
El tanto por ciento de extraccin para cada aminocido a partir del
papel SS-903 viene representado en la segunda columna. Puede observarse
una extraccin total en los primeros aminocidos que eluyen de la columna e incluso en algunos casos apreciablemente mayores del 100 %. La
razn de este aumento es desconocida, aunque puede observarse, por un

Anlisis

de aminocidos

en muestras

biolgicas

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lado, que el coeficiente de variacin entre ensayos para estos aminocidos


es tambin mayor, y por otra parte existen casos como el del cido asprtico referenciados en la bibliografa (8) en los cuales su concentracin
parece ser mayor en muestras impregnadas en papel de filtro que en muestras lquidas.
Para los aminocidos neutros y bsicos que eluyen posteriormente, se
observa un porcentaje de extraccin entre el 60 y el 80 %. El tratamiento
del disco con disolucin de un detergente como el Brij 35 al 0,2 % con el
fin de mejorar el porcentaje de extraccin no produjo aumento apreciable de ste.
Esta elucin incompleta de los aminocidos neutros y bsicos del disco de papel puede estar causada por una absorcin inespecfica de la matriz celulsica del papel para determinados grupos qumicos presentes en
las molculas de los aminocidos. Por tanto, para saturar estos centros de
absorcin, se intent impregnar el papel con la misma disolucin patrn
de todos los aminocidos a 80 mg/1, pero conteniendo tambin 5 g/1 de
albmina de suero bovino, protena que podra saturar dichos centros y
bloquear la unin de los aminocidos provocando su extraccin completa.
Los resultados de estos experimentos se representan en la columna tercera de la tabla 1.
Puede observarse que aunque no se consigue la extraccin completa
de los aminocidos, s aumenta significativamente el porcentaje de extraccin, llegando al 90 % en algunos casos. Este aumento no puede atribuirse
a posibles aminocidos libres que presente como impurezas la albmina
de suero bovino, puesto que se comprob que no existen en cantidades
significativas en una muestra lquida de la disolucin de albmina a 5 g/1.
Efecto del tiempo de extraccin de la muestra impregnada en papel.
Se realizaron una serie de experimentos en los que el disco de papel
fue extrado en las condiciones descritas en mtodos, pero se utilizaron
distintos tiempos de extraccin. Para tiempos de 1,2, 5, 10 y 30 minutos
se obtuvieron los mismos niveles de extraccin. Por lo tanto, este factor
no resulta crtico en cuanto al desarrollo del mtodo.
Estabilidad de los aminocidos impregnados en papel.
La estabilidad de los aminocidos impregnados en papel, cuando las
muestras se almacenan durante perodos variables de tiempo, es otro factor que debe ser tenido en cuenta, ya que desde que son tomadas hasta
que llegan al laboratorio para su anlisis, transcurre un perodo de tiem-

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'

R. Peafiel, F. Monserrat, F. Solano y J. A. Lozano

po variable, en el que las muestras estn expuestas a diversas temperaturas.


Por ello se almacenaron muestras a diferentes concentraciones a temperatura ambiente durante una semana. La mayora de los aminocidos
resultaron estables durante ese tiempo, incluyendo aquellos de mayor inters en el screening para la deteccin de aminoacidopatas, tales como
fenilalanina (para deteccin de fenilcetonuria), tirosina (para deteccin
de tirosinemia) y ios ramificados leucina, isoleucina y valina (para la deteccin d enfermedad del Jarabe de Arce).
Algunos aminocidos s presentaron cambios importantes con el tiempo de almacenamiento, aunque stos, afortunadamente, no se hayan directamente relacionados con enfermedades metablicas congnitas importantes. Tal es el caso de los aminocidos con grupo hidrxido treonina
y serina y los aminocidos bsicos, principalmente la histidina, que es el
ms seriamente afectado. Su concentracin puede disminuir hasta un
20 % despus de una semana de almacenamiento en este tipo de muestras.
Comparacin entre anlisis realizados con muestras lquidas y con
muestras impregnadas en papel.
La determinacin de aminocidos en muestras biolgicas impregnadas en papel de filtro puede realizarse por comparacin con el patrn
lquido, teniendo en cuenta los porcentajes de extraccin previamente determinados. Sin embargo, existe una dependencia de estos porcentajes de
extraccin con la presencia de protenas en las muestras, por lo cual la
alta concentracin de stas en el plasma o la sangre entera puede introducir serios errores en el clculo. Otros factores pueden asimismo introducir
desviaciones significativas en la estimacin, como por ejemplo, el volumen de lquido que impregna un disco de papel y que vara segn la naturaleza de la muestra biolgica que se impregne y del papel que se utilice,
distinto segn se trate de sangre u orina.
Por ello, es ms conveniente y sencillo determinar la concentracin de
aminocidos por comparacin de las muestras con patrones previamente
impregnados en el mismo tipo de papel. De este modo se evitan todos los
factores que pueden contribuir a modificar la extraccin, ya que dichos
factores afectan igualmente a la muestra biolgica cuya concentracin se
quiere determinar que al patrn.
Para comprobar la exactitud de las determinaciones en estas muestras
biolgicas impregnadas en papel se realiz un estudio comparativo con
los valores que se obtienen de analizar directamente las muestras biolgicas lquidas.

Anlisis

de aminocidos

en muestras

biolgicas

15

Una muestra lquida de orina normal se dividi en dos partes. En una


parte, lquida, se determin la concentracin de los aminocidos por comparacin con el patrn lquido. Con la otra parte de la orina se impregn
papel Whatman 1, usado para este tipo de muestras, y despus del secado
se proces segn el protocolo para muestras impregnadas y se determin
la concentracin de aminocidos respecto al patrn impregnado en el
mismo tipo de papel.
Los resultados de esta experiencia se recogen en la tabla 2, donde se
expresa la concentracin calculada para cada aminocido en muestra
lquida (primera columna) y en muestras impregnadas en papel Whatman 1 utilizando uno (segunda columna) o dos discos (tercera columna).
Todos los valores son el resultado de tres determinaciones y puede observarse en la mayora de los casos una buena correlacin.
La concentracin de aminocidos en orina es variable y depende de la
diuresis, de tal forma que cuando sta es alta, la concentracin de aqullos es baja. En tales casos es conveniente realizar el anlisis a partir de
dos discos de papel, realizando la extraccin igual que se describe en
mtodos para un disco, y empleando como patrn dos discos de ste,
procesados de igual forma. Debido a esto se obtuvieron los resultados de
la tercera columna en tabla 2 que no indican la introduccin de errores
apreciables por la presencia de dos discos.
Un estudio anlogo al realizado en orina se realiz con una muestra
de sangre entera normal y del plasma obtenido a partir de ella. En ambos
casos se realizaron determinaciones, bien a partir de una alcuota lquida
o bien a partir de una alcuota impregnada en papel SS-903, que es el normalmente utilizado para recoger este tipo de muestras biolgicas para el
screening.
Los resultados, tanto en plasma como en sangre entera, se expresan
en la tabla 3. Puede observarse una mayor variacin respecto a la encontrada en orina, particularmente en los aminocidos con menor tiempo de
retencin cromatogrfica. Sin embargo, de nuevo, los aminocidos de
mayor inters desde el punto de vista de las aminoacidopatas son los sujetos a menor variacin, existiendo una buena correlacin entre los valores encontrados en muestras lquidas y los encontrados en muestras impregnadas en papel de filtro.
Por otra parte, existen casos como el de ornitina y cido asprtico,
que dan siempre valores superiores en muestras impregnadas que en
muestras lquidas, mientras que la concentracin de arginina, al contrario, es siempre menor en muestras impregnadas que en muestras lquidas.
La decomposicin de arginina impregnada en papel en ornitina y urea
podra explicar estos hechos experimentales.

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R. Peafiel, F. Monserrati F. Solano y J. A. Lozano

Respecto a los valores encontrados en sangre y su plasma, como es


lgico, en general los encontrados en plasma, son mayores que los encontrados en sangre entera. Sin embargo, tras las correcciones calculadas en
funcin del volumen de hematocrito, los valores calculados para sangre
en funcin de los encontrados en plasma son menores que los obtenidos
cuando se analiza directamente la sangre entera. Esta variacin puede ser
debida a los aminocidos que se encuentran en el interior del eritrocito
y que se liberan al medio como consecuencia de la hemolisis que ocurre
cuando stos se tratan en un medio,cido fuerte, como el tricloroactico.
En conclusin, el mtodo ha resultado ser de validez y ha permitido
la deteccin rpida de casos de fenilcetonuria, tirosinemia. Jarabe de
Arce, cistinuria, hiperglicinemia, etc., en las muestras analizadas por el
Instituto de Bioqumica Clnica procedentes del rea geogrfica que cubre. En la figura 3 (A, B y C) se muestran cromatogramas de muestras de
neonatos con estos tipos de alteraciones, concretamente un caso de fenilcetonuria, otro de tirosinemia y otro de Jarabe de Arce.
RESUMEN
Se ha establecido un mtodo rpido y sencillo para la cuantificacin
de aminocidos en muestras biolgicas impregnadas en papel de filtro,
que son las habituales en el screening neonatal para la deteccin de aminoacidopatas. Los aminocidos de mayor inters para este propsito son
estables en este tipo de muestras y pueden ser extrados y determinados
de manera precisa. El mtodo resulta de especial inters para laboratorios
dedicados a este tipo de anlisis, ya que se evitan los tiempos que se pierden en la peticin de nuevas muestras lquidas y que son crticos para
iniciar satisfactoriamente el tratamiento.
La determinacin de ciertos aminocidos en muestras impregnadas en
papel puede sufrir variaciones respecto al anlisis directo en muestras
lquidas debido a diversos factores, como estabilidad en este tipo de
muestras, etc. Sin embargo, mediante el clculo de factores de correccin,
para cada aminocido en particular, pueden ser tambin cuantizados con
precisin aceptable.

Anlisis

de aminocidos

en muestras

17

biolgicas

TABLA

FACTORES DE RESPUESTA Y PORCENTAJE DE EXTRACCIN


DE LOS AMINOCIDOS DE PAPEL SS-903
B

Aminocidos
Tau
Asp
HO-Pro
Tre
Ser
Glu
Pro
Gli
Ala
Val
Cis
Met
He
Leu
Tir
Fen
Homocis
Baba
His
Orn
Lis
Arg

0,905
0,512
0,123
0,660
0,980
0,516
0,293
1,160
1,130
0,890
0,165
0,550
1,074
1,062
0,830
0,890
0,045
0,760
1,013
0,600
0,686
0,688

0,192
0,096
0,015
0,060
0,143
0,061
0,037
0,124
0,108
0,072
0,012
0,120
0,062
0,052
0,040
0,036
0,003
0,052
0,108
0,072
0,064
0,089

78,9
116,6
124,4
104,3
104,0
107,9
67,4
60,0
57,0
81,2
77,3
66,5
77,1
78,3
83,8
79,3
81,2
76,1
75,7
75,1
72,5
76,4

15,1
23,4
16,8
12,3
16,4
9,6
5,3
10,5
6,6
13,6
5,4
8,2
4,3
3,9
5,7
5,2
3,1
6,0
9,8
10,2
6,4
6,7

82,6
121,6
114,0
96,6
88,5
94,8
64,5
63,0
57,9
91,7
82,4
?1,9
84,2
83,8
92,2
88,8
80,8
83,9
82,5
85,0
81,3
88,0

16,3
22,5
15,6
9,9
12,4
10,7
5,2
9,6
5,8
12,6
7,2
7,8
5,4
4,5
6,1
4,8
3,8
7,6
7,9
10,9
8,2
8,4

A: Factores de respuesta de todos los aminocidos respecto a Nor-leucina en patrn


lquido. Todos se encuentran a concentracin de 1,6 mg/I.
B: Porcentaje de extraccin de cada aminocido a partir de muestras en papel
SS-903 previamente impregnado en disolucin patrn de aminocidos a 80 mg/1.
C: Porcentaje de extraccin de cada aminocido a partir de muestras en papel
SS-903 previamente impregnado en disolucin patrn de aminocidos a 80 mg/l
conteniendo albmina de suero bovino a 5 g/1.

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R. Peafiel,

F. Monserrat,

F. Solano y J. A.

Lozano

TABLA 2

CONCENTRACIN DE AMINOCIDOS (mg/I) EN UNA ORINA HUMANA


ADULTA NORMAL
Aminocidos
Tau
Asp
HJPro
Tre
Ser
Glu
Pro
Gli
Ala
lie
Leu
Tir
Fen
His
Orn
Lis
Arg

B
28,3 4,2
39,1 5,3
39,0 2,9
12,1 1,1
24,5 2,9
61,2 7,5
24,6 10,3
79,710,3
28,3 4,5
3,7 1,3
8,3 2,0
9,6 1,8
4,5 0,9
33,3 5,9
30,6 3,2
35,9 2,5
7,5 1,1

30,3 6,5
31,5 6,4
37,4 3,6
14,9 1,4
29,2 3,2
71,7 6,6
22,8+ 2,9
98,7 12,0
29,5 3,2
5,6 0,6
10,5 1,3
11,6 2,2
6,0 1,4
27,3 4,6
25,8 3,9
29,4 3,6
6,7 0,6

38,7
32,2
32,61
13,5
34,8i
65,1
23,6
98,2
33,0
5,9i
13,6'
10,6
6,71+
27,0'
30,4!+
32,8
7,6

5,7
4,6
7,5
1,9
4,2
8,0
3,2
11,2
4,1
0,9
1,6
1,5
1,2
5,3
4,2
4,1
0,9

A: Calculada a partir de muestras lquidas.


B: Calculada a partir de 1 disco de muestras impregnadas en papel W-1.
C: Calculada a partir de 2 discos de muestras impregnadas en papel W-1.

TABLA 3

CONCENTRACIN DE AMINOCIDOS (mg/1) EN PLASMA Y SANGRE ENTERA


HUMANA ADULTA NORMAL
Aminocidos

Asp
Tre
Ser
Glu
Pro
Gli
Ala
Val
He
Leu
Tir
Fen
His
Orn
Lis
Arg

i?

Plasma

Sangre

16,3 2,1
10,7 1,4
15,5 2,1
29,9 2,8
14,1 1,6
28,4 3,2
21,9 2,6
8,2 1 , 1
12,6 1,2
11,8 0,9
7,9 0,8
20,6 3,4
12,3 1,8
30,1 2,8
14,3 1,9

13,4 2,2
13,2 1,6
10,2 1,2
16,7 2,1
18,6 2,3
12,7 1,8
20,2 1,4
21,1 2,6
6,5 0,8
13,4 1 , 2
10,0 1,3
6,8 1,2
16,1 4,5
14,4 2,2
25,4 3,1
11,0 2 , 3

Plasma
26,4 +
21,8
17,6
17,3
26,7
15,7
22,5
16,3
7,1
10,1
9,8
6,2
23,5
19,6
27,0
10,7

5,4
2,8
3,2
1,8
3,5
1,3
2,9
4,8
0,9
1,1
1,9
0,7
4,6
1,7
3,2
2,1

A: Calculada a partir de muestras lquidas.


B: Calculada a partir de muestras impregnadas en papel SS-903.

Sangre
26,4 4,6
14,2 4,5
19,0 3,6
22,5 2,4
19,3 5,1
15,0 1,2
24,81 3,5
26,9 7,2
9,7 1,2
16,5 2,4
14,4' 3,1
8,9 + 1,1
12,6 ! 5,2
15,9 3,6
34,6' 2,9
7,6 1,9

l-t

a
o H W

>

ai

s:

m 3 j
fH )

v< c
1 -H a

>- J z - (^

FIGURA 1.Cromatograma obtenido a partir de una disolucin patrn de aminocidos a concentracin de 1,6 mg/1. (Los tiempos de retencin se expresan
en minutos.

o J S5 <

U T-i r-t
U <<

CH

33

01
S

i-l 01 I -H 0)
H f4 Z H b

FIGURA 2.Cromatograma obtenido a partir de un disco de papel SS-903 impregnado


con disolucin de aminocidos a concentracin de 80 mg/1.

t M i -
U -H X

O tA g.

M
U

<

FIGURA

3A.^Cromatograma obtenido con un disco impregnado de sangre


en un caso de hiperfenilalaninemia.

VLy^^-V
FiGURA 3B.Cromatograma obtenido con un disco impregnado de sangre
en un caso de tirosinemia.

tu
f-i
t-'

FIGURA

3 01
a) ,-5
J
I

3C.Cromatograma obtenido con un disco innpregnado de sangre


en un caso de enfermedad de Jarabe de Arce.

Anlisis

de aminocidos

en muestras

biolgicas

25

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